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中国精品科技期刊2020

乳酸对地衣芽孢杆菌HK高密度发酵的影响

赵艳梅, 鲁佳康, 史玥玡, 王彦婷, 黄亚男, 陈雄, 王志

赵艳梅,鲁佳康,史玥玡,等. 乳酸对地衣芽孢杆菌HK高密度发酵的影响[J]. 食品工业科技,2025,46(7):151−160. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050140.
引用本文: 赵艳梅,鲁佳康,史玥玡,等. 乳酸对地衣芽孢杆菌HK高密度发酵的影响[J]. 食品工业科技,2025,46(7):151−160. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050140.
ZHAO Yanmei, LU Jiakang, SHI Yueya, et al. Influences of Lactate on the High-density Fermentation by Bacillus licheniformis HK[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(7): 151−160. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050140.
Citation: ZHAO Yanmei, LU Jiakang, SHI Yueya, et al. Influences of Lactate on the High-density Fermentation by Bacillus licheniformis HK[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(7): 151−160. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050140.

乳酸对地衣芽孢杆菌HK高密度发酵的影响

基金项目: 湖北省教育厅优秀中青年科技创新团队项目(T2022011)。
详细信息
    作者简介:

    赵艳梅(1997−),女,硕士研究生,研究方向:发酵工程,E-mail:2033998390@qq.com

    通讯作者:

    王志(1971−),男,博士,教授,研究方向:发酵工程,E-mail:wangzhi@hbut.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.3

Influences of Lactate on the High-density Fermentation by Bacillus licheniformis HK

  • 摘要: 为了提高地衣芽孢杆菌HK(Bacillus licheniformis HK)的生物量和芽孢率,在20 L罐水平考察了发酵16~32 h耦合pH7.0流加乳酸(终浓度2.0%)对其生长代谢及产孢的影响,并基于转录组与代谢组差异分析了乳酸的代谢调控机制。结果表明:乳酸补料组的峰值生物量(30 h)为5.43×1010 CFU/mL,较对照(基础发酵组)提高54.3%;芽孢数为5.36×1010 CFU/mL,较对照提高60.0%。乳酸补料组的糖异生和磷酸戊糖途径关键基因ldhpckAgapBzwftkt较对照上调2.8~9.3倍;同时,其标志代谢物丙酮酸、6-磷酸果糖、1,3-二磷酸甘油酸、6-磷酸葡萄糖酸、5-磷酸-核酮糖、7-磷酸景天庚酮糖的丰度较对照增加1.55~12.6倍。TCA循环和氧化磷酸化关键基因citZicdcitBodhBatpABndhyumBqcrABCctaODCythAsdhAB表达较对照下调34.2%~96.8%,而硝酸盐呼吸代谢基因nasBCD较对照上调107.4~287.3倍。与之相应的胞内关键代谢物顺乌头酸、异柠檬酸和柠檬酸丰度较对照降低52.6%~62.5%,而NAD+、NADH丰度较对照增加1.6和2.7倍。同时,磷壁酸的前体3-磷酸甘油、肽聚糖的前体UDP-N-乙酰胞壁酸和UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-谷氨酸的丰度较对照提高了1.5~14倍;而且,芽孢生成相关基因phrACcotPcotAyeekyheDtasAgerQyuzJ的表达较对照上调1.4~5.7倍,而rapABabrByisIynzDspo0E较对照下调60.7%~96.7%。说明乳酸增强了糖异生、磷酸戊糖途径、硝酸盐呼吸、细胞壁合成,从而促进了细胞生长及芽孢的生成效率。本文结果为地衣芽孢杆菌高密度发酵生产提供了理论支撑。
    Abstract: To improve the biomass and spore rate of Bacillus licheniformis HK, influences of lactate on cell growth and metabolism and spore production were investigated at a 20 L bioreactor, and lactate addition was conducted by coupling with pH7.0 from 16 h to 32 h. Basing on the data differences in transcriptome and metabolome, the metabolic regulation mechanism of lactate was analyzed. The results showed that a peak biomass (30 h) of 5.43×1010 CFU/mL was obtained in lactate supplement group, which was 54.3% higher than that of basic fermentation group (control). Meanwhile, the spore number was 5.36×1010 CFU/mL, which was 60.0% higher than the control. Compared with the control, expressions of key genes in gluconeogenesis and pentose phosphate pathway (ldh, pckA, gapB, zwf, and tkt) were up-regulated by 2.8~9.3 fold in the lactate supplement group, the abundance of marker metabolites (pyruvate, fructose-6-phosphate, glyceric acid-1,3-diphosphate, 6-phosphate-gluconate, 5-phosphate-ribulose, and sedoheptulose 7-phosphate) in the pathways were increased by 1.55~12.6 fold compared with the control. Additionally, expressions of key genes in TCA cycle and oxidative phosphorylation system (citZ, icd, citB, odhB, atpAB, ndh, yumB, qcrABC, ctaODC, ythA, and sdhAB) were down-regulated by 34.2%~96.8%, while nitrate respiration metabolism gene (nasBCD) was up-regulated by 107.4~287.3 fold compared with the control. Abundances of corresponding key metabolites, such as aconitate, isocitrate and citrate, were decreased by 52.6%~62.5%, while the abundances of NAD+ and NADH were increased by 1.6~2.7 fold. Meanwhile, the precursors abundances of teichoic acid (glycerol-3-phosphate) and peptidoglycan (UDP-N-acetylmuramic acid, UDP-N-acetylmuramyl-L-alanine-D-glutamate) were increased by 1.5~14 fold compared with the control. Moreover, gene expressions involved in sporogenesis, such as phrAC, cotP, cotA, yeek, yheD, tasA, gerQ, yuzJ, were up-regulated by 1.4~5.7 fold, while rapAB, abrB, yisI, ynzD, and spo0E were down-regulated by 60.7%~96.7% compared with the control. The results suggested that lactate promoted gluconeogenesis, pentose phosphate pathway, nitrate respiration, and cell wall synthesis, thus promoting cell growth and spore formation efficiency. The results provided theoretical supports for high-density fermentation production of Bacillus licheniformis.
  • 地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌在亲缘关系和发酵特性上十分接近,其生长代谢过程中分泌淀粉酶[1]、蛋白酶[2]、维生素、氨基酸、促生长因子等有益物质,具有耐高温[3]、抗胁迫[4]、安全性高[5]的特点,被广泛应用于医药、发酵食品、微生态等领域[69],如:作为益生菌制剂维持动物肠道菌群平衡,保护肠道健康。而地衣芽孢杆菌的高密度培养技术是实现工业化应用的重要步骤,目前,选择和优化发酵培养基、控制发酵过程、调控代谢途径及补料策略是高密度培养的常用方法。杨旭等[10]使用优化发酵培养基(3%玉米淀粉、2.5%酵母粉等)摇瓶发酵48 h,细胞数达到1.62×1010 CFU/mL,芽孢率为70%。魏强等[11]采用正交优化的发酵培养基及条件培养地衣芽孢杆菌,22 h芽孢数达2.02×1010 CFU/mL。丁跃等[12]耦合pH流加柠檬酸培养地衣芽孢杆菌M52(3.5%玉米淀粉,4%豆粕),36 h芽孢数达到4.1×1010 CFU/mL。提高芽孢杆菌生长效率和芽孢率,降低生产成本是工业生产的核心问题,因而研究地衣芽孢杆菌HK生长及产孢特征、确认过程瓶颈、建立补料新技术对生产芽孢杆菌益生菌制剂具有积极意义和价值。

    能量的有效供应是芽孢杆菌高密度发酵过程中生长的必要条件。发酵中后期细胞通过系列复杂的代谢调控来维持生长,如:碳分解代谢物阻遏蛋白CcpA的靶基因脱阻遏表达,如:TCA循环citZ[13]、氧化磷酸化途径cydA[14]、溢流代谢分子利用基因ackA[15]、乙偶姻利用基因acuAB[16]。同时,糖异生途径被激活,如:丙酮酸由PycA-PckA次序催化[17]代谢进入糖异生途径和HMP途径。另外,溶氧不足引发的兼性厌氧状态激活硝酸盐呼吸操纵子narGHIJ、亚硝酸盐还原酶操纵子nasBCD,使细胞通过厌氧呼吸维持产能和细胞生长[1819]。就产孢而言,Spo0A的含量及其磷酸化水平发挥着重要作用,其中涉及到磷酸酶yisIynzDspo0E(水解Spo0A~P的磷酸根)[20];此外,调控子AbrB间接阻遏spo0A的转录,abrB表达受到阻遏后,spo0A转录增强进而促进芽孢生成[21]

    菌株HK摇瓶发酵显示存在乳酸利用现象(文献中未显示),乳酸作为储备能源可经丙酮酸进入糖异生途径参与细胞代谢[2223],但其在地衣芽孢杆菌高密度发酵中的调控作用尚未见报道。因此,本文在20 L罐水平研究了耦合pH7.0流加乳酸对地衣芽孢杆菌HK生长和芽孢生成的影响,并基于转录组与代谢组分析了乳酸代谢在糖异生、能量代谢、细胞壁组分合成、芽孢生成等关键生物学过程中的潜在作用及其机制,为地衣芽孢杆菌高芽胞密度发酵提供理论和技术支撑。

    地衣芽孢杆菌HK(Bacillus licheniformis HK) 实验室保藏;玉米淀粉、豆粕、玉米浆、乳酸 国药集团化学试剂有限公司;泡敌 佛山南海大田化学有限公司;甲醇、乙腈、甲酸、丙醇 色谱纯,Fisher公司;其他实验试剂均为国产分析纯。

    BIOTECH-20JS发酵罐 上海保兴生物公司;SPX-150D型恒温生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司;CJ-2D型无菌操作台 天津市泰斯特仪器有限公司;高压蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;S-10 生物传感分析仪 上海惠诚生物科技有限公司;Vanquish Horizon system型UHPLC液相色谱系统、Q-Exactive HF-X型质谱仪 、LSTAR1116型pH计 赛默飞世尔科技有限公司;VORTEX2型漩涡振荡器 艾卡生物科技有限公司。

    种子培养基、CFU计数培养基(g/L):Tryptone 10,酵母浸粉5,NaCl 10,琼脂粉 20,调pH7.0,121 ℃,灭菌20 min。

    发酵培养基(g/L):玉米淀粉40、豆粕60、葡萄糖15、玉米浆10、CaCO3 2.0、MgSO4·7H2O 0.3、K2HPO4·3H2O 0.7、MnSO4·H2O 0.2、泡敌6,121 ℃,灭菌30 min。

    乳酸母液:20%的乳酸溶液,115 ℃,20 min灭菌。

    地衣芽孢杆菌HK从−80 ℃甘油管吸取20 μL转接到LB琼脂培养基平板,37 ℃培养12 h。挑适量菌苔转接至PA瓶(装量5 mL的LB培养基),37 ℃、230 r/min培养12 h。吸取3 mL接种至100 mL的LB培养基(250 mL摇瓶),37 ℃、230 r/min培养8 h,后合瓶获得种子液备用。

    20 L发酵罐培养基灭菌后体积为10 L,按10%的接种量将液体种子接种罐内。搅拌转速500 r/min、通气量1.6 m3/h、罐压0.035 MPa,温度37 ℃,发酵12 h后转速700 r/min,通气量2.0 m3/h。

    基础发酵(对照组,ck组):发酵培养过程的pH自然。16~32 h流加1.0 L无菌水,发酵液中的溶解氧(DO)变化基本特征为:发酵8 h时DO降为0,13 h后DO回升,至发酵结束为80%(19 h的DO为40%)。

    乳酸补料发酵(实验组,Lac组):16~32 h耦合pH7.0流加乳酸(pH大于7.0自动补料启动,补入1.0 L乳酸母液,终浓度为2%)。补料过程DO变化特征为:发酵7 h的DO降至0,12 h后DO回升,至19 h达到20.5%后下降,21 h至发酵结束(32 h)DO维持0。

    梅特勒pH电极连接于发酵罐pH信号线,采用pH6.86和pH4.01标准缓冲液标定pH电极。发酵控制程序控制pH电极在线测定pH。

    梅特勒溶解氧电极(DO电极)连接于发酵罐DO电极信号线,121 ℃、30 min保压过程中标定培养基的溶氧为0;发酵0 h时(转速500 r/min、通气量1.6 m3/h、罐压0.035 MPa的条件)培养基的溶氧标定为100%。发酵控制程序控制DO电极在线测定DO值。

    生物量(CFU/mL):采用稀释涂布平板法[24]测定。

    芽孢数:适当稀释后的菌液80 ℃水浴10 min,后进行平板涂布,37 ℃培养24 h计数。芽孢率按公式(1)计算:

    (%)=×100 (1)

    发酵样品(−20 ℃保存)经12000 r/min离心5 min,上清液适当稀释后,准确吸取25 μL稀释液进样。测定样品前用标准品溶液进行三次标定[25]

    对照组19 h生物量达到峰值后自溶,此时葡萄糖浓度为1.2 g/L。乳酸补料组19 h细胞数与对照接近,但对数生长期维持到30 h。因而发酵21 h时的细胞代谢差异可以反映乳酸代谢的影响,取对照组(ck组,补同体积无菌)和乳酸补料发酵(Lac组)21 h的发酵样进行转录组分析。

    取样具体流程如下:取20~30 mL发酵液至无菌的50 mL离心管中,全程放置在冰盒上操作,另配制相同重量50 mL离心管配平放置冷冻离心机中4 ℃、1500 r/min离心5 min,转移至超净工作台中,取上清转移至新的50 mL无菌离心管中,目的为初步除去浊液培养基里的不溶物质(豆粕等),配平后4 ℃、2500 r/min离心5 min,再次离去不溶性杂质。吸取上层发酵液1 mL,转移至1.5 mL的EP管中(制备15个),配平4 ℃、12000 r/min离心2 min。此时EP管内分三层,上层清液弃置,中层杂质用200 μL枪头吸取4 ℃无菌生理盐水轻柔吹打后弃置,留最下层菌体沉淀。将收集到的菌体沉淀放入液氮中速冻后,菌体保存于−80 ℃冰箱中待转录组测定,每个样品三个生物学重复。

    测序数据的质控、转录组测序、基因注释与表达量差异分析均由美吉生物科技有限公司完成。流程如下:Illumina Hiseq二代高通量测序平台测序得到的原始图像经处理得到FASTQ格式的原始数据;对原始测序数据质控得到高质量序列;通过软件Bowtie与指定参考基因组进行比对,基于Burrows-Wheeler方法获得用于后续分析的Mapped data;对提供的参考基因组进行功能注释,基于蛋白序列与五大数据库(NR库、swiss-prot库、Pfam库、COG数据库、GO数据库)进行比对,得到功能注释信息,综合五大数据库的注释结果,选择最佳的基因数据库进行分析。

    转录表达定量分析TPM值按照公式(2)[26]计算;差异倍数按公式(3)计算:

    TPM=R×106(R1L1+R2L2++RnLn)×L (2)
    FC=TPM(Lactate)TPM(ck) (3)

    式中:R和L,需计算基因的read counts和基因长度,Ri和Li(i=1,2…,n),样品中第i个基因的read counts和基因长度。

    最后对差异表达基因使用KOBAS进行KEGG富集分析,以确定差异基因行使的生物学功能。

    进行代谢组分析的样品及其制备方法同上述转录组。LC-MS/MS对试验样本的检测,代谢物的鉴定与差异分析均由美吉生物科技有限公司完成。

    具体流程如下:样品上机完成后,采用Progenesis QI软件对色谱峰进行分析,同时将一级与二级的质谱信息与代谢公共数据库进行匹配,得到代谢物信息。其次,以正交偏最小二乘法的VIP>1.0、差异倍数FC>1.5且P<0.05为条件筛选出差异代谢物。最后使用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路注释及分析。

    色谱条件:2 μL样本经 HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 µm)分离后进入质谱检测。流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸),流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)。分离梯度:0~0.1 min,流动相B从线性0升至5%;0.1~2 min,流动相B从线性5%升至 25%;2~9 min,流动相B线性从25%升至100%;9~13 min,流动相B维持100%;13.0~13.1 min,流动相B线性从100%降至0;13.1~16 min,流动相B维持0。流速为0.40 mL/min,柱温为40 ℃。

    质谱条件:样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式,质量扫描范围m/z:70~1050。离子喷雾电压,正离子电压3500 V,负离子电压2800 V,鞘气40 psi,辅助加热气10 psi,离子源加热温度400 ℃,20-40-60 V循环碰撞能,MS1分辨率70000,MS2分辨率17500。

    每组实验都进行3次平行实验,数据以平均值±标准差表示。通过Origin 9.0和SPSS 23.0进行作图以及数据处理分析,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

    地衣芽孢杆菌HK发酵生长和芽孢形成特征如图1(对照组)所示:15 h时pH为6.97,后持续回升,至27 h为8.41,后发酵结束。对数期生物量由17 h的2.01×1010 CFU/mL对数生长至19 h达到峰值(3.52×1010 CFU/mL);同时芽孢数由17 h的1.87×1010 CFU/mL提高至19 h的3.35×1010 CFU/mL,芽孢率高达95.2%,达到高密度发酵水平。19~22 h,生物量及芽孢数分别由各自峰值快速下降至2.14×1010 CFU/mL和1.85×1010 CFU/mL,分别下降了39.2%和44.8%,而且19 h后葡萄糖、乳酸等碳源基本耗尽,这也会限制细胞的生长或芽孢形成的效率。22 h后细胞二次生长至27 h的2.83×1010 CFU/mL,芽孢数为2.79×1010 CFU/mL,此时葡萄糖和乳酸浓度为1.8 g/L和0.1 g/L。说明细胞在碳限制状态利用培养基中丰富的氮源来二次生长。

    图  1  菌株HK发酵生长特征
    Figure  1.  Fermentation growth characteristics of strain HK

    基础料的玉米浆含有乳酸等物质[27],可由乳酸脱氢酶(LDH)催化生成丙酮酸(伴随NADH生成)进入糖异生或TCA途径[22]。因此对发酵过程中的乳酸含量进行检测,发现乳酸和葡萄糖含量由0 h的0.73 g/L和12.20 g/L持续降至6 h的最低值(0.10 g/L和1.40 g/L,图1),说明6 h后迟效性碳源玉米淀粉的分解与利用处于平衡状态,并维持细胞对数生长到峰值。研究结果显示菌株HK具备葡萄糖和乳酸的共代谢能力,乳酸可作为储备碳源被细胞吸收并经呼吸代谢二次利用,这与Hui等[23]的报道一致。

    芽孢杆菌利用葡萄糖进行对数生长存在CcpA的调控[28],随着碳源的消耗,细胞可利用溢流分子经呼吸代谢产能和糖异生作用进行二次生长[2223]。菌株HK发酵19 h后的能量供应矛盾在于碳源不足,虽然期间氨基酸脱氨基作碳源代谢促进了二次生长,但在一、二次生长之间存在强烈的细胞自溶现象,因而氨基酸参与碳代谢存在效能不足的缺陷。如图1所示,菌株HK具有葡萄糖和乳酸的共代谢能力,而且乳酸也能参与糖异生代谢[22],因而,考察了耦合pH7.0补料乳酸(16~32 h)对地衣芽孢杆菌HK生长的影响,如图2所示。

    图  2  乳酸对地衣芽孢杆菌HK生长的影响
    Figure  2.  Effects of lactate on the growth of Bacillus licheniformis HK

    pH变化趋势与对照(ck组,图1)基本一致,17 h回升至7.0,开始耦合pH7.0乳酸补料(16~32 h)过程维持在6.86~7.18左右。生物量和芽孢数在19 h达到3.66×1010 CFU/mL和3.55×1010 CFU/mL,与对照(ck组,图1)接近;30 h生物量达到峰值5.43×1010 CFU/mL,较对照峰值(19 h,3.52×1010 CFU/mL,图1)提高了54.3%。30 h芽孢数达到5.36×1010 CFU/mL,较对照(19 h,3.35×1010 CFU/mL,图1)提高了60.0%,芽孢率为98.7%;而且24~30 h细胞继续生长,至30 h芽孢数达到峰值,芽孢率维持在98%以上。

    发酵7 h的DO降至0,12 h后DO开始回升,至19 h达到20.5%后下降,21 h至发酵结束维持0,而对照组为40%~80%(材料与方法1.2.3),由于芽孢杆菌具备利用乳酸进行呼吸代谢的途径[2223],因而这种对氧消耗的显著改变可能由乳酸代谢引起。0~17 h乳酸和葡萄糖含量变化趋势与对照(图1)接近,17~31 h浓度均在0.3 g/L和2.0 g/L左右,说明此时细胞依然处于碳限制状态,虽然16~32 h流加了终浓度2%的乳酸,但其浓度依然处于较低水平。结果说明乳酸代谢效率高,而且增强了糖异生途径和能量供应效率,并有效促进菌株HK生长和芽孢形成。

    对照组19 h生物量达到峰值后自溶(图1),而且21 h已处于自溶状态;而补料组发酵21 h时仍处于对数生长期(图2)。因而两者在发酵21 h的细胞转录组和代谢组差异可能会反映出乳酸补料对菌株HK生长和芽孢生成的调控细节。

    以差异倍数FC>1.5,显著性P<0.05为条件筛选出差异表达基因。差异表达的基因经KEGG功能富集分析(图3),乳酸补料组(Lac组)上调基因主要集中在糖异生(Gluconeogenesis)、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway)、芽孢形成代谢(Spore formation)、硝酸盐呼吸(Nitrate respiration)等过程(图3a)。下调基因主要集中在TCA循环(TCA cycle)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等生物过程(图3b)。

    图  3  差异表达基因KEGG富集散点图
    注:a上调基因;b下调基因。
    Figure  3.  Scatter plot of KEGG enrichment of differentially expressed genes

    被注释到的主要差异基因如表1所示:糖异生途径相关基因如:ldh(乳酸脱氢酶)、pckA(磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶)、gapB(3-磷酸甘油醛脱氢酶)显著上调(P<0.05),磷酸戊糖途径(HMP)相关基因如:zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶)、tkt(转酮醇酶)等显著上调(P<0.05),说明乳酸增强了糖异生代谢及HMP途径。

    表  1  KEGG通路差异基因及FC值
    Table  1.  KEGG pathway differential genes and FC values
    通路主要差异基因及显著性差异倍数(FC值)
    糖异生途径ldh*pckA**gapB**上调4~7倍
    磷酸戊糖途径zwf**tkt*上调2.8~9.3倍
    TCA循环citZ*icd、citB*odhB*下调34.2%~76.6%
    氧化磷酸化atpA*atpB**ndh*yumB*qcrABC*ctaO**ctaDC*ythA*sdhAB*下调55.4%~96.8%
    硝酸盐呼吸nasBCD***上调107.4~287.3倍
    芽孢生成phrAC*cotP*cotA*yeek*yheD*tasA**gerQ*yuzJ**上调1.4~5.7倍
    注:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;表2表3同。
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    TCA循环相关基因如:citZ(柠檬酸合成酶)、icd(异柠檬酸脱氢酶)、citB(乌头酸酶)、odhB(α-酮戊二酸脱氢酶)等下调,氧化磷酸化相关基因如:atpAB(ATP合酶)、ndhyumB(NADH脱氢酶)、qcrABC(细胞色素C还原酶)、ctaODC(细胞色素C氧化酶)、ythA(细胞色素bd氧化酶)、sdhAB(琥珀酸脱氢酶)等下调,而硝酸盐呼吸相关基因如:nasBCD(硝酸盐还原酶系统)极显著上调(P<0.0001),说明菌株HK通过硝酸盐呼吸获得能量,这与乳酸流加期间DO一直维持为0(资料未显示)的现象一致。

    另外,芽孢形成相关基因如:phrAC(磷酸酶)、cotPcotAyeekyheDtasAgerQyuzJ(芽孢衣蛋白合成)等显著上调(P<0.05),说明乳酸促进了芽孢的生成效率。

    Lac和ck组样品中共检测到3222种代谢物,以正交偏最小二乘法的VIP>1.0、差异倍数FC>1.5且P<0.05为条件筛选出差异代谢物795种,显著上调的有598种,显著下调的有197种。被注释到的主要差异代谢物如表2所示。

    表  2  KEGG通路差异代谢物及丰度差异倍数
    Table  2.  Differential metabolites and abundance differences of KEGG Pathway
    通路 主要差异代谢物及显著性 Lac/ck丰度差异倍数
    糖异生途径 丙酮酸*、6-磷酸果糖*、1,3-二磷酸甘油酸* 上调1.6~3.7倍
    TCA循环 异柠檬酸*、顺乌头酸*、柠檬酸* 下调52.6%~62.5%
    辅因子代谢 NAD+*、NADH* 上调1.6~2.7倍
    磷酸戊糖途径 5-磷酸核酮糖***、7-磷酸景天庚酮糖*、6-磷酸葡萄糖酸* 上调1.55~12.6倍
    肽聚糖、磷壁酸合成 UDP-N-乙酰胞壁酸***、UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸**、D-丙氨酰-D-丙氨酸*
    磷壁酸*、3-磷酸甘油*
    上调1.5~14倍
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    糖异生途径相关代谢产物如:丙酮酸、6-磷酸果糖、1,3-二磷酸甘油酸显著上调(P<0.05),说明乳酸增强了糖异生代谢。

    TCA循环中间产物异柠檬酸、顺乌头酸显著下调(P<0.05),而辅因子NAD+显著上调(P<0.05),说明NADH的生成及氧化所生成的NAD+不是分别通过TCA、氧化磷酸化(ETC)实现的,这与乳酸流加期间DO一直维持为0的现象一致。

    另外,磷酸戊糖途径(HMP)标志代谢物5-磷酸-核酮糖、7-磷酸景天庚酮糖、6-磷酸葡萄糖酸等显著上调(P<0.05),肽聚糖合成代谢中间产物UDP-N-乙酰胞壁酸、UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸等和细胞壁组分-磷壁酸显著上调(P<0.05),说明乳酸提高糖异生运转效率的同时,促进了HMP途径和细胞壁组分(肽聚糖和磷壁酸)的合成效率。

    对照发酵16~19 h处于对数生长后期,葡萄糖浓度已消耗到较低水平(图1),22 h后出现二次生长现象,说明发酵后期存在氨基酸作碳源的代谢特征。而流加乳酸可经乳酸脱氢酶(LDH)催化生成丙酮酸,进而在丙酮酸羧化酶(PycA)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶(pckA编码)催化下生成草酰乙酸(OAA)和PEP,经3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapB编码)等催化进入糖异生途径,生成1,3-二磷酸甘油酸、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖等,并在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf编码,产物为6-磷酸葡萄糖酸、NADPH)、转酮醇酶(tkt编码,生成7-磷酸景天庚酮糖等)等催化下进入磷酸戊糖(HMP)途径。因而,对糖异生、糖酵解、磷酸戊糖途径代谢相关基因表达差异进行了分析,如图4所示。

    图  4  乳酸对糖异生、糖酵解和磷酸戊糖途径代谢基因表达的影响
    注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,图5~图8同。
    Figure  4.  Effects of lactate on gene expression of gluconeogenesis, glycolysis, and HMP pathway metabolism

    与对照组相比,乳酸补料组糖酵解途径的3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapA)、磷酸果糖激酶(pfkA)以及丙酮酸激酶(pyK)的表达分别下调了86.3%、92.5%和75.6%,这与其21 h葡萄糖低于2.5 g/L一致,说明细胞处于碳限制状态,糖酵解途径的关键酶基因基本上不表达。

    乳酸补料组ldh上调了4倍,促进了乳酸向丙酮酸的转化和NADH的有效供应。而pycA与对照接近,无显著差异。乳酸补料组pckAgapB(3-磷酸甘油醛脱氢酶)表达分别上调了7倍和5.9倍,说明LDH催化反应是NADH的主要供应途径之一。而且增强了OAA向PEP转化(pckA催化)、1,3-二磷酸甘油酸向3-磷酸甘油醛的转化(gapB催化)效率,糖异生途径得到加强,此时糖异生途径成为代谢主流。同时,HMP途径关键酶基因zwf、转酮醇酶基因tkt分别上调9.3倍和2.8倍。表明乳酸还增强了HMP途径的关键酶基因表达效率。

    基于此,分析了代谢组关键代谢物的丰度差异,如图5所示:乳酸组胞内丙酮酸,6-磷酸果糖、1,3-二磷酸甘油酸的丰度(以峰面积表示,其余同),比对照提高了1.6~3.7倍。而乳酸丰度与对照接近,说明乳酸的转运和转化效率极高,细胞处于严重的碳饥饿状态。糖异生代谢增强后,其代谢中间产物(丙酮酸,6-磷酸果糖、1,3-二磷酸甘油酸)丰度高于对照1.6~3.7倍,而且HMP途径标志代谢产物7-磷酸景天庚酮糖、5-磷酸核酮糖、6-磷酸葡萄糖酸的丰度分别比对照提高了1.59倍、12.6倍和1.55倍。这与关键酶基因的表达差异一致(图4)。即乳酸促进了糖异生、HMP途径的代谢效率,支撑了细胞的继续生长(图2)。

    图  5  糖异生、糖酵解和磷酸戊糖途径代谢物丰度
    Figure  5.  Metabolite abundances in the gluconeogenesis, glycolysis, and HMP pathways

    乳酸补料(图2)发酵中,地衣芽孢杆菌HK发酵30 h达到峰值生物量(5.43×1010 CFU/mL),较对照(图1)峰值提高了54.3%。由于能量供应效率是高密度发酵的前提条件,因而分析了TCA循环、氧化磷酸化、硝酸代谢关键基因的表达差异,如表3所示。

    表  3  TCA循环、氧化磷酸化、硝酸代谢关键基因表达差异
    Table  3.  Differences in gene expression related to TCA cycle, oxidative phosphorylation, and nitrate metabolism
    基因ID号基因基因描述FC(Lac/ck)
    B4U62_19870atpBATP合酶亚基A0.042**
    B4U62_19850atpAATP合酶亚基α0.156*
    B4U62_06810ndhNADH脱氢酶10.201*
    B4U62_17340yumBNADH脱氢酶20.329*
    B4U62_12250qcrA甲基萘醌-细胞色素c还原酶铁硫亚基0.443*
    B4U62_12245qcrB甲基萘醌-细胞色素c还原酶细胞色素b亚基0.241*
    B4U62_12240qcrC甲基萘醌-细胞色素c还原酶细胞色素b/c亚基0.249*
    B4U62_06700ctaO血红素IX基转移酶0.032**
    B4U62_08195ctaC细胞色素c氧化酶亚基20.174*
    B4U62_08200ctaD血红素泛醌氧化酶亚基I0.387*
    B4U62_16490ythA细胞色素泛醌氧化酶亚基I0.446*
    B4U62_15340sdhA琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基0.328*
    B4U62_15335sdhB琥珀酸脱氢酶铁硫亚基0.242*
    B4U62_15695citZ柠檬酸合酶20.446*
    B4U62_15690icd异柠檬酸脱氢酶(NADP+0.658
    B4U62_09790citB乌头酸水合酶0.234*
    B4U62_01945nasB亚硝酸盐还原酶大亚基287.340***
    B4U62_01935nasD亚硝酸盐还原酶大亚基284.973***
    B4U62_01940nasC同化硝酸还原酶催化亚基107.402***
    B4U62_10555odhB2-酮戊二酸脱氢酶复合体的二氢脂赖氨酸残基琥珀酰转移酶组分0.489*
    B4U62_05285nsrR转录调控因子0.054**
    B4U62_20075narH硝酸还原酶亚基β0.658
    B4U62_20080narG硝酸还原酶α0.563
    B4U62_20070narJ硝酸还原酶钼辅因子组装伴侣NarJ0.516
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    乳酸补料期间细胞生长迅速,耗氧量很大,因而DO维持为0,而这将对三羧酸循环及有氧呼吸代谢产生影响。TCA循环关键酶柠檬酸合成酶(citZ)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、乌头酸酶(citB)、α-酮戊二酸脱氢酶(odhB)表达量分别下调55.4%、34.2%、76.6%和51.1%。氧化磷酸化(ETC)ATP合酶(atpAB)、NADH脱氢酶(ndhyumB)、细胞色素C还原酶(qcrABC)、细胞色素C氧化酶(ctaODC)、细胞色素bd氧化酶(ythA)以及琥珀酸脱氢酶(sdhAB)表达量下调了55.4%~96.8%。同时,TCA循环代谢中间产物顺乌头酸、异柠檬酸和柠檬酸峰丰度比对照降低58.8%、62.5%和52.6%(P<0.05,图6),说明乳酸转化为丙酮酸后进入糖异生途径是代谢主流,这与丙酮酸,6-磷酸果糖、1,3-二磷酸甘油酸代谢物丰度显著增强一致(P<0.05,图5)。TCA循环碳通量不是主流,TCA-ETC也不是细胞NADH合成和氧化及ATP合成主要途径。而LDH催化乳酸向丙酮酸转化是NADH的主要生成途径(图4)。

    图  6  TCA循环和氧化磷酸化途径代谢物丰度
    Figure  6.  Metabolite abundance in TCA cycle and ETC pathway

    兼性厌氧条件下ATP的生成和NADH的氧化还与无氧呼吸有关[29],因而对硝酸盐还原酶系统(narGHJ、nsrR、nasBCD编码)的表达特征进行了分析,乳酸流加组和对照组的narGHJ表达量差异不显著,说明NADH的氧化不是限制因素。但是,nsrR表达量(阻遏亚硝酸盐还原酶nasBCD表达)显著下调94.6%(P<0.001),使得nasBCD强烈脱阻遏而表达,其表达量分别极显著上调了107.4~287.3倍(P<0.0001)。这极大地促进了NADH的氧化和NO2向NH3的转化效率,促进了兼性厌氧条件下NADH/NAD+平衡、降低了的NO2毒性,这与NAD+和NADH的丰度比对照高1.6倍和2.7倍(图6)一致。

    总之,乳酸补料促进细胞生长的同时,不仅使得发酵体系溶氧长期维持为0(21~32 h),且乳酸向丙酮酸的转化产生大量NADH(图6),进而引起细胞进行硝酸盐呼吸获得能量。

    乳酸补料促进了细胞生长,这需要细胞组分(细胞壁等)的有效合成,肽聚糖和磷壁酸生物合成中间产物的丰度差异如图7所示。菌株HK作为革兰氏阳性菌,其细胞壁组分之一肽聚糖合成前体D-丙氨酰-D-丙氨酸、UDP-N-乙酰胞壁酸和UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸丰度分别比对照高1.5倍、14倍和5.25倍。另一组分磷壁酸及其前体3-磷酸甘油丰度比对照高2.2倍和1.9倍。说明菌株HK利用乳酸代谢,促进了糖异生途径的代谢效率(图4),保证了6-磷酸果糖/葡萄糖的供应(图5),进而促进了肽聚糖和磷壁酸前体/中间产物的合成(图7),保证了细胞壁的合成效能,为细胞快速生长提供了有力支撑。

    图  7  细胞壁组分合成中间代谢物丰度
    Figure  7.  Metabolite abundances of intermediate metabolites in cell wall synthesis

    芽孢杆菌芽孢生成程序启动的决定性转录因子为Spo0A,当其表达丰度和磷酸化程度达到一定阈值时,芽孢形成才能启动[30]。而芽孢形成的外部因素则与发酵培养基中细胞密度以及细胞自身的营养状态有关。当发酵罐内细胞密度过大时,Phr(磷酸酶调节蛋白)会被寡肽通透酶运回胞内并活化,活化后的Phr蛋白可以专一性地抑制磷酸酶Rap的活性[31],进而Spo0F的磷酸化水平升高,使Spo0A~P高于阈值而促进芽孢生成启动[32]。因而,对芽孢形成关键基因的表达差异进行了分析,如图8所示。

    图  8  乳酸对芽孢形成基因表达的影响
    Figure  8.  Effects of lactate on the expression of sporulation genes

    乳酸补料组发酵后期(30 h)芽孢峰值达5.36×1010 CFU/mL,较对照峰值显著提高(60.0%)。高细胞密度使得磷酸酶调节蛋白PhrAC在胞内发挥作用,抑制磷酸酶Rap的活性,进而促进芽孢形成。磷酸酶调节蛋白编码基因phrAphrC分别上调了1.8和3.0倍,抑制了磷酸酶基因rapArapB的表达(两者分别下调了71.7%、88.8%),从而增强了Spo0F、Spo0B和Spo0A的磷酸传递效率,进而激活芽孢的生成。另外,全局调控子abrB间接阻遏spo0A表达,其编码基因abrB下调96.7%,使得spo0A脱阻遏而表达;磷酸酶编码基因yisIynzDspo0E分别下调60.7%、82.1%、93.9%,也提高了Spo0A的磷酸化效率。

    另外,芽孢衣是芽孢的重要组成部分[3337],主要由蛋白质组成,因而分析了芽孢外壳蛋白合成效率对芽孢生成的影响。编码芽孢衣蛋白合成相关基因cotPcotAyeekyheDtasAgerQyuzJ分别上调1.5倍、1.9倍、2.4倍、1.4倍、5.7倍、1.9倍和5.4倍。说明乳酸提高了菌株HK芽孢生成效率,这与发酵过程中产孢率显著提高的现象一致。

    地衣芽孢杆菌HK发酵16~32 h耦合pH7.0进行乳酸补料增强了细胞糖异生途径和磷酸戊糖途径的代谢强度、促进了细胞壁组分(肽聚糖和磷壁酸)的合成效率、强化了硝酸盐呼吸代谢、减弱了有氧呼吸代谢(三羧酸循环及氧化磷酸化过程)、提高了芽孢生成系统基因的表达强度,显著提升了菌株HK生长和芽孢生成效率,发酵30 h生物量峰值达5.43×1010 CFU/mL,较对照(未补乳酸)峰值提高了54.3%,芽孢数达到5.36×1010 CFU/mL,较对照提高60.0%。研究结果首次揭示了发酵中后期厌氧呼吸条件下乳酸代谢在调控芽孢形成中的作用,为地衣芽孢杆菌高密度、高芽胞率发酵提供理论和技术支撑,而乳酸补料组发酵30 h后细胞仍然自溶的现象有待进一步研究。

  • 图  1   菌株HK发酵生长特征

    Figure  1.   Fermentation growth characteristics of strain HK

    图  2   乳酸对地衣芽孢杆菌HK生长的影响

    Figure  2.   Effects of lactate on the growth of Bacillus licheniformis HK

    图  3   差异表达基因KEGG富集散点图

    注:a上调基因;b下调基因。

    Figure  3.   Scatter plot of KEGG enrichment of differentially expressed genes

    图  4   乳酸对糖异生、糖酵解和磷酸戊糖途径代谢基因表达的影响

    注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,图5~图8同。

    Figure  4.   Effects of lactate on gene expression of gluconeogenesis, glycolysis, and HMP pathway metabolism

    图  5   糖异生、糖酵解和磷酸戊糖途径代谢物丰度

    Figure  5.   Metabolite abundances in the gluconeogenesis, glycolysis, and HMP pathways

    图  6   TCA循环和氧化磷酸化途径代谢物丰度

    Figure  6.   Metabolite abundance in TCA cycle and ETC pathway

    图  7   细胞壁组分合成中间代谢物丰度

    Figure  7.   Metabolite abundances of intermediate metabolites in cell wall synthesis

    图  8   乳酸对芽孢形成基因表达的影响

    Figure  8.   Effects of lactate on the expression of sporulation genes

    表  1   KEGG通路差异基因及FC值

    Table  1   KEGG pathway differential genes and FC values

    通路主要差异基因及显著性差异倍数(FC值)
    糖异生途径ldh*pckA**gapB**上调4~7倍
    磷酸戊糖途径zwf**tkt*上调2.8~9.3倍
    TCA循环citZ*icd、citB*odhB*下调34.2%~76.6%
    氧化磷酸化atpA*atpB**ndh*yumB*qcrABC*ctaO**ctaDC*ythA*sdhAB*下调55.4%~96.8%
    硝酸盐呼吸nasBCD***上调107.4~287.3倍
    芽孢生成phrAC*cotP*cotA*yeek*yheD*tasA**gerQ*yuzJ**上调1.4~5.7倍
    注:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;表2表3同。
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    表  2   KEGG通路差异代谢物及丰度差异倍数

    Table  2   Differential metabolites and abundance differences of KEGG Pathway

    通路 主要差异代谢物及显著性 Lac/ck丰度差异倍数
    糖异生途径 丙酮酸*、6-磷酸果糖*、1,3-二磷酸甘油酸* 上调1.6~3.7倍
    TCA循环 异柠檬酸*、顺乌头酸*、柠檬酸* 下调52.6%~62.5%
    辅因子代谢 NAD+*、NADH* 上调1.6~2.7倍
    磷酸戊糖途径 5-磷酸核酮糖***、7-磷酸景天庚酮糖*、6-磷酸葡萄糖酸* 上调1.55~12.6倍
    肽聚糖、磷壁酸合成 UDP-N-乙酰胞壁酸***、UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸**、D-丙氨酰-D-丙氨酸*
    磷壁酸*、3-磷酸甘油*
    上调1.5~14倍
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    表  3   TCA循环、氧化磷酸化、硝酸代谢关键基因表达差异

    Table  3   Differences in gene expression related to TCA cycle, oxidative phosphorylation, and nitrate metabolism

    基因ID号基因基因描述FC(Lac/ck)
    B4U62_19870atpBATP合酶亚基A0.042**
    B4U62_19850atpAATP合酶亚基α0.156*
    B4U62_06810ndhNADH脱氢酶10.201*
    B4U62_17340yumBNADH脱氢酶20.329*
    B4U62_12250qcrA甲基萘醌-细胞色素c还原酶铁硫亚基0.443*
    B4U62_12245qcrB甲基萘醌-细胞色素c还原酶细胞色素b亚基0.241*
    B4U62_12240qcrC甲基萘醌-细胞色素c还原酶细胞色素b/c亚基0.249*
    B4U62_06700ctaO血红素IX基转移酶0.032**
    B4U62_08195ctaC细胞色素c氧化酶亚基20.174*
    B4U62_08200ctaD血红素泛醌氧化酶亚基I0.387*
    B4U62_16490ythA细胞色素泛醌氧化酶亚基I0.446*
    B4U62_15340sdhA琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基0.328*
    B4U62_15335sdhB琥珀酸脱氢酶铁硫亚基0.242*
    B4U62_15695citZ柠檬酸合酶20.446*
    B4U62_15690icd异柠檬酸脱氢酶(NADP+0.658
    B4U62_09790citB乌头酸水合酶0.234*
    B4U62_01945nasB亚硝酸盐还原酶大亚基287.340***
    B4U62_01935nasD亚硝酸盐还原酶大亚基284.973***
    B4U62_01940nasC同化硝酸还原酶催化亚基107.402***
    B4U62_10555odhB2-酮戊二酸脱氢酶复合体的二氢脂赖氨酸残基琥珀酰转移酶组分0.489*
    B4U62_05285nsrR转录调控因子0.054**
    B4U62_20075narH硝酸还原酶亚基β0.658
    B4U62_20080narG硝酸还原酶α0.563
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-05-14
  • 网络出版日期:  2025-01-24
  • 刊出日期:  2025-03-31

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