Physicochemical Properties and in Vitro Antioxidant Activity of Gradient Ethanol Precipitation Polysaccharides from Haematococcus pluvialis Residue
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摘要: 为探索雨生红球藻渣多糖的综合利用价值，本研究采用40%、60%和80%的乙醇梯度分离雨生红球藻渣多糖，依次得到HP40、HP60、HP80三个粗多糖组分，通过高效液相色谱（HPLC）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统（HPSEC-MALS-RI）等方法对各组分多糖的单糖组成、分子量、结构、粒径和Zeta电位等理化特性进行分析，并测定其抗氧化活性。结果表明，乙醇浓度显著影响所沉淀雨生红球藻渣多糖的理化性质和抗氧化活性。醇沉粗多糖的得率和纯度随着乙醇浓度的增加而降低，并且乙醇浓度越高，沉淀的粗多糖分子量越低。本研究提取的粗多糖的纯度较高，其中HP40的总糖含量可达99.46%±0.015%。三种组分均包含Glc、Man、Gal、Ara、Rha、Xyl、Fuc、Glc-UA这8种单糖，但单糖组成及比例并不相同，与HP40相比，HP60和HP80还含有核糖，共有9种单糖。HP的粒径和Zeta电位分析结果表明，HP80的粒径最小（73.505±2.405 nm）且Zeta电位的绝对值最大（−11.6 mV）。抗氧化分析结果表明，HP80的抗氧化活性最强，且对羟自由基的清除率最高可达96%以上（10.0 mg/mL）。综上所述，梯度醇沉可以对雨生红球藻渣多糖进行初步分离，得到单糖组成、粒径、分子量、抗氧化活性各不相同的粗多糖。其中，40%乙醇所沉淀的粗多糖得率和糖含量最高，80%乙醇所沉淀的粗多糖分子量最小、抗氧化能力最强。Abstract: To explore the comprehensive utilization value of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue, ethanol gradient precipitation (40%, 60% and 80%) was used to isolate polysaccharides from H. pluvialis residue in this study. Three fractions with crude polysaccharides (HP40, HP60 and HP80) were obtained by 40%, 60% and 80% ethanol precipitation successively. The monosaccharide composition, molecular weight, structure, particle size and Zeta potential of each fraction were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), high pressure gel chromatography-multiple angle light scattering detector-differential refractive index detector (HPSEC-MALS-RI), and their antioxidant activity was also evaluated. Results showed that the physicochemical properties and antioxidant activity of polysaccharides precipitated from H. pluvialis residue were significantly affected by ethanol concentration. The yield and purity of the crude polysaccharides decreased with the increase of ethanol concentration. Furthermore, the lower molecular weight polysaccharides were precipitated by higher concentration of ethanol. High-purity crude polysaccharides were obtained in this study, in which, the total sugar content of HP40 was up to 99.46%±0.015%. All fractions contained 8 monosaccharides, including Glc, Man, Gal, Ara, Rha, Xyl, Fuc and Glc-UA, while the composition and proportion of monosaccharides were different. Compared with HP40, ribose was also involved in HP60 and HP80, which contained a total of 9 monosaccharides. HP80 possessed the smallest particle size (73.505±2.405 nm) and the largest Zeta potential absolute value (−11.6 mV). The results of antioxidant analysis showed that HP80 had the strongest antioxidant activity, and the scavenging rate of hydroxyl radicals was up to 96% (10.0 mg/mL). In summary, gradient ethanol precipitation method was effective to isolate polysaccharides from H. pluvialis residue preliminarily, and obtained polysaccharides with different monosaccharide composition, particle size, molecular weight and antioxidant activity. In which, the highest yield and sugar content was gained in fraction precipitated by 40% ethanol (HP40), while the smallest molecular weight and the strongest antioxidant capacity were gained in fraction precipitated by 80% ethanol (HP80).
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雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水单细胞绿藻，富含蛋白质、脂质、维生素等多种营养物质，是天然虾青素的主要来源[1]，其在食品[2]、饲料[3]、抗炎化合物[4]的开发上具有广泛的应用前景。然而迄今为止，对雨生红球藻的研究大多集中于虾青素，对其多糖等其它营养成分的研究较少[5−6]，限制了雨生红球藻全细胞的高值化利用。近年来，从海藻中分离的多糖在乳制品、化妆品、生物医药等领域得到了越来越广泛的应用[7−9]。据报道，来源于海藻的多糖具有免疫调节[4]、抗传染[10]、抗癌[11]、抗氧化[12]等多种生物活性。而多糖的生物活性与其分子大小、糖苷键类型、单糖组成以及摩尔比等理化特性密切相关[13]。因此，了解海藻多糖的提取分离及其生物活性是多糖广泛应用的基础，将有助于提高其利用价值。
水提醇沉具有操作简便、容易放大、成本低、分离效果好等优点，因此在工业上常被用作多糖初步分离方法。在此基础上采用梯度提取的方法，不仅能够提高目标产物的产率，还有助于实验室内对多糖的生物活性和理化性质进行初步评估，达到高效筛选产物的目的。比如：Yang等[14]发现采用80%乙醇分离所得多糖的抗氧化性比50%和70%的多糖强，且具有调节脂类酶活性的能力；郭慧静等[15]采用乙醇分级沉淀蒲公英多糖，发现20%、40%、60%和80%的多糖其单糖组成不一样，且40%乙醇分离所得多糖的得率最高；Zhang等[16]采用乙醇梯度沉淀法对马尾藻多糖进行分离，发现不同乙醇浓度所提取多糖的分子量不同，且乙醇浓度为30%和90%提取的多糖对金黄色葡萄球菌有抑制作用；谷怡静[17]采用乙醇分级沉淀提取分离海带多糖，发现不同乙醇浓度所提取的多糖其生化组成、分子量各不相同。
当前，雨生红球藻主要是作为天然虾青素的原料，提取虾青素后的藻渣一般用作低值饲料或者农作物肥料，虽然可以实现资源回收但是未实现高值化利用。实验前期对雨生红球藻的营养成分分析发现其总碳水化合物含量高达20%，这种化合物主要由多糖构成，而多糖具有多种生物活性，在医药、食品、化妆品等行业都受到了广泛关注[7−9]。此外，多糖还由于其高丰度、低成本、可降解等优势被用于制备食品包装材料[18]。因此，本研究采用乙醇梯度沉淀法对雨生红球藻渣中的水溶性多糖进行初步分离，并对各组分的生化组成、单糖组成、分子量、结构等理化特性以及多糖的抗氧化活性进行分析，以期开发雨生红球藻渣多糖的生物利用潜力，实现雨生红球藻全细胞的利用，达到资源最大化的目的，为雨生红球藻今后在功能食品、医药等领域的应用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雨生红球藻 福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室；无水乙醇 西陇科学股份有限公司；抗坏血酸（VC） 如吉生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法） 碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；Infinite M200 Pro酶标仪 瑞士帝肯公司；K9840自动凯氏定氮仪 山东海能科学仪器有限公司；Zetasizer Nano-ZSE 纳米粒度及Zeta电位仪 英国马尔文公司；Optilab T-rEX示差折光-DAWN HELEOS Ⅱ激光光散射检测器 美国Wyatt Technology公司；U3000高压凝胶色、ICS 5000+高效液相色谱、Nicolet IS 50红外光谱 美国Thermo Fisher公司。
1.2 实验方法
1.2.1 粗多糖制备
首先利用乙醇多次浸提除去雨生红球藻中的色素和油脂，得到雨生红球藻渣，再采用分步醇沉法提取藻渣中的水溶性多糖。具体制备流程如图1所示：称取适量雨生红球藻渣，按料液比1:25加入去离子水，调节pH10.0，于90 ℃下提取3 h；提取结束后，溶液于7000 r/min，离心20 min，上清液真空浓缩备用；向浓缩上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度为40%，于4 ℃沉淀过夜，离心（7000 r/min，20 min），所得沉淀采用Sevag法去蛋白质[19]、冷冻干燥后，所得粉末即为40%乙醇沉淀的粗多糖（HP40）；向上述上清液中再加入无水乙醇，使乙醇体积浓度为60%，于4℃沉淀过夜，离心（7000 r/min，20 min），所得沉淀经去蛋白质、冷冻干燥，即得60%乙醇沉淀的粗多糖（HP60）；向上述上清液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度为80%，于4 ℃沉淀过夜，离心（7000 r/min，20 min），所得沉淀经过去蛋白质、冷冻干燥，即得80%乙醇沉淀的粗多糖（HP80）。
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图 1 雨生红球藻渣多糖的制备流程Figure 1. Preparation of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue1.2.2 粗多糖的理化特性
1.2.2.1 糖含量
参考苯酚-硫酸法[20]测定粗多糖的糖含量。取1 mL不同浓度的待测样品于试管，依次加入1 mL 5%苯酚、5 mL浓硫酸，摇匀，室温静置20 min后，测量样品在490 nm处的吸光值。以D-葡萄糖为标准品，绘制标准曲线（y=0.0057x+0.0565，R2=0.9992）。
1.2.2.2 硫酸根含量
参考李菀等[20]的方法并稍作修改。将待测样品溶于0.2 mL 1 mol/L HCl，依次加入3.8 mL 3%三氯甲酸，和2 mL 0.5%氯化钡-明胶溶液，充分混匀，测定其在360 nm处的吸光值。空白组以0.5%明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液，K2SO4为标准品绘制标准曲线（y=0.9572x+0.1951，R2=0.9904）。
1.2.2.3 糖醛酸含量
参考李菀等[20]的方法，利用硫酸-咔唑比色原理测定糖醛酸含量，分别移取0.5 mL 1 mg/mL的HP40、HP60、HP80溶液，依次加入3 mL 9.54 mg/mL硼砂硫酸溶液，摇匀，将混合液置于100 ℃条件下15 min，冷却后分别加入0.2 mL 0.15%咔唑溶液，混匀。于530 nm处测定吸光值。以半乳糖醛酸为标准品，绘制标准曲线（y=0.0028x+0.0620，R2=0.9973），计算糖醛酸含量。
1.2.2.4 单糖组成分析
参考林丽芹等[21]的方法，取适量样品，加入1 mL 2 mol/L TFA 酸溶液，121 ℃加热2 h，通氮气吹干。加入99.99%甲醇清洗后用无菌水溶解，转入色谱瓶，外标法定量。采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析单糖组成。色谱系统为Thermo ICS 5000+离子色谱系统，检测器为电化学检测器。
液相色谱柱为Dionex™ CarboPac™ PA20（150×3.0 mm，10 μm），进样量为5 μL；柱温30 ℃；流动相A（H2O），流动相B（0.1 mmol/L NaOH），流动相C（0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaCH3COO），流速0.5 mL/min；梯度洗脱程序：0 min（95% A相：5% B相：0% C相，V/V），26~42 min（85% A相：5% B相：10% C相，V/V），42.1 min（60% A相：0% B相：40% C相，V/V），52 min（60% A相：40% B相：0% C相，V/V），52.1~60 min（95% A相：5% B相：0% C相，V/V）。
1.2.2.5 分子量分布
参考林丽芹等[21]的方法，将样品溶于0.1 mol/L NaNO3水溶液（含0.02% NaN3）中，使质量浓度为1 mg/mL。采用凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统（High pressure gel chromatography-Muitiple angle light scattering detector-Differential refractive index detector，HPSEC-MALS-RI）分析样品分子量。色谱条件：Ohpak SB-805 HQ、Ohpak SB-804 HQ和Ohpak SB-803 HQ凝胶排阻色谱柱（300×8 mm），柱温45 ℃，进样量100 μL。流动相：0.02% NaN3，0.1 mol/L NaNO3。流速：0.4 mL/min。洗脱梯度：等度100 min。
1.2.2.6 粒径与Zeta电位
配制1 mg/mL的粗多糖样品并用Zetasizer Nano-ZSE纳米粒度及Zeta电位仪测定HP40、HP60、HP80的粒径及Zeta电位。
1.2.2.7 傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）
参考李灿等[22]的方法，使用FT-IR仪在4000~500 cm−1范围扫描，得到粗多糖的红外光谱以分析其主要的化学键、官能团等结构。
1.2.3 抗氧化活性
1.2.3.1 总还原力
参考Sun等[23]的方法并稍作修改。取2.5 mL 2.0 mol/L，pH6.6的PBS、2.5 mL K3Fe（CN）6（1%，w/v）与1 mL样品混匀，50 ℃孵育20 min，冷却后加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%，w/v），离心。取2.5 mL上清液，加入0.2 mL FeCl3溶液（1%，w/v）和2.5 mL灭菌水混匀，静置10 min。测量样品在700 nm处的吸光值，以VC为阳性对照。
1.2.3.2 羟自由基清除能力
参考李菀等[20]的方法，稍作修改，具体如下：取400 μL 2 mmol/L的FeSO4，400 μL 2 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，400 μL各浓度的样品溶液，混匀，将混合液置于37 ℃保存30 min，冷却后测定样品在510 nm处的吸光值，对照组以蒸馏水代替H2O2，空白组以蒸馏水代替样品。按式（1）计算羟自由基清除率，以VC为阳性对照。
清除率(%)=A0−Ai+AxA0×100 (1) 式中：Ai表示样品溶液的吸光值；Ax表示对照组的吸光值；A0表示空白组的吸光值。
1.2.3.3 ABTS+自由基清除能力
配制不同浓度的样品溶液，按总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）说明书进行操作，具体如下：在96孔板中加入200 μL ABTS工作液和10 μL样品溶液，混匀后，室温避光静置5 min，测定溶液在734 nm处的吸光值，空白组以蒸馏水代替样品，以VC为阳性对照，测定ABTS+自由基的清除能力。
1.3 数据处理
所有试验在相同条件下重复测定3次，结果以“均值±标准差”表示，利用SPSS 16.0软件进行显著性分析，采用one-way ANONA进行单因素分析，P<0.05表示差异显著，Origin 2024软件进行作图。
2. 结果与分析
2.1 粗多糖的化学组成
采用40%、60%、80%的乙醇依次从雨生红球藻渣中分离得到HP40、HP60、HP80三个组分。当乙醇浓度为40%时其得率最高，占总醇沉粗多糖组分的63.48%，HP60次之（32.64%），HP80最低（3.82%）。同样，徐海军等[24]也发现乙醇浓度越高从霍山石斛药渣中分离到的粗多糖得率越低。然而，雪松松针多糖和淡竹叶多糖的析出得率却随着乙醇浓度的增加而增加[25−26]。这主要是由于多糖在乙醇水溶液中的溶解度与其结构有关，不同来源的多糖其单糖组成、多糖分子量和结构各不相同。本研究中多糖在低浓度的乙醇溶液中得率更高，很可能是因为雨生红球藻渣的可溶性多糖多为分子量较大的多糖，使得其在高浓度乙醇溶液中的溶解度较低。
HP40、HP60、HP80三个组分的糖含量随着乙醇浓度的升高而降低。当乙醇浓度为40%时，糖含量高达99.46%±0.015%，分别为HP60和HP80的1.46倍（P<0.05）和1.72倍（P<0.05）。有研究利用乙醇梯度醇沉海带多糖时也发现类似的情况，在乙醇浓度较低（40%）时获得糖含量最高的组分[17]。此外，本研究所得HP40纯度较高，是马尾藻褐藻多糖的1.87倍[27]、海带多糖的1.22倍[17]。这可能是由于粗多糖的来源不同，此外也与粗多糖的制备方式有一定关系，例如不同制备方式对蛋白质等杂质的去除程度不同。
由表1可见，三个组分的多糖均含有糖醛酸和硫酸根。其中，硫酸根含量在8.17%~9.21%之间，HP40、HP60之间差异不显著（P>0.05），HP80与前两者差异显著（P<0.05）；而糖醛酸含量最高9.65%±0.007%（HP60），最低为5.32%±0.001%（HP80），这说明雨生红球藻渣多糖HP多为酸性多糖。谷怡静[17]采用乙醇分级沉淀海带多糖时，也同样发现在40%和60%的乙醇提取组分中的糖醛酸含量较高。此外，粗多糖HP的糖醛酸含量（5.32%~9.65%）与5种褐藻、红藻和绿藻多糖的糖醛酸含量（4.05%~11.9%）相当[28]，略低于坛紫菜多糖（9.67%~12.33%）[29]。这主要是由于粗多糖的来源不同，其结构和组成也不同，糖醛酸含量也各有差异。此外，这也表明利用不同浓度的乙醇提取多糖，提取产物的糖醛酸、硫酸根的含量也不一样，这种差异与提取溶剂极性的变化有一定的联系。
表 1 雨生红球藻渣多糖的得率及其化学组成Table 1. Yield and chemical compositions of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue样品 HP40 HP60 HP80 得率（%） 1.01±0.058a 0.52±0.064b 0.061±0.016c 总糖含量（%） 99.46±0.015a 67.98±0.017b 57.83±0.022c 硫酸根含量（%） 8.22±0.017b 8.17±0.016b 9.21±0.004a 糖醛酸含量（%） 8.78±0.004b 9.65±0.007a 5.32±0.001c 注：不同字母表示样品间相同成分含量差异显著（P<0.05）。 2.2 单糖组成
由图2和表2可知，雨生红球藻渣多糖是由葡萄糖（Glucose，Glc）、甘露糖（Mannose，Man）、半乳糖（Galactose，Gal）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、鼠李糖（Rhamnose，Rha）、核糖（Ribose，Rib）、木糖（Xylose，Xyl）、岩藻糖（Fucose，Fuc）和葡萄糖醛酸（Glucuronic Acid，Glc-UA）等9种单糖为单元构建的杂多糖。冯以明等[5]提取的雨生红球藻多糖，主要含有Gal、Man、Ara、Glc、Xyl、Rha、Fuc、Glc-UA这8种单糖，以及少量半乳糖醛酸（Galacturonic Acid，Gal-UA）、葡萄糖胺（Glucosamine，GlcN）和半乳糖胺（Galactosamine，GalN）。该结果与本研究分析的雨生红球藻渣粗多糖的单糖组成相似，均含有Glc、Man、Gal、Ara、Xyl、Rha、Fuc和Glc-UA，然而，本文采用离子色谱法检测到HP含有核糖而不含半乳糖醛酸，与之前研究得出的结果并不一致[5]，这可能是提取方法不同所致，冯以明等[5]利用5% NaCO3溶液提取多糖，而本研究采用纯热水浸提的方法提取HP。此外，两者单糖组成的差异也可能是由藻株不同所引起，这说明雨生红球藻株的不同、提取粗多糖和检测方法的差异均会对单糖组成的分析结果产生影响。此外，在HP中未检测到果糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸（Mannuronic Acid，Man-UA）和古罗糖醛酸（Guluronic Acid，Gul-UA）。Liu等[30]采用热水浸提法获得小球藻多糖，发现其包括Rib、Rha、Ara、Xyl、Man、Glc和Gal这7种单糖。Chen等[31]通过色谱柱纯化获得的螺旋藻多糖，主要检测到Rha、Fuc、Ara、Xyl、Man和Glc这6种单糖。在雨生红球藻、小球藻、螺旋藻中均检测到Glc、Rha、Ara、Xyl、Man这5种单糖，而均未检测到果糖（Fructose，Fru）、半乳糖醛酸和甘露糖醛酸[5,30−31]，这主要是微藻株不同其单糖组成也不一样，因此不同微藻株的单糖结构单元脱水形成粗多糖的差异较大。
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图 2 标准品（A）、HP40（B）、HP60（C）、HP80（D）的HPLC色谱图Figure 2. HPLC chromatograms of standard sample (A), HP40 (B), HP60 (C) and HP80 (D)表 2 分级醇沉各组分的单糖组成（摩尔比）Table 2. Monosaccharide composition of polysaccharide fractions obtained by fractional ethanol precipitation (Molar ratio)单糖 HP40 HP60 HP80 葡萄糖（Glc） 74.57 27.92 17.62 甘露糖（Man） 8.83 20.25 30.11 半乳糖（Gal） 5.47 12.13 10.90 阿拉伯糖（Ara） 3.54 14.68 4.26 鼠李糖（Rha） 3.10 9.49 17.80 核糖（Rib） 0.00 7.85 16.62 木糖（Xyl） 2.84 4.29 2.20 岩藻糖（Fuc） 1.03 2.02 0.39 果糖（Fru） 0.00 0.00 0.00 葡萄糖醛酸（Glc-UA） 0.62 1.37 0.09 半乳糖醛酸（Gal-UA） 0.00 0.00 0.00 甘露糖醛酸（Man-UA） 0.00 0.00 0.00 古罗糖醛酸（Gul-UA） 0.00 0.00 0.00 不同乙醇沉淀的三个组分（HP40、HP60、HP80）的单糖组成基本一致，均含有Glc、Man、Gal、Ara、Rha、Xyl、Fuc、Glc-UA这8种单糖。除这8种单糖外，HP60、HP80与HP40相比，还多了核糖。此外，核糖的含量随着乙醇浓度的增加而增加，当乙醇浓度由40%增至60%时，核糖含量由0.00%增至7.85%，当乙醇浓度增至80%时，核糖含量增至最高（16.62%）。本研究提取的HP40不含核糖，与之前报道采用不同浓度的乙醇沉淀多糖种类相同，但比例不同的结果并不一致[32]，这也可能是由于HP40中核糖的含量极少而未被检测到。但是，由表1可知，HP40的得率是三个组分中最高的，这可能是因为在低浓度乙醇中析出的粗多糖，即HP40，大多由葡萄糖以及其他单糖（除核糖外）聚合而成。
此外，三个组分的摩尔比各不相同。其中，HP40的Glc含量最高（74.57%）、Man次之（8.83%）、Gal第三（5.47%），而Ara（3.54%）和Rha（3.10%）含量最低。与HP40不同的是，HP60中含量较高的单糖分别为Glc（27.92%）、Man（20.25%）和Ara（14.68%）；HP80中含量较高的单糖依次为Man（30.11%）、Rha（17.80%）、Glc（17.62%）。葡萄糖主要富集于40%的乙醇中，阿拉伯糖主要富集于60%的乙醇中，半乳糖主要在乙醇浓度较高时（60%和80%）析出。此外，甘露糖占比与乙醇浓度呈正相关关系，当乙醇浓度提高至80%时其含量达到最高（30.11%），甚至超过了葡萄糖（17.62%），为HP40的3.40倍。可见，乙醇浓度不同，沉淀多糖的单糖组成、摩尔比也各不相同。此外，三个组分的核糖含量有较大差异，HP40的核糖含量基本为0.00%，而HP80的核糖含量却达16.62%。这主要是与单糖的极性，多糖中单糖组成单元的连接方式、基团的极性相关，而单糖的极性又与含氧原子数量及其位置有关。类似地，有研究采用不同浓度分离的微拟球藻多糖也是杂多糖，并且3种粗多糖的单糖组成、摩尔比也各不相同[21]。其中，40%乙醇浓度提取多糖的Glc、Man、Fuc的摩尔比为11.15:13.42:53.03；而60%和80%乙醇浓度多糖中三者的摩尔比依次为2.30:19.81:31.65和58.16:18.06:12.61。并且，60%的多糖包含7种单糖，而80%的多糖却只检测到5种单糖。这说明乙醇浓度会影响多糖的单糖的种类以及摩尔比。有研究表明，提取方法的不同会导致多糖之间的单糖的含量显著差异，从而进一步影响其生物活性[33]。
2.3 分子量分布
三个组分HP40、HP60、HP80的分子量分布结果如图3所示。可见，粗多糖分子量分布范围广，且各组分的部分参数之间差值较大，形成的峰形态也有差异。如表3所示，HP40、HP60、HP80的数均分子量（Mn）与乙醇浓度呈负相关关系，三者依次为206.42±0.03、18.38±0.09、11.84±0.14 kDa。并且，峰值分子量、重均分子量、z均分子量，均随着乙醇浓度的不断上升而逐渐减小。说明乙醇浓度会影响雨生红球藻渣多糖的分子量大小，且浓度越高，分子量越小。
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图 3 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的分子量分布注：LS指多角度激光光散射信号；dRI指相对示差信号。Figure 3. Molecular weight distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)表 3 雨生红球藻渣多糖分子量的相关参数Table 3. Related parameters of molecular weight of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue样品 HP40 HP60 HP80 峰值范围（min） 32.00~62.00 34.00~62.00 42.00~61.00 多分散指数（Mw/Mn） 5.88 8.80 2.37 数均分子量Mn （kDa） 206.42±0.03 18.38±0.09 11.84±0.14 峰值分子量Mp （kDa） 49.06±0.06 6.30±0.17 5.57±0.22 重均分子量Mw （kDa） 1212.98±0.01 161.79±0.02 28.02±0.04 z均分子量Mz （kDa） 11453.78±0.04 2634.84±0.03 82.21±0.09 此外，由表3所示，粗多糖的多分散指数（Mw/Mn）的范围为2.37~8.80，说明采用梯度醇沉得到的HP为多分散聚集体[17]。HP60的多分散指数最高，说明其分子量分布的范围最广，谱带范围最宽。同样，Premarathna等[34]从不同藻株中提取的红藻多糖，其粗多糖的分子量分布范围也较广，但不同藻株的分子量分布也各不相同。其中，从角叉菜中提取的粗多糖分子量较大，平均分布于1117~1456 kDa，而从掌形藻和高氏马尾藻中提取的粗多糖分子量分别在142~497 kDa和340~689 kDa之间。此外，Niu等[35]采用梯度醇沉提取仙草多糖，其分子量大小与乙醇浓度也呈负相关关系，表明提取藻株、乙醇浓度的不同对提取多糖的分子量均有一定的影响。这可能与多糖羟基的多少有关，其数量越多，极性、亲水性也越大。然而乙醇浓度越高，溶液的极性就越小，越易与水竞争，从而促进多糖的分子内结合并发生沉淀[32]。因此，分子量越大，多糖的溶解度越差。
研究表明，分子量还会影响所提取多糖的生物活性，使各组分产生差异[32,36]。因此，本研究通过对乙醇浓度的控制，对雨生红球藻渣多糖进行初步分离。
2.4 粒径和Zeta电位
HP40、HP60、HP80的粒径大小如图4所示，随着乙醇浓度的上升，所沉淀多糖的粒径逐渐减小。其中，HP40和HP60的粒径分布主要集中在20~400 nm，分别占总峰面积的96.9%和94.4%；而HP80的粒径主要分布在10~1000 nm范围内，占峰面积的64.4%；少部分分布在1~10 nm，仅占28.8%；以及极少部分分布在4000 nm附近。三个组分的平均粒径依次为130.23±0.47、135.15±2.48、73.505±2.41 nm。其中，HP80的平均粒径最小，分别为HP40、HP60的56%和54%。研究表明，一定范围内多糖的粒径越小越容易被吸收利用[37]，可见，粒径较小的HP80（73.505±2.41 nm）可能具有更好的生物利用潜力。
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图 4 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的粒径分布Figure 4. Particle size distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)Zeta电位可反映样品粒子表面静电荷所产生的电位高低，其绝对值越高，溶液体系越稳定。图5为三个多糖组分的Zeta电位分布图。其中，HP40、HP60溶液表面以正电荷为主，而HP80以负电荷为主。分析结果表明，HP40、HP60、HP80的Zeta电位分别为0.430、0.642、−11.6 mV。这说明乙醇浓度会影响HP的Zeta电位。研究表明，溶液的Zeta电位绝对值越大，其溶液越不容易发生聚集和絮凝，稳定性就越高，具有更高的利用价值[38−39]。因此，HP80在食品、药物中更容易被吸收利用，在生产中具有更广的应用前景。
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图 5 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的Zeta电位分布Figure 5. Zeta potential distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)2.5 傅里叶红外光谱（FT-IR）
HP40、HP60、HP80在4000~500 cm−1范围内的FT-IR分析结果如图6所示。不同浓度乙醇沉淀的雨生红球藻渣多糖，其特征吸收峰基本一致。但HP40、HP60、HP80所产生吸收峰的锋利程度逐渐降低，说明三种粗多糖的糖含量依次降低。其中，3300 cm−1附近的强宽吸收峰由-OH伸缩振动所产生[32]，2925 cm−1附近不明显的吸收峰由C-H的伸缩振动所产生[15]。三个组分在1630、1633 cm−1附近的吸收峰由C=O的伸缩振动所产生，而1410 cm−1附近较小的吸收峰与C-O的伸缩振动有关，表明三个组分都含有糖醛酸[15]。此外，1200~1000 cm−1附近的吸收峰是多糖的指纹区的吸收峰，与C-O-C或C-O吡喃糖环的伸缩振动有关，表明这三种粗多糖均含有α-吡喃糖环[22]。该结果与林丽芹等[21]的分析结果相似，其也发现采用不同浓度的乙醇沉淀微拟球藻多糖，不同组分其FT-IR谱图趋势基本一致，并且均含有多糖的典型吸收峰。
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图 6 HP40、HP60、HP80在4000~500 cm−1范围内的FT-IR光谱Figure 6. FT-IR spectra of HP40, HP60 and HP80 in the range of 4000~500 cm−12.6 抗氧化活性
2.6.1 总还原力
采用吸光值的大小评估总还原力的大小，其吸光值越大，总还原力越强。如图7（A）所示，三种粗多糖的总还原力为HP80>HP60>HP40，且均低于VC阳性对照（P<0.05）。一定浓度范围内（0.04~10.0 mg/mL），三种粗多糖的吸光值在0.1~0.5的范围内呈缓慢上升趋势。并且，粗多糖的总还原力随浓度的上升而上升，这与之前的研究结果一致[40]，即总还原力呈现剂量依赖性。当样品浓度低于5 mg/mL时，三种粗多糖溶液的吸光值均低于0.3，总还原力较弱。但是，VC的总还原力随其浓度的缓慢上升并达到较高水平，当浓度增至1 mg/mL时，其吸光值达到2.3。当浓度均为2 mg/mL时，HP80的吸光值（0.186）低于马尾藻多糖的吸光值（0.497）[40]；而浓度均为10 mg/mL时，HP80的吸光值（0.582）高于裸藻多糖的吸光值（0.170）[41]。这表明多糖的总还原力不仅与其浓度有关，还与多糖的来源、提取方式有关。
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图 7 多糖的抗氧化活性注：相同浓度下的不同字母表示样品间抗氧化活性差异显著（P<0.05）。Figure 7. Antioxidant activity of polysaccharides2.6.2 羟自由基清除能力
HP40、HP60、HP80对羟自由基的清除能力如图7（B）所示。样品浓度在0.04~10.0 mg/mL范围内时，三个组分对羟自由基的清除能力随浓度的上升而上升。其中，HP80的羟自由基清除能力最强，最高可达96%以上（10.0 mg/mL），为HP40的1.51倍（P<0.05）。当粗多糖浓度较低时（0.04~2.0 mg/mL），三个组分的羟自由基清除率从10%逐渐增加到40%，而VC的清除率迅速增至80%以上，并且，在该浓度范围内时HP与VC的羟自由基清除能力差异显著（P<0.05）。然而，当浓度较高时（5.0~10.0 mg/mL），HP60和HP80的羟自由基清除率则可达到较高水平，与VC之间无显著差异（P>0.05），其IC50分别为2.233 mg/mL，2.105 mg/mL。据报道，紫菜多糖[37]和岩藻多糖[42]对羟自由基的IC50分别为26.59 mg/mL、6.02 mg/mL，均高于HP60和HP80对羟自由基的半抑制浓度，说明HP60、HP80具有较好的羟自由基清除能力，具有抗氧化剂的开发前景。
2.6.3 ABTS+自由基清除能力
HP对ABTS+自由基的清除能力如图7（C）所示，在0.04~10 mg/mL范围内总体呈上升趋势，且HP80的ABTS+自由基清除能力最强，但HP清除ABTS+自由基能力均弱于VC（P<0.05）。当浓度为10 mg/mL时，HP80对ABTS+自由基的清除率达到53.69%，分别为HP40、HP60的2.67倍和1.62倍（P<0.05）。类似的，杨迪等[43]提取的普通和富硒小球藻多糖也表现出剂量依赖性。当浓度为2 mg/mL时，HP80对ABTS+清除率最高（19.21%），低于同等浓度下的富硒小球藻多糖[43]（约80%）和海带多糖[44]（60.06%），但同之前报道中未破壁的雨生红球藻多糖[12]相近（约为15.20%）。因此，三种粗多糖的ABTS+清除率低于报道可能与粗多糖来源、试验方法、试验环境等因素有关。
3. 结论
采用不同浓度的乙醇（40%、60%和80%）对雨生红球藻渣多糖进行沉淀，可达到初步分离的效果。随着乙醇浓度的升高，提取粗多糖的得率、糖含量反而降低。其中，HP40的得率和糖含量最高，分别为1.01%±0.058%和99.46%±0.015%。此外，雨生红球藻渣多糖是包含Glc、Man、Gal、Ara、Rha、Xyl、Fuc、Rib和Glc-UA这9种单糖的杂多糖。三种粗多糖的单糖组成、分子量、粒径、Zeta电位以及FT-IR光谱的锋利程度均会受到乙醇浓度的影响。其中，HP80的数均分子量最小（11.84±0.14 kDa），且粒径最小（73.505±2.41 nm）、Zeta电位的绝对值最大（−11.6 mV），表明其可能具有更好的生物利用潜力。
抗氧化分析结果表明，粗多糖的抗氧化能力为HP80>HP60>HP40。HP80的羟自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、总还原力最强，其中羟自由基清除率最高可达96%以上（10.0 mg/mL）。这说明所提取的粗多糖具一定的抗氧化能力，具有较好的应用前景，有望用于抗氧化制剂开发、保健品开发等。
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图 1 雨生红球藻渣多糖的制备流程
Figure 1. Preparation of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue
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图 2 标准品（A）、HP40（B）、HP60（C）、HP80（D）的HPLC色谱图
Figure 2. HPLC chromatograms of standard sample (A), HP40 (B), HP60 (C) and HP80 (D)
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图 3 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的分子量分布
注：LS指多角度激光光散射信号；dRI指相对示差信号。
Figure 3. Molecular weight distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)
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图 4 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的粒径分布
Figure 4. Particle size distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)
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图 5 HP40（A）、HP60（B）、HP80（C）的Zeta电位分布
Figure 5. Zeta potential distribution of HP40 (A), HP60 (B) and HP80 (C)
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图 6 HP40、HP60、HP80在4000~500 cm−1范围内的FT-IR光谱
Figure 6. FT-IR spectra of HP40, HP60 and HP80 in the range of 4000~500 cm−1
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图 7 多糖的抗氧化活性
注：相同浓度下的不同字母表示样品间抗氧化活性差异显著（P<0.05）。
Figure 7. Antioxidant activity of polysaccharides
表 1 雨生红球藻渣多糖的得率及其化学组成
Table 1 Yield and chemical compositions of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue
样品 HP40 HP60 HP80 得率（%） 1.01±0.058a 0.52±0.064b 0.061±0.016c 总糖含量（%） 99.46±0.015a 67.98±0.017b 57.83±0.022c 硫酸根含量（%） 8.22±0.017b 8.17±0.016b 9.21±0.004a 糖醛酸含量（%） 8.78±0.004b 9.65±0.007a 5.32±0.001c 注：不同字母表示样品间相同成分含量差异显著（P<0.05）。 
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表 2 分级醇沉各组分的单糖组成（摩尔比）
Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharide fractions obtained by fractional ethanol precipitation (Molar ratio)
单糖 HP40 HP60 HP80 葡萄糖（Glc） 74.57 27.92 17.62 甘露糖（Man） 8.83 20.25 30.11 半乳糖（Gal） 5.47 12.13 10.90 阿拉伯糖（Ara） 3.54 14.68 4.26 鼠李糖（Rha） 3.10 9.49 17.80 核糖（Rib） 0.00 7.85 16.62 木糖（Xyl） 2.84 4.29 2.20 岩藻糖（Fuc） 1.03 2.02 0.39 果糖（Fru） 0.00 0.00 0.00 葡萄糖醛酸（Glc-UA） 0.62 1.37 0.09 半乳糖醛酸（Gal-UA） 0.00 0.00 0.00 甘露糖醛酸（Man-UA） 0.00 0.00 0.00 古罗糖醛酸（Gul-UA） 0.00 0.00 0.00
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表 3 雨生红球藻渣多糖分子量的相关参数
Table 3 Related parameters of molecular weight of polysaccharides from Haematococcus pluvialis residue
样品 HP40 HP60 HP80 峰值范围（min） 32.00~62.00 34.00~62.00 42.00~61.00 多分散指数（Mw/Mn） 5.88 8.80 2.37 数均分子量Mn （kDa） 206.42±0.03 18.38±0.09 11.84±0.14 峰值分子量Mp （kDa） 49.06±0.06 6.30±0.17 5.57±0.22 重均分子量Mw （kDa） 1212.98±0.01 161.79±0.02 28.02±0.04 z均分子量Mz （kDa） 11453.78±0.04 2634.84±0.03 82.21±0.09
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