Effects of Gelatin-Saccharides Interactions on the Physicochemical Properties and in Vitro Digestion of Cold-set Gels
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摘要: 本研究旨在明确不同糖类（阿洛酮糖、果糖、低聚果糖（FOS）、蔗糖）与明胶的理化互作对凝胶性质（硬度、色泽、体外消化性等）的影响。将明胶分别与上述四种糖类高温混合后冷却制备了含糖凝胶，通过质构仪和色度分析比较凝胶的质地和色泽。基于凝胶明显的褐变现象，从美拉德反应的角度，表征了不同凝胶中还原糖、氨基酸的含量变化及褐变产物的紫外-可见光吸收差异。此外，通过SDS-PAGE、体外消化和消化产物的抗氧化性实验比较了凝胶中蛋白质亚基的交联情况及其对蛋白质消化率和消化产物抗氧化性的影响。结果表明，从凝胶质地上来看，添加阿洛酮糖和果糖的凝胶质地较软，硬度在10.5~12.6 N之间，而添加蔗糖和FOS的凝胶质地较硬，硬度最高分别为29.9 N和22.2 N。除蔗糖（非还原糖）外，明胶与这些糖类在30%~50%浓度下的美拉德反应程度较低，还原糖损失率小于10%，游离氨基含量在3.6~3.8 mg/g；在72%糖浓度下，还原糖损失率最高可达17.6%，游离氨基含量小于3.2 mg/g，美拉德反应加剧。阿洛酮糖相比果糖呈现出更高的美拉德反应活性；FOS含有约50%的还原糖，反应较弱。这种短时间热处理条件下的美拉德反应引起了明胶蛋白质的聚集，并未影响消化性，其体外消化率在23%~25%之间，但其消化产物的ABTS+和DPPH自由基清除率显著增加（P<0.05）。Abstract: This study aimed to clarify the effects of physico-chemical interactions between gelatin and different saccharides (including allulose, fructose, fructo-oligosaccharides (FOS), and sucrose) on the properties (hardness, color, in-vitro digestibility, etc.) of gelatin-saccharide mixed gels. Gelatin was mixed with the various concentrations of saccharides at a high temperature and then cooled to prepare cold-set gels, with the texture and color of gels characterized using a texture analyzer and a colorimeter. Based on evident browning of the gels, the Maillard reaction-induced changes in reducing sugar and free amine contents as well as the UV-visible light absorption of Maillard reaction products in each gel were characterized. In addition, the gels’ protein molecular weight distribution, in-vitro protein digestibility, and the antioxidant properties of digesta were compared through SDS-PAGE, in-vitro digestion, and antioxidant assays. The results indicated that in terms of texture, gels with allulose and fructose were softer, with hardness ranging from 10.5 to 12.6 N, while those with sucrose and FOS were harder, with the highest hardness being 29.9 N and 22.2 N respectively. Except for sucrose (a non-reducing sugar), the Maillard reaction occurred to limited degrees in mixtures with 30%~50% saccharides, with a reducing sugar loss rate of less than 10%, and free amine content ranging from 3.6 to 3.8 mg/g. At 72% saccharide concentration, the maximum reducing sugar loss rate could reach 17.6%, with free amine content less than 3.2 mg/g, intensifying the Maillard reaction. Allulose exhibited higher Maillard reactivity compared to fructose, whereas FOS, containing about 50% reducing sugars, showed weaker reaction. Under mild thermal processing condition, the Maillard reaction caused slight crosslinking of gelatin subunits but did not significantly affect the in-vitro digestibility of protein, with an in vitro digestibility rate between 23% and 25%, but significantly increased the ABTS+ and DPPH free radical scavenging rates of the gel digesta (P<0.05).
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Keywords:
- gelatin /
- allulose /
- fructo-oligosaccharides /
- Maillard reaction /
- in-vitro digestion /
- antioxidant
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糖果行业是全球的主要食品行业之一，而凝胶糖果是其中最常见的消费品，也是增长最快的产品之一[1]。传统凝胶糖果是以蔗糖、葡萄糖浆为主要原料，以琼脂、明胶、变性淀粉、卡拉胶等作为胶凝剂，经高温溶解混合、低温灌模成型等工艺制成的具有较高水分含量（16%~20%）和弹性、咀嚼性的凝胶产品，深受消费者喜爱[2]。明胶是动物（猪、鱼、牛皮/骨等）胶原蛋白水解而成的蛋白质，是食品工业中应用最广的大分子胶体，赋予凝胶产品特殊的弹性[3]。随着消费者健康意识的提高，低糖、功能化是目前糖果产业的主要发展方向，即使用低糖、低热量的甜味剂（如糖醇、稀少糖等）或功能性添加剂（如膳食纤维、维生素、矿物质、益生菌等）代替部分蔗糖或糖浆，以达到降低能量摄入，增加产品附加值的目的[4]。
阿洛酮糖（D-psicose/D-allulose）作为一种天然的稀少糖（Rare sugars），因其良好的口感和生理功能而备受关注。阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体[5]，具有与蔗糖相似的口感和容积特性。其甜度相当于蔗糖的70%，而热量仅0.3 kcal/g。我国目前已建成多条万吨级阿洛酮糖生产线，各企业也在积极推进其在国内食品应用领域和行政许可[6]。除低热量外，阿洛酮糖还被证明具有诸多生理活性，如抗氧化性、降血糖活性、抗衰老等[7]。另外，阿洛酮糖作为一种还原糖，能通过糖化作用改善蛋白质的理化、功能性质[8−9]。膳食纤维是植物中天然存在的、从植物中提取或直接合成的聚合度≥3、可食用的、不能被人体小肠吸收的、对人体有健康意义的碳水化合物的总称[10]。低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，FOS），又称果寡糖（Oligofructose），是一类以果糖为主要结构单元的天然低聚糖，一般由菊粉（Inulin，聚合度2~60，平均约12个结构单元）水解而成，聚合度<20，约9个结构单元，属于可溶性膳食纤维范畴[11]。FOS具有一定的甜度（蔗糖的30%~60%）、黏度和极高的水溶性，在食品工业中具有极大的应用潜力[12]。
糖果凝胶的成形依赖于明胶在高浓度糖类化合物溶液中的凝胶化行为，不同构象和分子量的糖类化合物与明胶的互作机理和程度各异，糖类化合物的选择决定了凝胶的质地、风味和色泽。在凝胶制作过程中，糖类物质与明胶在高温下可能发生美拉德反应（Maillard reaction），即非酶褐变反应（Non-enzymatic browning），使蛋白质发生糖化（Glycation），产生褐色物质，从而影响产品的色泽及蛋白质的功能性和消化性[13−14]。然而，美拉德反应的程度受到温度、蛋白质和糖的种类与浓度、水分活度、反应时间等多种因素的影响[15]。阿洛酮糖、FOS等功能性糖类对明胶基糖果凝胶的品质、美拉德反应活性及蛋白质功能性的影响尚不清楚。
因此，本文旨在研究阿洛酮糖、FOS等新型糖类对明胶基糖果凝胶品质的影响及在传统凝胶糖果加工条件下糖类与明胶发生非酶褐变反应的程度。由于阿洛酮糖和FOS均为果糖衍生化合物，本研究以果糖作为阳性对照，以非还原糖（蔗糖）作为阴性对照，制备了明胶浓度8%的含糖凝胶。通过分析凝胶的色度与质构比较不同浓度的上述糖类（30%、50%、72%）对凝胶品质的影响。为表征不同体系中美拉德反应程度，比较了各凝胶中还原糖与氨基酸的损失率和产物的紫外-可见光吸收值。此外，本研究还探究了美拉德反应对明胶的糖基化交联程度及体外消化性的影响。厘清新型糖类原料与明胶的相互作用对于其在凝胶糖果类产品中的应用具有重要的指导意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
明胶 德国Weishardt公司；阿洛酮糖、蔗糖、果糖、三硝基苯磺酸（TNBS）、L-亮氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、二硝基水杨酸（DNSA）、无水葡萄糖 分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；低聚果糖（Orafti ® P95） 比利时Beneo公司；胃蛋白酶（P6887，≥3200 U/mg蛋白，来源于猪胃粘膜）、胰酶（P7545，8×USP，来源于猪胰腺） Sigma-Aldrich公司；ABTS+自由基清除能力检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。
UV-2550紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Mini-PROTEAN Tetra SDS-PAGE电泳系统、ChemiDoc Touch成像系统 美国Bio-Rad公司；MS-H-ProM 电加热磁力搅拌器 北京大龙兴创（DLAB）实验仪器公司；TS8216色差仪 广东三恩时智能科技有限公司；LabMaster水分活度仪 瑞士Novasina公司；SPL-450恒温生化培养箱 天津莱玻特瑞仪器有限公司；DV2T黏度计 美国Brookfield公司；TA.new plus质构仪 美国ISENSO公司；Spark酶标仪 瑞士Tecan公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 凝胶的制备
凝胶的制备工艺如图1所示。首先制备明胶含量为40%的明胶母液，于60 ℃溶胀1 h，搅拌均匀后倒入模具中，冷却，固化成明胶块备用。分别称取干重为30、50、72 g的阿洛酮糖、蔗糖、FOS和果糖粉末，加水补至80 g，磁力搅拌加热至沸腾（即完全溶解）。补充加热过程蒸发的水分后，加入20 g上述明胶块，在80~90 ℃下搅拌至完全融化，以制得明胶含量为8%，糖含量为0、30%、50%、72%的糖-明胶混合溶液（总质量100 g）。当体系冷却至50~60 ℃时，用注射器吸取溶液灌入硅胶模具或直径3.5 cm的透明塑料培养皿中，移至22 ℃恒温培养箱中静置约24 h使其充分固化，得到含糖凝胶体样品。
1.2.2 凝胶色度的测定
用色差仪对3.5 cm培养皿中的凝胶样品进行检测，记录L*、a*、b*。色差仪采用标准黑、白板进行校正。
1.2.3 凝胶质构的测定
用质构仪对凝胶样品进行质构测定，将完整的凝胶从硅胶模具中取出，置于载物台中心，使用P/100探头和质地剖面模式（TPA）对样品进行两次压缩至40%形变（无停留时间），测前、测试和测后速度分别为5.0、1.0和5.0 mm/s。由仪器自带ISENSO软件记录样品的硬度、弹性和咀嚼性等TPA结果。
1.2.4 美拉德反应相关理化性质表征
1.2.4.1 还原糖含量的测定及损失率的计算
采用DNSA法测定样品中还原糖的含量[16]。准确称取1 g凝胶或糖原料粉末样品加入10 mL水，50 ℃水浴10~20 min至使样品完全溶解。将30%和50%糖浓度样品溶液稀释50倍，72%糖浓度样品和糖原料样品稀释100倍，使溶液中糖浓度在0.1~1.0 mg/mL范围内。取稀释后的样品溶液1.0 mL于15 mL试管中，加DNSA试剂2.0 mL，沸水浴加热2 min，冷却后加水补足至15 mL，于520 nm波长下测定吸光度。以不同浓度的无水葡萄糖溶液制作标准曲线，计算样品中还原糖的含量及凝胶中还原糖的损失率。
还原糖损失率(%)=样品中还原糖的减少量样品中所添加的还原糖的量×100 (1) 式中：样品中还原糖的减少量=样品中添加的还原糖含量-实际测得的样品中还原糖的含量。
1.2.4.2 游离氨基的测定
采用TNBS法测定样品中游离氨基含量[17]。称取1 g凝胶样品加入10 mL水，50 ℃水浴保温10~20 min至样品完全溶解。将溶解后的样品稀释10倍，取稀释后的样品1 mL，加入1 mL磷酸缓冲液（pH8.2）和1 mL新鲜配制的0.05%TNBS溶液。反应体系涡旋混匀后，于50 ℃水浴中避光反应1 h。反应结束后立即加入2 mL 0.1 mol/L盐酸溶液终止反应，混匀后加入5 mL去离子水。使用酶标仪测定340 nm处的吸光度。以不同浓度的L-亮氨酸溶液制作标准曲线，计算样品中游离氨基的含量。
1.2.4.3 褐变产物的相对定量
称取1 g凝胶样品加入10 mL去离子水，于50 ℃水浴保温10~20 min至样品完全溶解。1.2.4.2中稀释10倍的凝胶溶液于420 nm处测定其吸光度（A420）。将溶解后的样品溶液稀释一倍（即整体稀释20倍），测定294 nm处的吸光度（A294）。
1.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
为了比较不同凝胶样品中蛋白质的分子量分布，将凝胶用热水稀释50倍（至1.6 mg/mL蛋白质）后与4×Laemmli样品缓冲液混合，95 ℃加热5 min后冷却。制备浓缩胶浓度5%、分离胶浓度8%的15-孔SDS-PAGE胶板，每孔加入15 μL蛋白质溶液或5 μL分子量标准溶液（40~300 kDa）。上样后将胶板插入装有Tris/glycine/SDS缓冲液的垂直电泳槽中通电（80 mV恒定电压20 min，随后增大至100 mV电压1 h）。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1 h后，用醋酸/乙醇溶液脱色。凝胶经ChemiDoc Touch成像系统扫描。
1.2.6 蛋白质体外消化性测定
参考Nature Protocol中的INFOGEST2.0标准方法[18]，制备模拟唾液（SSF）、模拟胃消化液（SGF，含有9.1 mg/mL胃蛋白酶）和模拟肠消化液（SIF，含有4 mg/mL胰酶和120 mg/mL胆盐）。利用自动凯氏定氮仪分析凝胶的蛋白质浓度后，取含有100 mg蛋白质的凝胶，加入4 mL SSF溶液（pH7.0）于37 ℃摇床振荡保温2 min，随后加入8 mL SIF （pH3.0）于37 ℃摇床振荡保温2 h。最后加入16 mL SIF （pH7.0）于37 ℃摇床振荡保温3 h。消化结束后沸水浴灭酶，冷却后通过邻苯二甲醛（OPA）试剂测定蛋白质的水解度（以丝氨酸溶液制作标准曲线计算）。
1.2.7 消化产物的抗氧化活性
1.2.7.1 DPPH自由基清除率的测定
将0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液与凝胶样品水解液以1:1（体积比）混匀，以无水乙醇代替DPPH溶液与样品水解液混合作为对照，室温下黑暗中放置30 min，在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率（%）计算如下：
DPPH自由基清除率(%)=(1−AS−ABAC)×100 (2) 式中：AS为样品的吸光度；AB为样品和无水乙醇组成的对照的吸光度；AC为DPPH溶液和去离子水组成的空白的吸光度。
1.2.7.2 ABTS+自由基清除率的测定
采用ABTS+自由基清除能力检测试剂盒对凝胶样品水解液的ABTS+自由基清除能力进行测定，按顺序加入各工作液后，室温避光静置6 min，测定405 nm处的吸光度。ABTS+自由基清除率（%）计算如下：
ABTS+自由基清除率(%)=A空白−(A测定−A对照)A空白×100 (3) 式中：A空白为蒸馏水和ABTS溶液组成的空白的吸光度；A测定为样品和ABTS溶液组成的样品的吸光度；A对照为样品和缓冲液组成的对照的吸光度。
1.3 数据处理
所有实验均进行三次重复，并至少设置3次平行。使用SPSS软件对实验数据结果进行不同变量值之间的相关性分析；采用GraphPad Prism对实验取得的数据进行作图；采用Duncan’s多重比较法进行显著性分析；数据结果以平均值±标准偏差表示。
2. 结果与分析
2.1 明胶-糖混合凝胶的外观与色度
本研究选取了凝胶糖果中最常用的A型猪皮明胶（250冻力值），制备了明胶浓度8%、糖浓度（0、30%、50%、72%）各异的凝胶，其加工过程涉及短时间的高温（80~90 ℃）混合，随后混合溶液冷却至室温并固化约24 h。图2展示了不同凝胶的外观形态，通过背景中字母A的可视程度可判断凝胶的透明度。不含糖的明胶水凝胶无色透明，而含糖凝胶呈现微弱的浅黄（30%~50%）、深黄（72% FOS）、棕色（72%阿洛酮糖/果糖）或白色（72%蔗糖）。72%糖浓度下各凝胶的色泽差异说明明胶与各糖类在热处理过程中发生了不同程度的美拉德反应，而蔗糖为非还原糖且溶解度低，发生结晶化导致凝胶呈白色。这三种凝胶中，明胶-阿洛酮糖凝胶透明度较高，而果糖和FOS体系基本不透明。凝胶的透明度差异可能与体系的黏度有关：相同浓度下，明胶与糖类混合溶液的黏度受到蛋白组分和糖组分的共同影响。在相同质量浓度下，糖溶液的黏度呈现如下规律：阿洛酮糖<果糖<FOS（未显示），这与糖类的分子量和玻璃化温度有关。尽管阿洛酮糖与果糖分子量一致，前者的玻璃化温度（−6.5 ℃）低于后者（5~10 ℃），使阿洛酮糖体系黏度更低[19]。高黏度的体系在混合过程中容易混入更多的气泡，使体系透光性下降。
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图 2 含有不同浓度糖的明胶-糖凝胶的外观形态Figure 2. Appearance of gelatin-saccharide gels with various saccharide concentrations对各样品进行色差分析，结果如表1所示，在30%~50%糖浓度下，各凝胶的L*（亮度值）与对照差异不显著（44~45），a*（红绿值>0为红色）差异较小（介于0.47与0.68之间，呈略微增加趋势），而b*（黄蓝值>0为黄色）在50%糖浓度时显著增加（0.15~0.84）（P<0.05）。72%糖浓度时，除蔗糖对照以外，各样品的L*显著下降，a*和b*显著升高，尤其是b*值的增幅最大（P<0.05）。说明随着糖浓度的增加，凝胶的色度向红色和黄色区域加深，以黄色为主，与文献报道的趋势一致[20]。
表 1 明胶-糖凝胶的色度特征值Table 1. Color characteristics of gelatin-saccharide mixed gels糖种类 糖浓度（%） L* a* b* − 0 44.46±0.72b 0.41±0.05b −0.63±0.23a 蔗糖 30 44.99±0.29b 0.47±0.05ab −0.31±0.31ab 50 44.99±0.56b 0.52±0.05ab 0.06±0.37abc 72 57.77±8.07c −0.86±0.26a 2.90±0.56e 阿洛酮糖 30 45.13±0.26b 0.54±0.06ab −0.34±0.17ab 50 45.16±0.36b 0.68±0.02ab 0.47±0.17cd 72 39.47±0.45a 2.97±0.62d 17.68±0.91g 果糖 30 44.92±0.40b 0.55±0.03ab 0.00±0.22abc 50 44.27±0.58b 0.63±0.06ab 0.84±0.43d 72 39.80±0.87a 0.86±0.34c 16.85±0.70f FOS 30 45.25±0.30b 0.50±0.08ab −0.36±0.39ab 50 44.88±0.62b 0.58±0.13ab 0.15±0.13bcd 72 41.52±0.82a 0.86±1.16c 16.79±2.02f 注：同列不同字母表示存在显著性差异，P<0.05，表2同。 2.2 明胶-糖凝胶的质构
对各凝胶样品进行质构测定，样品的硬度、弹性和咀嚼性如图3所示。不含糖的明胶水凝胶硬度值约为7.65±0.75 N，弹性值约为0.90±0.02（未显示）。从图3A来看，糖类的添加使凝胶硬度明显增加（10.3~29.9 N），但不同糖类提高凝胶硬度的程度各异。明胶-阿洛酮糖和果糖凝胶硬度相似，在30%、50%和72%浓度下的硬度值分别约为10.5、14.0、12.6 N和10.9、14.5、12.6 N。明胶-蔗糖和FOS凝胶在30%~50%浓度下硬度相当，分别约为14.3、21.3 N和14.9、22.2 N；浓度增加至72%时，明胶-FOS凝胶硬度变化不大，但蔗糖凝胶由于结晶的产生使凝胶硬度显著增加（29.9 N）（P<0.05）。咀嚼性的结果与硬度的趋势基本一致（图3C）。总的来说，添加单糖的明胶凝胶相较于添加双糖或低聚糖的凝胶质地更软，蔗糖的结晶能显著增加凝胶的硬度和咀嚼性。
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图3B显示了各凝胶的弹性，与凝胶结构的形成密切相关。不含糖的明胶凝胶弹性值为0.94±0.00（未显示）。当四种糖浓度为30%时，凝胶的弹性平均值在0.94~0.95之间，与对照差异并不显著；增加糖浓度至50%时，凝胶的弹性有所增加（平均值0.96~0.98），其中明胶-FOS凝胶的弹性最大（0.98±0.01）。但72%糖浓度时，所有凝胶的弹性均有所下降，尤其是蔗糖和FOS凝胶。易结晶的糖类（蔗糖）会降低凝胶的弹性，这与何玉莲等[21]的研究结果一致。对于其它非结晶糖，弹性的下降可能说明凝胶结构的形成受限。尽管许多研究报道了糖类的添加能增强明胶凝胶的硬度和弹性，但浓度过高时，可能由于体系黏度太高而阻止凝胶网络的增长，使凝胶弹性下降[22]。总的来说，高浓度下，阿洛酮糖和果糖凝胶硬度和咀嚼性较为适宜，弹性较高且不易结晶。
2.3 明胶-糖凝胶混合体系的美拉德反应程度表征
2.3.1 明胶-糖凝胶混合体系的还原糖损失
美拉德反应是还原糖和蛋白质游离氨基之间的羰氨缩合反应，因此，还原糖和游离氨基含量的变化在一定程度上可表征美拉德反应的程度。本研究首先测定了上述糖类原料的还原糖含量，如图4所示。阿洛酮糖和果糖为单糖，故其还原糖含量接近1000 mg/g；而蔗糖本身为非还原糖，只检测到极微量的还原糖8.90±0.22 mg/g；FOS的还原糖含量（以葡萄糖计）为467±12 mg/g，说明低聚糖含有还原端，具备美拉德反应活性。
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图 4 不同糖类原料的还原糖含量（干基）注：不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。Figure 4. Reducing sugar content (dry basis) of different saccharide raw materials基于原料的还原糖比例及不同凝胶样品中还原糖的含量，计算出不同样品加工过程中的还原糖损失量和损失率。如图5所示，由于蔗糖中只含有极微量的还原糖，蔗糖凝胶在各浓度下的还原糖损失量（平均值约0.95）和损失率（平均为0.12%）也极低，且不同浓度下的损失程度差异不显著。在30%和50%浓度下，两种单糖（阿洛酮糖和果糖）的还原糖损失量分别为20.9、45.1 mg/g和19.7、38.8 mg/g，而相同浓度下FOS的还原糖损失量约为单糖的一半。就损失率而言，含有阿洛酮糖、果糖和FOS的凝胶在这两个浓度下的还原糖损失均不超过其添加量的10%，且三种糖类凝胶在同一糖浓度下的还原糖损失率差异不大。在更高的浓度（72%）下，还原糖的损失加剧，阿洛酮糖、果糖和FOS的还原糖损失量分别为134±10.0、90.9±9.0和45.8±5.4 mg/g，平均损失率分别为17.6%、11.8%和13.4%。说明在同样的加工条件下，明胶-阿洛酮糖混合体系的还原糖损失量/率显著高于明胶-果糖混合体系。明胶-FOS体系的还原糖损失量虽然更低，但其损失率略高于果糖。
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图 5 不同浓度阿洛酮糖、果糖、低聚果糖和蔗糖与明胶（8%）混合凝胶的还原糖损失量（A）及损失率（B）Figure 5. Reducing sugar loss (A) and reduction rate (B) of gelatin (8%)-saccharide mixed gels with different concentrations of allulose, fructose, fructo-oligosaccharides and sucrose2.3.2 明胶-糖凝胶混合体系的游离氨基含量
三硝基苯磺酸（TNBS）能特异性识别蛋白质溶液中的游离氨基（伯胺），发生显色反应。图6显示了上述凝胶的游离氨基含量。作为对照，未添加糖的8%明胶水凝胶含有4.07±0.06 mg/g游离氨基，占蛋白质总量的5.1%。蔗糖凝胶的游离氨基含量与明胶水凝胶相近，且在这三个糖浓度水平，游离氨基含量无显著差异，说明明胶与蔗糖混合并未造成氨基的消耗。在30%糖类添加量下，除蔗糖凝胶外的各凝胶的游离氨基浓度均约为3.8 mg/g，相较于对照样品略有下降。当糖量浓度增加至50%时，凝胶游离氨基的浓度进一步下降至3.65~3.68 mg/g，但糖的种类对结果的影响不显著（P>0.05）。进一步增大糖的浓度，游离氨基的含量下降至2.96~3.15 mg/g，其中添加阿洛酮糖的样品氨基酸的损失率（27.2%）显著高于添加果糖或FOS的样品（22.6%~22.8%）。说明在30%~50%糖浓度下，氨基酸的反应活性并不高，但在72%糖浓度下，明胶的游离氨基反应活性显著提高。阿洛酮糖相较于果糖和FOS具有更高的反应活性。在相同的糖添加量下，果糖和FOS组的游离氨基反应程度无显著差异，但其还原糖损失量差异显著，可能说明除了羰氨反应以外，体系中还存在其它不需要游离氨基参与的反应。例如，在80 ℃以上的高温下，还原糖容易发生氧化、异构化、降解等反应[23]。
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图 6 不同浓度阿洛酮糖、果糖、低聚果糖和蔗糖与明胶（8%）混合凝胶的游离氨基含量Figure 6. Free amine content in gelatin (8%)-saccharide mixed gels with different concentrations of allulose, fructose, fructo-oligosaccharides and sucrose蛋白质与糖类的美拉德反应与混合体系的水分活度密切相关，一般研究认为，美拉德反应发生的最适水分活度（Aw）介于0.4~0.8之间[23]。当糖浓度为30%~50%时，明胶与上述糖类混合体系的Aw值为0.866~0.988，而72%糖浓度时，Aw值降低至0.638~0.650（阿洛酮糖和果糖）和0.718（FOS），这也能解释在72%糖类浓度下褐变和底物消耗程度显著增加。
2.3.3 明胶-糖凝胶混合体系褐变产物的相对定量
除了反应底物的损失外，混合体系在294 nm和420 nm处的吸光度变化也能反映美拉德发生的程度。294 nm的吸光度代表美拉德反应的中间阶段Amadori/Heyns产物的降解反应，而美拉德反应的终末产物，如深褐色的类黑精，在420 nm具有特征吸收[24]。如表2所示，不含糖的明胶水溶液在294和420 nm（A294和A420）吸光度分别为0.887和0.052。其中294 nm处具有较高的吸光值，这与Kachou等[25]报道的结果类似，可能是由于明胶中的肽键和芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）所致。由于蔗糖不具备反应活性，明胶-蔗糖体系的A294和A420相较于对照无显著变化。对于含有还原糖的另外三种明胶-糖体系，A294和A420随着糖浓度的增加显著增加。在30%糖浓度下，三种明胶-糖混合体系的A294差异不显著（P>0.05），其平均值在0.93~0.95之间；在50%糖浓度下，A294显著增加（0.97~1.05），其中，明胶-阿洛酮糖凝胶的A294显著高于明胶-果糖和明胶-FOS凝胶，但A420值与不添加糖类的纯水凝胶相比差异不大。说明在较低糖浓度下，美拉德反应中间产物略有生成，但基本无类黑精产生。添加72%阿洛酮糖、果糖和FOS的凝胶稀释后A294平均值分别达到2.70、1.60和1.25；而A420平均值增加至0.19、0.12和0.08，即反应加剧，中间产物和终末产物均显著增加。其中，分子量较大、还原糖当量较低的FOS与明胶的美拉德反应产物的相对较少。
表 2 明胶-糖凝胶溶解稀释后在294 nm和420 nm处的吸光度Table 2. Absorbances at 294 nm and 420 nm of gelatin-saccharide mixed gels after being dissolved and diluted in water糖种类 糖浓度（%） A294（稀释20倍） A420（稀释10倍） − 0 0.887±0.009a 0.052±0.001ab 蔗糖 30 0.877±0.011a 0.053±0.001bc 50 0.873±0.007a 0.053±0.010bc 72 0.885±0.010a 0.053±0.009bc 阿洛酮糖 30 0.940±0.011bc 0.053±0.001bc 50 1.050±0.009f 0.054±0.001c 72 2.700±0.040i 0.188±0.003f 果糖 30 0.925±0.016b 0.051±0.001a 50 0.971±0.038d 0.054±0.001c 72 1.600±0.018h 0.123±0.004e FOS 30 0.951±0.010c 0.054±0.001bc 50 1.011±0.018e 0.054±0.001c 72 1.250±0.013g 0.074±0.001d 对比两种单糖，阿洛酮糖-明胶混合体系的A294和A420均高于明胶-果糖体系，与其相对更高的还原糖与氨基酸的损失率结果一致（图5和图6）。阿洛酮糖和果糖是互为C-3差向异构体的己酮糖。根据前人的报道，己糖与蛋白质发生美拉德反应时，Amadori /Heyns产物的降解速率及棕色产物的生成速率与其C3位置的手性分子空间构型有关[26]。根据Cahn-Ingold-Prelog（CIP）规则，对称中心周围最优先的三个取代基顺时针排列时，称为R构型，而当它们逆时针排列时，称为S构型。一般认为，C3的构象为S型比R型更容易产生类黑素，在本研究中，阿洛酮糖为S型，果糖为R型，这可能是二者美拉德反应速率和褐变程度差异的原因。
2.4 明胶-糖凝胶的蛋白质分子量分布
美拉德反应的发生不仅带来体系颜色的褐变，还可能通过化学交联作用修饰蛋白质的结构使之聚集（糖基化）。许多研究报道了蛋白质与糖类化合物长时间共热后发生分子交联，伴随着功能性和消化性的变化[27−29]，但蛋白质与糖之间的反应程度受到底物种类、浓度和热处理程度等因素的调控，因此对于不同体系中的糖基化程度及对其理化性质的影响也不尽相同。本研究对不同浓度的糖类与明胶高温混合形成的凝胶进行电泳分析，结果如图7所示。在相同的蛋白质浓度下，添加30%~50%浓度的各种糖类后，各主要亚基条带的光强度（泳道3~10）与对照（泳道2）差异不大，说明未发生明显的亚基的聚集或解离现象。然而，添加72%阿洛酮糖、果糖和FOS的样品中α（α1和α2）、β和γ亚基均变浅；此外，还观察到低分子量（～40 kDa）的肽段有所变浅，而在浓缩胶上端均观察到少量无法进入浓缩胶的高分子聚合物（HMW）（泳道12~14）。含有72%蔗糖的凝胶，分子量分布与对照相似，并未生成HMW组分（泳道11）。这种变化说明，高浓度还原糖与明胶发生美拉德反应后，α、β和γ亚基及小分子多肽均参与了糖基化交联反应，最终形成了大分子交联物。
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图 7 明胶-糖凝胶体的SDS-PAGE图谱注：泳道1为蛋白Marker，泳道2为对照，泳道3~6为30%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖，泳道7~10为50%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖，泳道11~14为72%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖。Figure 7. SDS-PAGE gel electrophoresis of gelatin-saccharide mixed gelsKchaou等[25]研究表明，鱼明胶和葡萄糖高温共热（90~130 ℃，24 h）时会导致蛋白亚基被糖的降解产物交联，形成高聚物，且氨基酸修饰率（33.6%~55.5%）随温度上升显著提高。本研究采用传统凝胶糖果的制备工艺，明胶与糖溶液混合时温度约80~90 ℃，短暂搅拌混合后灌注于模具中，体系快速冷却至室温。这种条件下，低糖浓度下（30%~50%）发生的微弱的美拉德反应，中间产物的生成有限，对明胶的分子量分布无显著影响；而当添加72%的阿洛酮糖、果糖或FOS时，美拉德反应程度和产物的生成量显著提高，观察到明胶组分的交联，与前人研究中观察到的现象一致。然而，本研究中氨基酸的损失率（即修饰率）为22.6%~27.2%，远低于上述文献中的反应强度。
2.5 明胶-糖凝胶的体外消化性
蛋白质的赖氨酸和精氨酸残基被认为是糖与蛋白质发生美拉德时主要受到修饰的位点，同时也是胰蛋白酶的主要作用位点。因此，许多研究发现，美拉德反应所带来的蛋白质结构修饰将使蛋白质的消化率大大下降，尤其是赖氨酸这一必需基酸失去生理活性，但关于明胶的糖基化所引起的消化性变化未见报道。为明确明胶与各种糖类在凝胶糖果加工条件下发生的美拉德反应对凝胶中明胶蛋白质消化率的影响，本研究使用INFOGEST2.0方法测定不同凝胶中蛋白质（100 mg）的体外消化率，结果以蛋白质的水解度表示（图8）。未与糖类物质混合的明胶水凝胶中蛋白质消化率不高，约为24.0%。这一结果略低于Wang等[13]报道的鱼鳞明胶的体外水解率（26.1%），可能与猪皮明胶中羟脯氨酸的含量较高有关。羟脯氨酸有利于蛋白质中螺旋结构的形成，而研究表明胶中的螺旋结晶区具有抗酶解特性[30]，这可能是明胶蛋白质体外消化率较低的原因。
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图 8 明胶（8%）与不同浓度的阿洛酮糖（A）及72%的不同糖类（B）形成的凝胶的体外消化率注：ns表示差异不显著P>0.05。Figure 8. In vitro digestion rate of gelatin (8%) gels with different concentrations of allulose (A) and different saccharides at 72% concentration (B)根据前面的研究结果，在本研究所用的四种糖类中，阿洛酮糖的美拉德反应活性最高，且在72%糖浓度下，美拉德反应最剧烈，氨基酸修饰率最高。因此，本研究选择了不同浓度（0~72%）的明胶-阿洛酮糖凝胶和72%糖浓度的明胶-糖类凝胶进行体外消化率的测定。将明胶与不同浓度的阿洛酮糖在高温下混合后冷却得到的凝胶，在相同的体外模拟条件下消化相同时间后，发现OPA法测得的消化率在23.3%~24.4%之间，且不同糖浓度下并无显著差异。明胶与72%的蔗糖、阿洛酮糖、果糖和FOS混合后，体外消化率为23.8%~24.2%，不同糖类之间也无显著差异（P>0.05）。尽管前面提到不同糖浓度或糖的种类引起明胶美拉德反应的程度及游离氨基的消耗量有显著差异，但并未显著降低明胶蛋白质的体外消化率，这与其它文献中提到的蛋白质消化率下降[31−32]的现象不同。究其原因，一方面可能是由于凝胶糖果加工涉及的热处理时间较短，条件相对温和，而一般针对美拉德反应的研究中都涉及更长时间或更高温度的蛋白质-糖共热处理。因此，本研究中美拉德反应程度不高（氨基酸的修饰率不超过30%），对蛋白质消化性的不利影响较小；另一方面，本研究中使用的明胶中赖氨酸和精氨酸的比例不高（摩尔比分别为2.5%和4.7%），而羟脯氨酸比例高（16.3%）。前人研究指出，明胶蛋白质本身含有较高的螺旋有序结构，这种结构具有抗酶解能力，使蛋白质消化率较低[30]。羟脯氨酸具有很强的形成螺旋有序结构的能力，因此影响明胶蛋白质消化率的可能主要是羟脯氨酸，而非赖氨酸和精氨酸。然而，若提高热处理强度，如延长明胶与还原糖混合后的热处理温度/时间，可能造成更高的氨基酸修饰率从而降低蛋白质的可利用率，这是软糖生产中值得考虑和进一步探究的问题。
2.6 明胶-糖凝胶消化产物的抗氧化性
众多研究表明，美拉德反应除了能赋予产品独特的色、香、味外，还能产生有益的生物活性物质，增强食品的抗氧化活性[33−34]。如图9所示，测定了糖浓度72%的明胶-阿洛酮糖、果糖、FOS和蔗糖凝胶及纯明胶消化产物的抗氧化性。与纯明胶相比，四种凝胶的DPPH和ABTS+自由基清除率显著增加（P<0.05），其中，阿洛酮糖、果糖和FOS凝胶的自由基清除率显著高于蔗糖凝胶（P<0.05），可能是因为明胶与还原糖类发生美拉德反应生成了一些具有抗氧化活性的物质。蔗糖为非还原糖，不与明胶发生美拉德反应，明胶-蔗糖凝胶相较于不含糖的对照抗氧化活性的增加可能是由于蔗糖本身具有一定的抗氧化性[35]。阿洛酮糖凝胶的抗氧化活性最高，可能是因为阿洛酮糖与明胶发生美拉德反应的程度最深，生成的具有抗氧化活性的产物最多。总的来说，明胶与糖类间的美拉德反应程度虽未显著影响其体外消化率，但产生了一些具有抗氧化活性的产物，使凝胶的抗氧化活性显著增加。
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图 9 明胶-糖凝胶消化产物的抗氧化性注：不同大写字母表示DPPH自由基清除率有显著性差异，不同小写字母表示ABTS+自由基清除率有显著性差异，P<0.05。Figure 9. Antioxidant activities of digesta from gelatin-saccharide gels3. 结论
本研究将明胶加入高温糖类溶液中形成含有不同浓度、种类糖类的凝胶，旨在探讨几种糖类（尤其是功能性糖类：阿洛酮糖和FOS）对明胶凝胶性质及美拉德反应的影响。结果表明，糖的种类和浓度显著影响凝胶的质地和色泽，其中明胶-单糖凝胶相较于明胶-双糖/低聚糖凝胶质地更软，弹性更高。低浓度（30%~50%）下，明胶与还原糖仅发生微弱的美拉德反应，凝胶呈浅黄色；而在72%糖浓度（水分活度0.6~0.8）时，美拉德反应底物（还原糖、氨基酸）的消耗率显著增加，而产物的紫外（294 nm）和可见光（420 nm）吸收值显著增加。在相同浓度下，反应程度呈现：阿洛酮糖>果糖>FOS（47.3%还原糖）>蔗糖（非还原糖，不反应）。由于氨基酸的修饰，通过电泳观察到明胶亚基的共价交联，产生大分子聚集物。然而，在本研究涉及的较为温和的加工条件下，这种共价修饰对蛋白质的体外消化率影响不显著，这可能与蛋白质的修饰率不高（22.6%~27.2%）有关。最后，明胶的美拉德反应使凝胶的抗氧化性有所提高，其中阿洛酮糖对凝胶的抗氧化性贡献最大。本研究对于凝胶糖果，尤其是减糖配方中糖类原料的选择及凝胶理化性质调控具有重要的指导作用。
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图 2 含有不同浓度糖的明胶-糖凝胶的外观形态
Figure 2. Appearance of gelatin-saccharide gels with various saccharide concentrations
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图 4 不同糖类原料的还原糖含量（干基）
注：不同小写字母表示存在显著性差异，P<0.05。
Figure 4. Reducing sugar content (dry basis) of different saccharide raw materials
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图 5 不同浓度阿洛酮糖、果糖、低聚果糖和蔗糖与明胶（8%）混合凝胶的还原糖损失量（A）及损失率（B）
Figure 5. Reducing sugar loss (A) and reduction rate (B) of gelatin (8%)-saccharide mixed gels with different concentrations of allulose, fructose, fructo-oligosaccharides and sucrose
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图 6 不同浓度阿洛酮糖、果糖、低聚果糖和蔗糖与明胶（8%）混合凝胶的游离氨基含量
Figure 6. Free amine content in gelatin (8%)-saccharide mixed gels with different concentrations of allulose, fructose, fructo-oligosaccharides and sucrose
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图 7 明胶-糖凝胶体的SDS-PAGE图谱
注：泳道1为蛋白Marker，泳道2为对照，泳道3~6为30%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖，泳道7~10为50%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖，泳道11~14为72%蔗糖、果糖、阿洛酮糖、低聚果糖。
Figure 7. SDS-PAGE gel electrophoresis of gelatin-saccharide mixed gels
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图 8 明胶（8%）与不同浓度的阿洛酮糖（A）及72%的不同糖类（B）形成的凝胶的体外消化率
注：ns表示差异不显著P>0.05。
Figure 8. In vitro digestion rate of gelatin (8%) gels with different concentrations of allulose (A) and different saccharides at 72% concentration (B)
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图 9 明胶-糖凝胶消化产物的抗氧化性
注：不同大写字母表示DPPH自由基清除率有显著性差异，不同小写字母表示ABTS+自由基清除率有显著性差异，P<0.05。
Figure 9. Antioxidant activities of digesta from gelatin-saccharide gels
表 1 明胶-糖凝胶的色度特征值
Table 1 Color characteristics of gelatin-saccharide mixed gels
糖种类 糖浓度（%） L* a* b* − 0 44.46±0.72b 0.41±0.05b −0.63±0.23a 蔗糖 30 44.99±0.29b 0.47±0.05ab −0.31±0.31ab 50 44.99±0.56b 0.52±0.05ab 0.06±0.37abc 72 57.77±8.07c −0.86±0.26a 2.90±0.56e 阿洛酮糖 30 45.13±0.26b 0.54±0.06ab −0.34±0.17ab 50 45.16±0.36b 0.68±0.02ab 0.47±0.17cd 72 39.47±0.45a 2.97±0.62d 17.68±0.91g 果糖 30 44.92±0.40b 0.55±0.03ab 0.00±0.22abc 50 44.27±0.58b 0.63±0.06ab 0.84±0.43d 72 39.80±0.87a 0.86±0.34c 16.85±0.70f FOS 30 45.25±0.30b 0.50±0.08ab −0.36±0.39ab 50 44.88±0.62b 0.58±0.13ab 0.15±0.13bcd 72 41.52±0.82a 0.86±1.16c 16.79±2.02f 注：同列不同字母表示存在显著性差异，P<0.05，表2同。 
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表 2 明胶-糖凝胶溶解稀释后在294 nm和420 nm处的吸光度
Table 2 Absorbances at 294 nm and 420 nm of gelatin-saccharide mixed gels after being dissolved and diluted in water
糖种类 糖浓度（%） A294（稀释20倍） A420（稀释10倍） − 0 0.887±0.009a 0.052±0.001ab 蔗糖 30 0.877±0.011a 0.053±0.001bc 50 0.873±0.007a 0.053±0.010bc 72 0.885±0.010a 0.053±0.009bc 阿洛酮糖 30 0.940±0.011bc 0.053±0.001bc 50 1.050±0.009f 0.054±0.001c 72 2.700±0.040i 0.188±0.003f 果糖 30 0.925±0.016b 0.051±0.001a 50 0.971±0.038d 0.054±0.001c 72 1.600±0.018h 0.123±0.004e FOS 30 0.951±0.010c 0.054±0.001bc 50 1.011±0.018e 0.054±0.001c 72 1.250±0.013g 0.074±0.001d
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百度学术
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