Functional Characteristics and Lipid Lowering Activity of Auricularia heimuer Soluble Dietary Fiber
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摘要: 本研究以热水提取黑木耳多糖后剩余的黑木耳残渣为原料，通过复合酶法提取黑木耳可溶性膳食纤维（Auricularia heimuer soluble dietary fiber，HSDF），对其分子量、单糖组成及糖链组成进行分析，检测其持水力、持油力、膨胀力等理化性质，并通过测定胆固醇吸附能力、脂肪酶抑制率及胆酸盐结合率，评价其体外降脂活性。通过高脂喂养（High-fat diet，HFD）C57BL/6J小鼠构建肥胖动物模型，给予黑木耳可溶性膳食纤维治疗，评估HSDF治疗肥胖小鼠的体重、生化指标以及肝脏组织和脂肪组织病理学改变特征，探究其在肥胖小鼠模型中的降脂效果。结果表明，HSDF的相对分子量为4.14×105 Da，是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖聚合而成的混合物，摩尔比为1808.87:0.00278:4.43:2.13:2.84:5.01。HSDF平均持水力为（11.62±0.302）g·g−1，平均持油力为（2.95±0.259）g·g−1，平均膨胀力为（12.7±0.434）mL·g−1，对肠道胆固醇的吸附能力为6.63 mg·g−1；浓度为1.2 mg·mL−1时，对甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠的结合率可达92.91%和90.93%。此外，浓度为2.0 mg·mL−1的HSDF对胰脂肪酶抑制率为75%，具有良好的体外降脂活性。同时，HSDF可以显著（P<0.05）改善HFD小鼠脏器指数，改善HFD小鼠肝脏中脂质积累、炎性细胞浸润及脂肪组织中脂肪细胞增大，对于附睾白色脂肪组织细胞面积的改善可以达到50%以上，具有较好的体内降脂效果，结果可为后续黑木耳膳食纤维的研究以及功能食品的研发提供数据支持与理论基础。Abstract: In this study, the residue of Auricularia heimuer polysaccharide after hot water extraction was used as raw material, and the soluble dietary fiber (HSDF) of A. heimuer was extracted by compound enzyme method. Its molecular weight, monosaccharide composition and sugar chain composition were analyzed, its water holding capacity, oil holding capacity, swelling power and other physical and chemical properties were detected, and its lipid-lowering activity in vitro was evaluated by measuring cholesterol adsorption capacity, lipase inhibition rate and cholate binding rate. The obese animal model was constructed by high fat diet (HFD) C57BL/6J mice, and treated with A. heimuer soluble dietary fiber. The body weight, biochemical indexes, and pathological changes of liver tissue and adipose tissue of HSDF treated obese mice were evaluated, and its lipid-lowering efficacy in obese mouse model was explored. Results showed that the relative molecular weight of HSDF was 4.14×105 Da, which was a mixture of mannose, glucuronic acid, glucose, galactose, xylose and fucose. The molar ratio was 1808.87:0.00278:4.43:2.13:2.84:5.01. The average water holding capacity of HSDF was (11.62±0.302) g·g−1, the average oil holding capacity was (2.95±0.259) g·g−1, the average swelling capacity was (12.7±0.434) mL·g−1, and the adsorption capacity of intestinal cholesterol was 6.63 mg·g−1. When the concentration was 1.2 mg·mL−1, the binding rate of sodium glycocholate and sodium taurocholate could reach 92.91% and 90.93%. In addition, HSDF with a concentration of 2.0 mg·mL−1 had a 75% inhibition rate of pancreatic lipase, and had good lipid-lowering activity in vitro. At the same time, HSDF could significantly (P<0.05) improve the organ index of HFD mice, improve the lipid accumulation, inflammatory cell infiltration in the liver and adipocyte enlargement in adipose tissue of HFD mice, and improve the cell area of white adipose tissue of epididymis by more than 50%, which had a good lipid-lowering effect in vivo. The results can provide data support and theoretical basis for the subsequent research on dietary fiber of A. heimuer and the research and development of functional food.
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高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是体内脂质代谢紊乱的表现，也是诱发动脉粥样硬化直接因素[1−2]。据统计，每年因心血管疾病（Cardiovascular disease，CVDs）死亡的人数占全球总死亡人数的32%，这也是全球死亡率增高的主要原因之一。目前，临床上常用于治疗高血脂的药物为他汀类药物，但长期服用不仅会产生很多副作用，还会增加经济负担。因此，有必要开发具有降血脂功能的天然物质产品，作为对抗疗法药物的替代途径。膳食纤维（dietary fiber，DF）是在人体小肠中不能被消化吸收，而在大肠中完全或部分发酵的植物性可食用部分或类似碳水化合物的总称，具有良好的营养价值和生理功能，被认为是“第七大营养素”，金针菇、胡萝卜、燕麦以及滇橄榄果渣等多糖或膳食纤维已被发现具有显著的降脂作用[3−4]。
黑木耳（Auricularia heimuer F.）隶属于担子菌门、蘑菇纲、木耳目、木耳科、木耳属[5−6]，在我国有千余年的栽培历史，是我国食用菌第二大栽培品种[7]。黑木耳的膳食纤维含量高达51.92~57.57 g/100 g，是黑木耳中最主要的成分之一[8]，具有开发为天然降脂活性成分的潜力，但目前对于其降脂活性的研究仍不完善，因此，本研究采用复合酶法提取黑木耳残渣中可溶性膳食纤维，并对其胆固醇吸附能力、脂肪酶抑制率和胆酸盐结合率进行了详细的测试，以评估其在体外的降脂效果，并通过构建肥胖动物模型，探究黑木耳可溶性膳食纤维对高脂饮食诱导的肥胖症的降脂作用效果，为后续黑木耳膳食纤维的研究以及功能食品的研发提供数据支持与理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
4周龄C57BL/6J小鼠 购自北京维通利华生物科技有限公司（动物许可证号：SCXK（京）2021-0006），实验动物方案通过吉林农业大学动物伦理审批（动物实验伦理号：20220921001）；热水提取黑木耳多糖后剩余的黑木耳残渣干粉 由吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心提供；纤维素酶 10000 U/g，上海麦克林生化科技有限公司；果胶酶 40 U/mg，武汉华翔科洁生物技术有限公司；鸡蛋 市售；胆固醇 四川维克奇生物科技有限公司；胰脂肪酶 30~90 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；奥利司他 重庆植恩药业有限公司；辛他伐汀 北京双鹭药业股份有限公司；胰蛋白酶 50 U/mg，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；血清总胆固醇（TC）试剂盒、血清甘油三酯（TG）试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司。
AL104分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；KJ 20AL超声机 深圳市科洁超声科技有限公司；THZ-98A恒温摇床振荡器 上海一恒科学仪器有限公司；Model 1680酶标分析仪 伯乐生命医学产品有限公司；ALPHA1-4真空冷冻干燥机 江苏肯尔菲实验仪器贸易有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黑木耳可溶性膳食纤维提取及含量测定
称取黑木耳残渣干粉，料液比为1:80（g:mL），液体为纯净水，80 ℃提取5 h后，在转速7000 r/min下离心15 min，取上清液1；在下层沉淀中，料液比为1:30（g:mL），向其中加入Na2CO3溶液，常温下超声提取30 min，然后以7000 r/min速度离心15 min，得到清液2。将下层沉淀用蒸馏水洗至中性，60 ℃，20 h进行烘干。在烘干的沉淀中，按照1:30的料液比例加入蒸馏水，pH调节至5.0。加入0.9%的纤维素酶和果胶酶，并在50 ℃下酶解反应3.5 h。随后，在100 ℃下灭活20 min，在转速为7000 r/min下离心15 min，通过分离过程得到上清液3，pH调节至7.0，合并上清液1、2、3，进行60 ℃，12 h浓缩及−50 ℃，12 h冻干处理，最终获得黑木耳可溶性膳食纤维（HSDF）。
可溶性膳食纤维的质量分数按照GB 5009.88-2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》中的酶重量法进行测定。蛋白质含量的测定参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品的方法测定》。采用ICP-OES方法，依据GB 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》，对黑木耳可溶性膳食纤维（HSDF）中的铁元素进行测量。
1.2.2 黑木耳可溶性膳食纤维组成分析
1.2.2.1 分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法对HSDF进行分子量测定[9]，称取分子质量（Mv）为10、40、70、100、200、500 kDa的葡聚糖标准品，加蒸馏水配制成10 mg/mL溶液，过0.22 μm水相滤膜，保留时间t为x轴，相对分子质量对数lg Mw为y轴，绘制标准曲线（y=−0.23361x+7.6677，R2=0.9941）。称取5 mg HSDF加入蒸镏水配制成10 mg/mL溶液，过0.22 μm水相滤膜，进行检测并记录色谱图。色谱条件为：Agi-lent 1260 Infinity ELSD蒸发光散射检测器，TSK-gel G-3000PWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm），柱温为35 ℃，流动相为蒸馏水，流速为0.6 mL/min。根据标准曲线，计算SDF相对分子质量。
1.2.2.2 单糖组成分析
通过高效液相色谱对HSDF单糖组成进行测定，称取HSDF 5 mg，加入配制好的TFA溶液，121 ℃加热2 h，氮气吹干。加入甲醇清洗再吹干，重复3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。流动相：A相：ddH2O；B相：200 mmol/L NaOH；C相：200 mmol/L NaOH/500 mmol/L NaAC。洗脱程序为：0~30 min流动相A、B、C分别为99.2%、0.8%和0%；30~40 min流动相A、B、C分别为79.2%、0.8%和20%；40~60 min流动相A、B、C分别为20%、80%和0%；60 min流动相A、B、C分别为99.2%、0.8%和0%。流速：0.5 mL/min。
1.2.2.3 红外光谱分析
称好的样品和溴化钾（KBr）放入烘干机中，烘干4 h；将样品与溴化钾以质量比1:100的比例充分研磨，混合均匀，用压片机将混合物压成透明片，在4000~500 cm−1范围内扫描，扫描次数为64，分辨率为4 cm−1。
1.2.3 黑木耳可溶性膳食纤维理化性质测定
1.2.3.1 持水力的测定
参照文献[10]，称取0.5 g的HSDF，加入8 mL蒸馏水混合均匀。在室温条件下静置18 h，然后在3000 r/min下离心20 min。记录离心后沉淀的质量为mf，将沉淀在105 ℃下干燥，直到质量恒定，记录此时的质量为md。每组重复3次，持水力（WRC）计算公式如下：
WRC(g/g)=mf−mdmd 式中：WRC为膳食纤维持水力，g/g；mf为离心后沉淀质量，g；md为干燥后沉淀质量，g。
1.2.3.2 持油力的测定
参照文献[11]，准确称取0.2 g HSDF（标记为m0），将其放入离心管中，再次称量离心管和样品的总质量为m1。接下来，加入5 mL精制菜籽油，与样品充分混合。将混合物在室温下静置18 h，并以6000 r/min的速度离心10 min。之后，去除表面的油，并称量剩余物质（表示为m2）。每组三次平行试验，按照以下公式计算持油力（OAC）。
OAC(g/g)=m2−m1m0 式中：OAC为膳食纤维持油力，g/g；m0为称量的HSDF质量，g；m1为总质量，g；m2为剩余物质总质量，g。
1.2.3.3 膨胀力的测定
参照文献[12]，准确称取0.5 g HSDF（m），放入离心管中。轻轻振动离心管以保持样品平面水平，并记录初始体积为V0。向其中加入10 mL蒸馏水，将混合物置于环境温度下，水合18 h，并记录最终体积V。膨胀力（WSC）计算公式如下：
WSC(mL/g)=V−V0m 式中：WSC为膳食纤维膨胀力，mL/g；m为称量的HSDF质量，g；V0为初始体积，mL；V为最终体积，mL。
1.2.4 黑木耳可溶性膳食纤维体外降脂活性
1.2.4.1 胆固醇吸附能力
鸡蛋取鸡蛋黄，去除蛋清，随后向其中加入9倍体积的去离子水稀释，充分搅打，在200 mL锥形瓶中加入50 mg HSDF，加入15 mL上述蛋黄液，将pH分别调至2和7，对人的胃和肠道环境进行模拟[13]。置于37 ℃的环境下，进行2 h的搅拌，在4000 r/min下离心20 min，抽取上清液400 μL，将1 mL浓硫酸加入1.5 mL配制好的OPA试剂盒，混匀后，置于室温10 min，最终以550 nm波长检测样本的吸光度。以胆固醇标准浓度为横坐标x，以吸光度为纵坐标y绘制标准曲线，根据标准曲线（y=0.0094x−0.0076，R2=0.9965）求出胆固醇的浓度。
胆固醇吸附能力(mg/g)=a−bm 式中：a为吸附前蛋黄液中的胆固醇含量，mg；b为吸附后上清液中的胆固醇含量，mg；m为HSDF加入量，g。
1.2.4.2 胆酸盐吸附能力
取3 mL HSDF于锥形瓶中，向其中加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶（溶于pH 6.3的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液），1 mL 0.01 mol/L HCl，以模拟胃消化过程及环境。向每个样品中同等加入4 mL 0.4 mmol/L的甘氨胆酸钠、0.5 mmol/L牛磺胆酸钠，于37 ℃恒温条件下振荡1 h，将混合物转移至离心管中，以4000 r/min离心20 min，取上清液，采用比色法进行测定，每个样品平行3次。胆酸盐结合率计算公式如下：
胆酸盐结合率(%)=胆酸盐加入量−胆酸盐剩余量胆酸盐加入量×100 1.2.4.3 胰脂肪酶抑制活性
将0.5 mg胰脂肪酶溶解于1 mL PBS缓冲液（200 mmol/L pH7.5）中，配制成0.5 mg/mL溶液；称取0.5 mg 4-甲基伞形酮油酸酯（4-MUO），将其溶解于浓度1 mL的PBS缓冲液（200 mmol/L pH7.5），配比得到浓度为0.5 mg/mL的溶液备用；继续称取40 mg HSDF溶解于4 mL PBS缓冲液中，配制成10 mg/mL溶液，并设置不同浓度梯度。最终在320 nm激发波长和450 nm发射波长下测量吸光度。并将奥利司他和辛他伐汀作为阳性对照。抑制率的计算公式为：
胰脂肪酶抑制率(%)=(1−A样品−A样品对照A空白−A空白对照)×100 1.2.5 黑木耳可溶性膳食纤维体内降脂效果
1.2.5.1 动物建模给药
实验以90只4周龄雄性C57BL/6J小鼠为对象，体重20~22 g。动物室内的温度保持在20～25 ℃，湿度保持在50%～55%，给予明/暗光照时间分别为12 h。对小鼠进行适应性喂养1周后，随机选择75只小鼠喂食60%的高脂肪饲料（D12492）进行建模，其余小鼠作为空白组（NC），继续饲喂普通饲料。建模时间为8周。成功建立肥胖小鼠模型后，剔除建模不成功的小鼠，将空白对照组以外的其他小鼠随机分为五组（n=8）：模型组（MC）、阳性对照组（PC）、HSDF低剂量组（SL，100 mg/kg）、中剂量组（SM，200 mg/kg）和高剂量组（SH，400 mg/kg）。分组后，空白对照组的小鼠继续每天喂食基础饲料，其他组继续喂食高脂饲料。根据体重对小鼠进行灌胃给药，阳性药选择为奥利司他（150 mg/kg）。给药期间自由饮水和进食。给药周期为6周。
1.2.5.2 样品收集
实验结束后，解剖小鼠，取小鼠肝脏、腹股沟白色脂肪组织、肾周白色脂肪组织、附睾白色脂肪组织、肩胛骨棕色脂肪组织，对各个组织进行称重，一部分放入5 mL离心管中，于-80 ℃进行保存，其余部分用4%多聚甲醛固定，常温保存，用于后续实验。
1.2.5.3 血清生化指标测定
根据相关试剂盒说明书对小鼠血清总胆固醇（Total cholestero，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）指标进行检测。
1.2.5.4 苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，H&E）染色检测
将切割好的组织和相应的标签放入脱水槽中。将脱水槽放入脱水器内的篮子中，逐渐梯度脱水。浸蜡组织在包埋机内进行包埋。将蜡块从框架中取出并切割，切片厚度为4 μm。切片漂浮在40 ℃摊铺机的温水中，将组织压平，用载玻片将其拾起，并在60 ℃的烘箱中烘烤。完成后，进行H&E染色以及显微镜观察，进行图像采集分析。
1.2.5.5 脂肪细胞测量
采用Image-pro plus 6.0 （Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA）分析软件，每组内每张切片挑选200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件以200倍标尺为标准，每张切片选取5个完整的脂肪细胞测量面积。
1.3 数据处理
所有试验均重复测定3次，并采用SPSS 20软件对数据进行统计分析，利用Origin9.0软件绘图，数据处理采用单因素方差分析中Tukey法比较组间的差异性，当P<0.05时具有统计学差异，数据表示为平均值±标准误差。
2. 结果与分析
2.1 黑木耳可溶性膳食纤维成分分析及理化性质
HSDF的提取率为78%，经检测确定HSDF由50.7%的膳食纤维，14.86%的粗多糖，18.1%的蛋白质组成，并含有255 mg/kg的Fe（表1）。理化性质分析结果表明（表2），HSDF的平均持水力为（11.62±0.302）g/g，平均持油力为（2.95±0.259）g/g，平均膨胀力为（12.7±0.434）mL/g，膳食纤维具有大量的亲水基团，与水分子结合后会起到膨胀的效果，在胃肠道中会增强饱腹感，从而有助于减肥降脂[14]。所测性质高于毕云枫等[15]从人参残渣中所提取的膳食纤维，以及杭书扬等[16]从山药皮残渣中所提取的可溶性膳食纤维，接近张羽婷[17]所提取的梯棱羊肚菌可溶性膳食纤维，表现出良好的理化性质。
表 1 HSDF成分分析Table 1. Composition analysis of HSDF成分 含量 总膳食纤维（g/100 g） 50.7 可溶性膳食纤维（g/100 g） 78 粗多糖（g/100 g） 14.86 铁元素（mg/kg） 255 蛋白质（g/100 g） 18.1 表 2 HSDF的理化性质Table 2. Physicochemical properties of HSDF指标 结果 持水力（g/g） 11.62±0.302 持油力（g/g） 2.95±0.259 膨胀力（mL/g） 12.7±0.434 2.2 黑木耳可溶性膳食纤维的分子量测定
对样品分子量进行标准曲线的绘制，回归曲线为lg=−0.23361x+7.6677，R2=0.9941。在此条件下测定HSDF的分子量（图1），HSDF洗脱峰为单一洗脱峰，保留时间为8.779 min，代入分子量标准曲线得到分子量为4.14×105 Da。
2.3 黑木耳可溶性膳食纤维的单糖组成分析
HSDF经酸解及衍生化后，通过HPLC检测的结果如图2所示。甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖保留时间分别为18、30.2、39.5、45.5、48.1、58.1 min。根据计算得出，HSDF单糖组成摩尔百分比为1808.87:0.00278:4.43:2.13:2.84:5.01。
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图 2 HSDF单糖组成分析注：Man甘露糖，Glc A葡萄糖醛酸，Glc葡萄糖，Gal半乳糖，Xyl木糖，Fuc岩藻糖。Figure 2. Analysis of monosaccharide composition of HSDF2.4 黑木耳可溶性膳食纤维的红外光谱分析
如图3所示，黑木耳可溶性膳食纤维具有纤维素类多糖的特征吸收峰，其中在波数3400 cm−1附近的宽吸收峰是O-H键伸缩振动产生的，说明分子内氢键较多，这增加膳食纤维的亲水性[18]；在波数2900 cm−1附近出现由糖类甲基和亚甲基C-H引起的伸缩振动，在波数1600 cm−1附近是羧基或醛基的特征峰，说明黑木耳残渣SDF中含有糖醛酸；在波数1000 cm−1左右具有C-O-C引起的伸缩振动[19]。综上，HSDF具有较多的亲水基团，是由多糖聚合而成的β-吡喃糖。
2.5 黑木耳可溶性膳食纤维体外降脂活性
2.5.1 吸附胆固醇能力
胆固醇在体内有着广泛的生理作用，然而它也可能导致高脂血症，并且可能会造成如动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症等严重问题[20]。HSDF能够吸附胆固醇，可以有效降低机体胆固醇含量，从而减少相关并发症的发生[21−22]。对HSDF的胆固醇吸附能力进行分析，在pH为7时，HSDF对胆固醇的吸附能力为6.63 mg/g，而当pH为2时，吸附能力为3.68 mg/g，即HSDF在肠道中的吸附能力强于在胃中的吸附能力。这可能是因为膳食纤维对胆固醇的吸附能力受pH条件的显著影响，在酸性条件下，较多的H+使样品与胆固醇均带有一定的正电荷，两者产生排斥力，减弱了样品对胆固醇的吸附[23]。膳食纤维对胆固醇的吸附能力常作为亲脂性物质的评价指标，且已有文献报道，膳食纤维可减少小肠对过量供给的甘油三酯和胆固醇的吸收和利用，从而降低血胆固醇的水平[24]。马凤等[25]从梨渣中提取可溶性膳食纤维，测得在肠道环境中对胆固醇吸附能力为4.81 mg/g。HSDF具有较好的胆固醇吸附能力，膳食纤维在消化道中对其的吸附能力越强，越能起到更好的作用效果。
2.5.2 结合胆酸盐能力
纤维素和果胶等物质可以与胆盐结合成复合物，从而阻止微小胆固醇颗粒的形成，进而降低胆固醇的吸收[26]。HSDF结合甘氨胆酸钠及牛黄胆酸钠的能力结果见图4，HSDF有一定的胆酸盐结合能力。如图4（A）、图4（C）所示，甘氨胆酸钠标准曲线为y=2.8129x+0.0195（R2=0.9977），线性关系良好；牛黄胆酸钠标准曲线为y=2.535x+0.0143（R2=0.9994），线性关系良好。随着膳食纤维浓度的增加，甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠的结合率逐渐增加，且与SDF的浓度之间有明显的剂量-效应关系，在膳食纤维浓度达到1.2 mg/mL时，对甘氨胆酸钠的结合率可达到92.91%；在膳食纤维浓度达到1.8 g/mL时，对牛黄胆酸钠的结合率可达到90.93%。说明HSDF对胆酸盐表现出较强的结合能力。
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图 4 HSDF结合胆酸盐能力注：（A）和（C）分别为甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠标准曲线；（B）和（D）分别为甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠结合率。Figure 4. Cholate-binding capacity of HSDF2.5.3 胰脂肪酶抑制活性
胰脂肪酶在甘油三酯的消化中起关键作用，它有效防止肠道对膳食甘油三酯的吸收，因此是控制高脂血症和肥胖的关键途径[27]。抑制胰脂肪酶活性对减少脂肪吸收具有有益作用。结果如图5所示。在0.0~2.0 mg/mL浓度范围内，HSDF对胰脂肪酶抑制率随着浓度的增大而增加，表现出较好的线性关系。在最大浓度时，抑制率为75%，接近于药物（辛他伐汀、奥利司他）对胰脂肪酶的抑制率，可见黑木耳可溶性膳食纤维的抑制效果有一定的剂量依赖性，但最终体现出良好的抑制效果，说明HSDF在脂质消化中具有干预和调节的潜在优势。
2.6 黑木耳可溶性膳食纤维体内降脂效果
2.6.1 HSDF对小鼠脏器指数的影响
通过对比表3中各组小鼠的脏器指数可以发现，MC组小鼠经过高脂饲料喂养后，各指数较NC组均有升高迹象，MC组的肝脏指数较NC组显著上升（P<0.05），SL组较MC组相比有显著的恢复效果（P<0.01）。尤其需要注意的是脂肪组织指数，附睾脂肪组织MC组与NC组相比，有极显著上升（P<0.001），肾周白色脂肪组织与腹股沟白色脂肪组织MC组与NC组相比也有上升现象（P<0.05），这是由于高脂喂养引起的过度肥胖导致的脂肪堆积造成的。在经过不同剂量的HSDF给药干预后，各项指数均有所下降，脂肪组织指数方面下降较为明显（P<0.05），说明HSDF具备减肥降脂，缓解肥胖的功效。
表 3 各组小鼠脏器指数Table 3. Organ index of mice in each group器官组织 NC MC SL SM SH 肝脏 4.625±0.002 5.236±0.008# 4.161±0.003** 4.791±0.004 4.671±0.006* 附睾白色脂肪组织 1.029±0.004 3.265±0.009### 1.907±0.004** 2.189±0.005* 2.171±0.005* 肾周白色脂肪组织 0.239±0.001 1.198±0.003# 0.728±0.002* 0.774±0.002* 0.751±0.003* 腹股沟白色脂肪组织 0.621±0.003 1.824±0.003# 0.897±0.004*** 1.091±0.003** 0.967±0.004** 棕色脂肪组织 0.399±0.001 0.352±0.001 0.462±0.001* 0.475±0.001* 0.475±0.002* 注：n=8，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs NC组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs MC组。 2.6.2 HSDF对小鼠生化指标的影响
如图6所示，高脂喂养的小鼠血清中总胆固醇含量显著高于正常饲料喂养小鼠，表明小鼠受肥胖状态影响，出现了脂质代谢紊乱状况，给予不同剂量黑木耳可溶性膳食纤维灌胃后，各治疗组总胆固醇水平均有显著下降，其中、高剂量灌胃组效果最为显著（P<0.0001）。黑木耳可溶性膳食纤维对小鼠血清中甘油三酯的影响结果如图6所示，模型组小鼠血清甘油三酯水平显著高于空白组小鼠，但经过灌胃黑木耳可溶性膳食纤维后，均照模型组有显著改善（P<0.0001）。以上结果表明，HSDF对于高脂饮食造成的脂质代谢紊乱状况有良好的治疗缓解效果。
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图 6 不同浓度HSDF对小鼠血脂水平的影响注：####P<0.0001，vs NC组；***P<0.001，****P<0.0001，vs MC组，n=8。Figure 6. Effects of different concentrations of HSDF on blood lipid levels in mice2.6.3 HSDF对HFD小鼠肝脏的病理影响
肝脏是机体脂质代谢的中心器官[28]，肝内脂肪主要来源于食物和外周脂肪组织，通过对小鼠肝脏的病理观察，可以判断给药是否起到了保护效果。如图7结果显示，NC组肝组织结构正常，肝细胞未见明显脂肪变性；MC组，肝组织结构重度异常，肝细胞广泛脂肪变性，胞浆可见大小不一圆形空泡，组织可见少量炎症细胞浸润，给药组，随着剂量的增加，损伤程度较MC组有明显的改善，不但抑制了炎症细胞浸润现象，同时减少了脂肪的积累，说明摄入HSDF能有效抑制由高脂饮食诱导的肝细胞形态学改变和脂肪变性。
2.6.4 HSDF对HFD小鼠脂肪组织的影响
白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）和棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT）是人体内两种不同类型的脂肪组织，它们在结构和代谢功能上存在显著差异。白色脂肪是人体中最常见的脂肪组织，主要存储能量并提供细胞膜的构建材料[29]。然而，当白色脂肪过度积累时，就会导致肥胖症的发生。经过HFD喂养的小鼠会引起体内WAT脂肪细胞肥大和增生。如图8脂肪组织HE染色结果显示，NC组，脂肪空泡整体面积较小，分布均匀；MC组脂肪泡整体偏大，并可见部分大泡脂肪细胞，给药组均可见少量大泡脂肪细胞，较MC组有所改善。对细胞面积进行测量，结果如图9所示，可见MC组脂肪细胞的面积相较于NC组脂肪细胞面积显著增大（P<0.001），而摄入HSDF能有效改善恢复高脂饮食对脂肪组织细胞造成的损伤，给药组细胞面积明显缩小，SH组效果最为明显（P<0.001）。
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图 9 小鼠脂肪细胞面积注：####P<0.0001，vs NC组； **P<0.01，****P<0.0001，vs MC组。Figure 9. Area of adipocytes in mice3. 讨论
目前提取膳食纤维的主要方法有粗提法、化学法（酸碱浸提）、酶提法和发酵法等[30]。本实验采用复合酶提法从黑木耳残渣中提取可溶性膳食纤维，提取率为78%，付娆等[31]采用纤维素酶法从黑木耳残渣中提取膳食纤维，不可溶性膳食纤维的提取率为40.32%，Du等[32]采用亚临界水提取法等三种提取方法提取脱脂椰子粉膳食纤维，最优提取率为13.99 g/100 g，本实验采用复合酶法提取，提取率为78%，与已有研究中的提取率相比，本研究所采用方法提取率高，成本较低。
膳食纤维生物活性与其结构密切相关，膳食纤维最佳活性的发挥依赖于其相对分子量的大小，分子量的过大或过小都不利于物质发挥其生物活性，本研究结果显示HSDF分子量为4.14×105 Da；此外，HSDF主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖组成，其摩尔比为1808.87:0.00278:4.43:2.13:2.84:5.01。胰脂肪酶是一种重要的脂肪分解酶，由胰腺合成和分泌，它将脂肪和油水解成单甘油酯和脂肪酸，然后被身体重新吸收，合成脂肪[33]，因此，抑制胰脂肪酶活力能够有效抑制脂质摄入。而胆酸盐可以通过“肝肠循环”进行再利用，结合胆酸盐之后，胆酸盐则无法完成“肝肠循环”，肝脏就会将更多的胆固醇转化为胆汁酸，从而间接地降低胆固醇，以此来达到降脂的目的[34]。体外降脂实验结果表明，在HSDF浓度为1.2 mg/mL时，对甘氨胆酸钠的结合率可达到92.91%；当浓度达到1.8 mg/mL时，对牛黄胆酸钠的结合率可达到90.93%。HSDF对胰脂肪酶抑制率呈现剂量依赖性，在最大浓度时，抑制率为75%，接近于辛他伐汀及奥利司他对胰脂肪酶的抑制率。可见黑木耳残渣中提取的可溶性膳食纤维具有减少机体对脂肪和胆固醇摄入的潜力，可以作为预防肥胖、高血脂等方面疾病的保健食品原料来源[35−36]。
研究表明，长期摄入的食物中含有大量的饱和脂肪或反式脂肪、缺乏锻炼、吸烟及肥胖均可引发高血脂症[37]，研究通过高脂饲料诱导建立小鼠肥胖症模型，给予HSDF干预，来检验HSDF在体内的降脂效果。TC浓度过高导致的胆固醇代谢失衡是高脂症的特征之一[38]，而TG可在肝脏、脂肪等组织中可合成，贮存脂肪组织中，同时TG也是人体中提供能量的主要来源。刘学成等[3]研究发现，金针菇膳食纤维可改善由高脂饮食诱导的肥胖症小鼠脂质代谢紊乱现象，而本研究证实，HSDF具备良好的降低TC、TG水平的效果。在降脂方面，Pan等[39]发现灰树花多糖能上调肥胖小鼠AMPK-α、PPAR-α等基因的表达，下调固醇调节原件结合蛋白-IC（SREBP-IC）、FAS等蛋白的表达水平从而调节TG代谢，起到降脂功效；Zhou等[40]研究发现，竹笋膳食纤维可以通过调节肠道菌群和PPAR/脂肪酸代谢信号通路改善高脂肪饮食引起的肥胖及其伴随的代谢变化。关于黑木耳可溶性膳食纤维降脂的作用机制还有待进一步研究确定。
4. 结论
本研究通过采用复合酶提法从黑木耳残渣中提取可溶性膳食纤维，并探究其功能特性、体外降脂活性以及对高脂喂养诱导的肥胖小鼠的影响。结果表明，HSDF持水力，持油力等理化性质良好，其对脂肪、胆固醇、胆酸盐均表现出一定的吸附作用，具备开发功能性食品的潜力。在降脂活性方面，HSDF显著降低小鼠血清TC、TG水平，同时HSDF给药治疗不但抑制了肝脏组织中炎症细胞浸润现象，同时减少了脂肪的积累，说明摄入脂肪组织切片HSDF能有效抑制由高脂饮食诱导的肝细胞形态学改变和脂肪变性；而结果显示，摄入HSDF能有效改善恢复高脂饮食对脂肪组织细胞造成的损伤。综上，黑木耳可溶性膳食纤维具有良好的降脂活性。未来可以结合肠道菌群研究及多组学联合分析继续开展黑木耳可溶性膳食纤维预防肥胖，降脂方面的研究，探究其作用机制，为后续药物开发提供理论支持。
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图 2 HSDF单糖组成分析
注：Man甘露糖，Glc A葡萄糖醛酸，Glc葡萄糖，Gal半乳糖，Xyl木糖，Fuc岩藻糖。
Figure 2. Analysis of monosaccharide composition of HSDF
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图 4 HSDF结合胆酸盐能力
注：（A）和（C）分别为甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠标准曲线；（B）和（D）分别为甘氨胆酸钠和牛黄胆酸钠结合率。
Figure 4. Cholate-binding capacity of HSDF
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图 6 不同浓度HSDF对小鼠血脂水平的影响
注：####P<0.0001，vs NC组；***P<0.001，****P<0.0001，vs MC组，n=8。
Figure 6. Effects of different concentrations of HSDF on blood lipid levels in mice
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图 9 小鼠脂肪细胞面积
注：####P<0.0001，vs NC组； **P<0.01，****P<0.0001，vs MC组。
Figure 9. Area of adipocytes in mice
表 1 HSDF成分分析
Table 1 Composition analysis of HSDF
成分 含量 总膳食纤维（g/100 g） 50.7 可溶性膳食纤维（g/100 g） 78 粗多糖（g/100 g） 14.86 铁元素（mg/kg） 255 蛋白质（g/100 g） 18.1 
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表 2 HSDF的理化性质
Table 2 Physicochemical properties of HSDF
指标 结果 持水力（g/g） 11.62±0.302 持油力（g/g） 2.95±0.259 膨胀力（mL/g） 12.7±0.434
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表 3 各组小鼠脏器指数
Table 3 Organ index of mice in each group
器官组织 NC MC SL SM SH 肝脏 4.625±0.002 5.236±0.008# 4.161±0.003** 4.791±0.004 4.671±0.006* 附睾白色脂肪组织 1.029±0.004 3.265±0.009### 1.907±0.004** 2.189±0.005* 2.171±0.005* 肾周白色脂肪组织 0.239±0.001 1.198±0.003# 0.728±0.002* 0.774±0.002* 0.751±0.003* 腹股沟白色脂肪组织 0.621±0.003 1.824±0.003# 0.897±0.004*** 1.091±0.003** 0.967±0.004** 棕色脂肪组织 0.399±0.001 0.352±0.001 0.462±0.001* 0.475±0.001* 0.475±0.002* 注：n=8，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，vs NC组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs MC组。
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