Optimization of the Solid-state Fermentation Process for Morchella esculenta Fermented Wheat and Analysis of Its Nutritional Components, Physicochemical Properties and Antioxidant Activity
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摘要: 以小麦粒为原料，羊肚菌为发酵菌株，采用固态发酵工艺制备小麦羊肚菌菌粮（fungus fermented wheat，FFW）。以粗纤维含量和非淀粉多糖（NSP）含量为评价指标，料液比、基质起始pH、接种量、发酵天数为考察因素，利用正交试验优化小麦羊肚菌菌粮制备工艺，并分析菌粮的营养成分、理化性质和抗氧化活性。结果表明最佳发酵工艺为：料液比为1:0.9（g:mL）、基质起始pH为7.0、接种量为5块（直径0.8 cm的菌丝块）、发酵天数为10 d，该条件下制备的小麦羊肚菌菌粮粗纤维含量为4.09%，NSP含量为9.31%。与发酵前相比，小麦羊肚菌菌粮表面出现孔洞，沟壑增多，褶皱加深，菌粮的蛋白质含量提高了78.79%，碳水化合物含量降低了17.79%；可溶性膳食纤维SDF增加了43.70%、不可溶性膳食纤维 IDF降低了19.24%、总膳食纤维TDF在发酵前后变化不明显。发酵后菌粮的持水性、吸附不饱和脂肪酸能力、吸附饱和脂肪酸能力和溶胀性分别增加了77.84%，11.49%、25.00%、26.00%；在模拟人体胃和小肠的环境下对胆固醇吸附率分别提高了86.29%、290.14%。发酵后菌粮的总抗氧化活性、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和羟自由基清除率分别提高了41.29%、14.54%、490.68%、10.80%。该工艺制备的小麦羊肚菌菌粮可显著提升小麦的营养价值、理化性质和抗氧化活性，本研究为开发小麦羊肚菌菌粮新产品提供理论依据。Abstract: Using wheat grains as the raw material and Morchella esculenta as the fermentation strain, fungus fermented wheat (FFW) was prepared through a solid-state fermentation process. Crude fiber content and non-starch polysaccharide (NSP) content were used as evaluation indicators, while factors such as the material to liquid ratio, initial pH of the substrate, inoculum amount, and fermentation duration were investigated. An orthogonal experimental design was utilized to optimize the preparation process of FFW, and the nutritional composition, physicochemical properties and antioxidant activity were analyzed. The results showed that the optimal fermentation conditions were a material to liquid ratio of 1:0.9 (g:mL), an initial substrate pH of 7.0, an inoculum amount of 5 inoculum blocks (each with a diameter of 0.8 cm), and a fermentation duration of 10 days. Under these conditions, the crude fiber content of FFW was 4.09%, and the NSP content was 9.31%. Compared to unfermented wheat, the surface of FFW developed holes, increased grooves, and deepened wrinkles. The protein content of FFW increased by 78.79%, while the carbohydrate content decreased by 17.79%. The soluble dietary fiber (SDF) increased by 43.70%, whereas the insoluble dietary fiber (IDF) decreased by 19.24%, with no significant change in the total dietary fiber (TDF). Additionally, the water-holding capacity, unsaturated fatty acid adsorption capacity, saturated fatty acid adsorption capacity, and swelling capacity of FFW increased by 77.84%, 11.49%, 25.00%, and 26.00%, respectively. Under simulated conditions of the human stomach and intestine, the cholesterol adsorption rate increased by 86.29% and 290.14%, respectively. The total antioxidant activity, DPPH radical scavenging rate, superoxide anion radical scavenging rate, and hydroxyl radical scavenging rate of FFW increased by 41.29%, 14.54%, 490.68%, and 10.80%, respectively. In summary, FFW prepared by this process significantly enhances the nutritional value, physicochemical properties, and antioxidant activity of wheat, providing a theoretical basis for the development of new products based on FFW.
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小麦是世界上最重要的粮食作物之一，也是许多国家的主要粮食来源。在中国，小麦是三大主粮之一，2023年我国小麦总产量已达1.366亿吨[1]。全谷物小麦富含碳水化合物、蛋白质、膳食纤维等营养物质，满足了人们日常饮食的基本需求[2]。然而，随着经济不断发展，人类为了追求口感、风味、外观，将粮食精制，营养物质大量丢失，导致国民膳食纤维和微量营养素摄入不足[3−4]。大量流行病学研究表明，适量摄入全谷物食物，可有效降低肥胖症[5]、心血管疾病[6]、糖尿病[7−8]、肠道炎症[9−10] 等慢性疾病的发病风险。因此，国内外学者围绕着全谷物小麦的营养特性、加工工艺、实际应用等展开了大量研究[11]。但因为全麦食品的适口性、加工特性以及储存稳定性等方面存在一些问题，限制了全麦粉的广泛应用。
利用食用菌固态发酵小麦，不仅可以有效改善全谷物粗糙的口感，降低粗纤维含量，还能丰富其中的营养物质，保留全谷物的膳食纤维、矿物质、维生素，并且增加抗氧化活性成分[11]。而非淀粉多糖（non-starch polysaccharides，NSP）作为小麦膳食纤维的重要组成部分，具有降血脂、降血糖等多种功效。近年来，一些研究者利用食用菌固态发酵改善了小麦的营养特性与功能特性，如利用姬松茸[12]、大球盖菇[13]、棱柄马鞍菌、双孢蘑菇和嗜蓝孢孔菌[14]等食用菌，对小麦进行固态发酵，显著提升了小麦中蛋白质、氨基酸、多酚类等营养物质含量，有效提高抗氧化等活性成分含量，改良了其加工特性。尽管已有研究探讨了食用菌固态发酵小麦的某些主要营养成分或抗氧化活性，但这些研究往往只关注单一方面。总体来看，关于食用菌固态发酵小麦工艺优化和理化性质的全面研究明显不足。羊肚菌（Morchella esculenta）作为一种珍贵的食药用真菌，不仅含有丰富的氨基酸、多糖、生物酶、有机酸，还富含钙、铁、硒等多种矿物质。研究表明羊肚菌具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、抗菌、降血压和血脂等多种功效[15]。利用羊肚菌固态发酵小麦不仅能够充分挖掘小麦的内在营养价值，还能整合羊肚菌的营养特性和生物活性，从而显著提升小麦羊肚菌菌粮的营养价值。目前，国内外对羊肚菌固态发酵小麦制备菌粮的研究鲜有报道。本研究旨在建立小麦羊肚菌菌粮（fungus fermented wheat，FFW）的制作工艺，改良小麦的性质，分析小麦羊肚菌菌粮的营养成分、理化性质和抗氧化活性，为改善全谷物小麦口感、提升营养价值和丰富食用菌发酵食品提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
小麦 购于农贸市场；菌种 羊肚菌Morchella esculenta 现保存于河北师范大学应用真菌学实验室；淀粉酶、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、Tris碱、柠檬酸、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂粉等试剂 国产分析纯。
YH-M10000 型电子天平 瑞安市英恒电器有限公司；S-4800型扫描电子显微镜 日立（中国）有限公司；1510-03461 型酶标仪 赛多利斯科学仪器有限公司；Heraeus Fresco 21型离心机 赛默飞科技有限公司；JYS-M01 磨粉机 九阳股份有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；WSB-2色度仪 深圳市白鳍豚生物科技有限公司；MJ-250B5-III 霉菌培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 小麦羊肚菌菌粮制备工艺
在50 mL锥形瓶中，加入20 g小麦，加入水分调整其料液比为1:0.9（g:mL），起始pH为7，用打孔器取3片直径为0.8 cm的菌丝块，置于25 ℃恒温暗培养，10 d后菌丝长满小麦后，再暗发酵15 d，以便羊肚菌菌丝将小麦表皮的粗纤维进行更充分的分解。将锥形瓶内的发酵产物取出烘干，磨粉过40目筛。测定粗纤维含量和非淀粉多糖（NSP）含量。
1.2.1.1 单因素实验
分别考察料液比（1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1（g:mL））、起始pH（6、6.5、7、7.5、8）、接种量（直径0.8 cm的菌丝块1、2、3、4、5块）、发酵天数（5、10、15、20、25 d）对粗纤维含量和NSP含量的影响，其他过程参照1.2.1。从每个因素中选取三个试验结果较好的水平进行正交试验。
1.2.1.2 正交试验设计
在单因素实验基础上进行正交试验优化（表1）。
表 1 L9（34）正交试验因素水平Table 1. Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment水平 因素 A 料液比
（g:mL）B 基质起始pH C接种量（块） D发酵天数（d） 1 1:0.8 6.5 3 10 2 1:0.9 7.0 4 15 3 1:1.0 7.5 5 20 1.2.1.3 扫描电镜观察
取适量小麦羊肚菌菌粮于锥形瓶中，用蒸馏水冲洗除去表面可见菌丝，取20 g加入柠檬酸缓冲液（pH为4.8）200 mL，超声处理60 min，手洗去除菌丝。65 ℃烘干后，备用。分别取干燥后的菌粮和小麦，喷金120 s，10 kV电压，扫描电镜观测其表面结构。
1.2.1.4 出麸量计算
取100 g菌粮清理掉杂质，放入磨粉机磨成面粉与麸皮混合物，先过40 目筛对混合物进行筛分，使面粉落下，麸皮留在筛上，再过60 目筛进一步分离麸皮中的细面粉，确保麸皮纯净，称重，依据下面的公式计算出麸量：
出麸量(%)=麸皮重量小麦初始重量×100 1.2.2 营养成分测定
参照GB/T 5009.10-2003的方法测定小麦菌粮粉中的粗纤维含量。参考李娅等[16]的方法测定NSP含量：准确称量小麦菌粮粉0.5 g，加入热水200 mL，回流提取2 h，离心后取上清，用Sevag法脱蛋白2次，上清液中加入等体积的Tris-马来酸盐溶液（10 mmol/L），30 min后置于沸水浴10 min，冷却后加入0.8 mL淀粉酶溶液（终浓度达 15 U/mL），40 ℃保温30 min，加入4倍体积乙醇，4 ℃沉淀过夜，离心后沉淀中加入热水溶解后得到NSP溶液，采用苯酚硫酸法测定样品中NSP含量。未发酵小麦和小麦羊肚菌菌粮的营养成分测定按照如下方法：能量参照GB/Z 21922-2008 2.2.8计算得出；蛋白质含量参照GB 5009.5-2016第一法中的方法测定；脂肪含量参照GB 5009.6-2016第二法中的方法测定；碳水化合物含量测定参照GB/Z 21922-2008 2.2.3中的方法；可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维和总膳食纤维含量测定参照GB/T 5009.88-2023中的方法。
1.2.3 理化性质分析
1.2.3.1 持水性
称取1.0 g发酵前后小麦，置于15 mL离心管中，加入10 mL水，使之全部浸没，静止1 h后，在3000 r/min的条件下离心15 min，称量样品的湿重。持水性计算公式为：
持水性(g/g)=样品湿重−样品干重样品干重 1.2.3.2 持油性
参照Sangnark[17]的方法，精确称取一定量（记为W1）发酵前后小麦，按照1:8的比例加入食用油，37 ℃保温1 h，4000 r/min 离心 20 min，除去食用油并用滤纸吸干，再次称重，记为 W2。吸附不饱和脂肪酸采用花生油，吸附饱和脂肪酸将花生油替换为猪油。持油性计算公式为：
持油性(g/g)=W2−W1W1 1.2.3.3 膨胀力
分别称取1.0 g发酵前后小麦，置于量筒中，测量其体积V1，加入10 mL水，使之全部浸没，静止24 h后，记录饱胀的小麦体积V2。膨胀力计算公式为：
膨胀力(mL/g)=V2−V1样品干重 1.2.3.4 胆固醇吸附率
参考宋丽丽等[18]的方法，取新鲜鸡蛋蛋黄，加入8倍体积水，搅打成乳液，备用。精确称取1.0 g发酵前后小麦，加入50 g上述配制好的蛋黄液，搅拌均匀，将pH调为2.0（模拟胃环境）与7.0（模拟肠环境），37 ℃振荡2 h，4000 r/min离心20 min，取上清液用90%的醋酸稀释5倍，取0.1 mL该溶液，采用邻苯二甲醛作为显色剂，测定其在550 nm下吸光值，并计算胆固醇含量。胆固醇的吸附率计算公式为：
胆固醇吸附率(%)=吸附前蛋黄中胆固醇含量−吸附后上清中胆固醇含量吸附前蛋黄中胆固醇含量×100 1.2.3.5 色度测定
称取2.0 g发酵前后小麦，置于色度仪的粉末装置中挤压并测定L*、a*及b*值。
1.2.4 抗氧化活性测定
将小麦打细粉过60目筛，取1 g过筛细粉，加入10 mL蒸馏水，37 ℃超声提取45 min，4 ℃下8000 r/min离心10 min，收集上清，备用。总抗氧化活性测定，采用文献[19]的方法，所得标准曲线回归方程为Y=0.3176X−0.0045，R2=0.9977。参考顾丹丹等[20]的方法测定自由基清除率，DPPH自由基清除率：取100 μL样品，再加入100 μL DPPH（0.2 mmol/L）工作液，混匀，暗反应30 min，测定其在517 nm处的吸光值，记为A1；取100 μL样品溶液，加入100 μL无水乙醇溶液，测定其吸光值记为A2；取100 μL蒸馏水，加入100 μL DPPH溶液，测定其吸光值记为A0。超氧阴离子自由基清除率：在样品中加入100 μL Tris-HCl（50 mmol/L）缓冲液（pH8.2），25 ℃保温20 min，加入7 μL邻苯三酚（30 mmol/L）溶液，25 ℃保温6 min，加7 μL HCl（10 mol/L）溶液终止反应，测定其在325 nm处的吸光值，记为A1；用0.1 mol/L HCl溶液代替邻苯三酚溶液，吸光值记为A2；用蒸馏水代替样品溶液，吸光值记为A0。羟自由基清除率：在1 mL样品溶液中依次加入FeSO4溶液、H2O2溶液、水杨酸-乙醇溶液各1 mL，置于水浴锅中37 ℃保温1 h，取出后在510 nm波长处测定吸光值记为A1，用蒸馏水分别替代样品溶液和H2O2溶液，记为A0和A2。自由基清除率计算公式为：
自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中，A1代表样品组吸光值；A2代表本底组吸光值；A0代表空白组吸光值。
1.3 数据处理
每次实验重复3次，实验结果以“平均值±标准差”表示，采用Excel及SPSS17.0软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan检验进行显著性分析。其中，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 小麦羊肚菌菌粮制备工艺
2.1.1 料液比的筛选
小麦中水分含量对羊肚菌菌丝的代谢活动影响显著，进而影响发酵效率[21]。在料液比1:0.7~1:0.9（g:mL）时，随着料液比增加，小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量逐渐降低，NSP含量逐渐升高；在料液比1:0.9~1:1.1（g:mL）时，其粗纤维含量随料液比增大而升高，NSP含量随料液比增大降低。在料液比为1:0.9（g:mL）时，菌粮的粗纤维含量最低，为4.45%，NSP含量最高，为8.88%（图1）。在发酵过程中，小麦是羊肚菌菌丝的培养基质，水分含量偏低时，菌株生长易受抑制，菌丝生长进程受阻；水分含量过高时，过量液体会在容器底部积聚沉积，显著降低底部基质溶氧量，对该区域羊肚菌菌丝的生长及代谢活动产生抑制作用，最终影响羊肚菌菌丝对粗纤维的分解和NSP的转化。
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2.1.2 基质起始pH的筛选
基质pH可直接影响菌丝内酶的活性进而影响发酵进程。在pH为6.0~7.0时，小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量随pH升高而降低，在pH为7.0~8.0时，其粗纤维含量随pH升高而增加；在pH为6.0~8.0时，NSP含量随pH增加呈现出先升高后降低的趋势，但变化不显著（P>0.05）。当pH为7.0时（图2），菌粮的粗纤维含量达到最低值，为4.45%；NSP含量达到最高值，为8.88%，此pH条件为羊肚菌菌丝生长的最适pH[22]，在此条件下，菌丝细胞内的各种酶活性较高，对小麦中粗纤维的降解利用速度最快，NSP的转化速度最快。低于或高于此pH时，会导致羊肚菌细胞膜的稳定性受到破坏，菌丝内关键酶的活性也会受到抑制，菌丝的生长速度降低[22]，降解粗纤维的速度变慢，NSP含量也随之降低。
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图 2 基质起始pH对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响Figure 2. Effect of initial substrate pH on the contents of crude fiber and NSP in FFW2.1.3 接种量的筛选
适宜接种量可快速启动发酵过程并提高产物产量，但接种量过高会引发菌种激烈竞争，致使产量降低，还可能影响发酵过程的稳定性[23]。随着接种量的增加，小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量先逐渐降低后趋于平稳；而NSP含量则是先上升随后同样趋于平稳。接种量低于3块时，由于接种量少，菌丝总量不足，导致菌丝对粗纤维的分解能力弱，NSP的转化速度慢；接种量为3块时，菌粮中的粗纤维含量最低（4.45%），NSP含量最大（8.88%），此时菌丝的接种量比较适宜，菌丝量能够满足其快速生长需求，因而分解粗纤维及转化 NSP 速度最快。接种量超过3块后，粗纤维与NSP含量变化均不明显、趋于平稳（图3），这是由于过高接种量使小麦基质营养无法满足菌丝快速生长的需求，菌丝间竞争养分，导致其分解粗纤维与转化NSP的能力不再提升[23]。
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图 3 接种量对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响Figure 3. Effect of inoculation amount on the contents of crude fiber and NSP in FFW2.1.4 发酵天数的筛选
发酵时间对菌体生长代谢的影响显著[24]，在发酵5~15 d时，随着发酵天数的增加，小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量逐渐降低，NSP含量逐渐增加后趋于平缓，在发酵15~25 d时，随着发酵天数的增加，菌粮的粗纤维含量逐渐增加，NSP含量逐渐降低。在发酵天数为15 d时，菌粮中的粗纤维含量最低，为4.45%，在菌丝长满培养基后发酵天数为20 d时，NSP含量最高，为8.94%（图4）。在发酵初期（低于10 d），随着发酵时间增加，菌丝生长速度逐渐加快，对粗纤维的分解和NSP转化能力逐渐增强；随着发酵时间继续增加（10~20 d），菌丝对粗纤维的分解能力和NSP的转化能力达到最大值，当发酵时间过长（超过20 d），菌丝加速老化，生长变慢，且因老化菌丝积累，发酵产物中粗纤维含量开始增加，NSP 的含量则会随之降低。
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图 4 发酵天数对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响Figure 4. Effect of fermentation duration on the contents of crude fiber and NSP in FFW2.1.5 正交试验结果
不同正交试验组中小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量和NSP含量差异明显。通过表2的R极差分析，粗纤维含量的影响因素由弱到强为接种量（C）<基质起始pH（B）<菌丝长满培养基后发酵天数（D）<料液比（A），NSP含量的影响因素由弱到强为基质起始pH（B）=接种量（C）<菌丝长满培养基后发酵天数（D）<料液比（A），说明小麦羊肚菌菌粮的NSP含量和粗纤维含量受料液比影响最大，其次是菌丝长满培养基后发酵天数，受接种量的影响最小。k值分析结果表明，菌粮最佳制备工艺为A2B2C3D3，在此条件下，其粗纤维含量为4.85%，NSP含量为8.94%。正交试验直观分析结果表明，菌粮最佳制备工艺为A2B2C3D1，在此条件下，其粗纤维含量为4.09%，NSP含量为9.31%（表2）。分别对k值和直观分析结果确定的两种菌粮制备工艺开展验证试验，三次平行试验结果显示，k值分析确定的最佳工艺条件下粗纤维含量为4.92%±0.13%，NSP含量为8.85%±0.04%，直观分析结果确定最佳工艺条件下粗纤维含量为4.05%±0.12%，NSP含量为9.27%±0.21%，两种工艺得到的结果差异显著（P<0.05），表明直观分析结果确定的最佳工艺条件为小麦羊肚菌菌粮的最佳制备工艺，具体工艺为：料液比为1:0.9（g:mL）、基质起始pH为7.0、接种量为5块、菌丝长满培养基后发酵天数为10 d（表2）。固态发酵经工艺优化可显著提高营养成分、活性成分的含量[24−25]，本实验侧重于固态发酵对全谷物小麦外皮的降解，优化全谷物小麦产品的口感，并提高了其NSP的含量。
表 2 小麦羊肚菌菌粮发酵工艺正交试验结果Table 2. Orthogonal experiment results of the fermentation process of FFW试验号 A B C D 粗纤维含量（%） NSP含量（%） 1 1 1 1 1 5.97±0.27c 8.32±0.25h 2 1 2 2 2 5.30±0.39e 8.60±0.13f 3 1 3 3 3 4.88±0.33g 8.93±0.28c 4 2 1 2 3 4.21±0.07h 9.28±0.26b 5 2 2 3 1 4.09±0.04i 9.31±0.15a 6 2 3 1 2 5.78±0.20d 8.70±0.18e 7 3 1 3 2 6.49±0.34a 8.38±0.10g 8 3 2 1 3 5.21±0.24f 8.82±0.23d 9 3 3 2 1 6.11±0.01b 8.39±0.11g k1（粗纤维含量） 5.39 5.56 5.65 5.39 k2（粗纤维含量） 4.7 4.87 5.21 5.85 k3（粗纤维含量） 5.94 5.59 5.15 4.76 R（粗纤维含量） 1.24 0.72 0.5 1.09 k1（NSP含量） 8.62 8.66 8.61 8.67 k2（NSP含量） 9.1 8.91 8.76 8.56 k3（NSP含量） 8.53 8.67 8.86 9.01 R（NSP含量） 0.57 0.25 0.25 0.45 注：同一指标不同字母表示有显著差异（P<0.05）。 2.1.6 小麦羊肚菌菌粮表皮微观结构
多项研究表明麦麸或秸秆经真菌发酵后，表面结构的致密性会遭到破坏，表明真菌具有降解纤维素的能力[26−27]。对比羊肚菌发酵前后小麦表皮的显微结构可知，未发酵小麦表皮可见天然流畅的致密结构，无孔洞，经过小麦羊肚菌菌粮表面致密结构均遭到破坏，且表皮出现了孔洞，小麦表皮的褶皱与沟壑增多，破碎化程度显著增大（图5）。多孔结构的出现主要是由于菌丝生长，蔓延至基质的细胞壁下，出现了沟槽和孔洞，利于逐步分解纤维素、半纤维素等物质[28]，说明羊肚菌菌丝对小麦麸皮中纤维素具有较强的降解能力。
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图 5 小麦和小麦羊肚菌菌粮扫描电镜显微结构注：a：发酵前小麦；b：羊肚菌菌丝长满培养基后发酵15 d的小麦表皮；圆圈指示孔洞、箭头指示褶皱。Figure 5. Scanning electron microscopy (SEM) microstructure of wheat and FFW2.1.7 小麦羊肚菌菌粮的形态
经过羊肚菌发酵的小麦表面包被有洁白、浓密的菌丝，烘干后颜色变微黄，与高温高压处理的小麦相比，羊肚菌发酵小麦粉的色度较暗。破碎1 min后，未发酵小麦存在明显的麸皮物质，出麦麸量为13.2%，相同破碎时间下羊肚菌发酵小麦出麦麸量为7.4%，粉质更为细腻（图6）。小麦羊肚菌菌粮的制备已经实现放大，由50 mL的锥形瓶筛选发酵条件，再到600 mL的发酵瓶重复培养，升级到1000 mL的培养袋进行固态发酵，为工厂化生产提供了依据。经过羊肚菌发酵的小麦更容易被破碎成细粉，粉碎后含麸质较少，过筛后制备成为粉质细腻、颜色均一、独具风味的菌粮粉。目前，多数小麦菌粮是通过在小麦中添加食用菌子实体来提升其营养价值与附加值[29]。但羊肚菌子实体价格颇高，若将羊肚菌干品粉碎成粉添加到小麦粉中制备菌粮，成品价格必然较高。而利用羊肚菌菌丝固态发酵小麦可降低成本，从加工成本和产品附加值综合来看，小麦羊肚菌菌粮有良好的经济价值。
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图 6 羊肚菌固态发酵前后小麦形态的变化Figure 6. Morphological changes of wheat after solid-state fermentation with Morchella esculenta2.2 小麦羊肚菌菌粮营养成分、理化性质及抗氧化活性分析
2.2.1 小麦羊肚菌菌粮营养成分分析
小麦羊肚菌菌粮中脂肪和碳水化合物含量低于未发酵小麦，蛋白质高于未发酵小麦，菌粮中的蛋白质含量提高了78.79%，脂肪和碳水化合物含量分别降低了50.00%和17.79%，能量变化不显著（P>0.05）（表3）。可能是由于在发酵过程中羊肚菌重新合成了新的蛋白质分子，使得菌粮中的蛋白质含量提高，而碳水化合物是羊肚菌生长的主要碳源，在发酵过程中由于羊肚菌不断分解利用小麦中的碳水化合物，使其在发酵后显著降低[30−31]（P<0.05）。研究发现食用菌固态发酵可使小麦、玉米等谷物中蛋白质等营养成分含量增加，如刘明明等[30]利用香菇和猴头菇发酵的小麦菌质蛋白质含量可分别提高至16%和12%，刘红艳等[31]制备的双孢蘑菇固态发酵玉米产物的粗蛋白含量增加了10.67%，总糖含量降低了12.46%，与本研究中羊肚菌发酵小麦的营养成分变化基本类似。
表 3 小麦羊肚菌菌粮的营养成分Table 3. Nutritional components of FFW经过羊肚菌发酵后的菌粮中SDF增加了43.70%、IDF降低了19.24%、TDF在发酵前后变化不明显（表3）。发酵后SDF含量的升高可能是因为羊肚菌代谢分泌的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶等，使部分不溶性膳食纤维降解转化为可溶性膳食纤维[32]。
2.2.2 小麦羊肚菌菌粮理化性质分析
与发酵前的小麦相比，经羊肚菌发酵后的小麦菌粮的持水性、持油性和膨胀力显著增加（P<0.05），表现为持水性、吸附不饱和脂肪酸、吸附饱和脂肪酸、膨胀力分别增加了77.84%，11.49%、25.00%、26.00%（表4）。小麦经发酵后，细胞壁结构被降解，呈现出疏松多孔的状态，孔隙的明显增多使得其与水和油的接触面积增大[33]。一方面，IDF具有较强的吸水能力，含量增加后能让小麦吸附更多水分；另一方面，发酵促使交联的蛋白质大分子发生降解，这有利于亲水基团等功能性官能团的暴露，进而提升了蛋白质的溶胀程度以及截留水分子的能力 [34]。持油性的增加可能源于发酵产生的松散结构，或者是某些增加的SDF对脂质物质具有很强的亲和力 [33]，这一变化有利于高脂肪产品的加工。
表 4 小麦羊肚菌菌粮的理化性质Table 4. Physicochemical properties of FFW样品名称 持水性
（g/g）持油性（g/g） 膨胀力
（mL/g）胆固醇吸附率（%） 色度 吸附不饱和脂肪酸 吸附饱和脂肪酸 pH=2.0 pH=7.0 亮度（L*） 红度（a*） 黄度（b*） 发酵前小麦 1.58±0.24b 0.87±0.04b 0.96±0.07b 0.50±0.02b 2.99±0.06b 4.87±0.06b 74.36±0.81a −5.49±0.41b 24.91±1.21b 菌粮（FFW） 2.81±0.11a 0.97±0.06a 1.2±0.13a 0.63±0.03a 5.57±0.27a 19.00±0.19a 71.20±0.41b −2.38±0.05a 33.72±0.07a 在模拟胃（pH2）和小肠（pH7）的环境条件下，小麦羊肚菌菌粮对胆固醇的吸附率均高于未发酵小麦，分别提高了86.29%、290.14%（表4）。在模拟人体环境下对胆固醇吸附率大大增加，由于发酵使全谷物小麦原本的大纤维断裂，转变为细小纤维，发酵后的粗纤维致密性大大降低，比表面积增加，使得发酵后小麦对胆固醇的吸附能力显著增加（P<0.05）[35]。
经过羊肚菌发酵后的小麦菌粮，亮度（L*）显著性降低（P<0.05），红度（a*）、黄度（b*）显著增加（P<0.05），说明菌丝发酵会改变小麦的颜色，使得菌粮的整体色泽变暗变深（表4），而且羊肚菌菌丝呈淡黄色或棕褐色[36]，由于羊肚菌菌丝自身所包含的色素成分，使得经过发酵后的小麦在红度和黄度这两个指标上均显著增加（P<0.05）。
2.2.3 小麦羊肚菌菌粮抗氧化活性分析
小麦羊肚菌菌粮的总抗氧化活性、DPPH自由基清除率、超氧阴离子（O2-）自由基清除率、羟自由基清除率均高于未发酵小麦，分别提高了41.29%、14.54%、490.68%、10.8%（表5），尤其是超氧阴离子自由基清除率比发酵前增加了接近5倍，说明通过羊肚菌菌丝的固态发酵，提升了小麦的体外抗氧化活性。研究表明经食用菌发酵后的谷物，抗氧化活性可显著高于未发酵谷物，仲雪开发的猴头菇、香菇发酵玉米粉的抗氧化活性均高于未发酵玉米粉[37]，本实验开发的小麦羊肚菌菌粮的水提物抗氧化活性显著增高，与其他研究者的结果一致，原因可能是通过菌丝发酵提升了产物中的活性多肽、总酚或黄酮含量[38−39]，进而导致发酵后小麦的抗氧化活性增强，具体机制有待进一步研究。
表 5 小麦羊肚菌菌粮的体外抗氧化活性Table 5. In vitro antioxidant activity of FFW样品名称 总抗氧化活性（μmol/mL） DPPH自由基清除率（%） O2−自由基清除率（%） 羟自由基清除率（%） 发酵前小麦 22.21±0.35b 66.22±4.46b 10.84±2.66b 85.88±2.35b 菌粮（FFW） 31.38±0.22a 75.85±2.93a 64.03±4.46a 94.79±0.94a 羊肚菌和小麦都含多种风味物质[40−41]，如酯类、芳香类、脂肪烃类等，添加羊肚菌粉能让小麦粉制作的面包风味更丰富[29]。本文中小麦羊肚菌菌粮是利用羊肚菌菌丝发酵对小麦进行改良的产物，该菌粮在营养成分、理化性质、抗氧化活性方面均优于未发酵小麦，尤其是其超氧阴离子自由基清除率比发酵前提高近5倍（表5），是何种生物活性成分变化导致抗氧化活性增强，菌粮风味物质相较未发酵小麦有何变化、是否产生特有风味物质等，都需深入全面研究以获得准确科学的结论。
3. 结论
本文通过单因素实验和正交试验，确定了小麦羊肚菌菌粮的最佳制备工艺为：料液比为1:0.9（g:mL）、基质起始pH为7.0、接种量为5块（直径0.8 cm的菌丝块）、菌丝长满培养基后发酵天数为10 d，该条件下小麦羊肚菌菌粮的粗纤维含量为4.09%，NSP含量为9.31%，经过羊肚菌发酵的小麦菌粮表皮出现孔洞，褶皱与沟壑增多，致密结构遭到破坏。与发酵前相比，小麦羊肚菌菌粮营养成分、可溶性膳食纤维显著提升；持水性、持油性与膨胀力增强，在体外模拟条件下对胆固醇的吸附率显著提高；体外抗氧化活性显著增加。小麦羊肚菌菌粮更容易被破碎成细粉，粉碎后含麸质较少，过筛后可制备成为粉质细腻、颜色均一、独具风味的菌粮粉。本研究通过对发酵工艺的优化，提升了全谷物的营养价值，有助于进一步开发菌粮产品，提升经济效益。
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图 2 基质起始pH对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响
Figure 2. Effect of initial substrate pH on the contents of crude fiber and NSP in FFW
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图 3 接种量对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响
Figure 3. Effect of inoculation amount on the contents of crude fiber and NSP in FFW
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图 4 发酵天数对小麦羊肚菌菌粮粗纤维和NSP含量的影响
Figure 4. Effect of fermentation duration on the contents of crude fiber and NSP in FFW
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图 5 小麦和小麦羊肚菌菌粮扫描电镜显微结构
注：a：发酵前小麦；b：羊肚菌菌丝长满培养基后发酵15 d的小麦表皮；圆圈指示孔洞、箭头指示褶皱。
Figure 5. Scanning electron microscopy (SEM) microstructure of wheat and FFW
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图 6 羊肚菌固态发酵前后小麦形态的变化
Figure 6. Morphological changes of wheat after solid-state fermentation with Morchella esculenta
表 1 L9（34）正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment
水平 因素 A 料液比
（g:mL）B 基质起始pH C接种量（块） D发酵天数（d） 1 1:0.8 6.5 3 10 2 1:0.9 7.0 4 15 3 1:1.0 7.5 5 20 
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表 2 小麦羊肚菌菌粮发酵工艺正交试验结果
Table 2 Orthogonal experiment results of the fermentation process of FFW
试验号 A B C D 粗纤维含量（%） NSP含量（%） 1 1 1 1 1 5.97±0.27c 8.32±0.25h 2 1 2 2 2 5.30±0.39e 8.60±0.13f 3 1 3 3 3 4.88±0.33g 8.93±0.28c 4 2 1 2 3 4.21±0.07h 9.28±0.26b 5 2 2 3 1 4.09±0.04i 9.31±0.15a 6 2 3 1 2 5.78±0.20d 8.70±0.18e 7 3 1 3 2 6.49±0.34a 8.38±0.10g 8 3 2 1 3 5.21±0.24f 8.82±0.23d 9 3 3 2 1 6.11±0.01b 8.39±0.11g k1（粗纤维含量） 5.39 5.56 5.65 5.39 k2（粗纤维含量） 4.7 4.87 5.21 5.85 k3（粗纤维含量） 5.94 5.59 5.15 4.76 R（粗纤维含量） 1.24 0.72 0.5 1.09 k1（NSP含量） 8.62 8.66 8.61 8.67 k2（NSP含量） 9.1 8.91 8.76 8.56 k3（NSP含量） 8.53 8.67 8.86 9.01 R（NSP含量） 0.57 0.25 0.25 0.45 注：同一指标不同字母表示有显著差异（P<0.05）。
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表 4 小麦羊肚菌菌粮的理化性质
Table 4 Physicochemical properties of FFW
样品名称 持水性
（g/g）持油性（g/g） 膨胀力
（mL/g）胆固醇吸附率（%） 色度 吸附不饱和脂肪酸 吸附饱和脂肪酸 pH=2.0 pH=7.0 亮度（L*） 红度（a*） 黄度（b*） 发酵前小麦 1.58±0.24b 0.87±0.04b 0.96±0.07b 0.50±0.02b 2.99±0.06b 4.87±0.06b 74.36±0.81a −5.49±0.41b 24.91±1.21b 菌粮（FFW） 2.81±0.11a 0.97±0.06a 1.2±0.13a 0.63±0.03a 5.57±0.27a 19.00±0.19a 71.20±0.41b −2.38±0.05a 33.72±0.07a
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表 5 小麦羊肚菌菌粮的体外抗氧化活性
Table 5 In vitro antioxidant activity of FFW
样品名称 总抗氧化活性（μmol/mL） DPPH自由基清除率（%） O2−自由基清除率（%） 羟自由基清除率（%） 发酵前小麦 22.21±0.35b 66.22±4.46b 10.84±2.66b 85.88±2.35b 菌粮（FFW） 31.38±0.22a 75.85±2.93a 64.03±4.46a 94.79±0.94a
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