Ability of Different Heat-treated Egg Yolk Lipids to Alleviate Cognitive Decline in Mice
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摘要: 为探讨不同温度处理下蛋黄脂质对小鼠学习认知能力下降的缓解能力的差异。本研究利用小鼠认知障碍模型，比较95 ℃（水浴30 min）和121 ℃（灭菌锅加热30 min）热处理蛋黄脂质组分改善小鼠学习认知能力的差异。研究结果表明，相较于121 ℃热处理的蛋黄脂质，95 ℃热处理的蛋黄脂质更有效地降低了Tau蛋白的磷酸化和Aβ1-40、GSK-3β表达，下调了促炎因子的表达，其提升小鼠的学习记忆能力的效果更好。95 ℃热处理蛋黄脂质中的多不饱和脂肪酸以及DHA较121 ℃热处理的蛋黄脂质显著增加（P<0.05）。因此，过度的加热条件，会破坏蛋品中DHA等多不饱和脂肪酸，削弱蛋黄脂质的改善认知的生物活性。本研究为蛋制品的热加工工艺的优化提供参考依据。Abstract: To investigate the differences in the ability of egg yolk lipids to alleviate the decline in learning and cognitive abilities in mice under different temperature treatments. This study utilized a mouse model of cognitive impairment to compare the varying impacts on learning and cognitive functions resulting from 95 ℃ (30 min in water bath) and 121 ℃ (30 min in sterilization pot) heat treatments of egg yolk lipid components. The research results showed that compared with 121 ℃ heat treatment of egg yolk lipids, 95 ℃ heat treatment of egg yolk lipids effectively reduced the phosphorylation of Tau protein and the expression of Aβ1-40 and GSK-3β, downregulated the expression of pro-inflammatory factors, and had a better effect on improving the learning and memory abilities of mice. The levels of polyunsaturated fatty acids and DHA in 95 ℃ heat treatment of egg yolk lipids were significantly increased compared to those treated at 121 ℃ (P<0.05). The above results demonstrated that excessive heating impaired the ability of egg yolk lipids to alleviate cognitive decline, which might be related to the thermal degradation of polyunsaturated fatty acids such as DHA in egg products. This study provides a basis for the optimization of thermal processing of nutritious and healthy egg products.
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Keywords:
- egg yolk lipids /
- heat treatment /
- learning and memory
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蛋黄脂质主要由磷脂、胆固醇和蛋白质组成，具有丰富的生物功能和活性[1]。蛋黄脂质中的磷脂主要由卵磷脂、脑磷脂和少量的鞘磷脂构成[2]，具有调节脂质代谢、改善信号传导、缓解脑部的炎症应答、促进神经细胞的生长、改善学习认知能力等作用[3−6]。而这些作用的发挥，往往与磷脂特征结构密切相关，尤其是其Sn-1和Sn-2位的不饱和脂肪酸。这些磷脂经消化吸收后，最终以溶血磷脂和游离脂肪酸的形式穿过血脑屏障，进入脑组织中发挥作用[7]。Fan等[7]报道饱和脂肪酸可能会损害大脑并降低学习和记忆能力，而不饱和脂肪酸尤其是n-3多不饱和脂肪酸已被证明在大脑发育中起着重要作用[8−10]，但不饱和脂肪酸结构不稳定，受蛋鸡饲养、蛋鸡品种、尤其是加工条件的影响较大。不当的加工条件会引起多不饱和脂肪酸氧化降解、产生不良影响。因此，选择合适的加工条件尤为重要。
热处理是我国传统蛋制品加工中最常见的工艺流程。一些鸡蛋干、卤蛋等产品的加工流程中，为了达到杀菌、腌制等目的，往往经过长达1~2 h的高温蒸煮[11−14]。然而，过度热处理很可能导致磷脂或甘油三酯中的不饱和脂肪酸发生氧化、水解等一系列变化，导致不饱和脂肪酸含量显著降低[15−18]。在加热过程中，不饱和脂肪酸双键极易被氧化，从而产生过氧化物和自由基，引发连锁反应，形成一系列的分解产物，最终降低食物的营养价值，并可能造成细胞损伤、促进疾病发生。而上述这些变化是否会导致蛋制品改善学习认知能力的下降的研究还尚未报道。
本研究利用D-半乳糖和氯化铝联合处理的小鼠学习记忆能力损伤模型，比较95 ℃和121 ℃热加工下，蛋黄脂质组分改善小鼠学习认知能力的差异，并从蛋黄脂质组分构成和小鼠海马组织典型生物标志物的两方面变化，探索差异产生的原因。课题的研究结果将为我国传统蛋制品的热加工工艺的优化提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级雄性5周龄BALB/c小鼠（体重20±2 g） 北京华阜康生物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2020-0004；蛋黄卵磷脂 上海源叶生物科技有限公司；蛋黄脂质（低温95 ℃，高温121 ℃） 实验室提取；金龙鱼葵花籽清香型调和油 天猫超市；D-半乳糖、无水氯化铝 上海麦克林生化技术有限公司；Biosharp组织固定液、4%多聚甲醛/通用型组织固定液 福州奥研实验器材有限责任公司；P-TauSer404（货号44758）、P-TauSer396（货号44752）、Aβ1–40（货号44136）、Vectastain ABC法免疫组化试剂盒（货号PK-4000） 赛默飞世尔科技；Aβ1–42（货号AB5078P） Sigma-Aldrich公司；PrimeScript逆转录酶试剂盒 Takara Bio；SYBR Premix Ex TaqII rt PCR试剂盒 Takara生物工程公司；IL-4 ELISA试剂盒（货号EK204）、IL-1β ELISA试剂盒（货号EK201B）、IL-6 ELISA试剂盒（货号EK206）、IL-10 ELISA试剂盒（货号EK210）、TNF-α ELISA试剂盒（货号EK282EGA） 中国联科生物技术有限公司；TRNzol试剂 天根生化技术（北京）有限公司。
Morris水迷宫视频分析系统V2.0、小鼠跳台记录仪 安徽正华生物仪器设备有限公司；DF-Ⅱ型磁力加热搅拌器 常州荣华仪器制造有限公司；LB-B50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；KQ2200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH.S21-4电热恒温水浴锅 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蛋黄脂质提取
鸡蛋的热处理条件为：95 ℃的水浴锅中处理30 min、高压灭菌锅121 ℃杀菌30 min[19]。冷却后提取蛋黄，捣碎五个蛋黄后准确称取30 g，放入具塞锥形瓶中，加入180 mL氯仿-甲醇混合液（2:1）混匀。将锥形瓶放入超声波仪中，在常温80%功率下提取30 min。过滤后加入20 mL 0.88% NaCl水溶液，猛烈振荡混匀后转入分液漏斗静置分层，保留下层。对下层溶液进行3000×g离心10 min，抽离上清液，保留下层澄清橙黄色溶液。对下层溶液进行75 ℃减压旋转蒸发1 h后，75 ℃水浴氮吹至恒重，得到后续实验所用蛋黄脂质。
1.2.2 动物分组及给药
50只BALB/c小鼠随机分成5组：正常对照组（Ctrl组）、AD模型组（Model组）、卵磷脂阳性对照组（Lecithin组）、蛋黄脂质95 ℃热处理组（EYL-95 ℃组）和蛋黄脂质121 ℃热处理组（EYL-121℃组）。小鼠自由饮水及采食，适应性饲养1周后，除正常对照组外，其余四组每日灌胃0.1 mL AlCl3溶液（4 mg/mL）及颈部皮下注射D-半乳糖（24 mg/mL）溶液0.1 mL[20]。同时，卵磷脂阳性对照组每日灌胃植物油0.2 mL，蛋黄脂质组每日灌胃0.2 mL蛋黄脂质稀释液（以蛋黄脂质:植物油1:6比例稀释）[21]，正常对照组与AD模型组灌胃生理盐水0.2 mL，连续8周。第9周开始进行水迷宫实验，检测小鼠的学习记忆功能，若模型组小鼠在水迷宫的目标象限的停留时间、活动距离以及穿越平台的次数显著减少，且在跳台实验中，模型组小鼠潜伏期减少、错误次数增加。即判断为造模成功。取脑组织进行后续指标检测。实验符合实验动物管理条例和动物实验管理的相关要求，且获得了中国农业大学实验动物委员会的批准（AUJ21903202-5-1）。
1.2.3 Morris 水迷宫实验
参照周娇娇等[22]的方法，首先将小鼠面向池壁从第Ⅰ象限中放入水中，设定实验时间为60 s，小鼠从入水开始找安全平台（位于第Ⅲ象限）。若60 s内找到平台，则使其在平台上停留10 s；若60s内未找到平台，则将其引导至平台，并停留10 s。定位航行实验连续4 d。第5 d开始空间探索，撤掉平台，将小鼠从第Ⅰ象限入水，持续时间60 s。记录小鼠穿越平台次数以及在第Ⅲ象限停留时间和游泳距离。
1.2.4 跳台实验
将小鼠放入跳台箱内适应环境3 min后通36 V交流电，小鼠在站台上可免受电击，跳下站台，则受到电击；24 h后为测试阶段，记录其5 min内第1次跳下站台时间（即跳台潜伏期）及遭受电击次数（即错误次数）。
1.2.5 脑组织HE染色
小鼠使用4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注后取新鲜脑组织，浸泡在中性福尔马林中固定。将组织块修成适当大小后，依次进行脱水、浸蜡、石蜡包埋及切片，最后对组织切片进行常规HE染色。并对被HE染色染成粉红色的嗜酸性粒细胞进行手动计数[23]。
1.2.6 免疫组织化学分析
免疫组化染色分析p-Tau（s404、s396）、Aβ1-40和Aβ1-42在大脑皮层和海马中的表达。应用小鼠抗兔抗体和二氨基联苯胺进行显色反应。通过Vectastain ABC试剂盒以及二氨基联苯胺的底物观察抗体结合水平。在显微镜下获得图像以观察形态学变化。在光镜下随机选取海马CA1区5个视野（400×），计数200个细胞中的阳性细胞数。
1.2.7 实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析
收集每组剩余5只小鼠的海马组织，于−80 ℃冰箱中储存。使用TRNzol试剂从海马组织中提取总RNA。用于qPCR的引物序列和产物大小列于表1中。引物由Invitrogen（中国北京）合成。使用2−ΔΔCt方法计算mRNA表达水平[24]，并将所有数据标准化为ACTIN基因，在三个重复孔中测试每个样品。PCR反应条件为：95 ℃保持10 s，60 ℃保持60 s，95 ℃保持15 s，共进行40个循环。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence引物 上/下游 引物序列（5'~3'） 产物大小（bp） GSK-3β 上游 CTCTTGTGGTAGAAACGGAA 123 GSK-3β 下游 ATAACCCTGTGAAACTGACC PP2A 上游 AGTTTGACCCAGCACCTC 205 PP2A 下游 GCACATCTTTTGGTCCGT ACTIN 上游 CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 159 ACTIN 下游 ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG 1.2.8 炎症因子表达水平
根据说明书使用商业ELISA试剂盒测定血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10的含量。将这些炎症因子的水平标准化为样品的总蛋白浓度。数据以pg/mg蛋白质表示。使用酶标仪在450 nm处测定每个孔中的光密度值。
1.2.9 脂肪酸组成测定
蛋黄脂质的皂化和甲酯化参照王庆玲[25]的方法和GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》[26]的外标法。
脂肪酸检测气相色谱分析条件参照袁诺等[27]的方法，毛细管色谱柱：SH-Rt-2560，柱长100 m，内径0.25 mm，膜厚0.2 μm；载气为氦气；流速1.0 mL/min；分配比为15:1；注射器温度：240 ℃；程序升温：柱温先以130 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至190 ℃，以1 ℃/min升至210 ℃保持5 min，再以4 ℃/min升至240 ℃保持5 min。定量方法为外标法，用色谱峰面积计算样品中各种脂肪酸的含量。
1.3 数据处理
使用GraphPad Prism分析数据，结果以平均值±标准误表示，组间数据的显著性分析采用一维方差分析（One-way ANOVA）中的Tukey's多重比较进行。P<0.05表示数据具有显著差异，P<0.01表示数据具有非常显著差异，P<0.001表示数据具有极显著差异。
2. 结果与分析
2.1 行为学结果
2.1.1 水迷宫
水迷宫是一种空间学习和记忆能力测试的神经行为学实验方法[28−30]。图1A显示了每组小鼠的典型水迷宫轨迹。水迷宫实验中各组小鼠的平台穿越次数、在目标象限停留时间和在目标象限游泳距离如图1B~1D所示。与正常对照组相比，模型组小鼠的穿越次数显著减少（P<0.05），在目标象限的停留时间和活动距离也减少但不显著（P>0.05），表明模型组小鼠认知功能下降，这可以作为模型建立成功的指标之一。与模型组相比，阳性对照组卵磷脂的穿越平台次数、在目标象限的停留时间和在目标象限内的活动距离均显著增加（P<0.05，P<0.01），蛋黄脂质95 ℃热处理组在目标象限内停留时间和在目标象限内活动距离均显著增加（P<0.05）。其中，与蛋黄脂质121 ℃热处理组相比，蛋黄脂质95 ℃热处理组的穿越平台次数、在目标象限的停留时间以及活动距离增加，但无显著差异（P>0.05）。这些结果表明，95 ℃热处理的蛋黄脂质改善小鼠的学习记忆能力明显强于121 ℃热处理组。
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2.1.2 跳台实验
跳台测试通常用于测试小鼠的逃避和逃脱学习能力[31]。结果如图2所示。与正常对照组相比，模型组潜伏期缩短，错误次数有所增加，表明模型组小鼠认知能力下降，模型建立成功。与模型组相比，各组小鼠的潜伏期都有一定的延长，蛋黄脂质95 ℃热处理组的效果更好。蛋黄脂质95 ℃和121 ℃热处理组小鼠的潜伏期虽然与模型组相比有一定的增加，但没有显著差异（P>0.05）。在错误次数方面，与模型组比较，其他组的错误次数减少，尤其是蛋黄脂质95 ℃热处理组显著减少（P<0.05）。蛋黄脂质121 ℃热处理组的错误次数也有一定减少。这些结果表明，蛋黄脂质95 ℃热处理组更能提高小鼠的学习记忆能力。
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图 2 不同热处理蛋黄脂质组小鼠跳台实验Figure 2. Step-down test of mice with different heat-treated egg yolk lipids groups2.2 脑组织HE染色
HE染色后各组小鼠脑组织中海马的病理形态如图3所示。模型组小鼠海马CA1区细胞排列紊乱、有间隙且形态各异。细胞核表现出凝结、溶解和消失的特征，并失去了正常的结构。与模型组相比，卵磷脂阳性对照组的细胞有序且均匀，细胞形态明显改善。蛋黄脂质95 ℃热处理组和蛋黄脂质121 ℃热处理组具有一定的效果：细胞表现出轻微的核裂解，排列相对整齐，细胞空间在一定程度上缩小。表明蛋黄脂质组能改善D-半乳糖和氯化铝处理诱导的衰老小鼠的脑组织海马的病理形态。嗜酸性粒细胞计数升高通常与各种慢性炎症性疾病有关[32]。对小鼠海马CA1区嗜酸性细胞进行计数，结果显示，与模型组相比，其他组的嗜酸性细胞比例均降低，蛋黄脂质热处理组的嗜酸细胞数量较模型组显著减少（P<0.05），说明蛋黄脂质能在一定程度上逆转海马损伤。
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图 3 不同热处理蛋黄脂质对小鼠神经元损伤的影响Figure 3. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on neuronal damage in mice2.3 Aβ和Tau蛋白表达的免疫组织化学
Aβ和Tau是神经退行性疾病的常见生物标志物[33]。D-半乳糖和铝离子会导致Aβ沉积和Tau蛋白过度磷酸化、神经元损伤，影响学习记忆能力[34]。Aβ1-40、Aβ1-42是常见的β-淀粉样蛋白，Tau pS396和Tau pS404是常见的Tau蛋白磷酸化位点蛋白。如图4所示，与正常对照组相比，模型组中Aβ1-40、Aβ1-42、Tau pS396和Tau pS404的平均光密度值（AOD）极显著升高（P<0.001），即蛋白的表达极显著增加（P<0.001）。卵磷脂阳性对照组中Aβ1-40和Aβ1-42的阳性表达水平极显著低于模型组（P<0.001）。与模型组相比，蛋黄脂质95 ℃热处理组和蛋黄脂质121 ℃热处理组的Aβ1-40阳性表达水平显著降低（P<0.01，P<0.05），而Aβ1-42阳性表达水平无显著差异（P>0.05）。图4C和4D显示，与模型组相比，卵磷脂阳性对照组显著降低了Tau pS396和Tau pS404的阳性表达（P<0.05）。95 ℃加热的蛋黄脂质处理导致Tau pS396和Tau pS404的阳性表达非常显著地降低（P<0.001，P<0.01），而蛋黄脂质121 ℃热处理组没有显著差异（P>0.05）。上述实验结果表明，蛋黄脂质不仅能抑制Aβ1-40和Aβ1-42的产生和聚集，还能防止Tau蛋白的过度磷酸化，且蛋黄脂质95 ℃热处理组效果优于蛋黄脂质121 ℃热处理组。
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图 4 不同热处理蛋黄脂质对Aβ和Tau蛋白表达的影响Figure 4. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the protein expression of Aβ and Tau2.4 不同热处理蛋黄脂质对小鼠海马PP2A和GSK-3β mRNA表达的影响
蛋白磷酸酶-2A（PP2A）是一种具有去磷酸化功能的重要蛋白酶，可介导Tau的异常磷酸化[35]。PP2A基因表达上调能减少磷酸化Tau蛋白的积累，改善认知损伤。糖原合酶激酶3β（GSK3β）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它在多种生物学过程中发挥作用，包括新陈代谢、细胞结构维持、基因表达的调节以及细胞死亡，可磷酸化多个残基上的Tau，导致Tau过度磷酸化[36]。GSK3β基因表达的下调会减少Tau的磷酸化。本文通过qRT-PCR检测了PP2A、GSK3β基因的表达情况，结果如图5所示。与正常对照组相比，模型组PP2A基因表达极显著降低（P<0.001），GSK3β基因表达极显著增加（P<0.001）。各给药组的PP2A基因的表达相较于模型组有一定的增加，但没有显著差异（P>0.05）。卵磷脂阳性对照组和蛋黄脂质95 ℃热处理组非常显著地抑制了GSK-3β基因表达（P<0.01）。结果表明，D-半乳糖和氯化铝联合处理会导致PP2A基因表达下降，GSK-3β基因表达升高，而蛋黄脂质95 ℃热处理组可促进PP2A基因表达、抑制GSK-3β基因表达，从而减少Tau蛋白的过度磷酸化。
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图 5 不同热处理蛋黄脂质对PP2A和GSK-3β基因表达的影响Figure 5. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the mRNA expression of PP2A and GSK-3β2.5 不同热处理蛋黄脂质组小鼠的炎症因子水平
D-半乳糖和氯化铝联合处理可通过异常累积的Aβ激活神经小胶质细胞，释放大量炎症因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6等[37]。这些炎症反应一般发生在神经退行性疾病如AD的早期，增强了不溶性Aβ和Tau的积累，从而导致认知学习能力下降[38−39]。本研究利用ELISA试剂盒检测了血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抗炎细胞因子IL-4和IL10的表达量，结果如图6所示。与正常对照组相比，模型组IL-1β和IL-6外周炎症水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，卵磷脂阳性对照组IL-1β和IL-6水平非常显著地降低（P<0.01），EYL-95 ℃组这两种外周炎症水平也显著降低（P<0.05）。其余组之间没有统计学上的显著差异（P>0.05）。结果表明，蛋黄脂质95 ℃热处理组在降低促炎因子表达水平、提高抑炎因子表达水平方面比蛋黄脂质121 ℃热处理组更有效。
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图 6 不同热处理蛋黄脂质对炎症因子水平的影响Figure 6. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the levels of inflammatory factors2.6 不同热处理的蛋黄脂质脂肪酸含量
不同温度处理对蛋黄脂肪酸组成的影响如图7所示，与95 ℃热处理后的蛋黄相比，121℃热处理的蛋黄的饱和脂肪酸（SFA）总含量以及单不饱和脂肪酸（MUFA）含量没有显著差异（P>0.05）。121 ℃热处理组的多不饱和脂肪酸（PUFA）含量显著低于95 ℃热处理组（P<0.05）。其中，大脑中具有代表性神经保护作用的ω-3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）的含量也因加热温度的升高而显著减少（P<0.05）。在加热过程中，脂质可能发生了氧化降解。PUFA因其具有更多的双键，更容易受到自由基的攻击，因此更容易发生氧化、水解反应和降解[40−41]。这些脂肪酸变化，可能是不同热处理蛋黄脂质缓解D-半乳糖和AlCl3联合处理导致的小鼠学习记忆能力损伤能力差异的原因。一方面，已有大量研究证明不饱和脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸能显著改善认知功能[42−45]。另一方面，脂质氧化产生的潜在毒性产物，一旦进入体内会破坏细胞结构，进一步引起炎症性疾病，以及癌症、动脉粥样硬化、衰老等[46−47]。与蛋黄脂质的95 ℃热处理组相比，121 ℃热处理组的多不饱和脂肪酸尤其是有益的长链多不饱和酸的含量降低，这可能导致121 ℃热处理组改善学习记忆能力损伤的效果不如95 ℃热处理组。
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图 7 不同热处理蛋黄脂质对脂肪酸组成的影响注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。Figure 7. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the composition of fatty acids3. 结论
本研究采用不同温度处理蛋黄脂质，探讨不同温度处理下蛋黄脂质对D-半乳糖和AlCl3联合给药诱导的衰老小鼠学习记忆能力的影响。95 ℃（水浴30 min）处理的蛋黄脂质能够有效提升小鼠的学习记忆能力，效果明显优于121 ℃热处理的脂质。相关生物标志物的检测也证明，低温处理蛋黄脂质更有效地降低了Aβ1-40、Tau蛋白的磷酸化、GSK-3β基因的表达和促炎因子的表达水平，因此具备了更强的改善认知能力。对于蛋黄脂质的脂肪酸组成分析结果也进一步证明，在较低的温度处理下蛋黄脂质多不饱和脂肪酸及DHA的含量更高，这可能与改善认知能力有一定关联。本文的研究结果表明，我国传统蛋制品加工中过度的加热条件会破坏产品中多不饱和脂肪酸，并进一步削弱蛋黄脂质的生物活性。
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图 2 不同热处理蛋黄脂质组小鼠跳台实验
Figure 2. Step-down test of mice with different heat-treated egg yolk lipids groups
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图 3 不同热处理蛋黄脂质对小鼠神经元损伤的影响
Figure 3. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on neuronal damage in mice
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图 4 不同热处理蛋黄脂质对Aβ和Tau蛋白表达的影响
Figure 4. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the protein expression of Aβ and Tau
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图 5 不同热处理蛋黄脂质对PP2A和GSK-3β基因表达的影响
Figure 5. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the mRNA expression of PP2A and GSK-3β
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图 6 不同热处理蛋黄脂质对炎症因子水平的影响
Figure 6. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the levels of inflammatory factors
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图 7 不同热处理蛋黄脂质对脂肪酸组成的影响
注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
Figure 7. Effects of egg yolk lipids under different heating treatments on the composition of fatty acids
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物 上/下游 引物序列（5'~3'） 产物大小（bp） GSK-3β 上游 CTCTTGTGGTAGAAACGGAA 123 GSK-3β 下游 ATAACCCTGTGAAACTGACC PP2A 上游 AGTTTGACCCAGCACCTC 205 PP2A 下游 GCACATCTTTTGGTCCGT ACTIN 上游 CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 159 ACTIN 下游 ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG 
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