Effects of Different Polar Solvents Extraction on Functional Components and Their Antioxidant Activities of Sanghuangporus vaninii
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摘要: 为明确不同极性溶剂提取对杨树桑黄功能成分及生物活性的影响，以杨树桑黄子实体干粉为原料，采用4种不同溶剂（乙醇、丙酮、乙酸乙酯和复配溶剂）提取桑黄多酚类物质，测定其中活性成分、多酚组成及抗氧化活性等多种指标，并对其进行相关性分析。结果表明：丙酮提取物（AE）的得率、总多酚和三萜含量分别为12.91%、37.38%和8.11%，显著高于乙醇提取物（EE）、乙酸乙酯提取物（EAE）和复配溶剂提取物（MSE）（P<0.05）；EE的总黄酮含量为14.90%，高于AE、EAE和MSE；而EAE的总甾醇含量为12.61%，高于EE、AE和MSE。桑黄多酚组分及含量测定实验结果发现，AE中原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸的含量分别为602.09、90.25、6.24和5.57 μg/100 mg，显著高于EE、EAE和MSE（P<0.05），且7种酚酸总含量最高。此外，AE的ABTS+自由基清除率和脂质过氧化抑制能力高于EE、EAE和MSE，而其还原力和蛋白氧化损伤抑制能力显著高于EE、EAE和MSE（P<0.05）；EAE的DPPH自由基清除率和β-胡萝卜素-亚油酸氧化抑制能力高于EE、AE和MSE，而其羟基自由基清除率和DNA氧化损伤保护能力显著高于EE、AE和MSE（P<0.05）。相关性分析结果表明，酚类化合物与抗氧化活性之间相关性较强。综上，丙酮溶剂对桑黄多酚的提取率高，其提取物主要多酚化合物含量高，且具有良好的抗氧化能力。本试验结果可为桑黄产品的开发利用提供理论依据。Abstract: To clarify the effects of different polar solvents extraction on the functional components and antioxidant activities of Sanghuangporus vaninii, the crude polyphenols from the dried powder of S. vaninii were extracted with four different solvents (ethanol, acetone, ethyl acetate and compound solvents), the bioactive ingredients, polyphenol compositions and antioxidant activities of different extracts were measured and their correlation were analyzed. Results indicated that the yield, the total contents of polyphenols and triterpenoids in acetone extract (AE) were 12.91%, 37.38% and 8.11%, respectively, which were significantly higher than other extracts (P<0.05). The total flavonoid content of ethanol extract (EE) was 14.90%, which was higher than that of AE, ethyl acetate extract (EAE) and mixed solvent extract (MSE). The highest total sterol content was observed in EAE with the value of 12.61%. Interestingly, AE showed the highest content of protocatechuic aldehyde, protocatechuic acid, caffeic acid and p-coumaric acid with the values of 602.09, 90.25, 6.24, and 5.57 μg/100 mg, respectively. Its total content of phenolic acids were significantly higher than those in EE, EAE and MSE (P<0.05). In addition, AE demonstrated better ABTS+ radical scavenging and lipid peroxidation inhibition capacities than those of EE, EAE, and MSE. Its reducing power and protein oxidative damage inhibition capacities were significantly higher than those of EE, EAE, and MSE (P<0.05). Moreover, the DPPH radical scavenging and β-carotene-linoleic acid oxidation inhibition capacities of EAE were higher than those of EE, AE, and MSE. Its hydroxyl radical scavenging and DNA oxidative damage protection ability were significantly higher than that of EE, AE and MSE (P<0.05). There was a strong correlation between the content of polyphenols and the antioxidant activity. In summary, acetone solvent exhibited a higher extraction yield and higher content of main polyphenols components from S. vaninii, and the extract showed a good antioxidant capacity. The results will provide a theoretical basis for the development and utilization of S. vaninii products.
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Keywords:
- Sanghuangporus vaninii /
- active ingredient /
- component analysis /
- antioxidant activity /
- correlation
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桑黄（Sanghuangporus vaninii，S. vaninii），又称桑耳、桑臣，属于担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科、桑黄孔菌属，是一类珍贵的药用真菌[1−2]，最早记载于我国两千多年前的医学专著《神农本草经》。目前全球已发现18个桑黄种，其中我国有11个[3]。现代药理学研究表明，桑黄含有大量的活性成分，包括多糖、多酚、黄酮、三萜等[4−5]，这些活性成分赋予桑黄免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗癌和抗氧化等多种药理作用[1,5−6]。如Yin等[7]发现杨树桑黄多糖可减轻体内氧化应激，并通过增加有益的肠道微生物和短链脂肪酸来增强小鼠免疫能力；昝立峰等[8]和Lin等[9]分别发现鲍姆桑黄多酚和桑树桑黄多酚对癌细胞具有一定的抑制作用；Hou等[10]证实桑树桑黄多糖能有效改善小鼠胰岛素抗性。此外，多个研究也表明桑黄抗氧化活性与多酚类化合物含量有一定相关性，如吕国英等[11]和Gao等[12]分别研究发现桑树桑黄和杨树桑黄中多酚和黄酮类化合物可能在抗氧化过程中发挥主要作用。目前，桑黄生物活性物质的提取纯化和功能研究已成为桑黄药用价值挖掘与产品开发的重点。
由于过度采摘及资源保护不到位，目前我国野生桑黄资源稀少。近年来，大量科研人员开展了桑黄人工栽培相关研究。目前已取得一定进展，其中杨树桑黄是为数不多能人工栽培的桑黄品种，产量高且稳定[13]，因此可以从杨树桑黄子实体中大量制备生物活性物质。研究发现，不同的极性溶剂会影响多酚的组成和含量，继而影响多酚的生物活性[14]，这可能是由于天然酚类化合物具有不同的极性，易溶于类似极性的溶剂中[15]。因此，选择合适的溶剂对于酚类物质的提取和生物活性的维持尤为重要。目前，多数研究集中在对杨树桑黄多酚、黄酮的提取工艺，而有关不同极性溶剂提取对杨树桑黄多酚组分、含量及其生物活性影响的研究尚未见报道。
本研究将采用4种不同极性的溶剂提取杨树桑黄中的酚类物质，测定提取物的活性成分、多酚组分和含量并比较了不同提取物的抗氧化能力，旨在为挖掘杨树桑黄的药用价值，促进其功能产品开发提供有力支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
杨树桑黄子实体 吉林省长白县林丰菌业有限公司；牛血清蛋白（BSA）、丁基羟基茴香醚（BHA）、抗坏血酸（VC）、没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、香草酸、对香豆酸、二氢槲皮素标准品 上海源叶生物科技有限公司；pMD18-T质粒DNA 大连宝生物工程有限公司；SDS-PAGE胶、乙腈、乙酸、甲醇（以上皆为色谱级）等 赛默飞世尔科技公司；其余试剂均为标准分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
RE-5205 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FD5 真空冷冻干燥机 金西盟（北京）仪器有限公司；AQ-C18色谱柱、UV-1800 紫外可见分光光度计 日本岛津有限公司；E2695 高效液相色谱仪 美国Waters公司；Varioskan Flash 多功能酶标仪 赛默飞世尔科技公司；Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 伯乐生命医学（上海）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品预处理
杨树桑黄子实体在60 ℃烘干至恒重，冷却，然后粉碎过40目筛得到桑黄干粉，放置4 ℃冰箱备用。
1.2.2 不同提取物的制备
参考李雨鸿等[5]的方法，并稍作修改。准确称取20 g桑黄干粉，分别与乙醇、丙酮、乙酸乙酯、复配溶剂（乙醇:丙酮:乙酸乙酯=1:1:1）溶液充分混合（料液比1:40，m/v）。然后在25 ℃、300 W条件下，进行20 min的超声提取，以8000 r/min的速度离心20 min，收集上清液。残渣根据以上步骤操作2次，随后合并上清液旋蒸浓缩至50 mL，将其冷冻干燥即得到乙醇提取物（EE）、丙酮提取物（AE）、乙酸乙酯提取物（EAE）、复配溶剂提取物（MSE）。
1.2.3 不同提取物活性成分的测定
总多酚采用福林-酚比色法[16]进行测定，总黄酮采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[17]进行测定，总三萜采用香草醛-高氯酸比色法[18]进行测定，总甾醇采用香草醛-高氯酸比色法[19]进行测定。
1.2.4 不同提取物的多酚组分分析
采用高效液相色谱法（HPLC）[20]测定不同提取物中7种主要酚类化合物含量。色谱条件：色谱柱为AQ-C18反相色谱柱（4.6×250 mm，3 μm），紫外检测波长280 nm，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，流动相A是含0.1%乙酸的水溶液，流动相B是含0.1%乙酸的乙腈溶液。洗脱程序如下：0~5 min，10%~20%B；5~20 min，20%~40%B；30~35 min，50%~30%B；35~40 min，30%~10%B；40~50 min，10%B。根据保留时间和峰面积确定提取物中不同化合物的含量。
1.2.5 不同提取物的抗氧化活性测定
1.2.5.1 自由基清除活性和还原力测定
不同样品用70%乙醇溶解后配制成试验浓度为0~2.5 mg/mL的溶液，然后根据前期实验室建立的方法测定了不同样品的DPPH、ABTS+、羟基自由基清除活性以及还原力[21]，以Vc为阳性对照。
1.2.5.2 脂质过氧化抑制活性测定
参考Liu等[22]方法，吸取1 mL蛋黄溶液，加入9 mL无水乙醇振荡混匀，随后离心10 min收集蛋黄悬浮液。取100 μL 250 μmol/L FeSO4溶液、100 μL不同浓度的样品和200 μL悬浮液，混匀后立即置于37 ℃水浴中反应1 h。然后分别加入0.67% 硫代巴比妥酸（w/v）和15% 三氯乙酸（w/v）各1.0 mL，在100 ℃沸水浴条件下反应40 min后取出冷却至室温。最后离心10 min收集上清液，于532 nm处测定吸光度，以Vc为阳性对照。按下式计算脂质过氧化抑制率：
脂质过氧化抑制率(%)=A0−A1A0×100 式中：A1、A0分别表示实验组、空白组的吸光度。
1.2.5.3 β-胡萝卜素-亚油酸漂白实验
参考Aktumsek等[23]方法，略作修改：2.5 mg β-胡萝卜素干燥粉末溶于5 mL氯仿中，随后加入50 μL亚油酸和0.5 mL Tween 40混匀。随后，40 ℃减压旋蒸去除氯仿，再加入50 mL氧饱和蒸馏水，剧烈摇晃10 min，形成乳化液 （β-胡萝卜素-亚油酸乳化液）。将1.2 mL的乳化液注入1.5 mL已灭菌的试管中，加入240 μL不同浓度的样品，混匀后在470 nm处立即测定吸光度，记为A0。将反应混合物在45 ℃水浴孵育2 h后再次测定吸光度，记为At。以BHA作为阳性对照，重复相同的步骤。按下式计算不同样品对β-胡萝卜素-亚油酸的氧化抑制率：
β-胡萝卜素-亚油酸的氧化抑制率(%)=(1−A0−AtA0′−At′)×100 式中：A0、At和A0′、At′分别表示试验样品组、空白组在0、120 min的吸光度。
1.2.5.4 DNA氧化损伤保护实验
参考Gao等[12]方法，取4 μL pMD18-T质粒，分别加入8 μL样品（2 mg/mL）和8 μL磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.0），然后加入2 μL 1%H2O2和2 μL 1 mmol/L FeSO4溶液，混匀后并在37 ℃水浴反应30 min。反应结束后，迅速冰浴使反应停止。随后，与1×上样缓冲液混合，将反应液加入到含有0.001%凝胶染色的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳60 min。电泳完成后，在紫外光照下拍摄凝胶图像，并通过ImageJ软件进行灰度分析，按下式计算不同样品对DNA氧化损伤的保护率：
DNA氧化损伤的保护率(%)=A0A1×100 式中：A0表示DNA损伤后所剩的灰度值（闭环质粒DNA），A1表示DNA的总灰度值（闭环质粒DNA+开环质粒DNA）。
1.2.5.5 蛋白氧化损伤抑制实验
参考张洋洋等[24]方法并略作修改，取12 μL 1.5 mg/mL BSA溶液，依次加入12 μL样品（2 mg/mL）、12 μL pH 7.4的PBS溶液、4 μL 5 mmol/L FeCl3溶液、4 μL 5 mmol/L Vc溶液和4 μL 5 mmol/L H2O2溶液，充分混匀后置于37 ℃水浴加热1.5 h。反应结束后，立即使用SDS-PAGE胶（10%分离胶和5%浓缩胶配制）进行电泳，随后考马斯亮蓝R-250溶液染色2 h、10%乙酸溶液脱色60 min，拍摄图像后使用ImageJ软件进行灰度分析，按下式计算不同样品对蛋白氧化损伤的抑制率：
蛋白氧化损伤的抑制率(%)=A0A1×100 式中：A0表示蛋白损伤后所剩的灰度值，A1表示蛋白的总灰度值。
1.3 数据处理
采用SPSS 26.0进行数据管理和分析，采用Origin 2024 Pro软件作图。所有实验至少重复三次，结果以均数±标准差（X±SD）表示。显著性水平P<0.05表示有统计学意义，并采用皮尔逊相关性分析活性成分、多酚组分、抗氧化活性之间的相关性。
2. 结果与分析
2.1 不同提取物中活性成分含量比较
不同提取物的得率、总多酚、黄酮、三萜及甾醇的含量见表1。不同极性溶剂提取对样品粗多酚得率影响较大，EAE得率仅为2.69%，远低于其他三组得率。与前期报道的杨树桑黄乙醇提取物得率[25]相比，AE、MSE、EE得率显著高于前期报道。研究认为，极性越高的溶剂越有利于多酚的提取[14]，但不同的原料中所含的多酚种类及其极性可能不同，因此不同溶剂提取得率会出现较大差异。本研究中，AE总酚为37.38%；高于EE、MSE和EAE，这和陆健等[26]之前研究结果相似，他们报道大麦多酚类物质在丙酮中具有良好的分散性，因此丙酮更有利于多酚类物质的提取。EE中总黄酮含量最高，EAE次之，AE和MSE较低，这表明乙醇可能较丙酮更适合杨树桑黄黄酮类物质的提取[14]。另外，AE中总三萜含量最高，但总甾醇含量最低，远低于EAE中总甾醇含量（12.61%）；这表明丙酮有利于杨树桑黄中三萜类化合物的溶出，而乙酸乙酯有利于杨树桑黄中甾醇类物质的提取。总体来看，丙酮可能是杨树桑黄多酚提取的最佳溶剂。除此之外，不同粗提物中生物活性物质种类可能存在不同，如宋吉玲等[27]发现杨树桑黄醇提物里还有生物碱、香豆素等，这对提取物的生物活性可能产生一定影响。
表 1 桑黄不同提取物活性成分（%）Table 1. Activity components of different extracts of S. vaninii (%)指标 EE AE EAE MSE 得率 7.55±0.42c 12.91±0.71a 2.69±0.06d 10.69±0.92b 总酚 33.88±0.26b 37.38±2.63a 30.96±2.44b 33.28±3.26b 总黄酮 14.90±0.32a 8.77±0.18b 12.74±0.34ab 7.36±4.28b 总三萜 3.20±0.07b 7.88±1.65a 6.08±0.02a 5.57±0.24a 总甾醇 11.11±1.41ab 8.11±0.34c 12.61±1.06a 9.75±0.37bc 注：每行中不同小写字母表示存在显著性差异（P<0.05），表2同。 2.2 不同提取物中主要多酚组分的鉴定及含量分析
本实验室前期研究发现，原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸等7种多酚化合物是杨树桑黄中的主要酚类化合物[12]。不同提取物中主要多酚化合物高效液相色谱图如图1所示，多酚化合物含量如表2所示。从表2中可知，在检测范围内7种多酚化合物的标准曲线均具有较高的线性相关性（R2>0.998）。不同提取物中的酚类化合物含量均存在显著差异（P<0.05）。其中，原儿茶醛在AE中含量高达602.09 μg/100 mg，远高于EAE（297.55 μg/100 mg）、MSE（288.06 μg/100 mg）和EE（85.37 μg/100 mg），这和之前的研究结果一致[12]，这表明丙酮有利于原儿茶醛的提取。原儿茶醛是游离酚酸类化合物，其母核相邻位含有两个酚羟基，该结构表现出较强的抗氧化活性[28]。此外，AE中原儿茶酸的含量也较高，这表明原儿茶醛和原儿茶酸可能与丙酮具有类似的极性[29]。与原儿茶醛和原儿茶酸相比，咖啡酸和对香豆酸含量较低，但二者在AE中含量显著高于其它提取物。此外，AE中检测到的多酚总含量为704.15 μg/100 mg，显著高于其他3种提取物（P<0.05），这与表1中的结果一致。不过，本文仅检测了桑黄提取物中主要的7种多酚物质，色谱图中还有一些未鉴定的物质。综上所述，不同极性溶剂提取对桑黄多酚种类影响较小，但对酚类化合物含量影响显著，这与前期研究结论一致[14,30]。
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图 1 桑黄不同提取物主要组分图注：A为标准品高效液相色谱图，B~E分别为EE、AE、EAE、MSE高效液相色谱图，其中1~7分别代表没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、香草酸、对香豆酸、二氢槲皮素。Figure 1. Main components diagram of different S. vaninii extracts表 2 桑黄不同提取物主要多酚类化合物含量Table 2. Contents of main polyphenols in different extracts of S. vaninii编号 组分名称 保留时间（min） 回归方程 含量（μg/100 mg） EE AE EAE MSE 酚酸类（合计） 164.00±1.72d 704.15±2.18a 350.18±2.07b 336.77±1.81c 1 没食子酸 10.409 y=70775x+19326（R2=0.9996） ND ND ND ND 2 原儿茶酸 13.858 y=30592x+6900.3（R2=0.9997） 76.82±0.67b 90.25±0.51a 47.63±0.28c 45.61±0.43c 3 原儿茶醛 16.872 y=108977x−177690（R2=0.9981） 85.37±0.90d 602.09±0.67a 297.55±0.68b 288.06±0.81c 4 咖啡酸 17.933 y=59469x+79318（R2=0.9989） 0.80±0.02c 6.24±0.61a 1.99±0.71b 1.59±0.34b 5 香草酸 18.559 y=48612x+41035（R2=0.9994） ND ND ND ND 6 对香豆酸 22.705 y=93803x+218622（R2=0.9997） 1.01±0.13c 5.57±0.39a 3.01±0.40b 1.51±0.23c 黄酮类（合计） ND ND ND ND 7 二氢槲皮素 24.196 y=67453x+83135（R2=0.9981） ND ND ND ND 注：ND表示未检测到。 2.3 不同提取物抗氧化活性比较
2.3.1 不同提取物DPPH自由基清除率比较
如图2所示，在0.25~2.5 mg/mL浓度，不同样品的DPPH自由基清除率均随样品浓度增加而增大。在2.5 mg/mL时，EAE清除活性最高，为82.85%，其次是EE（79.61%）和MSE（76.48%），最低的则是AE（64.62%）。此外，EAE和EE半抑制浓度IC50值分别为0.49 mg/mL和0.69 mg/mL，远低于AE（1.74 mg/mL）和MSE（1.23 mg/mL）IC50值，但4个样品IC50值均大于对照Vc的IC50值（0.04×10−3 μg/mL）；这表明EAE对DPPH自由基的清除活性最好。
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2.3.2 不同提取物羟基自由基清除率比较
羟基自由基可以很容易地穿过细胞膜，并与多数生物大分子发生反应，从而导致组织损伤或细胞死亡[31]。因此，羟基自由基清除活性是表征天然活性化合物抗氧化能力的又一指标。如图3所示，样品浓度与羟基自由基的清除率均呈现出明显的剂量依赖效应。在2.5 mg/mL时，EAE羟基自由基清除率最高为75.56%，其次是AE（65.27%）和MSE（58.01%），EE最低（P<0.05）。不同提取物的IC50值分别为0.80（EAE）、0.82（AE）、1.69（MSE）和2.14 mg/mL（EE），均大于Vc的IC50值（4.69×10−3 μg/mL）。这表明EAE对羟基自由基的清除能力更强。师聪等[32]研究发现，不同极性萃取物抗氧化能力强弱可能与萃取物中抗氧化物质的种类和结构不同有关。
2.3.3 不同提取物ABTS+自由基清除率比较
与脂溶性的DPPH自由基不同，ABTS+自由基具有亲脂性和亲水性，因而更易于同各种生物活性物质反应[5]。如图4所示，不同样品在0.25~2.5 mg/mL浓度范围内对ABTS+自由基均表现出较高的清除活性。当浓度达到2.5 mg/mL时，AE的清除率最高（95.04%）且接近于Vc。对应的AE、EAE、MSE和EE的IC50值分别为0.02、0.18、0.19和0.46 mg/mL。结果表明，在所有提取物中，AE对ABTS+自由基的清除能力更强，仅弱于Vc。多个研究报道，多酚含量较高的样品ABTS+自由基清除活性也较好[33−34]，这可能与其酚羟基含量较多有关。
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图 4 不同提取物的ABTS+自由基清除率Figure 4. ABTS+ free radical scavenging rate of different extracts2.3.4 不同提取物还原力比较
还原力也是评价天然活性化合物潜在抗氧化活性的重要指标，物质的还原力越强，其抗氧化活性越好[35]。如图5所示，随着浓度的升高，各样品的还原力吸光度逐渐增大。当浓度在2.5 mg/mL时，AE吸光度达到2.56，仅低于Vc；而EAE和MSE相似（分别为2.02和2.06），EE的还原力最低。结果表明，AE相较于其它3种提取物表现出较强的还原能力，这可能得益于其较高的多酚化合物含量[34]。
2.3.5 不同提取物脂质过氧化抑制率比较
脂质过氧化抑制能力也是表征天然活性产物抗氧化活性的重要指标[36]。如图6所示，不同提取物均表现出较好的脂质过氧化物抑制活性，且呈浓度依赖效应。当浓度为2.5 mg/mL时，AE和MSE的脂质过氧化抑制率分别为81.68%和81.14%，均高于EAE和EE。其中AE和EAE的IC50值分别为0.46 mg/mL和0.56 mg/mL，均低于Vc的IC50值（0.76 mg/mL），这表明AE和EAE脂质过氧化物抑制活性更好。研究表明，酚类化合物可通过给自由基提供电子，中和自由基电荷属性，从而减少脂质过氧化的产生[37]。
2.3.6 不同提取物β-胡萝卜素-亚油酸抑制率比较
β-胡萝卜素可被亚油酸自由基氧化降解，抗氧化剂可中和亚油酸自由基来阻碍β-胡萝卜素的氧化降解[23]。如图7所示，在2 h内，不同样品均对亚油酸氧化β-胡萝卜素表现出一定抑制活性。当浓度为2.5 mg/mL时，EAE和MSE对亚油酸氧化β-胡萝卜素的抑制率高达95.56%和90.34%，仅次于BHA（96.03%）；EE和AE的抑制率较低，分别为89.49%和88.56%，这表明不同提取物均可抑制亚油酸氧化β-胡萝卜素，但EAE效果较好。此外，研究认为酚类化合物对β-胡萝卜素氧化的抑制作用可能与酚羟基中和亚油酸自由基有关[38]。由此可见，含有较多酚羟基可能有利于抑制β-胡萝卜素的降解。本研究中AE总酚含量显著高于EAE，但对β-胡萝卜素的降解抑制率却显著低于EAE（P<0.05），这可能是多种活性物质产生协同或拮抗作用的结果[5]。
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图 7 不同提取物的β-胡萝卜素-亚油酸抑制率Figure 7. Inhibition rate of β-carotene-linoleic acid of different solvent extracts2.3.7 不同提取物对DNA氧化损伤的保护效果比较
天然存在的pMD18-T质粒呈超螺旋结构，氧化损伤会导致质粒开环并且构象发生改变[14]。不同提取物对DNA氧化损伤的保护结果见图8，泳道1为超螺旋pMD18-T质粒DNA条带。超螺旋DNA氧化损伤后形成开环DNA，在琼脂糖凝胶上会滞后（泳道2，被氧化完）。3~6泳道均显示多个条带，这表明不同提取物抑制了部分超螺旋质粒DNA的氧化损伤。柱状图显示，EAE对DNA的氧化损伤保护率最高，为63.16%；MSE（59.57%）和EE（48.64%）次之，AE保护率最低（44.85%）。显然，EAE具有较强DNA氧化损伤保护能力。Gao等[12]报道，桑黄多酚的DNA氧化损伤保护能力可能来自于一些酚类化合物（原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和组皮苷）的作用。在本实验中，AE总酚含量较高，DNA氧化损伤保护率却较低，这表明粗提物中可能还有其他活性物质参与了DNA氧化损伤的保护[5,32]。
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图 8 不同提取物对DNA氧化损伤的保护效果注：泳道1：空白组（Blank），质粒DNA；泳道2：模型组（Treatment），质粒 DNA+Fe2++H2O2；泳道3~6：试验组，质粒DNA+Fe2++H2O2+不同溶剂提取物（EE、AE、EAE、MSE）。Figure 8. Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage2.3.8 不同提取物对蛋白氧化损伤的抑制效果比较
Cu2+、Fe2+、Fe3+等金属离子可以催化H2O2分解，产生·OH，继而诱导蛋白质的氧化损伤[14]。不同提取物对蛋白氧化损伤的抑制效果见图9，阳性对照BHA对牛血清蛋白（BSA）氧化损伤抑制率为82.22%；样品组中AE对BSA的氧化损伤抑制率最高，为53.43%；EE（33.82%）次之；EAE和MSE较低，分别为28.34%和26.84%；而处理组（Treatment）蛋白氧化损伤抑制率只有26.77%。这表明AE可以有效抑制蛋白氧化损伤，其抑制效果可能与AE中含有的大量多酚有关。张洋洋等[24]报道桑黄多酚具有较强的蛋白氧化损伤抑制能力，本文结果与之一致。
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图 9 不同提取物对蛋白氧化损伤的抑制效果注：泳道1：空白组（BSA）；泳道2：模型组（Treatment），BSA+Fe3++H2O2+Vc；泳道3：阳性对照组（BHA），BSA+Fe3++H2O2+Vc+BHA；泳道4~7：试验组，BSA+Fe3++H2O2+Vc+不同溶剂提取物（EE、AE、EAE、MSE）。Figure 9. Inhibiting effects of different solvent extracts on protein oxidative damage2.4 不同提取物活性成分、酚类化合物含量与抗氧化活性的相关性分析
Pearson相关分析可以简洁直观的反应两个变量间的线性关系[33]，对所测定的活性成分、酚类化合物以及抗氧化活性水平之间的相关性进行分析，结果如图10所示。桑黄总酚含量与原儿茶醛、对香豆酸含量呈现显著正相关（P<0.05），与原儿茶酸和咖啡酸含量呈现极显著正相关（P<0.01），表明这4种酚酸是桑黄酚类化合物的重要成分[12]。除此之外，总黄酮含量与原儿茶醛含量呈显著负相关（P<0.05），表明不同提取物中总黄酮含量越少，原儿茶醛含量越高，这和表1和表2中测定结果一致。
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图 10 不同活性成分及抗氧化活性的相关性分析注：图中数据为相关系数（r）；*P<0.05；**P<0.01。Figure 10. Correlation analysis of different active components and antioxidant activities原儿茶醛含量与ABTS+自由基、还原力和蛋白氧化损伤呈现极显著正相关（P<0.01）；原儿茶酸与蛋白氧化损伤呈极显著正相关（P<0.01）；咖啡酸和对香豆酸含量与ABTS+自由基、还原力和蛋白氧化损伤均呈极显著正相关（P<0.01）。AE中原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸含量相对较高，因此AE呈现较强的ABTS+自由基清除活性、较强的还原力以及最高的蛋白氧化损伤保护率，这表明原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸可能是AE发挥抗氧化活性的主要成分。原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸含量都与DPPH自由基清除率呈显著负相关（P<0.05），另外，原儿茶酸还与DNA氧化损伤和β-胡萝卜素氧化呈显著负相关（P<0.05）。本研究结果也发现AE的DPPH自由基和羟基自由基清除活性、β-胡萝卜素氧化抑制活性以及DNA氧化损伤抑制活性不及EAE，而EAE中原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸含量显著低于AE，这表明不同多酚化合物可能具有不同的抗氧化机理。
此外，不同提取物的活性成分与抗氧化活性之间也具有一定的相关性，总酚含量与蛋白氧化损伤呈极显著正相关（P<0.01），相关系数达0.87；总黄酮含量与DPPH自由基清除率呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.63。不同提取物中总三萜和总甾醇含量较低，但与抗氧化指标之间也有相关性。其中，总三萜含量与羟基自由基和ABTS+自由基清除率、还原力呈极显著正相关（P<0.01），与脂质过氧化抑制率具有显著正相关（P<0.05）；甾醇含量与DPPH自由基清除率和DNA氧化损伤保护率分别呈极显著（P<0.01）和显著正相关（P<0.05）。
相关性分析表明，不同极性溶剂提取对提取物中活性成分和酚类化合物含量影响较大，但对抗氧化活性的影响不完全一致，这可能是由于不同提取物中抗氧化物质的种类和结构不同，其抗氧化机理不同，抑或存在协同或拮抗作用，继而会产生不同的抗氧化效果[32]。酚类化合物原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸的存在均会提高样品的ABTS+自由基清除率、还原力和蛋白氧化损伤抑制率，这与张亮亮等[14]、宋吉玲等[39]研究结果一致，但仍需更多研究来阐明其抗氧化机制。
3. 结论
本研究采用不同极性溶剂提取杨树桑黄多酚化合物并测定不同提取物的活性成分、酚类化合物含量和抗氧化活性。结果显示，不同极性溶剂对桑黄多酚类物质的提取影响较大，其中AE得率最高且AE中主要酚类化合物的含量最高。此外，不同溶剂提取对桑黄提取物的抗氧化能力具有不同的影响。相较而言，AE和EAE具有较好的抗氧化活性。综合提取得率、主要酚类化合物含量以及抗氧化活性等指标，丙酮溶剂可能更适用于杨树桑黄多酚的提取。本研究结果为杨树桑黄资源的开发利用提供了理论依据。本研究提取的桑黄多酚为粗提物，还需进一步分离纯化；另外文中抗氧化实验均为体外实验，体内抗氧化效果还有待进一步研究。
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图 1 桑黄不同提取物主要组分图
注：A为标准品高效液相色谱图，B~E分别为EE、AE、EAE、MSE高效液相色谱图，其中1~7分别代表没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、香草酸、对香豆酸、二氢槲皮素。
Figure 1. Main components diagram of different S. vaninii extracts
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图 4 不同提取物的ABTS+自由基清除率
Figure 4. ABTS+ free radical scavenging rate of different extracts
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图 7 不同提取物的β-胡萝卜素-亚油酸抑制率
Figure 7. Inhibition rate of β-carotene-linoleic acid of different solvent extracts
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图 8 不同提取物对DNA氧化损伤的保护效果
注：泳道1：空白组（Blank），质粒DNA；泳道2：模型组（Treatment），质粒 DNA+Fe2++H2O2；泳道3~6：试验组，质粒DNA+Fe2++H2O2+不同溶剂提取物（EE、AE、EAE、MSE）。
Figure 8. Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage
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图 9 不同提取物对蛋白氧化损伤的抑制效果
注：泳道1：空白组（BSA）；泳道2：模型组（Treatment），BSA+Fe3++H2O2+Vc；泳道3：阳性对照组（BHA），BSA+Fe3++H2O2+Vc+BHA；泳道4~7：试验组，BSA+Fe3++H2O2+Vc+不同溶剂提取物（EE、AE、EAE、MSE）。
Figure 9. Inhibiting effects of different solvent extracts on protein oxidative damage
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图 10 不同活性成分及抗氧化活性的相关性分析
注：图中数据为相关系数（r）；*P<0.05；**P<0.01。
Figure 10. Correlation analysis of different active components and antioxidant activities
表 1 桑黄不同提取物活性成分（%）
Table 1 Activity components of different extracts of S. vaninii (%)
指标 EE AE EAE MSE 得率 7.55±0.42c 12.91±0.71a 2.69±0.06d 10.69±0.92b 总酚 33.88±0.26b 37.38±2.63a 30.96±2.44b 33.28±3.26b 总黄酮 14.90±0.32a 8.77±0.18b 12.74±0.34ab 7.36±4.28b 总三萜 3.20±0.07b 7.88±1.65a 6.08±0.02a 5.57±0.24a 总甾醇 11.11±1.41ab 8.11±0.34c 12.61±1.06a 9.75±0.37bc 注：每行中不同小写字母表示存在显著性差异（P<0.05），表2同。 
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表 2 桑黄不同提取物主要多酚类化合物含量
Table 2 Contents of main polyphenols in different extracts of S. vaninii
编号 组分名称 保留时间（min） 回归方程 含量（μg/100 mg） EE AE EAE MSE 酚酸类（合计） 164.00±1.72d 704.15±2.18a 350.18±2.07b 336.77±1.81c 1 没食子酸 10.409 y=70775x+19326（R2=0.9996） ND ND ND ND 2 原儿茶酸 13.858 y=30592x+6900.3（R2=0.9997） 76.82±0.67b 90.25±0.51a 47.63±0.28c 45.61±0.43c 3 原儿茶醛 16.872 y=108977x−177690（R2=0.9981） 85.37±0.90d 602.09±0.67a 297.55±0.68b 288.06±0.81c 4 咖啡酸 17.933 y=59469x+79318（R2=0.9989） 0.80±0.02c 6.24±0.61a 1.99±0.71b 1.59±0.34b 5 香草酸 18.559 y=48612x+41035（R2=0.9994） ND ND ND ND 6 对香豆酸 22.705 y=93803x+218622（R2=0.9997） 1.01±0.13c 5.57±0.39a 3.01±0.40b 1.51±0.23c 黄酮类（合计） ND ND ND ND 7 二氢槲皮素 24.196 y=67453x+83135（R2=0.9981） ND ND ND ND 注：ND表示未检测到。
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