Fermentation Process of Aspergillus oryzae and Aspergillus niger of Kelp Paste Optimized by Response Surface Methodology
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摘要: 为研究海带酱的最佳发酵工艺，在考察湿海带与湿黄豆比例、米曲霉与黑曲霉比例、盐浓度和盐水添加量等单因素对海带酱氨基态氮影响的基础上，采用响应面法对海带酱的米曲霉和黑曲霉发酵工艺进行优化。结果表明，海带酱的最佳发酵条件为：湿海带与湿黄豆比例为3:1，米曲霉与黑曲霉比例为2:1，盐浓度为14.5%，盐水添加量为77%，该条件下海带酱中氨基态氮值达到最高，为0.76%±0.04%，与理论预测值基本一致。这表明使用最佳发酵条件制作海带酱，可提高氨基态氮含量，增强海带酱的鲜味。同时，该海带酱营养成分为：能量171.33±1.15 kJ/100 g，蛋白质3.22±0.04 g/100 g，脂肪1.92±0.03 g/100 g，碳水化合物5.68±0.06 g/100 g，钠2633.00±1.00 mg/100 g；其中，氨基态氮含量符合GB/T 24399-2009《黄豆酱》标准。本研究可为发酵酱制品的进一步开发与利用提供一定的技术指导。Abstract: In order to study the optimal fermentation process of kelp paste, the effect of four single factors (the ratio of wet kelp to wet soybean, the ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger, the salt concentration and the amount of brine addition) on the amino nitrogen of kelp paste was investigated. Based on the single factor experiments, the fermentation process of kelp paste was optimized by response surface methodology. Results showed that, the optimal fermentation conditions for kelp paste were as follows: 3:1 of the ratio of wet kelp to wet soybean, 2:1 of the ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger, 14.5% of salt concentration, and 77% of the amount of brine addition. The amino nitrogen was up to 0.76%±0.04% under these conditions, which was basically consistent with the theoretical prediction value. This indicated that using these conditions to make kelp paste could increase the amino nitrogen content and enhance the umami taste. Meanwhile, the nutritional components of the kelp paste were as follows: 171.33±1.15 kJ/100 g of energy, 3.22±0.04 g/100 g of protein, 1.92±0.03 g/100 g of fat, 5.68±0.06 g/100 g of carbohydrate, 2633.00±1.00 mg/100 g of sodium. Among them, the amino nitrogen content conformed to the requirements of the standard of GB/T 24399-2009 "Soybean Paste". This study could provide a certain technical guidance for the development and utilization of fermented sauce products.
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发酵海产品在我国有着悠久的历史记载，是一种风味独特、营养价值丰富，且具备一定保健功效的调味品[1-4]。我国自古代起，已采用自然发酵的方式发酵多种海产品[5-6]，随着社会发展，发酵海产品的种类层出不穷，以鱼类、虾类、牡蛎类原材料制作的发酵产品琳琅满目，但以海带为原材料发酵的酱制品研究较少[2]。
海带，别名纶布，属于褐藻类植物，具有丰富的营养价值与保健功效[7-9]。据2021年中国渔业统计年鉴记载，我国的海带养殖面积已达到46132公顷，福建省的海带养殖面积占全国总量的45.5%，因此，海带是我省的重要经济作物。目前，我省海带加工方式仍然处于初级阶段，主要以传统的初级加工形式为主，在很大程度上限制了海带产业的健康发展。现下，急需改变海带加工单一的现状，充分利用我省丰富的海带资源，研发一款新型发酵海带产品，为海带加工方向提供一个新思路。
目前，国内外学者对发酵海产品中的发酵菌种投入极大的关注，主要集中在乳酸菌、红曲霉、酵母菌、米曲霉、黑曲霉等方面[10-13]。Annette等[12]通过乳酸菌单菌发酵制备糖海带，得出发酵后的糖海带更具有海带风味，同时能够有效减少海带中的微量金属含量；严超等[13]通过米曲霉发酵扇贝豆酱，制得的扇贝豆酱香味浓郁，海鲜味突出；Yuan等[14]通过混合发酵的方式发酵鲶鱼肌肉，发现混合发酵的pH和总挥发性盐基氮均低于未发酵组，总酸度与氨基态氮、游离氨基酸含量较高，使发酵鲶鱼酱具有浓郁的鲜味和发酵风味。
因此，本实验采用米曲霉与黑曲霉混合制曲的方式来发酵海带酱，考察物料比、种曲比、盐浓度以及盐水添加量对海带酱发酵品质的影响，同时优化工艺参数，以期为海带酱的工业化生产提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042（编号CICC2339，孢子数≥180亿/g）、黑曲霉（Aspergillus niger）3.758（编号CGMCC32783，孢子数≥180亿/g） 沂源康源生物科技有限公司；盐渍海带片 福州海林食品有限公司；黄豆、食盐 福州家乐福超市；36%~38%甲醛溶液、氢氧化钠 分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
SH10A型电子水分测定仪 上海菁海仪器公司；PL602-L型精密天平、FE28型标准pH计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；YXQ-LS-30SⅡ全自动立式压力蒸汽灭菌锅 上海精宏实验设备有限公司；SPX-270智能生化培养箱 宁波江南仪器厂；HX-PB9538型破壁机 佛山市海迅电器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 海带酱制备流程
1.2.2 原料处理
参照李次力[15]的方法对海带酱原材料进行处理，挑选优质黄豆，用蒸馏水浸泡12 h，黄豆与蒸馏水的质量比为1:3，浸泡后清洗、沥干，用破壁机搅碎，以36000 r/min搅碎25 s；参照聂小伟等[16]的方法，挑选盐渍海带片，用蒸馏水浸泡3 h，海带与蒸馏水的质量比为1:3，浸泡后洗净海带表面的沙砾，沥干后用破壁机搅碎，以36000 r/min搅碎20 s。
1.2.3 海带酱的制备
将处理过后的海带酱原料根据比例装入500 mL烧杯中，原料总添加量为160 g/瓶，牛皮纸进行封口。将盛有物料的烧杯放入高压灭菌锅中，以121 ℃灭菌15 min，灭菌降温后，在无菌环境中将种曲按照比例加入，充分搅拌使物料和种曲混合均匀，封口，置于34 ℃的恒温培养[16]，2 d后，海带曲成熟，加入相对曲料重量75%的盐水搅拌均匀，盐水浓度为14.5%，封口，置于34 ℃恒温发酵。参照何天明等[17]的方法，进行预实验，海带酱发酵到10 d时，其氨基态氮值已符合GB/T 24399-2009《黄豆酱》的标准，因此，后续的发酵时间均确定为10 d。
1.2.4 海带酱发酵条件优化单因素实验
1.2.4.1 物料配比的确定
以物料比为变量的单因素实验中，湿海带和湿黄豆的质量比分别按照1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的比例分装在500 mL烧杯中，物料总重量为160 g，灭菌条件同1.2.3，接入米曲霉与黑曲霉的比例为2:1，种曲总量为0.064 g，搅拌均匀，封口。34 ℃下培养2 d，加入相对曲料重量75%的盐水搅拌均匀，盐水浓度为14.5%，继续发酵，待发酵10 d后测海带酱中氨基态氮含量。
1.2.4.2 种曲配比的确定
以种曲比为变量的单因素实验中，米曲霉与黑曲霉的种曲质量比分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，种曲总量为0.064 g，将其分别添加到湿海带与湿黄豆的质量比为3:1的物料中，物料总重量为160 g，分装在500 mL烧杯中，搅拌均匀，封口。34 ℃下培养2 d，加入相对曲料重量75%的盐水搅拌均匀，盐水浓度为14.5%，继续发酵，待发酵10 d后测海带酱中氨基态氮含量。
1.2.4.3 盐浓度的确定
以盐浓度为变量的单因素实验中，按照湿海带与湿黄豆的质量比为3:1、米曲霉与黑曲霉的种曲质量比为2:1的比例制备成曲，物料总重量为160 g，种曲总量为0.064 g，分装在500 mL烧杯中，将相对曲料重量75%的盐水加入物料中（盐水浓度分别为5.5%、10%、14.5%、19%、23.5%），搅拌均匀，封口。置于34 ℃恒温培养箱中，待发酵10 d后测海带酱中氨基态氮含量。
1.2.4.4 盐水添加量的确定
以盐水添加量为变量的单因素实验中，按照湿海带与湿黄豆的质量比为3:1、米曲霉与黑曲霉的种曲质量比为2:1的比例制备成曲，物料总重量为160 g，种曲总量为0.064 g，分装在500 mL烧杯中，将浓度为14.5%的盐水分别按相对曲料重量50%（80 mL）、62.5%（100 mL）、75%（120 mL）、87.5%（140 mL）、100%（160 mL）加入物料中，搅拌均匀，封口。置于34 ℃恒温培养箱中，发酵10 d后测海带酱中氨基态氮含量。
1.2.5 感官评定方法
参照食品安全国家标准GB 19643-2016《藻类及其制品》和GB/T 24399-2009《黄豆酱》的感官要求，对海带酱样品进行感官分析。由20名经过专业感官培训的专家组成感官评定小组，感官评价的全过程均在标准感官实验室内进行。根据表1对海带酱样品的色泽、滋味、气味、体态进行评分，其中色泽占20分、滋味占30分、气味占40分、体态占10分，总计100分。
表 1 感官评定标准Table 1. Sensory evaluation standard评价项目 感官评分标准 得分（分） 总分（分） 色泽 深褐色或褐绿色，鲜艳，有光泽 16~20 20 深褐色或褐绿色，略有光泽 11~15 棕褐色，光泽暗淡 <10 气味 酱香、酯香浓郁，无腥味 26~30 30 酱香、酯香味较淡，有少许腥味 21~25 酱香、酯香味较淡，腥味较重 <20 滋味 鲜味醇厚，浓厚海带风味，咸甜适度 36~40 40 有鲜味，有海带风味，无异味 31~35 鲜味较差，无海带风味，有异味 <30 体态 粘稠适宜，混合均匀，有明显黄豆和海带颗粒状 9~10 10 偏稀或偏稠，混合较均匀，黄豆和海带颗粒状不明显 6~8 偏稀或偏稠，混合不均匀，无大豆和海带颗粒状 <5 1.2.6 响应面试验
根据单因素实验结果，设计以种曲比、盐浓度、盐水添加量3个因素为自变量，以氨基态氮值为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，考察种曲比、盐浓度、盐水添加量对发酵海带酱氨基态氮含量的影响，确定海带酱的最佳发酵工艺。根据预测的海带酱最佳发酵条件，测定氨基态度的实际得率，比较预测值和实际值，验证其准确性。
1.2.7 基本营养成分分析
对0与10 d的海带酱基本营养成分进行测定，其中，参照GB 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》测定氨基态氮的含量；参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》测定水分的含量；参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》测定蛋白质的含量；使用pH计测定样品的pH；参照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》测定脂肪的含量；参照GB 28050-2011《预包装食品营养标签通则》测定碳水化合物的含量；参照GB 28050-2011《预包装食品营养标签通则》测定能量的含量；参照GB 5009.91-2017《食品中钾、钠的测定》测定钠的含量。
1.3 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6对实验数据进行处理和显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 物料配比的确定
从图1a可知，由于物料中黄豆比例的降低导致氨基态氮值不断减小，其原因主要为，黄豆中蛋白质含量较海带丰富，当物料总量不变的情况下，黄豆比例降低，海带酱内相对的蛋白质含量减少，因此蛋白酶酶解条件受限，使氨基态氮值减小。因本实验是为了研发一款新型海带酱产品，产品的主原料应以海带为主，考虑到图1a中各比例的氨基态氮值变化趋势较小，同时，结合图1b中各比例的海带酱感官评分，因此，最终选择口感风味较好的湿海带与湿黄豆比例为3:1作为海带酱的较优物料配比，后续单因素实验均以3:1的湿海带与湿海带比例为物料配比。
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2.1.2 种曲配比的确定
种曲比例对海带酱发酵过程可能有显著作用，能够直接影响发酵产物的种类和数量[18]。如图2所示，当菌种比在1:1到2:1之间时，氨基态氮值呈上升趋势。且当种曲比为2:1时，氨基态氮值处于最高点，表明在发酵过程中米曲霉产生酶系对蛋白质的酶解作用较大；当菌种比在3:1到5:1之间时，氨基态氮值呈下降趋势，可能是由于米曲霉比例逐渐增大，对黑曲霉的生长起到了一定的抑制作用 ，导致黑曲霉在发酵后期的酶系活力降低[19-20]；同时，米曲霉分泌的中性蛋白酶易在发酵后期受酸性环境抑制，使原料的转化率降低，从而导致氨基态氮值降低[21-23]。该实验结果与零春甜等[24]的研究结果相似，因此，采用米曲霉比黑曲霉比例为为2:1发酵得到的海带酱，其氨基态氮含量要比其余四种的比例要高，海带酱的鲜味更好。
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图 2 不同种曲配比的海带酱氨基态氮含量Figure 2. Amino nitrogen content of kelp paste with different seed ratios2.1.3 盐浓度的确定
如图3所示，盐浓度对氨基态氮含量的变化可能有重要影响。随着盐浓度的增加，氨基态氮值呈现先增加后降低的趋势。当盐浓度在5.5%时，由于盐浓度过低，易使发酵环境中的产酸性细菌大量进行繁殖，导致发酵环境的pH下降，从而抑制了中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解作用[25]，因此氨基态氮含量较低；当盐浓度从5.5%逐渐增大到14.5%时，发酵环境中的盐浓度逐渐加大，对产酸性细菌的抑制作用也增大，同时，由于较低的盐浓度状态渗透压较低，对蛋白质酶解的抑制作用较小[26]，因此，氨基态氮值逐渐增大。盐浓度继续增加，使发酵环境处于高盐浓度状态，抑制米曲霉的生长，蛋白酶含量减少，同时，由于渗透压变大使酶活性降低，原料分解不完全，从而氨基态氮值逐渐降低[27]。该实验结果与谢主兰等[28]的研究结果相似，因此，选择14.5%为最佳盐浓度，能抑制有害微生物的生长繁殖、保持酶活性，同时，氨基态氮含量达到最高。
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图 3 盐浓度对海带酱氨基态氮含量的影响Figure 3. Effect of salt concentration on amino nitrogen content in kelp sauce2.1.4 盐水添加量的确定
如图4所示，盐水添加量与海带酱发酵过程中产生的氨基态氮含量的变化可能有密切关系。随着盐水添加量的增加，氨基态氮值呈现先增加后降低的趋势。当盐水添加量在50%~75%之间时，由于酱中的水分含量得当，米曲霉保持较为旺盛的生命活力，水分子进入曲料内部，有利于曲料中营养物质的溶出，便于蛋白酶酶解蛋白质[29]；同时，随着盐水添加量的增大，盐浓度也随着增大，适当的盐浓度能够抑制产酸性细菌的大量繁殖，有利于蛋白质的酶解[25]，因此，氨基态氮含量逐渐增加，并在盐水添加量为75%时，氨基态氮值达到最高。当盐水添加量超过75%时，盐水中的盐浓度也逐渐增大，氨基态氮值逐渐降低，原因主要为大量的水分与种曲充分接触，对蛋白酶酶解速率有抑制作用，同时，盐浓度过大也会对酶解产生较大的抑制作用，蛋白质分解不完全，氨基态氮含量逐渐降低[30-34]。该实验结果与康蕾等[35]的研究结果相似，因此，选择75%为盐水添加量，既不影响酶活性，又能够抑制有害微生物的生长繁殖，氨基态氮含量达到最高。
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图 4 盐水添加量对海带酱氨基态氮含量的影响Figure 4. Effect of salt water addition on amino nitrogen content in kelp sauce2.2 响应面试验
2.2.1 响应面的试验设计及结果
由单因素实验可知：米曲霉与黑曲霉的混合比例以选择为2:1为宜、盐浓度以选择14.5%为宜、盐水添加量以选择75%为宜。根据单因素实验结果，选取种曲比、盐浓度、盐水添加量为主要考察因素，以氨基态氮值为响应值，进行响应面试验。响应面试验设计方案见表2。试验设计及结果见表3。
表 2 响应面试验设计方案Table 2. Design scheme of response surface methodology水平 因素 A米曲霉:黑曲霉 B盐浓度（%） C盐水添加量（%） −1 1:1 10 62.5 0 2:1 14.5 75 +1 3:1 19 87.5 表 3 海带酱发酵响应面试验设计及结果Table 3. Design and results of response surface experiment for kelp paste fermentation实验号 A B C 氨基态氮（%） 1 −1 −1 0 0.65 2 1 −1 0 0.54 3 −1 1 0 0.60 4 1 1 0 0.57 5 −1 0 −1 0.62 6 1 0 −1 0.59 7 −1 0 1 0.64 8 1 0 1 0.59 9 0 −1 −1 0.69 10 0 1 −1 0.67 11 0 −1 1 0.69 12 0 1 1 0.70 13 0 0 0 0.78 14 0 0 0 0.74 15 0 0 0 0.76 16 0 0 0 0.76 17 0 0 0 0.75 2.2.2 模型的建立及显著性分析
采用Design-Expert 8.0.6对表3中的实验数据进行分析，得到各项的显著性分析，并建立提取模型，分析结果见表4。由表4可知，回归模型P<0.0001，表明该回归模型达极显著水平；在一次项中，A对海带酱发酵的氨基态氮含量达到显著水平；在交互项中，AB对海带酱发酵的氨基态氮含量达到显著水平；在二次项中，A2、B2、C2均对海带酱发酵后的氨基态氮含量达到极显著水平；失拟项P=0.5903，失拟项不显著，并且该模型的决定系数R2=0.9849，校正决定系数R2Adj=0.9654，变异系数C.V. %=2.0857%，说明响应值的变化有98.49%来源于所选变量，该值接近于100%，说明优化后的回归模型能够较好地反应实际操作（种曲比、盐浓度、盐水添加量）与氨基态氮含量的实际关系，可用于海带酱最佳发酵工艺参数的确定。在所选取的各因素水平范围内，各因素对海带酱发酵后的氨基态氮含量的影响程度依次为：种曲比>盐水添加量>盐浓度。
表 4 方差分析结果Table 4. Results of variance analysis方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 回归模型 0.088197941 9 0.009799771 50.6261245 < 0.0001 A 0.00605 1 0.00605 31.25461255 0.0008 B 0.0001125 1 0.0001125 0.581180812 0.4708 C 0.0003125 1 0.0003125 1.614391144 0.2445 AB 0.0016 1 0.0016 8.265682657 0.0238 AC 0.0001 1 0.0001 0.516605166 0.4956 BC 0.000225 1 0.000225 1.162361624 0.3167 A2 0.063442368 1 0.063442368 327.7465527 < 0.0001 B2 0.008621316 1 0.008621316 44.53816275 0.0003 C2 0.002684474 1 0.002684474 13.86812973 0.0074 残差 0.001355 7 0.000193571 失拟项 0.000475 3 0.000158333 0.71969697 0.5903 纯误差 0.00088 4 0.00022 总离差 0.089552941 16 注：R2=0.9849，R2Adj=0.9654，C.V. %=2.0857%；P<0.05表示检测水平上显著；P<0.01表示检测水平上极显著。 各因素经二次多项式回归拟合后，得到氨基态氮值对种曲比、盐浓度、盐水添加量3个因素的二次多项回归方程：
Y=0.758−0.0275A−0.00375B+0.00625C+0.02AB−0.005AC+0.0075BC−0.12275A2−0.04525B2−0.02525C2
2.2.3 响应面图和等高线图分析
由以上方差分析结果可知，各因素对氨基态氮值的影响依次为：A>C>B。A、B、C二次项系数均为负值，方程表示的抛物面开口向下有极大值点。综合图5~图7的数据，比较三张曲面图，可以看出种曲比的曲线最陡峭，表明其对氨基态氮含量的影响最大，这与方差分析的结果一致；通过比较3张等高线图，发现种曲比和盐浓度对氨基态氮值含量的影响最显著，其表现为等高线呈现明显的椭圆形。而图6和图7的等高线图则椭圆性较差，与其相对应的响应面图形也较为平缓，这表明种曲比和盐水添加量、盐浓度和盐水添加量的交互作用对氨基态氮含量的影响不显著。
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图 5 种曲比和盐浓度对氨基态氮含量的响应面图Figure 5. Response surface diagram of seed ratio and salt concentration to amino nitrogen content![]()
图 7 盐浓度和盐水添加量对氨基态氮含量的响应面图Figure 7. Response surface diagram of salt concentration and salt water addition to amino nitrogen content![]()
图 6 种曲比和盐水添加量对氨基态氮含量的响应面图Figure 6. Response surface diagram of seed ratio and salt water addition to amino nitrogen content2.2.4 工艺验证
结合回归模型，由Design-Expert 8.0.6软件分析得到最佳海带酱发酵工艺为：米曲霉与黑曲霉比例为1.88:1，盐浓度为14.45%，盐水添加量为76.59%，在此条件下，氨基态氮值为0.76%。考虑到实际操作条件，将最佳工艺条件修正为：米曲霉与黑曲霉比例为2:1，盐浓度为14.5%，盐水添加量为77%。在此条件下重复3次实验，氨基态氮得率分别为0.72%、0.80%、0.77%，氨基态氮平均值为0.76%±0.04%，与理论预测值基本一致，这说明回归模型具有可靠性。氨基态氮实际值与预测值的线性关系见图8，其实际值与回归模型预测值呈现良好的线性关系，说明模型的预测值能较好地反应实际氨基态氮值。
2.3 发酵对海带酱基本营养成分的影响
由表5可知，以米曲霉和黑曲霉混合发酵的方式发酵海带酱，在最佳工艺条件下，海带酱中的基本营养成分为：能量171.33±1.15 kJ/100 g，蛋白质3.22±0.04 g/100 g，脂肪1.92±0.03 g/100 g，碳水化合物5.68±0.06 g/100 g，钠2633.00±1.00 mg/100 g。以60 kg的成年男性为例，食用海带酱时，其提供的营养素参考值为：能量2%、蛋白质5%、脂肪3%、碳水化合物1%、钠131%，根据中国营养学会提出的建议，并与汪洪涛[36]对市面上32款调味酱的调查结果进行比较，得出海带酱属于低能量、低脂肪的食品。根据GB/T 24399-2009《黄豆酱》中要求，氨基态氮（g/100 g）≥0.50，海带酱中氨基态氮为0.76%±0.04%，与普通酱制品比较，海带酱的氨基态氮含量较高。与0 d的营养成分进行比较，除氨基态氮外，发酵10 d后其他成分均呈下降趋势，可能的原因是，黄豆中的大豆蛋白在米曲霉和黑曲霉的酶系作用下，将蛋白质分解为具有多种呈味作用的小分子多肽、氨基酸以及多种风味前体物质，显著增强海带酱的风味[37]；脂肪在发酵过程中发生水解作用生成甘油、甘油单酯、甘油二酯以及脂肪酸，能够有效增强海带酱的独特风味[38]；碳水化合中的淀粉在糖化酶与α-淀粉的作用下生成麦芽糖、葡萄糖和有机酸、酯类等物质，葡萄糖为部分微生物提供生长所需碳源，酯类物质为海带酱的提供独特的色泽与风味[39]。因此，在最佳发酵参数下，能够得到最佳品质的海带酱。
表 5 海带酱的基本营养成分Table 5. Basic nutrients of kelp sauce样品 能量（kJ/100 g） 蛋白质（g/100 g） 脂肪（g/100 g） 碳水化合物（g/100 g） 钠（mg/100 g） 氨基态氮
（%）0 d 333.00±2.00a 4.61±0.01a 2.76±0.05a 9.03±0.06a 2690.67±0.58a 0.03±0.05b 10 d 171.33±1.15b 3.22±0.04b 1.92±0.03b 5.68±0.06b 2633.00±1.00b 0.76±0.04a 注：分别比较各组不同发酵时间的基本营养成分平均数，同列相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 3. 结论
海带酱发酵的最佳工艺参数为：湿海带与湿黄豆比例为3:1，米曲霉与黑曲霉比例为2:1，盐浓度为14.5%，盐水添加量为77%，发酵温度为34 ℃，发酵时间10 d，氨基态氮值为0.76%±0.04%，与理论预测基本一致；在此条件下，对海带酱的基本营养成分进行测定，能量171.33±1.15 kJ/100 g，蛋白质3.22±0.04 g/100 g，脂肪1.92±0.03 g/100 g，碳水化合物5.68±0.06 g/100 g，钠2633.00±1.00 mg/100 g，得出海带酱属于低能量、低脂肪的食品；氨基态氮0.76%±0.04%，结果符合GB/T 24399-2009《黄豆酱》的标准。海带酱作为一款风味发酵酱，在实际生产过程中，种曲比、盐浓度、盐水添加量均会对发酵过程产生影响，这与发酵的工艺参数有重要关系。而这种核心菌群的变化与风味之间构成的关系还有待进一步研究。
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图 2 不同种曲配比的海带酱氨基态氮含量
Figure 2. Amino nitrogen content of kelp paste with different seed ratios
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图 3 盐浓度对海带酱氨基态氮含量的影响
Figure 3. Effect of salt concentration on amino nitrogen content in kelp sauce
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图 4 盐水添加量对海带酱氨基态氮含量的影响
Figure 4. Effect of salt water addition on amino nitrogen content in kelp sauce
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图 5 种曲比和盐浓度对氨基态氮含量的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of seed ratio and salt concentration to amino nitrogen content
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图 7 盐浓度和盐水添加量对氨基态氮含量的响应面图
Figure 7. Response surface diagram of salt concentration and salt water addition to amino nitrogen content
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图 6 种曲比和盐水添加量对氨基态氮含量的响应面图
Figure 6. Response surface diagram of seed ratio and salt water addition to amino nitrogen content
表 1 感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standard
评价项目 感官评分标准 得分（分） 总分（分） 色泽 深褐色或褐绿色，鲜艳，有光泽 16~20 20 深褐色或褐绿色，略有光泽 11~15 棕褐色，光泽暗淡 <10 气味 酱香、酯香浓郁，无腥味 26~30 30 酱香、酯香味较淡，有少许腥味 21~25 酱香、酯香味较淡，腥味较重 <20 滋味 鲜味醇厚，浓厚海带风味，咸甜适度 36~40 40 有鲜味，有海带风味，无异味 31~35 鲜味较差，无海带风味，有异味 <30 体态 粘稠适宜，混合均匀，有明显黄豆和海带颗粒状 9~10 10 偏稀或偏稠，混合较均匀，黄豆和海带颗粒状不明显 6~8 偏稀或偏稠，混合不均匀，无大豆和海带颗粒状 <5 
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表 2 响应面试验设计方案
Table 2 Design scheme of response surface methodology
水平 因素 A米曲霉:黑曲霉 B盐浓度（%） C盐水添加量（%） −1 1:1 10 62.5 0 2:1 14.5 75 +1 3:1 19 87.5
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表 3 海带酱发酵响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiment for kelp paste fermentation
实验号 A B C 氨基态氮（%） 1 −1 −1 0 0.65 2 1 −1 0 0.54 3 −1 1 0 0.60 4 1 1 0 0.57 5 −1 0 −1 0.62 6 1 0 −1 0.59 7 −1 0 1 0.64 8 1 0 1 0.59 9 0 −1 −1 0.69 10 0 1 −1 0.67 11 0 −1 1 0.69 12 0 1 1 0.70 13 0 0 0 0.78 14 0 0 0 0.74 15 0 0 0 0.76 16 0 0 0 0.76 17 0 0 0 0.75
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表 4 方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis
方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 回归模型 0.088197941 9 0.009799771 50.6261245 < 0.0001 A 0.00605 1 0.00605 31.25461255 0.0008 B 0.0001125 1 0.0001125 0.581180812 0.4708 C 0.0003125 1 0.0003125 1.614391144 0.2445 AB 0.0016 1 0.0016 8.265682657 0.0238 AC 0.0001 1 0.0001 0.516605166 0.4956 BC 0.000225 1 0.000225 1.162361624 0.3167 A2 0.063442368 1 0.063442368 327.7465527 < 0.0001 B2 0.008621316 1 0.008621316 44.53816275 0.0003 C2 0.002684474 1 0.002684474 13.86812973 0.0074 残差 0.001355 7 0.000193571 失拟项 0.000475 3 0.000158333 0.71969697 0.5903 纯误差 0.00088 4 0.00022 总离差 0.089552941 16 注：R2=0.9849，R2Adj=0.9654，C.V. %=2.0857%；P<0.05表示检测水平上显著；P<0.01表示检测水平上极显著。
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表 5 海带酱的基本营养成分
Table 5 Basic nutrients of kelp sauce
样品 能量（kJ/100 g） 蛋白质（g/100 g） 脂肪（g/100 g） 碳水化合物（g/100 g） 钠（mg/100 g） 氨基态氮
（%）0 d 333.00±2.00a 4.61±0.01a 2.76±0.05a 9.03±0.06a 2690.67±0.58a 0.03±0.05b 10 d 171.33±1.15b 3.22±0.04b 1.92±0.03b 5.68±0.06b 2633.00±1.00b 0.76±0.04a 注：分别比较各组不同发酵时间的基本营养成分平均数，同列相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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