Effects on the Functionality and Structure of Rice-Pea Composite Protein by Industry-scale Microfluidizer Combined with pH Cycling Treatment
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摘要: 为探究复合植物蛋白经高压射流磨与pH循环共同处理后的增溶作用，明晰其增溶机制，采用大米蛋白与豌豆蛋白作为原料，配制蛋白比例1:1，总蛋白浓度4%的混合蛋白溶液，并将混合液pH调整至12，在高压射流磨不同压力下进行处理，再将溶液pH调回中性后得到复合蛋白。采用氮溶解指数、粒径、荧光光谱、圆二色谱、分子量等手段表征本工艺过程中复合蛋白理化性质和结构的变化。结果表明，经高压射流磨协同pH循环处理4%的复合蛋白，复合蛋白氮溶解指数随着压力增大而提升，处理压力为120 MPa时，氮溶解指数为92.67%±0.77%。扫描电镜与粒径结果显示，射流磨处理后的复合蛋白尺寸降低，比表面积增大。内源荧光光谱、表面疏水性、巯基二硫键、圆二色谱结果显示，两种蛋白之间产生了相互作用，形成了新的共架体，且复合蛋白随处理压力增大，表面疏水性由4025.33显著增大至7359.45（P<0.05），疏水区域增加、游离巯基含量由26.46±0.32 μmol/g显著上升至最高32.66±0.35 μmol/g（P<0.05），二硫键含量由9.86±0.42 μmol/g显著下降至5.48±0.27 μmol/g（P<0.05），α-螺旋实际含量（25.3%）高于理论值（21.83%），二级结构向更亲水的α-螺旋转变。此外，氨基酸分析显示复合蛋白的氨基酸配比均衡完整。经处理后的复合蛋白在高溶解性的基础上，乳化与起泡性能均明显优于大米蛋白与豌豆蛋白。本研究表明高压射流磨协同pH循环的处理方法能够有效改善复合蛋白的功能特性，为植物蛋白工业化增溶改性提供理论支撑。Abstract: To investigate the solubilization of composite plant protein after co-processing with an industry-scale microfluidizer and pH cycling and to clarify its solubilization mechanism, this paper used rice protein and pea protein as raw materials, a mixed protein solution with a protein ratio of 1:1 and a total protein concentration of 4% were configured. The pH of the mixture was then adjusted to 12 and the solution processed at different pressures in a high-pressure jet mill. The composite protein was then obtained by adjusting the pH of the solution back to neutral. And to characterize the changes in physicochemical properties and structure of composite protein during this process using nitrogen solubility index, particle size, fluorescence spectroscopy, circular dichroism, molecular weight, and other means. Results showed that the nitrogen solubility index of 4% composite protein underwent industry-scale microfluidizer and pH cycling treatment was increased with the increase of pressure, reaching the maximum of 92.67%±0.77% at 120 MPa. The results of scanning electron microscopy and particle size showed that the composite proteins decreased in size and the specific surface area increased after the treatment of the industry-scale microfluidizer. The results of intrinsic fluorescence spectroscopy, surface hydrophobicity, sulfhydryl disulfide bonding, and circular dichroism indicated that the two proteins interacted to form new co-assembly composites. Surface hydrophobicity increased significantly from 4025.33 to 7359.45 (P<0.05), the hydrophobic region increased. Free sulfhydryl content increased significantly from 26.46±0.32 μmol/g to a maximum of 32.66±0.35 μmol/g (P<0.05), while disulphide bonding content decreased significantly from 9.86±0.42 μmol/g to 5.48±0.27 μmol/g (P<0.05). The actual content of α-helices (25.3%) was higher than the theoretical value (21.83%), indicating a transition to a more hydrophilic α-helix in the secondary structure as the treatment pressure increased. Furthermore, the amino acid analysis revealed that the composite protein had a balanced and complete composition of amino acids. Additionally, the emulsification and foaming properties of the treated composite proteins were superior to those of rice and pea proteins due to their high solubility. This study demonstrated that the combination of industry-scale microfluidizer and pH cycling could effectively enhance the functional properties of the composite protein. The findings provide theoretical support for solubilization and modification of plant proteins on an industrial scale.
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Keywords:
- rice protein /
- pea protein /
- industry-scale microfluidizer /
- pH cycling /
- modification /
- functional characteristics /
- structure
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蛋白质是所有生命活动的物质基础，对人体生理、生化代谢反应起重要的调节作用。随着人口的增加与科技的进步，健康营养的饮食观念成为主流，在蛋白产品开发过程中选择更安全环保、富有营养的蛋白质原料已成为大势所趋。与动物蛋白相比，植物蛋白具有更好的安全性，更低的致敏性，具有多种生理保健功能。此外植物蛋白也更容易获得，对环境更为友好。因此，植物蛋白资源开发是当今研究热点之一。大米蛋白是从大米谷物中提取的一类优质植物蛋白，与其他谷类蛋白相比，大米蛋白有合理的必需氨基酸组成、低致敏性和较高的生物利用度等优点，近年来的研究表明，大米蛋白具有较好的抗氧化、降血压、降胆固醇、抗肥胖等保健功能[1−3]。豌豆蛋白是一种常见的植物膳食蛋白，具有较好的功能性质和一定的肠道菌群调节能力[4−5]。大米蛋白与豌豆蛋白不仅在致敏性、基因修饰问题等方面有共同优势，还在营养特性上达成互补，如豌豆蛋白富含大米蛋白缺乏的赖氨酸，大米蛋白可弥补豌豆蛋白在消化率与生物价上的不足[6]。利用两种蛋白开发出高性能复合蛋白产品，具有广阔的市场前景。
然而植物蛋白的低溶解度极大限制了复合蛋白的应用。大米蛋白是植物蛋白中典型的疏水性蛋白，其含量最高的谷蛋白（约80%）中有大量的疏水性基团，蛋白质分子间通过氢键和二硫键的作用使这些疏水性基团相互交联形成难溶性的聚集体，导致大米蛋白的水溶性差[7]，进而影响其它的功能性质。相比于大米蛋白，豌豆蛋白的功能性质相对较好，但仍然无法达到消费者可以接受的水准。目前，常见植物蛋白改性方法主要有高压、超声等物理改性法，或脱酰胺、糖基化等化学改性法，亦或蛋白酶酶解等生物酶改性法[8−10]。但这些方法在不同程度上存在改性效果不佳、安全性不高、苦咸味明显、工业化程度低等问题。较为温和的pH循环法在保证蛋白质一级结构完整的基础上，可以明显改善蛋白质的溶解性与其他功能性质，Pan等[11]最早通过pH循环制备玉米醇溶蛋白与酪蛋白的复合蛋白，使玉米醇溶蛋白的溶解度显著提升。Wang等[12−13]使用大米蛋白分别与酪蛋白、大豆蛋白复合，都可制备出高溶解度的复合蛋白。碱性环境能够改变蛋白质的高级结构，使蛋白质的三级结构崩塌，蛋白主链伸展为柔性肽链，并在溶液pH重调至中性过程中重新折叠至稳定结构，当多种蛋白参与重折叠进程，异源蛋白间会自然产生相互作用并生成新结构。
在目前的研究中，尽管利用pH循环法可以使植物蛋白的溶解性得到极大的提升，但是该项技术的实际应用仍然受到较大限制，即在有限的反应空间和温和的条件下，反应底物的浓度无法达到工业生产可以接受的水平，如上述的研究中，蛋白的浓度多被限制在1%。物理改性安全性高，作用时间短，对营养物质影响小，pH循环联合物理机械改性成为提高植物蛋白溶解性的有效手段。Wang等[14]将pH12.5的大米蛋白溶液进行冷冻研磨，得到的水溶性蛋白提高了42倍。对处于碱性状态下的蛋白质施以机械作用，是提升pH循环效率的有效途径。工业规模的动态高压射流磨是根据动态高压微射流的原理，并对其流体冲击腔进行改进后设计而成的，主要由三柱塞高压泵和微流化器喷嘴组成。同时，工业规模的微流化器具有专门设计的直径 300~500 μm 的微通道，比传统的动态高压微射流（<200 μm）大，同时具有更大的生产处理量（1 t/h），达到了工业化处理水平。这使得在料液处理过程中，能够有效避免原料堵塞，同时达到工业生产的水平。Li等[15]研究发现高压射流磨系统能够制备无需浸泡和过滤的全组分豆浆，且全豆豆浆的物理稳定性和营养价值都得到显著改善，充分体现了高压射流磨在液态食品加工中的潜力。He等[16]使用高压射流磨处理豌豆蛋白，蛋白质表面疏水性和游离巯基含量增加，蛋白质分子发生了去折叠/变性，不溶性蛋白质分子或聚集体转化为可溶性颗粒，蛋白的溶解度提升至64%。在此基础上，本文结合pH循环与工业级射流磨的优势，探究pH改性与物理改性共同作用下植物蛋白结构变化与增溶机理，对进一步推进植物蛋白基食品体系的发展有深远意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大米蛋白 纯度82.6%，江西恒顶食品有限公司；豌豆蛋白 纯度83.9%，烟台双塔食品股份有限公司；大豆油 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；ANS、尿素、十二烷基硫酸、β-巯基乙醇 美国 Sigma 公司；氯化钠、氢氧化钠 西陇科学股份有限公司；PBS磷酸盐缓冲液、Tris-甘氨酸缓冲液 北京索莱宝科技有限公司。
工业级高压射流磨 南昌大学农产品生物高效转化技术国家地方联合工程研究中心自制；Quanta-200 场发射环境扫描电子显微镜 美国 FEI 公司；Mastersizer 3000 粒度仪 英国 Malvern 公司；TU-1901 紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；F-7000 荧光分光光度计 日本 Hitachi 公司；T18分散机 德国IKA公司；K 9860 全自动凯氏定氮仪 海能未来技术集团股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大米-豌豆复合蛋白的制备
复合蛋白的制备方法在Wang等[17]的基础上略加修改。室温条件下将1:1的两种蛋白粉分散于水中，获得4%（w/v）的蛋白混合液100 L，用5 mol/L的NaOH将混合物pH调节至12，使用高压射流磨在30、60、90、120 MPa压力下处理复合蛋白液，再将蛋白混合液升温至50 ℃并机械搅拌1 h。用1 mol/L柠檬酸将混合液的pH缓慢调节至中性得到复合蛋白悬浊液。取部分复合蛋白液经4800 r/min离心20 min后取上清液，用分子量截留值为3400 Da的透析袋透析24 h除盐，冻干备用。
1.2.2 高压射流磨处理对氮溶解指数的影响
参考Luo等[18]的方法，不同处理压力样品均分为经过离心处理的上清液与未经处理的悬浊液。另将大米蛋白与豌豆蛋白按1:1的比例混合于超纯水中且不做任何处理，得到的4%（w/v）的蛋白混合液设置为对照组。不同处理压力得到的复合蛋白的氮溶解指数计算公式如下：
氮溶解指数(%)=上清液蛋白含量悬浊液蛋白含量×100 (1) 1.2.3 复合蛋白乳化性能的测定
采用比浊度法测定乳化性及乳化稳定性，参考Jiang等[19]的方法略作修改。将复合蛋白冻干粉复溶于超纯水中，并将溶液蛋白浓度调整为10 mg/mL，取16 mL复合蛋白溶液。在复合物中加入4 mL大豆油后，立即用分散机在10000 r/min下分散1 min得到乳液。然后立即在距离容器底部0.5 cm处准确量取50 μL乳状液分散于10 mL 0.1% SDS （w/v）中，涡旋混匀，分别于500 nm波长下测定0 min和10 min后的乳状液的吸光值A0和A10。采用乳化活性指数（EAI，m2/g）和乳化稳定性指数（ESI，min）来表示乳化性。其计算公式如下：
EAI=2×2.303×A0×DFC×(1−φ)×θ×10000 (2) ESI=A0×ΔtA0−A10 (3) 式中：DF表示稀释倍数；C表示蛋白浓度（g/mL）；φ表示油的体积分数（L/L）；θ表示光路（1 cm）；A0表示0 min的吸光值；A10表示10 min后的吸光值；Δt表示时间差。
1.2.4 复合蛋白起泡性能的测定
起泡性能及起泡稳定性按照Fathollahy等[20]的方法进行测定。将复合蛋白冻干粉复溶于超纯水中并将溶液蛋白浓度调整为10 mg/mL，取20 mL复合蛋白溶液使用分散机在10000 r/min下分散1 min，然后迅速转移到100 mL的量筒内。分别于0 min及20 min记录起泡体积V0及V20，蛋白的起泡能力及起泡稳定性计算公式如下：
起泡能力(%)=V020×100 (4) 起泡稳定性(%)=V20V0×100 (5) 1.2.5 复合蛋白粒径的测定
新鲜制备的复合蛋白悬浊液的粒径通过粒度仪测定，泵速设定在3000 r/min，折射率为1.45，吸收参数为0.01。遮光度达到3%~8%时，在室温下进行三次测量。
1.2.6 复合蛋白表面形态的测定
将蛋白粉末固定在载物台上进行喷金处理，随后采用扫描电子显微镜观察不同处理压力下的蛋白质表面形态，加速电压为5 kV，放大倍数为500倍。
1.2.7 复合蛋白分子量的测定
使用高效液相色谱系统（HPLC）和TSK凝胶GMPWXL色谱柱，通过凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量分布。在Xiao等[21]的方法上略有修改，实验使用流动相为 NaNO3 溶液（0.1 mol/L，含 0.05% NaN3），流速为0.6 mL/min，温度为35 ℃。将冻干样品粉末溶解于蒸馏水（10 mg/mL）中，使用 0.45 μm 的膜过滤器过滤。将滤液（20 μL）注入高效液相色谱系统，用 RID-20 差示折射率检测器检测蛋白质。所得结果经聚乙二醇（PEO）校准。
1.2.8 复合蛋白内源荧光光谱的测定
使用荧光分光光度计测定不同射流磨压力制备的复合蛋白的内源荧光光谱，在Dai等[22]的方法上略作修改。将冻干蛋白粉复溶于超纯水中，复合蛋白最终浓度0.25 mg/mL，激发波长280 nm，波长范围290~500 nm。激发狭缝宽度5.0 nm，发射狭缝宽度2.5 nm，扫描速度1200 nm/min。其中理论荧光光谱是将与复合蛋白溶液中对应浓度的大米蛋白和碗豆蛋白分别单独测定其荧光光谱，随后进行数值加和获得，在测量理论值与实际值时蛋白最终浓度更改为0.1 mg/mL。
1.2.9 复合蛋白表面疏水性的测定
在Haskard等[23]的实验方法基础上略作修改。以ANS为荧光探针，采用荧光分光光度计测定表面疏水性，激发波长390 nm，激发狭缝宽度5.0 nm，发射狭缝宽度2.5 nm。测定400~600 nm处的荧光发射光谱。以ANS-荧光强度来表征蛋白表面疏水性的变化。
1.2.10 复合蛋白巯基与二硫键的测定
采用Ellman法测定蛋白样品的游离巯基和总巯基含量，根据Hu等[24]描述的方法略作修改。实验方法具体步骤如下：在60 mg样品冻干粉末中加10 mL含8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸缓冲液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mol/L EDTA，pH8.0），磁力搅拌30 min后在10000 r/min下离心10 min，取上清液留作下一步测定。
游离巯基S-H含量测定：4 mL上清液加入200 μL Ellmans试剂（4 mg/mL），在412 nm下测定其吸光度。
总巯基含量：4 mL上清液加入8 μL β-巯基乙醇，在25 ℃下放置2 h，然后加入10 mL 12%的三氯乙酸（TCA），再在室温下（25 ℃）放置1 h，在10000×g下离心10 min。用5 mL 12%的TCA洗涤3次沉淀，用6 mL Tris-甘氨酸溶液溶解，4 mL上述溶液加200 μL Ellmans试剂，然后在412 nm下测定吸光度。
SH(μmol/g)=73.53×A412×DC (6) S-S(μmol/g)=N1−N22 (7) 式中：73.53为DTNB的摩尔吸光系数；A412为样品在412 nm处吸光度；D为样品稀释倍数；C为样品浓度（mg/mL）；N1为总巯基含量；N2为游离巯基含量。
1.2.11 复合蛋白二级结构的测定
实验方法在Jiang等[19]的基础上略加修改，将冻干蛋白粉复溶于超纯水中，并在室温下将溶液蛋白浓度调整为0.5 mg/mL，测定200~260 nm波长范围内复合蛋白的圆二色谱，并利用圆二色谱分析网站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk /html/home.shtml）计算蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构的含量。
1.2.12 复合蛋白氨基酸组成的测定
实验方法在汪婷婷[25]的基础上略加修改，将蛋白样品称取100 mg置于密封的水解管中，加入8 mL的6 mol/L HCl，通入3 min氮气后密封。120 ℃水解24 h后取出用10 mmol/L的NaOH进行中和，然后定容、过滤和离心（10000×g，4 ℃，30 min）。采用自动氨基酸分析仪，在38 ℃和1 mL/min的流速条件下测254 nm处测定吸光度。氨基酸的含量表示为g/100 g蛋白质。色氨酸（Trp）由于在酸性下易被降解而未检测到。
蛋白质的氨基酸评分（AAS）是目前应用较多的一种评价蛋白质营养价值的方法。表示为被测食物蛋白质的各种必需氨基酸（EAA）与推荐的理想模式或参考蛋白质的氨基酸模式进行比较并计算出分值，计算公式如下：
AAS=被测蛋白质中每克蛋白质中氨基酸量理想模式中每克蛋白质中氨基酸量×100 (8) 1.3 数据处理
所有实验设置三组平行。方差分析和显著性差异检验由SPSS 26.0根据 Duncan 检验采用单因素方差分析（ANOVA）确定，P<0.05代表样品间存在显著性差异。采用Origin 2021软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 复合蛋白氮溶解指数的测定
蛋白质溶解性是影响蛋白质其他功能特性的重要因素，较低的溶解度会极大限制蛋白质在液态食品领域的应用。图1中显示大米蛋白几乎无法溶解（1.07%±0.27%），豌豆蛋白溶解度也较低（12.71%±1.28%），对照组（大米蛋白与豌豆蛋白简单混合）的溶解度仅有8.24%±1.05%，使用高压射流磨在不同压力下对复合蛋白进一步处理，随着射流磨压力的增加，复合蛋白的氮溶解指数呈上升趋势，当射流磨压力达到120 MPa时，复合蛋白的氮溶解指数增加到92.67%±0.77%，显著高于仅pH循环的复合蛋白（63.11%±0.92%）（P<0.05）。这可能是因为在碱胁迫环境中，蛋白质的二硫键断裂，结合紧密的蛋白质聚集体舒展为柔性结构，这种变化使复合蛋白更易受到物理作用的影响[26]，两种蛋白产生相互作用并形成新共架体的概率提升，并在中和过程中展现了更好的抗折叠能力，且射流磨处理会使蛋白的平均粒径降低，促进了蛋白质在水溶液中的分散与水合作用[27]。结果表明，高压射流磨协同pH循环可有效提升复合蛋白的氮溶解指数。此外，由于对照组的氮溶解指数低于豌豆蛋白的溶解度，因此不再考察该对照组的其他性质。
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2.2 复合蛋白乳化性能的测定
通过浊度法测定复合蛋白乳化性能的变化，图2显示了大米蛋白、豌豆蛋白与经pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到复合蛋白的乳化性与乳化稳定性，仅pH循环处理的复合蛋白乳化性（17.13 m2/g）高于大米蛋白（7.09 m2/g）与豌豆蛋白（10.22 m2/g），且在高压射流磨压力为120 MPa时，复合蛋白的乳化性达到最高值（18.39 m2/g）。经高压射流磨协同pH处理的复合蛋白乳化稳定性（39.39 min）高于大米蛋白（14.60 min）与豌豆蛋白（28.18 min）。目前也有报道称pH循环法可使植物蛋白乳化性大幅度增强[28]，而机械处理导致的疏水基团暴露有助于增强蛋白质的油结合能力[29]，机械力作用还可以有效降低蛋白质粒径，更小的粒径有利于形成更小的乳液颗粒，进而增强乳液体系的稳定性。另一方面，溶解性是影响蛋白质乳化性能的重要因素，高压射流磨协同pH循环处理可使复合蛋白的氮溶解指数大幅提升，更为亲水的复合蛋白乳化性与乳化稳定性相比原样显著（P<0.05）提高[30]。结果表明高压射流磨协同pH循环处理可以有效增强复合蛋白的乳化性能。
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图 2 大米蛋白、豌豆蛋白与经pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的乳化性与乳化稳定性Figure 2. Emulsifiability and emulsion stability of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.3 复合蛋白起泡性能的测定
大米蛋白、豌豆蛋白与经pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白起泡性与起泡稳定性如图3所示，经pH循环协同高压射流磨压力120 MPa处理的复合蛋白起泡性（170%）远高于大米蛋白起泡性（47.5%）与豌豆蛋白起泡性（50%），显著高于（P<0.05）仅pH循环处理的复合蛋白起泡性（132.5%），这可能是因为可溶蛋白质的增加可以降低空气和水界面的表面张力[31]。复合蛋白的起泡稳定性略低于大米蛋白与豌豆蛋白，这是由于气泡的稳定性需要蛋白质在水-气界面形成一层具有一定厚度的弹性薄膜，而不溶性聚集体可以提供更好的稳定性[32]。结果表明，高压射流磨协同pH循环处理可以有效提升复合蛋白的起泡性能。
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图 3 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的起泡性与起泡稳定性Figure 3. Foamability and foam stability of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.4 高压射流磨处理对复合蛋白粒径的影响
大米蛋白、豌豆蛋白与经高压射流磨不同压力处理复合蛋白的粒径分布如图4A所示，pH循环处理后蛋白粒径明显左移，这种现象与Pan等[33]的报道相一致。当pH循环进一步结合射流磨后，处理之后的复合蛋白粒径分布明显左移且更为均一，蛋白质颗粒的尺寸在受到强烈的剪切力、撞击力与空化作用后逐步下降，扫描电镜的结果也显示了同样的现象。与此同时，如图4B所示，复合蛋白的比表面积也随高压射流磨的处理压力增高而显著（P<0.05）增大。由表1结果可见，高压射流磨处理协同pH循环处理可使复合蛋白颗粒的D[3,2]、D[4,3]、Dx （90）都显著下降（P<0.05），随着高压射流磨压力的增加，D[4,3]、Dx （90）呈先上升后下降的趋势，这可能是因为在低压力下，溶液中的蛋白颗粒被分散，但压力进一步增加时，两种蛋白在重折叠的过程中更容易形成新的复合结构而使蛋白颗粒粒径增加，当压力增加至90 MPa以上时，蛋白又被射流撞击腔内的复杂物理作用分散地更小而均一。粒径下降与比表面积的增大可以显著提升异源蛋白质在溶液体系中的结合效率，使复合蛋白的溶解度显著提升。
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图 4 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的粒径分布（A）与比表面积（B）Figure 4. Particle size distribution (A) and specific surface area (B) of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer表 1 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的粒径大小Table 1. Particle size of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer样品 D[3,2] D[4,3] Dx （10） Dx （50） Dx （90） 大米蛋白 20.23±0.87b 61.43±4.23b 8.24±0.31b 47.40±3.94b 136.67±8.50b 豌豆蛋白 47.26±3.55a 91.80±9.54a 29.40±1.90a 86.47±9.78a 168.00±9.54a 0 MPa 12.43±1.36c 29.20±2.05c 6.67±0.33c 25.36±2.21c 57.70±3.60e 30 MPa 2.62±0.52d 18.83±1.76de 1.12±0.20d 3.75±0.69d 66.43±3.65de 60 MPa 2.58±0.56d 24.86±1.40cd 1.15±0.17d 3.48±0.44d 89.67±3.59c 90 MPa 2.40±0.38d 20.13±2.66de 1.02±0.13d 2.93±0.24d 74.72±34.87d 120 MPa 2.10±0.30d 14.23±2.86e 0.95±0.16d 2.46±0.26d 46.43±3.72f 注：同一列数据中不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。 2.5 复合蛋白表面形态的测定
通过扫描电镜观察pH循环与高压射流磨对复合蛋白微观结构变化的影响，大米蛋白、豌豆蛋白与射流磨不同压力处理得到蛋白质的表面形态如图5所示，大米蛋白是不规则形状的蛋白质，蛋白颗粒具有褶皱状的粗糙表面，豌豆蛋白是较为光滑的球状蛋白。仅使用pH循环处理得到的复合蛋白显示出更一致的片状结构，但仍能明显观察到有豌豆蛋白与大米蛋白的形貌，这是在pH循环中没有参与到复合蛋白的形成而直接复性的蛋白，随着射流磨的压力增加，复合蛋白的大小与形貌趋向一致，在120 MPa下已不再能观测到具有大米蛋白与豌豆蛋白特有特征的颗粒，而是被破碎为更细小的片状，类似的现象在高压射流处理豌豆蛋白时被报道过[16]。说明复合蛋白在较高处理浓度下时，单独的pH循环无法使更多的大米蛋白与豌豆蛋白形成复合蛋白，这也是提高处理浓度后，pH循环处理效果下降的主要原因，高压射流磨处理使蛋白质粒径下降、比表面积增加，蛋白质的结构更为松散，异源蛋白在复性过程中形成新复合蛋白的概率增加。这样的结构也使蛋白质更易产生水合作用，从而使溶解度提升。
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图 5 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的表面形态（500×）Figure 5. Morphology of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer (500×)2.6 复合蛋白分子量的测定
复合蛋白的分子量分布如图6A所示，其中豌豆蛋白与大米蛋白原样分子量较小，分别为3.76 kDa与7.71 kDa，这可能是因为植物蛋白的溶解性较差，检测出的已溶解的蛋白分子量较小，如大米蛋白水溶部分为清蛋白，其分子量分布较小，且商品蛋白在提取过程中经过一些极端条件处理，会产生一些小分子肽。而经过高压射流磨协同pH循环处理后，复合蛋白上清液的蛋白分子量明显增大，由30 kDa增长至最高65 kDa，说明蛋白中原本大分子量且亲水性差的蛋白如谷蛋白等经过改性后可以部分稳定溶解在水溶液中[34]，由图6B所示，在高压射流磨压力由0 MPa增高至90 MPa的过程中，复合蛋白分子量占比中大于20 kDa的部分不断增大，这可能是因为高压射流磨处理使更多的蛋白参与到重组装的进程中，使重均分子量不断增大，但在压力由90 MPa增长至120 MPa时，复合蛋白的分子量下降至42 kDa，这可能是由于更强的物理作用使蛋白质聚集体的二硫键被打破，形成了分子量更小的蛋白颗粒。
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图 6 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的分子量分布（A）和各分子量区间的占比（B）Figure 6. Molecular weight distribution (A) and proportion of each molecular weight range (B) of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.7 复合蛋白内源荧光光谱的测定
芳香族氨基酸残基（色氨酸 Trp、酪氨酸 Tyr、苯丙氨酸 Phe）的内源荧光对微环境极其敏感，且蛋白质与异源物质的结合往往伴随着内源荧光的猝灭，所以可以利用蛋白质内源荧光光谱的最大荧光强度（FImax）与FImax所在波长（λmax）的变化印证蛋白之间的相互作用并表征pH循环与高压射流磨对复合蛋白三级结构的影响。在激发波长为280 nm时，复合蛋白在340 nm处出现了最大发射波长，并且理论荧光光谱的FImax远高于实际荧光光谱，说明pH循环促使大米蛋白与豌豆蛋白之间产生相互作用，形成了新的复合蛋白[35]。图7B显示了经高压射流磨处理后的复合蛋白λmax表现出向更大波长移动的趋势，这说明蛋白中的荧光基团与水的接触增加，发色源的微环境更具有极性与亲水性[36]。同时随着压力的增高，复合蛋白的FImax不断增强并在120 MPa达到最大值。高压射流磨处理可能会导致蛋白质尤其是大米蛋白进一步去折叠，破坏其紧致的蛋白结构并使其分子表面暴露出更多的疏水基团与区域，这种结构改变也使两种蛋白在复性阶段得以形成更多的复合体，进而提升复合蛋白的氮溶解指数与其他性质。
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图 7 pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的荧光光谱注：A为复合蛋白荧光强度理论值（将与复合蛋白溶液中对应浓度的大米蛋白和碗豆蛋白分别单独测定其荧光光谱，随后进行数值加和获得的荧光强度）与实际值（由高压射流磨120 MPa协同pH循环处理得到的蛋白的荧光强度）的荧光光谱；B为pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的荧光光谱。Figure 7. Fluorescence spectroscopy of composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.8 复合蛋白表面疏水性的测定
图8显示了复合蛋白经高压射流磨处理前后表面疏水性的变化，仅经pH循环处理的复合蛋白表面疏水性（4025.33±70.71）显著（P<0.05）低于大米蛋白（6268.75±114.9），又高于豌豆蛋白（2300.34±135.36），这可能是因为原本不溶的蛋白质亚基具有大量隐藏在结构内部的疏水残基，在其转变为可溶性复合蛋白的一部分过程中，两种蛋白在复性重折叠过程中形成了新的构象，疏水区域被包裹在新共架结构中，进而使表面疏水性降低[37]。在高压射流磨压力由30 MPa升高至90 MPa的过程中，射流磨撞击腔中的物理作用进一步分散了蛋白颗粒，使平均颗粒大小降低的同时也使蛋白结构更为舒张，这种作用促进了蛋白质疏水区域的暴露。当高压射流磨压力增高至120 MPa时，表面疏水性略微降低至6842.5±156.27，这可能因为蛋白质在更高压力下出现重聚集致使疏水区域被部分掩埋[38]。
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图 8 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的表面疏水性Figure 8. Surface hydrophobicity of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.9 复合蛋白巯基与二硫键的测定
游离巯基与二硫键含量可以一定程度上影响蛋白的溶解性，Ortolan等[39]认为高分子量谷蛋白与低分子量谷蛋白亚基相互作用时，会形成分子间和分子内二硫键，产生谷蛋白聚集体，导致溶解度降低。图9为高压射流磨协同pH循环处理对复合蛋白巯基与二硫键含量的影响，经pH循环处理，复合蛋白的总巯基含量（39.05±0.25 μmol/g）高于大米蛋白（36.78±0.56 μmol/g）但低于豌豆蛋白（42.53±0.41 μmol/g）。复合蛋白的游离巯基含量（26.46±0.32 μmol/g）略高于大米蛋白（25.86±0.56 μmol/g）而低于豌豆蛋白（29.17±0.44 μmol/g）。引入高压射流磨后，复合蛋白的总巯基没有发生明显变化，但游离巯基明显提升至最高32.66±0.35 μmol/g。与此同时，复合蛋白的二硫键含量随压力增加而降低。实验结果说明高压射流磨的物理作用可以增强pH循环，改变蛋白质颗粒表面性质的能力，即熔融态的蛋白聚集体进一步被破坏，使更多巯基暴露在蛋白表面。二硫键含量的降低说明复合蛋白在重折叠过程中没有更多的巯基被氧化成二硫键[38]。因此，pH 循环协同高压射流磨处理可破坏难溶性谷蛋白亚基间以及蛋白单体内的二硫键，进而提升复合蛋白的溶解性。
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图 9 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的巯基与二硫键含量Figure 9. Sulfhydryl and disulfide bond content of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer2.10 复合蛋白二级结构的测定
通过测定圆二色谱分析蛋白质的二级结构含量变化，结果如图10所示，为了更直观地表达高压射流磨协同pH循环处理对复合蛋白的影响，选取了处理压力0 MPa与120 MPa作为对比，其中理论值指使用豌豆蛋白与大米蛋白理论占比去计算得到的加权平均数，若理论值与实际值接近，则认为二级结构没有变化[17]。经pH循环处理的复合蛋白的β-转角、无规则卷曲实际含量与理论值近似，α-螺旋与β-折叠含量实际值与理论值有明显差异，并且这种差异在结合高压射流磨处理后更为明显，其中α-螺旋实际含量（25.3%）高于理论值（21.83%），β-折叠实际含量（19.9%）低于理论值（22.2%），实验结果表明复合蛋白的二级结构由β-折叠向α-螺旋转变，有报道称空泡作用可使蛋白质分子解离[40]，进而导致β-折叠含量下降，并且α-螺旋在结构上更为亲水，可以稳定蛋白与水的相互作用[17]。
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图 10 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨0、120 MPa处理得到的复合蛋白的二级结构注：A：α-螺旋；B：β-折叠；C：β-转角；D无规则卷曲。Figure 10. Secondary structures of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with 0, 120 MPa pressures of industry-scale microfluidizer2.11 复合蛋白氨基酸组成的测定
复合蛋白氨基酸分析结果如表2所示，复合蛋白的氨基酸组成大多处于大米蛋白与豌豆蛋白氨基酸组成的平衡点，其中高压射流磨处理压力120 MPa的复合蛋白的含硫氨基酸（Met+Cys-s）含量高于豌豆蛋白，赖氨酸含量高于大米蛋白，对人体健康有重要作用的精氨酸、丝氨酸等的含量仍保持在较高水平。经射流磨处理后，一些氨基酸含量上升可能是因为有更多的大米蛋白与豌豆蛋白形成了复合蛋白。复合蛋白在成人模式下的必需氨基酸评分结果如表3所示，九种必需氨基酸的评分中，仅有含硫氨基酸的评分略低于100，其中苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸等氨基酸评分远超100，说明经高压射流磨协同pH循环处理的复合蛋白氨基酸组成合理，是一种优质蛋白质。
表 2 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的氨基酸组成（g/100 g）Table 2. Amino acid composition of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer (g/100 g)氨基酸 大米蛋白 豌豆蛋白 0 MPa 120 MPa Asp 10.28±0.02b 13.37±0.24b 13.24±0.35b 12.77±0.04b Thr 4.41±0.04g 4.27±0.08i 4.10±0.14h 4.19±0.06hi Ser 7.04±0.01e 7.15±0.16d 7.14±0.16d 6.88±0.08f Glu 17.52±0.07a 16.85±0.11a 17.40±0.23a 16.82±0.06a Gly 7.53±0.06d 6.78±0.01d 7.53±0.43d 7.47±0.03d Ala 8.05±0.07c 5.91±0.13fg 6.14±0.28e 7.15±0.28e Cys 1.09±0.01m 0.33±0.07l 0.42±0.04l 0.50±0.14l Val 7.14±0.06e 6.36±0.33e 6.17±0.23e 6.64±0.16f Met 1.93±0.04k 0.69±0.06l 0.92±0.11k 1.15±0.09k Ile 3.84±0.07h 4.53±0.18i 4.29±0.03h 4.20±0.28h Leu 7.95±0.06c 8.30±0.12c 8.39±0.11c 8.26±0.57c Tyr 3.58±0.35i 2.44±0.02j 2.73±0.03i 3.02±0.11i Phe 4.04±0.07h 4.23±0.20i 4.02±0.11h 4.27±0.08h Lys 2.80±0.42j 6.17±0.21ef 5.00±0.28g 4.41±0.15h His 1.65±0.02l 1.55±0.22k 1.73±0.04j 1.64±0.16j Arg 5.81±0.20f 5.62±0.36gh 5.95±0.05e 5.40±0.08g Pro 5.82±0.04f 5.43±0.06h 5.52±0.04f 5.58±0.04g 注：不同字母表示同一蛋白的不同氨基酸含量差异显著（P<0.05）。 表 3 必需氨基酸评分（据 FAO/WHO 1985 模式，成人组）Table 3. Essential amino acid score (according to FAO/WHO 1985 model, adult group)氨基酸 大米蛋白 豌豆蛋白 0 MPa 120 MPa His 101.88 106.25 110.00 109.38 Ile 291.54 338.46 323.08 324.62 Leu 415.79 441.58 434.21 436.84 Lys 156.25 376.25 313.75 268.75 Met+Cys-s 175.29 65.29 72.35 87.06 Phe+Tyr 399.47 344.21 357.89 382.63 Thr 492.22 480.00 466.67 461.11 Val 552.31 470.77 486.92 519.23 2.12 高压射流协同pH循环处理改性大米-豌豆复合蛋白机理探究
基于前文实验结果，对大米-豌豆复合蛋白增溶机理进行推测，如图11所示。两种蛋白在碱性环境下转化为相对疏松的柔性结构，高压射流磨内的高密度机械作用力使得蛋白构象在碱性条件下获得进一步展开的内能，分子内二硫键断裂，展开成柔性肽链。这种变化可能使两种蛋白在酸诱导重折叠的过程中更易共架结合，同时折叠形成更多水合能力好的α-螺旋，得到更稳定的结构主干，这种主干可以抵抗酸中和过程中复性，导致蛋白质的折叠率更低和自聚集更少。在这种结构下，蛋白的分子量增大，疏水区域增加，结构更为疏松，溶解性提升，最终蛋白的功能性质得到明显增强。
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图 11 高压射流磨协同pH循环制备复合蛋白机制图Figure 11. Mechanism of preparation of composite proteins by industrial-scale microfluidizer synergistic pH cycling treatment3. 结论
本文通过高压射流磨协同pH循环处理两种植物蛋白，得到了高性能的复合蛋白，氮溶解指数最高可达92.67%±0.77%，功能性质均优于大米蛋白与豌豆蛋白，pH改性与物理改性的协同作用使两种蛋白在重折叠过程中可以形成新的蛋白结构，并保持良好的亲水性。复合蛋白的颗粒尺寸降低，比表面积增大，分子量增大。说明经pH循环结合高压射流磨处理改善了两种蛋白不溶性亚基的亲水性并使两种蛋白之间产生了相互作用，形成了新的共架体，且随处理压力增大复合蛋白的疏水区域、游离巯基增大，二硫键降低，结果表明高压射流磨可在pH循环的基础上进一步改变复合蛋白的表面性质。复合蛋白氨基酸组成合理，氨基酸评分基本都可达到成人推荐量。本文的研究表明，高压射流磨协同pH循环处理可以显著提升高浓度复合植物蛋白的功能性质，进一步将pH循环引入至工业规模，为植物蛋白的液态食品商业化提供了可行的新途径。然而高压射流磨协同pH循环处理中会产生一定的盐，而复合蛋白颗粒尺寸较小，使得传统的膜分离设备无法有效去除产品中的盐分，今后可继续研究有效的除盐策略或盐含量更少的处理方式。
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图 2 大米蛋白、豌豆蛋白与经pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的乳化性与乳化稳定性
Figure 2. Emulsifiability and emulsion stability of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 3 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的起泡性与起泡稳定性
Figure 3. Foamability and foam stability of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 4 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的粒径分布（A）与比表面积（B）
Figure 4. Particle size distribution (A) and specific surface area (B) of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 5 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的表面形态（500×）
Figure 5. Morphology of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer (500×)
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图 6 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的分子量分布（A）和各分子量区间的占比（B）
Figure 6. Molecular weight distribution (A) and proportion of each molecular weight range (B) of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 7 pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的荧光光谱
注：A为复合蛋白荧光强度理论值（将与复合蛋白溶液中对应浓度的大米蛋白和碗豆蛋白分别单独测定其荧光光谱，随后进行数值加和获得的荧光强度）与实际值（由高压射流磨120 MPa协同pH循环处理得到的蛋白的荧光强度）的荧光光谱；B为pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的荧光光谱。
Figure 7. Fluorescence spectroscopy of composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 8 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的表面疏水性
Figure 8. Surface hydrophobicity of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 9 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的巯基与二硫键含量
Figure 9. Sulfhydryl and disulfide bond content of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
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图 10 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨0、120 MPa处理得到的复合蛋白的二级结构
注：A：α-螺旋；B：β-折叠；C：β-转角；D无规则卷曲。
Figure 10. Secondary structures of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with 0, 120 MPa pressures of industry-scale microfluidizer
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图 11 高压射流磨协同pH循环制备复合蛋白机制图
Figure 11. Mechanism of preparation of composite proteins by industrial-scale microfluidizer synergistic pH cycling treatment
表 1 大米蛋白、豌豆蛋白与pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的粒径大小
Table 1 Particle size of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer
样品 D[3,2] D[4,3] Dx （10） Dx （50） Dx （90） 大米蛋白 20.23±0.87b 61.43±4.23b 8.24±0.31b 47.40±3.94b 136.67±8.50b 豌豆蛋白 47.26±3.55a 91.80±9.54a 29.40±1.90a 86.47±9.78a 168.00±9.54a 0 MPa 12.43±1.36c 29.20±2.05c 6.67±0.33c 25.36±2.21c 57.70±3.60e 30 MPa 2.62±0.52d 18.83±1.76de 1.12±0.20d 3.75±0.69d 66.43±3.65de 60 MPa 2.58±0.56d 24.86±1.40cd 1.15±0.17d 3.48±0.44d 89.67±3.59c 90 MPa 2.40±0.38d 20.13±2.66de 1.02±0.13d 2.93±0.24d 74.72±34.87d 120 MPa 2.10±0.30d 14.23±2.86e 0.95±0.16d 2.46±0.26d 46.43±3.72f 注：同一列数据中不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。 
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表 2 大米蛋白、豌豆蛋白和pH循环协同高压射流磨不同压力处理得到的复合蛋白的氨基酸组成（g/100 g）
Table 2 Amino acid composition of rice protein, pea protein and composite proteins obtained by pH cycling with different pressures of industry-scale microfluidizer (g/100 g)
氨基酸 大米蛋白 豌豆蛋白 0 MPa 120 MPa Asp 10.28±0.02b 13.37±0.24b 13.24±0.35b 12.77±0.04b Thr 4.41±0.04g 4.27±0.08i 4.10±0.14h 4.19±0.06hi Ser 7.04±0.01e 7.15±0.16d 7.14±0.16d 6.88±0.08f Glu 17.52±0.07a 16.85±0.11a 17.40±0.23a 16.82±0.06a Gly 7.53±0.06d 6.78±0.01d 7.53±0.43d 7.47±0.03d Ala 8.05±0.07c 5.91±0.13fg 6.14±0.28e 7.15±0.28e Cys 1.09±0.01m 0.33±0.07l 0.42±0.04l 0.50±0.14l Val 7.14±0.06e 6.36±0.33e 6.17±0.23e 6.64±0.16f Met 1.93±0.04k 0.69±0.06l 0.92±0.11k 1.15±0.09k Ile 3.84±0.07h 4.53±0.18i 4.29±0.03h 4.20±0.28h Leu 7.95±0.06c 8.30±0.12c 8.39±0.11c 8.26±0.57c Tyr 3.58±0.35i 2.44±0.02j 2.73±0.03i 3.02±0.11i Phe 4.04±0.07h 4.23±0.20i 4.02±0.11h 4.27±0.08h Lys 2.80±0.42j 6.17±0.21ef 5.00±0.28g 4.41±0.15h His 1.65±0.02l 1.55±0.22k 1.73±0.04j 1.64±0.16j Arg 5.81±0.20f 5.62±0.36gh 5.95±0.05e 5.40±0.08g Pro 5.82±0.04f 5.43±0.06h 5.52±0.04f 5.58±0.04g 注：不同字母表示同一蛋白的不同氨基酸含量差异显著（P<0.05）。
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表 3 必需氨基酸评分（据 FAO/WHO 1985 模式，成人组）
Table 3 Essential amino acid score (according to FAO/WHO 1985 model, adult group)
氨基酸 大米蛋白 豌豆蛋白 0 MPa 120 MPa His 101.88 106.25 110.00 109.38 Ile 291.54 338.46 323.08 324.62 Leu 415.79 441.58 434.21 436.84 Lys 156.25 376.25 313.75 268.75 Met+Cys-s 175.29 65.29 72.35 87.06 Phe+Tyr 399.47 344.21 357.89 382.63 Thr 492.22 480.00 466.67 461.11 Val 552.31 470.77 486.92 519.23
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