Substrate Specificity and Enzymatic Characteristics of Three Rutinosidases
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摘要: 芸香糖苷类黄酮化合物的水解产物槲皮素、柚皮素、橙皮素具有丰富的生物活性和应用前景。为了探讨不同芸香糖苷酶水解制备槲皮素、柚皮素和橙皮素的特性，选择了Aspergillus niger CBS 513.88的芸香糖苷酶AnRut，Acremonium sp. DSM 24697的αRβD I和αRβD II进行底物特异性和酶学性质的比较研究。结果表明，三种芸香糖苷酶均只能水解α-1,6连接的芸香糖苷类黄酮化合物，对α-1,2连接的新橙皮糖苷类黄酮化合物无作用。AnRut偏好水解3-O连接的芦丁，αRβD I偏好水解7-O连接的芸香柚皮苷和橙皮苷，αRβD II对两种类型底物都具有良好的水解活性。分子对接结果表明三种酶与芦丁、芸香柚皮苷和橙皮苷的结合模式不同，三种酶与底物的苷元结构的相互作用差异影响了底物特异性。AnRut最适温度50 ℃，最适pH4.0，10 mmol/L的β-ME和DTT对AnRut酶活有明显促进作用，相对酶活是未处理酶的223%和242%。αRβD I最适温度70 ℃，最适pH4.0，在酸性条件下对芸香柚皮苷和橙皮苷具有良好的水解活性。αRβD II最适温度40 ℃，最适pH6.0，较适用于中性条件下对三种底物的水解。本研究为应用不同芸香糖苷酶制备槲皮素、柚皮素、橙皮素以及芸香糖苷酶构效关系的后续研究提供了实验和理论依据。Abstract: Quercetin, naringenin, and hesperetin are the hydrolysis products of rutinoside flavonoids, known for their multiple biological activities and potential applications. To explore the characteristics of different rutinosidases in preparing quercetin, naringenin, and hesperetin, the rutinosidase AnRut from Aspergillus niger CBS 513.88, and αRβD I and αRβD II from Acremonium sp. DSM 24697 were selected for comparative studies on substrate specificity and enzymatic properties. The results showed that, all three rutinosidases could only hydrolyze flavonoid compounds with α-1,6-linked rutinosides, but had no effect on flavonoid compounds with α-1,2-linked neohesperidosides. AnRut primarily hydrolyzed 3-O-linked rutin, αRβD I mainly hydrolyzed 7-O-linked narirutin and hesperidin, while αRβD II showed no significant difference in hydrolytic activity towards both types of substrates. Molecular docking results indicated that there were distinct binding modes within the three rutinosidases with rutin, narirutin, and hesperidin, and the substrate specificities of the three rutinosidases were influenced with variations in their interactions with the glycoside structures rutinoside flavonoids. The optimal temperature for AnRut was 50 ℃, and the optimal pH was 4.0. Additionally, 10 mmol/L β-ME and DTT significantly enhanced AnRut's enzymatic activity, increasing the relative activity to 223% and 242% of the wild type, respectively. The optimum temperature and pH of αRβD I was 70 ℃ and 4.0, demonstrating efficient hydrolysis of narirutin and hesperidin under acidic conditions. αRβD II, meanwhile, had an optimal temperature of 40 ℃ and an optimal pH of 6.0, indicating its suitability for hydrolyzing rutinoside flavonoids under neutral conditions. This study would provide experimental and theoretical references for the preparation of quercetin, naringenin, and hesperetin using rutinosidases and lay the groundwork for future research on the structure-activity relationship of rutinosidases.
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类黄酮是一类具有抗炎、抗氧化、抗过敏和抗增殖作用的天然植物化学物质[1−3]。槲皮素、柚皮素和橙皮素是其中最常见的类黄酮化合物，槲皮素作为抗凋亡、抗氧化剂对多种器官损伤起到保护作用[4−5]；橙皮素主要用于神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的神经保护[6−8]；柚皮素具有抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤和免疫调节等特性[9−11]。在自然界，槲皮素、柚皮素和橙皮素的二糖糖苷形式广泛存在[12−14]，包括芸香糖与槲皮素苷元的3-O部分进行连接的芦丁，以及芸香糖与柚皮素、橙皮素苷元的7-O部分进行连接的芸香柚皮苷和橙皮苷（图1），这些二糖糖苷具有低生物利用度和稳定性差的缺点。此外，有研究表明类黄酮的抗氧化活性随着糖苷部分数量的增加而下降[15]。苷元比糖苷类黄酮具有更大的生物学效应[16]。苷元更容易被肠道上皮细胞吸收[17−18]，因此研究这些类黄酮糖苷的去糖基化具有重要意义。
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图 1 槲皮素、柚皮素、橙皮素和它们对应的二糖糖苷化合物结构注：a.槲皮素；b.芦丁；c.柚皮素；d.芸香柚皮苷；e.橙皮素；f.橙皮苷。Figure 1. Structures of quercetin, naringenin, hesperetin and their corresponding disaccharide glycoside compounds利用糖苷酶水解类黄酮糖苷是绿色、高效制备苷元的方法。类黄酮二糖苷可通过单糖苷酶的级联反应或二糖苷酶的一次水解进行去糖基化[19]（图2）。相对于单糖苷酶，芸香糖苷酶（Rutinosidase）能够直接水解芸香糖与苷元之间的糖苷键，更为高效。芸香糖苷酶主要来源于植物和丝状真菌，多数归类为糖苷水解酶GH5_23家族的成员[20]，少数归类到GH3或GH55家族[21−22]。目前有关二糖苷酶特别是芸香糖苷酶主要研究集中在酶资源的挖掘，蛋白质工程方法改善酶的性能等方面，其在食品、医药和农业等领域中均有应用[23−25]。少数研究进行了酶结构解析和催化机制的分析[26−27]，对不同芸香糖苷酶催化性质和结构差异的深入研究尚缺乏。芸香糖苷酶具有广泛的底物特异性，水解的底物包括芦丁、芸香柚皮苷、橙皮苷、异槲皮素等。研究发现不同来源的芸香糖苷酶底物特异性差异较大，对3-O和7-O连接的芸香糖苷化合物具有不同的水解活性[28−30]；加上不同研究采用的实验体系，测定的底物类型和酶活定义等存在差异[31−33]，很难比较不同芸香糖苷酶间的底物特异性和水解活性的差异。
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图 2 单糖苷酶和二糖苷酶水解芸香糖苷类黄酮的两个途径（以芦丁为例）Figure 2. Two pathways of hydrolysis of rutinoside flavonoids by monoglycosidases and diglycosidases (with rutin as an example)因此，为了对比分析不同芸香糖苷酶水解芦丁、芸香柚皮苷和橙皮苷制备槲皮素、柚皮素和橙皮素的特性和性质特点，本研究选择了A. niger CBS 513.88的AnRut（GenBank：QHN63926.1）以及Acremonium sp. DSM 24697的αRβD I（GenBank：AMD11613.1）和αRβD II（GenBank：QGN19489.1）三个水解芸香糖性质较好的酶进行异源表达，对三个重组酶的底物特异性及酶学性质进行了研究并从分子角度探讨了这三种芸香糖苷酶不同底物偏好性差异的原因。本研究为利用这三种不同芸香糖苷酶在不同条件下制备槲皮素、柚皮素和橙皮素提供了选择依据，也为进一步深入研究芸香糖苷酶的底物特异性的构效关系，酶的工程改造提供了研究基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
含重组pPIC9K-AnRut、pPIC9K-αRβD I、pPIC9K-αRβD II质粒的E. coli DH5α 委托安升达生物科技（苏州）有限公司合成；pPIC9K载体、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶 TaKaRa（中国大连）；DNA纯化试剂盒 中国Tiangen；表达宿主细胞P. pastoris strain GS115 Invitrogen公司（中国广州）；酶底物包括柚皮素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁、芸香柚皮苷 上海源叶生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（50 mmol/L柠檬酸和50 mmol/L磷酸氢二钠） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇 色谱纯，德国Meker公司。
SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；T100PCR扩增仪、1652100 MicroPulser电穿孔仪 美国BIO-RAD有限公司；ibright FL1000凝胶成像仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；ÄKTAprime plus 蛋白纯化仪 美国通用电气公司；ZWYR-2102双层恒温振荡摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司；MS-100金属浴 杭州奥盛有限公司；HH-6数显恒温循环水浴 常州国华电器有限公司；SynergyH1酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；YXQ-LB-50SII高压蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；Avanti J-26xpi立式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 芸香糖苷酶的表达与纯化
参照实验室前期的实验方法对pPIC9K-AnRut、pPIC9K-αRβD I、pPIC9K-αRβD II质粒在Pichia pastoris GS115进行异源表达[34]，重组酶经甲醇诱导表达7 d后，8000 r/min离心10 min，上清液即为诱导表达的蛋白。以pH6.0的10 mmol/L磷酸盐缓冲液作为透析液对芸香糖苷酶酶液进行透析。以1 mL/min的速度清洗阴离子交换柱3~5个柱体积后，pH6.0的10 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡3~5个柱体积。将透析后的酶液以1 mL/min的速度进行上样。用1 mol/L NaCl进行线性洗脱，收集在波长280 nm下紫外吸收峰出现的样品，SDS-PAGE（80 V，60 min）进行验证。将Q柱纯化的样品浓缩至500 µL并以0.5 mL/min的速度上样至Superdex 200 Increase 10/300 GL层析柱中，以上述相同的缓冲液进行洗脱，收集有紫外吸收峰出现的样品，SDS-PAGE（80 V，60 min）进行验证，使用BCA试剂盒测定芸香糖苷酶的蛋白浓度（y=0.0022x+0.1653，x为蛋白浓度µg/mL，y为吸光度，R2=0.9996）。
1.2.2 芸香糖苷酶最适反应条件及稳定性测定
1.2.2.1 芸香糖苷酶的最适温度和温度稳定性测定
对芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II分别进行最适温度的测定：以100 µg/mL的芦丁为底物，反应体系：以450 µL 100 µg/mL底物与50 µL的酶液分别放在20~80 ℃中反应30 min后，加入500 µL二硝基水杨酸（DNS）并沸水浴10 min终止反应，在540 nm波长下测定其吸光度，并计算酶活。以测得最高酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活。酶活（IU）定义：每分钟转化1 μmol底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位。
对芸香糖苷酶AnRut进行温度稳定性的测定：以100 µg/mL的芦丁为底物，在50、60 ℃条件下温浴AnRut酶液，0、0.5、1、1.5、2、3、4、5 h后，在最适条件下测定其残余酶活，至酶活降低为原来的50%以下为止。以最高酶活为100%，计算不同处理时间的相对酶活。
对芸香糖苷酶αRβD I进行温度稳定性的测定：以100 µg/mL的芦丁为底物，在70、75 ℃条件下温浴αRβD I酶液，0、0.5、1、1.5、2、3 h后，在最适条件下测定其残余酶活，至酶活降低为原来的50%以下为止。以最高酶活为100%，计算不同处理时间的相对酶活。
对芸香糖苷酶αRβD II进行温度稳定性的测定：以100 µg/mL的芦丁为底物，在40、50 ℃条件下温浴αRβD II酶液，0、1、3、4、5、7、10、12 h后，在最适条件下测定其残余酶活，至酶活降低为原来的50%以下为止。以最高酶活为100%，计算不同处理时间的相对酶活。
1.2.2.2 芸香糖苷酶的最适pH和pH稳定性测定
对芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II分别进行最适pH的测定：分别用pH3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8的缓冲液配制100 µg/mL的芦丁溶液按1.2.2.1的反应体系在最适温度下进行实验，测定最适pH。以测得最高酶活为100%，计算不同pH下的相对酶活。
对芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II分别进行pH稳定性的测定：分别用pH3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8的缓冲液在4 ℃下处理AnRut、αRβD I、αRβD II 24 h。按1.2.2.1的反应体系在最适温度下测定其残余酶活。以最高酶活为100%，计算经不同pH缓冲液处理的相对酶活。
1.2.3 芸香糖苷酶底物偏好性测定
以芦丁、芸香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷为底物，分别测定三种不同的芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II的底物偏好性。反应体系：以450 µL 100 µg/mL底物与50 µL的酶液分别在50、70、40 ℃条件下反应30 min后，加入500 µL DNS并沸水浴10 min终止反应，在540 nm波长下测定其吸光度，并计算底物转化率，底物转化率（%）=（芸香糖产物量/底物量）×100。
1.2.4 芸香糖苷酶分子对接
利用NCBI网站（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取αRβD I（GenBank：AMD11613.1）、αRβD II（GenBank：QGN19489.1）蛋白序列。而后通过Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/）在线平台，寻找具有较好同源性的蛋白结构作为模版，采用同源建模的方法[35]构建αRβD I、αRβD II的蛋白结构。AnRut的蛋白结构（PDB ID：6I1A）于PDB数据库下载（https://www.rcsb.org/）。在AutoDock Tools中对AnRut、αRβD I、αRβD II和底物进行分子对接，底物配体从PubChem下载并经Chem3D进行能量最小化，通过PyMOL 2.5将蛋白和小分子配体转化为“pdbqt”格式；采用Discovery Studio 2019 Client软件进行活性口袋预测，对接中心分别为（−26.331，5.612，1.331）、（8.418，0.376，0.936）、（17.686，−2.433，6.985）。在AutoDock Tools中对接盒子大小设置为（24×24×24）Å3，通过软件遗传算法模拟底物蛋白对接，选择结合能较低的对接构象，采用Discovery Studio 2019 Client显示受体和配体的相互作用力，PyMOL 2.5进行可视化与渲染作图。
1.2.5 芸香糖苷酶金属离子稳定性和有机试剂耐受性的测定
1.2.5.1 芸香糖苷酶在不同金属离子下的稳定性
三种芸香糖苷酶在4 ℃条件下分别用1、10 mmol/L Fe3+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Na+、K+、Ag+处理24 h后，按1.2.2.1的反应体系，在最适条件下测定残余酶活。相对酶活以最高酶活为100%。
1.2.5.2 芸香糖苷酶有机试剂耐受性的测定
分别以10%~50%（v/v）甲醇、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）处理重组芸香糖苷酶24 h，按1.2.2.1的反应体系，在最适条件下测定残余酶活。
1.2.6 芸香糖苷酶抑制剂与表面活性剂稳定性测定
三种芸香糖苷酶在4 ℃条件下分别被1、10 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巯基乙醇（β-ME）、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素（Urea）、二硫苏糖醇（DTT）和0.1%或1%（w/w或w/v）表面活性剂（Tween-20、Tween-80、Triton X-100）处理24 h后，在最适温度和最适pH下测定残余酶活。
1.3 数据处理
所有实验都进行三次平行实验，实验结果以每个样本重复值的平均值±标准差（SD）表示。采用Microsoft Excel 2013和Origin Pro 8.0软件对实验结果进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 三种芸香糖苷酶的异源表达及纯化
重组表达质蛋白AnRut、αRβD I、αRβD II纯化后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析，结果如图3所示。AnRut理论分子量42.98 kDa，αRβD I理论分子量为42.78 kDa，αRβD II理论分子量为81.5 kDa。SDS-PAGE条带显示AnRut分子量为52 kDa左右，NetNGlyc分析显示，AnRut含7个潜在的糖基化位点，可能在表达的过程中发生糖基化导致分子量偏大。αRβD II在表达过程中未发生糖基化，分子量未发生变化。αRβD I的SDS-PAGE条带显示分子量为42 kDa左右，符合理论值大小。
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图 3 芸香糖苷酶纯化后的SDS-PAGE注：a图中，M为Marker，1为pPIC9K；2为AnRut；b图中，M为Marker，1为pPIC9K，2为αRβD II；3为αRβD I。Figure 3. SDS-PAGE of purified rutinosidases2.2 芸香糖苷酶最适反应条件及稳定性
2.2.1 芸香糖苷酶最适温度及温度稳定性
重组芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II最适温度分别为50、70和40 ℃（图4a）。由图4b~图4d可知，在50 ℃处理3 h后，AnRut保持60%以上的酶活；αRβD I在70 ℃处理3 h后，酶活降低至50%，在75 ℃下处理60 min后，该酶酶活降低至47%；在40、50 ℃下测定重组芸香糖苷酶αRβD II的温度稳定性，在40 ℃（近乎常温的状态）稳定性较好，在40和50 ℃下处理12 h后仍具有50%以上的酶活。
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图 4 三种芸香糖苷酶的最适温度及温度稳定性注：a. 芸香糖苷酶最适温度；b. AnRut温度稳定性；c. αRβD I温度稳定性；d. αRβD II温度稳定性。Figure 4. Optimum temperature and temperature stability of three rutinosidases2.2.2 芸香糖苷酶最适pH及pH稳定性
重组芸香糖苷酶AnRut、αRβD I、αRβD II最适pH分别为4.0、4.0和6.0（图5a）。如图5a所示，AnRut酶在pH3.5~6.0具有良好的稳定性，但当pH超过6时，酶稳定性骤降，中性偏碱的环境对该酶的影响较大。图5b显示，αRβD I的pH稳定性较AnRut良好，在pH3.0~8.0的缓冲液处理24 h后，酶活仍保持85%以上。αRβD II与AnRut及αRβD I不同，最适pH偏中性。不同pH的缓冲液处理αRβD II 24 h后，该酶仍保90%以上的酶活力，具有良好的pH稳定性。
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图 5 三种芸香糖苷酶的最适pH及pH稳定性注：a. 芸香糖苷酶最适pH；b. 芸香糖苷酶的pH稳定性。Figure 5. Optimum pH and pH stability of three rutinosidases2.3 三种芸香糖苷酶底物特异性
以芦丁、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素为底物测定芸香糖苷酶的活性，实验结果显示芸香糖苷酶AnRut、αRβD I及αRβD II均只对芦丁、芸香柚皮苷、橙皮苷有酶解作用，而对柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素没有显示酶解作用（表1）。其中AnRut对3-O连接的芸香糖苷化合物芦丁水解活性更高，对7-O连接的芸香糖苷化合物芸香柚皮苷及橙皮苷仅具有轻微水解活性，αRβD I对7-O连接的芸香糖苷化合物芸香柚皮苷和橙皮苷水解活性相对较高，αRβD II对7-O和3-O连接的芸香糖苷化合物都具有良好的水解效率。AnRut和αRβD I同属于GH5-23家族，但底物特异性差别较大。而αRβD II与αRβD I为同一来源，但不同的是αRβD II在对7-O连接的芸香糖苷化合物有较好的活性的同时对3-O连接的芸香糖苷化合物也具有良好的水解效率，这说明αRβD II较于αRβD I具有较为广泛的底物适应性。
表 1 芸香糖苷酶底物偏好性Table 1. Substrates preference of rutinosidases芸香糖苷酶 底物转化率（%） 芦丁 芸香柚皮苷 柚皮苷 橙皮苷 新橙皮苷 柚皮素 AnRut 58.20±0.09 4.56±0.74 ND 15.10±0.96 ND ND αRβD I 9.84±0.40 79.19±1.01 ND 68.60±5.27 ND ND αRβD II 23.64±0.10 21.01±0.19 ND 36.50±3.01 ND ND 注：ND：未检测出酶活性。 芸香糖苷酶AnRut及αRβD I属于GH 5家族，且均在23亚家族中。GH 5家族被称为“纤维素酶 A家族”，主要两种类型的二糖苷酶，β-樱草糖苷酶及芸香糖苷酶[21]。AnRut和αRβD I虽同属于GH5_23家族，但底物特异性不同。αRβD II与αRβD I都来源于Acremonium sp. DSM 24697（GenBank：AMD11613.1）。αRβD I和αRβD II也被称为橙皮苷6-O-α-L鼠李糖基-β-D-葡萄糖苷酶[20]，它们作用的底物为橙皮苷及其相关的7-O-芸香糖苷类黄酮化合物，水解糖苷异位键，对单糖基化底物无活性。但不同的是αRβD II在对7-O连接的芸香糖苷化合物有较好的活性的同时对3-O连接的芸香糖苷化合物也具有良好的水解效率，这说明αRβD II较于αRβD I具有较为广泛的底物适应性。芦丁、芸香柚皮苷、橙皮苷三种底物的糖元部分均被α-1,6连接的芸香糖修饰，三种芸香糖苷酶均对这三种底物有酶解作用，而对所测的α-1,2连接的新橙皮糖不具有酶活，表明三种芸香糖苷酶仅能特异性水解芸香糖修饰的底物，对新橙皮糖修饰的底物不具备活性。
2.4 三种芸香糖苷酶与不同底物的分子对接
芸香糖苷酶AnRut-底物复合物的对接结果如图6a所示，三个底物均在结合口袋内（−26.331，5.612，1.331）。AnRut-芦丁、AnRut-芸香柚皮苷、AnRut-橙皮苷结合能分别为−9.3、−8.1、−8.5 kcal/mol，表明AnRut对芦丁的结合相对较好。图7为三个AnRut-底物复合物体系底物分子与活性口袋附近氨基酸形成的相互作用力。已有研究表明酶与底物的结合模式和相互作用中酶对底物的苷元部分因具有偏好性从而影响酶的水解活性[27]。一方面，AnRut活性口袋附近的氨基酸残基与芦丁的苷元槲皮素形成了五个非共价相互作用，在很大程度上促进了芦丁与AnRut活性氨基酸残基的结合，同时AnRut氨基酸侧链与芦丁的Glc、Rha和苷元部分之间发生了极性相互作用（图7a）。另一方面，大多数疏水相互作用和π-stacking相互作用只存在于糖苷元和AnRut侧链之间。相反，AnRut活性口袋附近的氨基酸与橙皮苷和芸香柚皮苷的苷元部分形成的相互作用较少（图7b~图7c），尤其是与芸香柚皮苷形成的相互作用最少，仅形成两个非共价相互作用。对于3-O连接的芦丁而言，其苷元槲皮素两侧的苯环与AnRut活性位点的氨基酸共形成五个氢键，使芦丁整体能够更好的固定在活性口袋中心。而7-O连接的芸香柚皮苷和橙皮苷的苷元两侧与AnRut活性口袋附近氨基酸残基几乎没有形成氢键，并且对芸香糖的相互作用也较弱。AnRut与三种底物不同的结合模式及相互作用，表明AnRut与3-O连接的芦丁更易发生相互作用。
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图 6 芸香糖苷酶-底物复合物的最佳对接构象注：a. AnRut-底物复合物的最佳对接构象；b. αRβD I-底物复合物的最佳对接构象；c. αRβD II-底物复合物的最佳对接构象。Figure 6. Optimal docking conformations of rutinosidase-substrate complexes![]()
图 7 芸香糖苷酶AnRut活性口袋与底物的2D相互作用网络图注：a：AnRut与芦丁分子对接后相互作用力分析；b：AnRut与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c：AnRut与橙皮苷分子对接后相互作用力分析。Figure 7. Network diagram of the 2D interaction of the AnRut activity pocket of rutinosidase with substrates芸香糖苷酶αRβD I-底物复合物的对接结果如图6b所示，三个底物均在结合口袋内（8.418，0.376，0.936）。αRβD I-芦丁、αRβD I-芸香柚皮苷、αRβD I-橙皮苷结合能分别为−7.9、−10.1、−10.1 kcal/mol，表明αRβD I对芸香柚皮苷以及橙皮苷的结合相对较好。图8为三个αRβD I-底物复合物体系底物分子与活性口袋附近氨基酸形成的相互作用力。AnRut和αRβD I同属于GH5_23家族，但底物特异性差别较大。对αRβD I与底物分子对接的结果分析发现，7-O连接的芸香柚皮苷和橙皮苷进入αRβD I的活性口袋的方向为横向进入（图8b~图8c），柚皮素和橙皮素被Phe216和Phe281两个芳香侧链夹住，固定于活性口袋中心，两个芳香环形成垂直的T形排列，与糖苷元三个环结构形成Pi-Pi T-shaped相互作用（图8d），而αRβD I与芦丁几乎没有形成氢键（图8a），这也可能是其对芦丁酶活较低的原因。此外，Ala282、Arg284与糖苷元之间建立了额外的疏水相互作用。而3-O连接的芦丁在进入活性口袋时，是以竖直向下的形式进入，不能同时与Phe216和Phe281形成相互作用，影响了αRβD I活性口袋周围氨基酸残基的相互作用。
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图 8 芸香糖苷酶αRβD I活性口袋与底物的2D相互作用网络图注：a. αRβD I与芦丁分子对接后相互作用力分析；b. αRβD I与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c. αRβD I与橙皮苷分子对接后相互作用力分析；d. Phe216和Phe281与苷元的相互作用。Figure 8. Network diagram of the 2D interaction of the αRβD I activity pocket of rutinosidase with substrates芸香糖苷酶αRβD II-底物复合物的对接结果如图6c所示。三个底物均在结合口袋内（17.686，−2.433，6.985）。αRβD II-芦丁、αRβD II-芸香柚皮苷、αRβD II-橙皮苷结合能分别为−7.7、−7.5、−7.9 kcal/mol。图9为三个AnRut-底物复合物体系底物分子与活性口袋附近氨基酸形成的相互作用力。αRβD I与αRβD II为同一来源，但性质差异较大，αRβD II对7-O连接和3-O连接的芸香糖苷类黄酮化合物均具有良好的水解活性。αRβD II分子对接结合能相对其余两个酶均较低，并且三个底物均未深入活性口袋，仅与αRβD II活性口袋表面氨基酸形成了相互作用力，这可能也是αRβD II对芦丁、芸香柚皮苷和橙皮苷的水解活性相差不大的一个原因。
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图 9 芸香糖苷酶αRβD II活性口袋与底物的2D相互作用网络图注：a. αRβD II与芦丁分子对接后相互作用力分析；b. αRβD II与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c. αRβD II与橙皮苷分子对接后相互作用力分析。Figure 9. Network diagram of the 2D interaction of the αRβD II activity pocket of rutinosidase with substrates2.5 芸香糖苷酶金属离子稳定性和有机试剂耐受性
2.5.1 芸香糖苷酶在不同金属离子下的稳定性
如图10所示，1 mmol/L的金属离子对芸香糖苷酶AnRut的影响较小，表现为不同程度的促进和抑制作用，但高浓度的金属离子对AnRut均表现为抑制作用，其中Cu2+抑制作用最强，使AnRut酶活降低至最大酶活的8%。αRβD I（图10 b）和αRβD II（图10 c）金属离子耐受性较差，几乎所有的金属离子对这两个酶都存在抑制现象。10 mmol/L的Ni2+和Co2+使αRβD I完全丧失活性，10 mmol/L的Al3+使αRβD II完全丧失活性。二价金属离子对AnRut、αRβD I、αRβD II影响较小，这可能是由于芸香糖苷酶在催化过程中产生负电荷，而二价金属离子对这些电荷起到稳定作用，对酶活影响较小[36]。
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图 10 金属离子对AnRut（a）、αRβD I（b）和αRβD II（c）的影响Figure 10. Effects of metal ions on AnRut (a), αRβD I (b) and αRβD II (c)2.5.2 芸香糖苷酶有机试剂的耐受性
由于芦丁溶解度及糖基受体选择等因素使得芸香糖苷酶转糖基反应通常发生在有机体系中，因此还进行有机试剂对芸香糖苷酶AnRut、αRβD I及αRβD II的影响。AnRut对甲醇、乙醇及DMSO的耐受性最好，在50%的有机试剂存在的条件下，仍保持50%以上的酶活（图11）。αRβD I的有机试剂耐受性最差，10%的甲醇使该酶的酶活降低至48%，在40%的甲醇和乙醇存在的条件下完全失去活性。αRβD II对乙醇的耐受性最好，30%的乙醇存在的条件下该酶保持90%左右的酶活，但当乙醇浓度升高时，该酶酶活迅速降低（图11）根据芸香糖苷酶AnRut、αRβD I及αRβD II的有机试剂耐受性分析，在底物溶解及受体溶解的过程中可选择合适的试剂，减小对酶活力的影响。
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图 11 甲醇（a）、乙醇（b）、DMSO（c）对三种芸香糖苷酶的影响Figure 11. Effects of methanol (a), ethanol (b), and DMSO (c) on three rutinosidases2.6 芸香糖苷酶抑制剂与表面活性剂的稳定性
低浓度和高浓度的β-ME和DTT均对芸香糖苷酶AnRut酶活有促进作用，其中10 mmol/L β-ME使AnRut相对酶活增加至原始型的223%，10 mmol/L DTT则使AnRut相对酶活增加至原始型的242%（图12）。在进行AnRut二硫键的预测时发现该蛋白含4个半胱氨酸，位于72位和79位半胱氨酸之间可形成一个二硫键。同时AnRut在天然的状态下为二聚体结构，β-ME和DTT均属于还原剂，β-ME和DTT的加入阻止了二硫键的形成，避免形成二聚体，使得酶活提高。SDS和尿素作为变性剂具有同样作用，但高浓度的尿素会使AnRut发生变性导致酶活降低。与AnRut相比，β-ME、DTT和SDS对αRβD I、αRβD II均表现为不同程度的抑制作用，这可能与蛋白结构有关。1 mmol/L的EDTA对αRβD I及αRβD II的酶活存在不同程度的抑制作用，但对AnRut作用较小，这可能是重组的芸香糖苷酶的酶活需要金属离子辅助导致的。Tween-20、Tween-80和TritonX-100通过疏水力与蛋白发生相互作用，使反应体系中水活度降低，不利于芸香糖苷酶发生水解作用，导致酶活降低。
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图 12 不同浓度抑制剂及表面活性剂对AnRut（a）、αRβD I（b）、αRβD II（c）的影响Figure 12. Effects of different concentrations of inhibitors and surfactants on AnRut (a), αRβD I (b), and αRβD II (c)3. 结论
本研究通过对三种芸香糖苷酶的比较研究，为选择不同性质芸香糖苷酶在不同条件下制备槲皮素、柚皮素、橙皮素提供了实验依据。通过对A. niger CBS 513.88的AnRut、Acremonium sp. DSM 24697的αRβD I和αRβD II的酶学性质及其底物特异性分析，得到以下结论：三种芸香糖苷酶中，AnRut在50 ℃，pH4.0条件下对3-O连接的芸香糖苷化合物芦丁的转化率最高；AnRut温度和pH稳定性较好，对有机试剂和金属离子耐受性在三个酶中最佳；10 mmol/L的DTT能够明显提高AnRut酶活至原始水平的242%。αRβD I在70 ℃，pH4.0的条件下对7-O连接的芸香柚皮苷及橙皮苷的转化率最高；在pH 3.0~8.0的范围内均具有较好的稳定性，但αRβD I的温度稳定性相对较差。αRβD II底物特异性在三个酶中最为广泛；在40 ℃，pH6.0条件下对7-O和3-O连接的芸香糖苷化合物均具有良好的水解活性，其温度和pH稳定性在三个酶中最佳；在40和50 ℃下处理12 h后，仍保持50%以上的酶活；在pH3~8的缓冲液中处理24 h后，酶活力保持90%以上。因此，AnRut较适合在酸性条件下水解芦丁制备槲皮素；αRβD I能够在高温条件下水解芸香柚皮苷及橙皮苷制备柚皮素和橙皮素，但其温度稳定性会影响反应的持续性。αRβD II的性质较均衡，三种底物均可水解，但不适合在高温、碱性和对底物专一性要求高的条件下使用。此外，本研究通过分子对接分析，初步揭示了AnRut、αRβD I和αRβD II在底物识别和作用模式上的差异性，但这些结论需通过实验进一步验证。未来期望能够借助蛋白质工程、晶体结构解析、分子动力学模拟、通道动力学等方法和技术，深入理解芸香糖苷酶的底物特异性及其构效关系，为阐明芸香糖苷酶的催化机理及其在生物医药和食品等领域的应用提供充分的科学依据。
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图 1 槲皮素、柚皮素、橙皮素和它们对应的二糖糖苷化合物结构
注：a.槲皮素；b.芦丁；c.柚皮素；d.芸香柚皮苷；e.橙皮素；f.橙皮苷。
Figure 1. Structures of quercetin, naringenin, hesperetin and their corresponding disaccharide glycoside compounds
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图 2 单糖苷酶和二糖苷酶水解芸香糖苷类黄酮的两个途径（以芦丁为例）
Figure 2. Two pathways of hydrolysis of rutinoside flavonoids by monoglycosidases and diglycosidases (with rutin as an example)
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图 3 芸香糖苷酶纯化后的SDS-PAGE
注：a图中，M为Marker，1为pPIC9K；2为AnRut；b图中，M为Marker，1为pPIC9K，2为αRβD II；3为αRβD I。
Figure 3. SDS-PAGE of purified rutinosidases
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图 4 三种芸香糖苷酶的最适温度及温度稳定性
注：a. 芸香糖苷酶最适温度；b. AnRut温度稳定性；c. αRβD I温度稳定性；d. αRβD II温度稳定性。
Figure 4. Optimum temperature and temperature stability of three rutinosidases
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图 5 三种芸香糖苷酶的最适pH及pH稳定性
注：a. 芸香糖苷酶最适pH；b. 芸香糖苷酶的pH稳定性。
Figure 5. Optimum pH and pH stability of three rutinosidases
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图 6 芸香糖苷酶-底物复合物的最佳对接构象
注：a. AnRut-底物复合物的最佳对接构象；b. αRβD I-底物复合物的最佳对接构象；c. αRβD II-底物复合物的最佳对接构象。
Figure 6. Optimal docking conformations of rutinosidase-substrate complexes
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图 7 芸香糖苷酶AnRut活性口袋与底物的2D相互作用网络图
注：a：AnRut与芦丁分子对接后相互作用力分析；b：AnRut与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c：AnRut与橙皮苷分子对接后相互作用力分析。
Figure 7. Network diagram of the 2D interaction of the AnRut activity pocket of rutinosidase with substrates
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图 8 芸香糖苷酶αRβD I活性口袋与底物的2D相互作用网络图
注：a. αRβD I与芦丁分子对接后相互作用力分析；b. αRβD I与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c. αRβD I与橙皮苷分子对接后相互作用力分析；d. Phe216和Phe281与苷元的相互作用。
Figure 8. Network diagram of the 2D interaction of the αRβD I activity pocket of rutinosidase with substrates
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图 9 芸香糖苷酶αRβD II活性口袋与底物的2D相互作用网络图
注：a. αRβD II与芦丁分子对接后相互作用力分析；b. αRβD II与芸香柚皮苷分子对接后相互作用力分析；c. αRβD II与橙皮苷分子对接后相互作用力分析。
Figure 9. Network diagram of the 2D interaction of the αRβD II activity pocket of rutinosidase with substrates
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图 10 金属离子对AnRut（a）、αRβD I（b）和αRβD II（c）的影响
Figure 10. Effects of metal ions on AnRut (a), αRβD I (b) and αRβD II (c)
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图 11 甲醇（a）、乙醇（b）、DMSO（c）对三种芸香糖苷酶的影响
Figure 11. Effects of methanol (a), ethanol (b), and DMSO (c) on three rutinosidases
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图 12 不同浓度抑制剂及表面活性剂对AnRut（a）、αRβD I（b）、αRβD II（c）的影响
Figure 12. Effects of different concentrations of inhibitors and surfactants on AnRut (a), αRβD I (b), and αRβD II (c)
表 1 芸香糖苷酶底物偏好性
Table 1 Substrates preference of rutinosidases
芸香糖苷酶 底物转化率（%） 芦丁 芸香柚皮苷 柚皮苷 橙皮苷 新橙皮苷 柚皮素 AnRut 58.20±0.09 4.56±0.74 ND 15.10±0.96 ND ND αRβD I 9.84±0.40 79.19±1.01 ND 68.60±5.27 ND ND αRβD II 23.64±0.10 21.01±0.19 ND 36.50±3.01 ND ND 注：ND：未检测出酶活性。 
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