Protective Effect of Puerarin on Chronic Alcoholic Liver Injury in Mice Based on Metabolomics
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摘要: 目的：采用非靶向代谢组学技术对慢性酒精性肝损伤（alcoholic liver disease，ALD）小鼠的血清和肝脏中的代谢产物进行分析，以鉴定筛选出与酒精性肝损伤相关的差异代谢物，并构建其代谢通路，从而探究葛根素保护酒精性肝损伤小鼠的作用机制。方法：连续8周灌胃52°白酒建立慢性酒精性肝损伤小鼠模型；采用肝功能生化指标、病理组织切片评价葛根素对ALD小鼠的保护作用；采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）代谢组学技术对小鼠肝脏及血清代谢物进行分析；采用多元统计分析对数据进行处理，以第一主成分的变量重要性投影（VIP）>1且t检验P<0.05为条件筛选出差异代谢物；运用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路分析。结果：葛根素可以显著降低酒精性肝损伤小鼠的ALT和AST水平（P<0.05或P<0.01），病理切片结果显示葛根素能够改善ALD小鼠肝脏炎症细胞浸润。经多元统计分析，在血清代谢组中发现模型组和空白组之间存在11个差异代谢物，在葛根素干预下，11种差异代谢物水平趋于空白组，主要涉及氨基酸的合成与代谢、谷胱甘肽代谢、卟啉和叶绿素代谢等代谢途径；在肝脏代谢组发现模型组和空白组之间存在32个差异代谢物，在葛根素干预下，31种差异代谢物水平趋于空白组，主要涉及氨基酸合成与代谢、初级胆汁酸的生物合成、嘌呤代谢、磷脂酰肌醇信号系统、类固醇激素代谢等代谢途径。结论：葛根素具有保护酒精性肝损伤小鼠的作用，其作用机制可能通过调节血清及肝脏代谢物紊乱发挥作用，为今后解酒保健食品的开发提供了有价值的参考。Abstract: Objective: The Non-targeted metabolomics technology was used to analyze the metabolites in the serum and liver of mice with chronic alcoholic liver injury (ALD), to identify and screen out the differential metabolites related to alcoholic liver injury and construct its metabolic pathway, and to explore the protective mechanism of puerarin against alcoholic liver injury in mice. Methods: The mouse model of chronic alcoholic liver injury was established by intragastric administration of 52 liquor for 8 weeks. Meanwhile, the protective effects of puerarin on ALD mice were evaluated using biochemical indexes of liver function and pathological tissue sections. Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) metabonomics technique was used to analyze the metabolites of mouse liver and serum. Multivariate statistics were used to process the data, and the variable importance projection (VIP) of the first principal component was >1 and the t-test P<0.05 was used to screen out the differential metabolites. Metabolic pathways of differential metabolites using KEGG database. Results: Puerarin could significantly improve ALT and AST levels in alcohol-induced liver injury mice (P<0.05 or P<0.01). Furthermore, the pathological section results indicated that puerarin could improve liver inflammatory cell infiltration in ALD mice. Through multivariate statistics, 11 metabolites were found in serum metabolites between the model group and the blank group. Under puerarin intervention, the levels of 11 metabolites tended to blank group, mainly related to amino acid synthesis and metabolism, glutathione metabolism, porphyrin metabolism and chlorophyll metabolism. There were 32 different metabolites between the model group and blank group in liver metabonomics, and the levels of 31 different metabolites tended to blank group under puerarin intervention, which mainly involved the amino acid synthesis and metabolism, biosynthesis of primary bile acids, purine metabolism, phosphatidylinositol signalling system, steroid metabolism and other metabolic pathways. Conclusion: Puerarin has a protective effect on alcoholic liver injury in mice, and its mechanism may be through regulating the disorder of serum and liver metabolites, which provides a valuable reference for anti-alcoholism health food in the future.
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Keywords:
- chronic alcoholic liver injury /
- puerarin /
- metabolomics /
- metabolic pathways
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肝脏是体内以物质和能量代谢为主的器官，是大量内源性代谢产物的来源[1]。一旦肝脏受到损伤对人体健康有着极大的危害，严重者甚至危及生命。酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease ，ALD）是一个复杂的过程，其病理变化过程包括肝细胞脂变、肝细胞的骨架的损伤、炎症、肝纤维化、肝细胞凋亡和坏死[2]。据统计，ALD几乎占全世界肝硬化死亡人数的50%，由酒精所致肝损伤的发病率呈逐年上升趋势，严重威胁国民健康[3]，目前酒精性肝病主要是通过药物和手术进行治疗，但大多数药物治疗都有副作用和高复发率。因此，开发天然安全高效的保肝药已成为干预酒精性肝病的重要途径，近年研究表明中药由于其多靶点和低毒副作用在预防和治疗ALD的上具有一定优势[4]，食源性天然物质对酒精性肝损伤的保护作用更是受到广泛关注。
葛根是豆科植物野葛Puearia lobata （Willd.） Ohwi的干燥根[5]，是我国常见的药食同源中药之一，始载于汉代的《神农本草经》，味凉、甘、辛，具有止渴解酒的功效，而葛根素是葛根最重要的活性成分之一[6−7]，可以通过抑制炎症反应、增强乙醇代谢和线粒体生物合成、降低氧化应激水平来减少乙醇诱导的肝损伤[8−10]。然而，葛根素改善酒精性肝损伤传统的药效研究大多数仅进行谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性等病理生理指标的检测，只能从宏观上证明药物的干预作用，无法全面系统地揭示药物的作用机制[11−12]。代谢组学是研究生物体受到外界扰动后内源性差异代谢物的动态变化，可以从微观的角度全面系统的揭示药物发挥疗效的作用机制[13−14]。因此，本实验建立了慢性酒精性肝损伤（ALD）小鼠模型，并且采用非靶向代谢组学的手段探讨葛根素对慢性酒精性肝损伤中肝脏和血清的差异代谢物的变化规律和代谢通路的影响，从代谢变化角度阐明葛根素干预治疗慢性酒精性肝损伤的机制，为葛根在食品开发与应用和预防及治疗ALD提供新的方向。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雄性KM小鼠 24只，8周龄，体重（20±2）g，动物许可证号：SCXK（辽）2020-000172，辽宁长生生物股份有限公司，实验动物于通风环境中饲养，给予充足饮水和饲料，实验操作均符合国家制定的实验动物管理和使用指南，实验动物伦理编号（HLK-20221008-001）；乙腈、甲醇 美国Fisher公司；52°白酒 北京红星股份有限公司；生理盐水 武汉滨湖双鹤药业有限责任公司；联苯双酯滴丸 万邦德医药集团股份有限公司；葛根素 西安立森生物科技有限公司；苏木精、伊红染液、4%多聚甲醛PFA固定液 武汉赛维尔生物科技有限公司；谷草转氨酶（AST）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒 南京建成生物工程研究所。
RM2016病理切片机 上海徕卡仪器有限公司；Vanquish型超高效液相色谱仪、Orbitrap Exploris 120型高分辨质谱 美国赛默飞世尔科技公司；十万分之一天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL-16M型离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KZ-III-F型组织破碎仪 武汉赛维尔生物科技有限公司；KQ5200E型超声机 深圳市雷德邦电子有限公司；RT-2100C型全波长酶标仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 给药及造模
混悬液的配制根据文献[15]可知，葛根素成人每日推荐摄入量为16.67 mg/kg（BW/d），以次作为成人每日剂量进行人与动物临床剂量折算，小鼠的每日临床等效剂量为150 mg/kg，小鼠灌胃体积为0.01 mL/g，故将葛根素加生理盐水现用现配制成15 mg/mL的混悬液备用。联苯双酯的配用：取联苯双酯滴丸研细，取适量粉末，精密称定，加入生理盐水超声混匀，制成8.775 mg/mL的联苯双酯溶液。24只小鼠适应性喂养1周，将小鼠随机分为4组：空白组（Control）、模型组（Model）、联苯双酯组、葛根素组（PUE），每组6只。除空白组外，其余各组均灌胃52°白酒（灌胃体积为0.01 mL/g），空白组每天早晨灌胃等量生理盐水，给酒1 h后，阳性药组灌胃给予联苯双酯混悬液（8.775 mg/mL）、葛根素组灌胃给予葛根素混悬液（15 mg/mL），连续8周。给药8周后，禁食不禁水12 h后，麻醉小鼠后，取眼球血于EP管中3000 r/min离心15 min。采血后，即刻将小鼠脱颈椎处死，取肝脏，用预冷的生理盐水清洗污血后用滤纸吸干表面水分。肝脏组织按1:9加入冰PBS缓冲液稀释10倍，充分匀浆后，3000 r/min离心15 min，吸取上清，得肝脏组织匀浆液。
1.2.2 生化指标的测定
按试剂盒说明书操作，测定谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的活性。
1.2.3 肝组织病理形态观察与病理评分
取小鼠的肝脏组织，用4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋并切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，参照文献[16]的肝组织评分标准，进行病理评分，病理评分标准如下：没有炎症细胞浸润，记0分；轻度炎症细胞浸润记1分；中度炎症细胞浸润记2分；重度炎症细胞浸润记3分；细胞大小正常，记0分；轻度细胞肿胀，记1分；中度细胞肿胀，记2分；重度细胞肿胀记3分。病理组织评分=炎症细胞浸润程度评分+细胞肿胀程度评分。
1.2.4 UPLC-Q-TOF/MS代谢组学分析
1.2.4.1 血清样品的制备
血清样品（100 μL）与提取液（甲醇:乙腈，1:1（v/v）400 μL，为有效地消除分析过程中的误差，提高测定结果的准确度和精密度，向提取溶液中加入氘代内标物，混合涡旋30 s，在4 ℃水浴中超声处理10 min，并在−40 ℃下静置1 h沉淀蛋白质。然后将样品在4 ℃离心12000 r/min，离心15 min。然后，取上清于进样瓶中上机检测；所有样品另取等量上清混合成QC样品上机检测。
1.2.4.2 肝脏组织样品的制备
取小鼠肝组织样品（25±1） mg，与搅拌子一起和提取液（甲醇:乙腈:生理盐水，2:2:1（v/v））400 μL，并向提取液中加入氘代内标物，将混合溶液涡旋30 s。随后的程序与1.2.4.1相同。
1.2.4.3 色谱条件
使用Vanquish（Thermo Fisher Scientific）超高效液相色谱仪，以Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）为色谱柱，以含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水为流动相A，乙腈溶液为流动相B。样品盘温度4 ℃，进样体积2 μL。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式，毛细管温度320 ℃，辅助气流量50 arb，鞘气体流量15 arb，全MS分辨60000，MS/MS分辨率15000，NCE模式下碰撞能量20/30/40，喷雾电压3.8 kV（ESI+），−3.4 kV（ESI-）。
1.3 数据处理
1.3.1 代谢数据分析
原始数据经ProteoWizard软件转成.mzXML格式后，使用自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB V2.1自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。数据经标准化处理后导入SIMCA16.0.2 软件进行进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。
1.3.2 差异代谢物的筛选与代谢通路分析
在OPLS-DA模型中，以第一主成分的变量重要性投影（VIP）值>1且t检验P<0.05为标准进行组间差异代谢物的筛选。通过差异代谢物对KEGG、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，在取得差异代谢物的匹配信息后，采用KEGG数据库（http://www.genome.jp/KEGG/结合MetaboAnalyst 5.0软件（http://www.MetaboAnalyst.ca/）对筛选出的差异代谢物进行代谢通路分析。
1.3.3 统计学处理方法
通过SPSS 22.0 软件对各组间的差异代谢物进行单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 AST、ALT生化指标结果
Guo等[17]在使用昆布多糖治疗小鼠酒精性肝损伤发现在酒精刺激的下肝细胞变性，肝细胞膜发生脂质过氧化，AST和ALT通过受损的肝细胞膜释放到血液中，导致血清AST和ALT水平异常升高。由表1可知，与空白组相比，模型组小鼠血浆的ALT和AST极显著地升高（P<0.01），与模型组相比，葛根素可以显著降低ALT水平（P<0.05），可极显著降低AST水平（P<0.01），阳性药可极显著降低血浆ALT和AST活性（P<0.01），且葛根素组和阳性药组的ALT和AST活性无显著性差异，显示葛根素对酒精性肝损伤有保护作用，以上结果初步表明葛根素对ALD有一定的治疗作用，但两者具体作用机制尚不明确。在此基础上从血清代谢组学和肝脏代谢组学角度探讨葛根素治疗ALD的作用机制。
表 1 葛根素对小鼠血清中AST、ALT含量的的影响Table 1. Effects of puerarin on serum levels of AST and ALT in mice组别 AST（U/g prot） ALT（U/g prot） 空白组 13.4±3.26 12.47±2.83 模型组 20.88±2.21* 18.75±3.791* 联苯双酯组 13.51±2.193## 12.34±1.533## 葛根素组 14.01±1.343## 14.92±3.252# 注：*表示与空白组比较，P<0.01；#表示与模型组比较，P<0.05；##表示与模型组比较，P<0.05。 2.2 小鼠肝组织病理形态与病理评分
结果如图1所示，空白组肝细胞排列整齐，结构清晰，染色均匀。与空白组相比，模型组细胞结构紊乱，同时可见明显的肝细胞肿胀和炎性细胞浸润见黑色箭头所示，进一步证实了ALD模型的成功建立。阳性药组和葛根素组的组织病理学结果显示，肝细胞排列良好，肝组织形态结构改善，肝细胞大小发生变化，边界基本清晰，此外实验证明，小鼠服用葛根素后，酒精性肝损伤得到一定程度的缓解。各组小鼠肝组织病理评分比较见图2，评分越高，表明肝细胞损伤及炎症细胞浸润程度越高。
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图 1 各组小鼠肝组织切片（HE，200×）Figure 1. Liver tissue sections from various groups of mice (HE, 200×)![]()
图 2 各组小鼠肝组织病理评分比较（n=6）注：**表示与空白组比较，P<0.01；#表示与模型组比较，P<0.05。Figure 2. Comparison of liver histopathological scores of mice in each group (n=6)2.3 小鼠血清代谢组学分析
2.3.1 血清代谢组数据PCA分析
PCA 3D评分图见图3，可以看出，三组的样本代谢成分呈现部分分离趋势，尤其是空白组和模型组，发生明显分离，说明酒精造成了小鼠血清代谢物出现差异。
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图 3 各组小鼠血清PCA 3D得分散点Figure 3. Points of dispersion of serum PCA 3D in each group of mice2.3.2 血清代谢组数据OPLS-DA分析
为进一步筛选组间差异，采用OPLS-DA对小鼠血清样本进一步分析。OPLS-DA得分图中葛根素与模型组分离明显，聚集程度较好，说明血清代谢物在葛根素与模型组之间存在明显差异（图4）。为检验OPLS-DA模型是否存在过拟合现象，通过置换检验对OPLS-DA模型进行统计验证。OPLS-DA置换检验中R2X与R2Y值越接近1表明模型拟合数据效果越好，且当Q2在Y轴上的截距小于0时表明分析模型可靠。结果表明所有的Q2值均低于右侧原点，且Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0（R2Y=0.97，Q2= −0.33），表明此模型无过度拟合现象具有很好的可预测性和拟合度，能够准确地描述数据，见图5A。基于PCA和OPLS-DA对检测到的所有代谢物进行差异分析，绘制代谢物火山图，见图5B，观察差异代谢的分布。
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图 5 OPLS-DA 评分及置换检验和火山图注:A模型组与葛根素组的置换检验；B为模型组和葛根素组差异代谢物火山图。Figure 5. OPLS-DA score and replacement test and volcano plots2.3.3 血清代谢差异物筛选
依据OPLS-DA模型，以VIP>1且P<0.05为标准进行组间差异代谢物的筛选。空白组与模型组共筛选出11个差异代谢物，是潜在的酒精性肝损伤生物标志物。葛根素组显著改变了血清样本中的11种差异代谢物，其中7种差异代谢物上调，包括N-甲基烟酰胺、胆绿素、白青霉烯、L-脯氨酸、鸟氨酸、假尿苷、赤藓醇，4种差异代谢物下调，包括（2R,3R,4R）-2-氨基-4-羟基-3-甲基戊酸、3-羟基异戊酸、9,10-二羟基硬脂酸、3-羟基十四酸。见表2。此外，通过对差异代谢物的聚类层次分析绘制了聚类热图，见图6。热图结果体现模型组、空白组和葛根素组中代谢物相对含量的变化趋势，血清差异代谢物在不同组间区别明显，其中红色表示物质相对含量上调，蓝色表示物质相对含量下调。各组组内聚类理想且葛根素组更接近于空白组，说明在给药后酒精性肝损伤小鼠血清异常代谢得到修复。
表 2 各组小鼠血清差异代谢物分析Table 2. Analysis of differential metabolites of mouse serum in each groupNo 代谢产物 VIP
（模型组/空白组）P
（模型组/空白组）VIP
（模型组/葛根组）P
（模型组/葛根素组）（模型组/空白组） （模型组/葛根素组） 1 N-甲基烟酰胺 1.96 0.0066 1.45 0.0451 ↓## ↑# 2 胆绿素 2.12 0.0001 1.90 0.0084 ↓## ↑## 3 白青霉烯 2.19 0.0157 2.22 0.0001 ↓# ↑## 4 L-脯氨酸 2.00 0.0091 1.74 0.0232 ↓## ↑# 5 鸟氨酸 2.04 0.0074 1.58 0.0396 ↓## ↑# 6 假尿苷 1.62 0.0137 1.59 0.0281 ↓# ↑# 7 赤藓醇 1.82 0.0249 2.52 0.0011 ↓# ↑## 8 （2R,3R,4R）-2-氨基-4-羟基-
3-甲基戊酸2.26 0.0081 1.85 0.0296 ↑## ↓# 9 3-羟基异戊酸 1.68 0.0189 1.78 0.0138 ↑# ↓# 10 9,10-二羟基硬脂酸 1.55 0.0371 1.70 0.0456 ↑# ↓# 11 （R）-3-羟基十四酸 1.57 0.0484 1.81 0.02851 ↑# ↓# 注：↑相对表达上调；↓相对表达下调；# P<0.05，##P<0.01 ![]()
图 6 分层聚类分析作为空白组、模型组和PUE组的热图Figure 6. Hierarchical cluster analysis as heat maps for blank, model and PUE groups2.3.4 血清代谢通路富集分析
将表2中的差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路拓扑分析和富集分析，筛选出如下代谢通路作为关键的相关代谢通路，见图7。结果表明，葛根素主要影响的血清代谢通路有精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸的生物合成、卟啉和叶绿素代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酰-tRNA的生物合成。
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图 7 血清代谢物通路分析注：a. 精氨酸和脯氨酸代谢；b. 精氨酸的生物合成；c. 卟啉和叶绿素代谢；d. 谷胱甘肽代谢；e. 氨基酰-tRNA的生物合成。Figure 7. Pathway analysis of serum metabolites2.4 肝脏代谢组学分析
2.4.1 肝脏代谢组数据PCA分析
肝脏PCA 3D评分图见图8，可以看出，三组的样本代谢成分呈现部分分离趋势，尤其是空白组和模型组，发生明显分离，说明酒精造成了小鼠肝脏代谢物出现差异，葛根素干预之后发现葛根素组和空白组的样本更相似。
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图 8 各组小鼠肝脏PCA 3D得分散点Figure 8. Points of dispersion of PCA 3D in the liver of each group of mice2.4.2 肝脏代谢组数据OPLS-DA分析
为进一步筛选组间差异，采用OPLS-DA对小鼠肝脏进一步分析。OPLS-DA得分图中葛根素与模型组分离明显，聚集程度较好，说明肝脏代谢物在葛根素与模型组之间存在着明显差异如图9。通过置换检验对OPLS-DA模型进行统计验证，结果表明所有的Q2值均低于右侧原点，且Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0（R2Y=0.92，Q2=−0.42），表明此模型无过度拟合现象具有很好的可预测性和拟合度，能够准确地描述数据，见图10A。基于PCA和OPLS-DA对检测到的所有代谢物进行差异分析，绘制代谢物火山图，见图10B，观察差异代谢的分布。
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图 10 OPLS-DA评分及置换检验和火山图注：A为空白组和模型组置换检验；B为火山图。Figure 10. OPLS-DA scores and permutation tests and volcano diagrams2.4.3 肝脏代谢差异物筛选
依据OPLS-DA模型，以VIP>1且P<0.05为标准进行组间差异代谢物的筛选。空白组与模型组共筛选出32个差异代谢物，是潜在的酒精性肝损伤生物标志物。葛根素组显著改变了肝脏样本中的32种差异代谢物，其中3种差异代谢物上调，包括O-丙酰基肉碱、3-氨基-2-哌啶酮、瓜氨酸，29种差异代谢物下调包括L-茶氨酸、香草酸、N-丙酰基甘氨酸、戊基丝氨酸等见表3。此外，通过对差异代谢物的聚类层次分析绘制了聚类热图，见图11。结果显示，肝脏差异代谢物在不同组间区别明显，组内聚类理想，且葛根素组更接近于空白组，其中红色表示物质相对含量上调，蓝色表示物质相对含量下调。说明在葛根素干预后酒精引起的肝脏代谢异常得到改善。
表 3 各组小鼠肝脏差异代谢物分析Table 3. Analysis of differential metabolites in the liver of various groups of miceNo. 代谢产物 VIP
（模型组/空白组）P
（模型组/空白组）VIP
（模型组/葛根素组）P
（模型组/葛根素组）（模型组/空白组） （模型组/葛根素组） 1 O-丙酰基肉碱 1.79 0.0028 1.66 0.0184 ↓## ↑# 2 3-氨基-2-哌啶酮 1.75 0.0012 1.80 0.0067 ↑## ↑## 3 瓜氨酸 1.56 0.0004 1.20 0.0399 ↓## ↑# 4 戊基丝氨酸 1.62 0.0098 1.81 0.0019 ↑## ↓## 5 N-丙酰基甘氨酸 1.33 0.0352 1.93 0.0007 ↑# ↓## 6 高柑橘酸 1.54 0.0005 2.08 0.0036 ↑## ↓## 7 香草酸 1.79 0.0005 2.13 0.0005 ↑## ↓## 8 L-茶氨酸 1.87 0.0002 1.40 0.0181 ↑## ↓# 9 丙氨酰-缬氨酸 1.77 0.0010 2.04 0.0009 ↑## ↓## 10 9,10-二羟基硬脂酸 1.33 0.0304 1.77 0.0193 ↑# ↓# 11 组氨酰色氨酸 1.79 0.0084 1.38 0.0421 ↑## ↓# 12 丝氨酰天冬酰胺 1.63 0.0227 1.47 0.0174 ↑# ↓# 13 天冬酰胺酰-精氨酸 1.57 0.0076 1.81 0.0112 ↑## ↓# 14 酪氨酰-γ-谷氨酸 1.81 0.0214 1.81 0.0385 ↑# ↓# 15 缬氨酰-谷氨酰胺 1.49 0.0188 1.63 0.0244 ↑# ↓# 16 二氨基亚硒酸 1.71 0.0221 1.74 0.0335 ↑# ↓# 17 麦芽四糖 1.85 0.0186 1.27 0.1438 ↑# ↓# 18 肌醇 1.67 0.0107 1.70 0.0103 ↑# ↓# 19 D-麦芽糖 1.75 0.0177 1.19 0.0496 ↑# ↓# 20 麦芽糖 1.65 0.0163 1.32 0.0322 ↑# ↓# 21 胆固醇硫酸盐 1.48 0.0131 1.49 0.0219 ↑# ↓# 22 1D-1,3,4,6-四磷酸肌醇 1.62 0.0085 1.64 0.0133 ↑## ↓# 23 赖氨酰乙醇胺（18:1（9Z）/0:0） 1.90 0.0003 1.41 0.0418 ↑## ↓# 24 赖氨酰乙醇胺
（18:2（9Z,12Z）/0:0）1.61 0.0030 1.55 0.0211 ↑## ↓# 25 11，12-二甲氧基二氢卡瓦因 1.74 0.0031 1.61 0.0242 ↑## ↓# 26 7-甲基鸟苷 1.55 0.0129 1.44 0.0472 ↑# ↓# 27 乙酰高丝氨酸 1.27 0.0271 1.80 0.0020 ↑# ↓## 28 色氨酰-缬氨酸 1.76 0.0007 1.77 0.0004 ↑## ↓## 29 嘌呤 1.60 0.0059 1.52 0.0163 ↑## ↓# 30 黄嘌呤 1.81 0.0005 1.64 0.0081 ↑## ↓## 31 牛磺酸 1.53 0.0044 1.06 0.0498 ↑## ↓# 32 乙酰甘露胺 1.33 0.0475 1.46 0.0345 ↑# ↓# 注：↑相对表达上调；↓相对表达下调；# P<0.05，##P<0.01 ![]()
图 11 分层聚类分析作为空白组、模型组和PUE组的热图Figure 11. Hierarchical clustering analysis presented as a heatmap for control, model and PUE groups2.4.4 肝脏代谢通路富集分析
将表3中的差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路拓扑分析和富集分析，筛选出如下代谢通路作为关键的相关代谢通路，见图12。结果表明，葛根素主要影响的肝脏代谢通路有肌醇磷酸盐代谢抗坏血酸和醛酸代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统、泛醌和其他萜类-醌的生物合成、精氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、氨基酸糖和核苷酸糖代谢、酪氨酸代谢、初级胆汁酸的生物合成、嘌呤代谢、类固醇激素的生物合成。
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图 12 肝脏代谢物通路分析注：a. 磷脂酰肌醇信号系统；b. 肌醇磷酸盐代谢；c. 牛磺酸和低牛磺酸代谢；d. 精氨酸的生物合成；e. 淀粉和蔗糖代谢；f. 泛醌和其他萜类-醌的生物合成；g. 淀粉和蔗糖代谢；h. 半乳糖代谢；i. 半乳糖代谢；j. 酪氨酸代谢；k. 初级胆汁酸的生物合成；m. 类固醇激素的生物合成；l. 嘌呤代谢。Figure 12. Analysis of hepatic metabolite pathways2.5 血清差异代谢物与肝脏差异代谢物的联系
通过11种血清差异代谢物（图6），32种肝脏差异代谢物（图11）进行Spearman相关性分析。相关系数矩阵显示为热图（图13），血清代谢产物与肝脏代谢产物关系密切，（2R,3R,4R）-2-氨基-4-羟基-3-甲基戊酸与16种肝脏代谢产物呈密切相关，（R）-3-羟基十四酸与3种肝脏代谢产物呈密切相关，3-羟基异戊酸与12种肝脏代谢产物呈密切相关，9,10-二羟基硬脂酸与8种肝脏代谢产物呈密切相关。
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图 13 血清代谢产物与肝脏代谢产物的相关性Figure 13. Correlation of serum metabolites with hepatic metabolites3. 讨论
嘌呤代谢对调节组织稳态发挥着重要作用，嘌呤分解代谢可以使身体免受氧化损伤[18]。有研究表明黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XO）是嘌呤代谢的关键酶，能将次黄嘌呤氧化成黄嘌呤及尿酸，在发生氧化反应过程中，会产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），而ROS的累积是氧化应激导致肝损伤的重要原因[19]。在另一项研究中，Xiong等[20]通过非靶向粪便代谢组学研究，结果发现嘌呤代谢异常是酒精造成氧化应激型肝损伤的机制之一，与正常组相比，肝纤维化小鼠粪便中腺嘌呤含量增加。而本实验肝脏代谢组发现，ALD模型组中的黄嘌呤相对于空白组上调，推测酒精诱导的肝损伤可能是由于黄嘌呤氧化酶的异常表达和随后活性氧的过量产生，表现为嘌呤代谢紊乱，而葛根素显著下调了酒精性肝损伤后上调的黄嘌呤，因此，推测葛根素干预后差异代谢物黄嘌呤下调可能通过调节嘌呤代谢异常导致的氧化应激从而对酒精性肝损伤产生保护作用[21]。
现代药理学研究表明，胆汁酸是一种生理清洁剂，可促进脂肪和甾醇在肠道和肝脏中的排泄、吸收和运输，初级胆汁酸是肝细胞直接从胆固醇合成的胆汁酸，主要包括胆酸（Cholic acid，CA）和鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）[22−23]。牛磺酸是一种由细胞色素P4503A4酶催化的代谢产物，一旦肝脏受损，肝脏中的牛磺酸水平将补偿性增加，以保护肝脏免受损伤[24−25]，Su等[26]研究发现酒精性肝损伤大鼠模型胆汁酸代谢紊乱，模型组牛磺酸胆汁酸、牛黄脱氧胆酸和7-硫酸甘鹅脱氧胆酸的浓度与空白组相比具有不同程度的上调或下调，而肝脏是胆汁酸合成和脂质代谢的重要器官，长期饮酒会导致肝脏脂质沉积和胆汁淤积，胆汁酸的异常增加导致氧自由基和内质网应激的产生，最终诱导细胞凋亡，促进肝纤维化[27]。有研究发现初级胆汁酸在肝脏中合成之后，由肠道菌群转化为次级胆汁酸，它不仅能促进肠道营养吸收，还能够调节脂质代谢和肠道微生物群组成[28−30]，此外，Hou等[31]研究发现初级胆汁酸可激活转录因子法尼醇X受体，该受体除了参与胆汁酸中脂蛋白、脂质和葡萄糖代谢调节外，还可通过阻止核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的表达来抑制炎症反应。在本实验肝脏代谢组结果发现，模型组小鼠中牛磺酸上调，提示酒精性肝损伤小鼠胆汁酸代谢紊乱，在葛根素的干预下可以调节牛磺酸的水平，从而保护肝细胞。因此，推测葛根素对酒精性小鼠的肝脏保护作用可能与调节胆汁酸代谢进而缓解细胞凋亡和抑制炎症反应相关。
氨基酸能影响脂质、谷胱甘肽、核苷酸等的合成，而肝脏在维持氨基酸平衡方面起着不可或缺的作用[32]。研究发现，当肝脏受损时，促进氨基酸分解代谢的激素会相应增加或者减少，导致系统循环中氨基酸分解代谢和氨基酸水平增加或者下降，研究发现精氨酸不仅能降低酒精诱导的肝损伤小鼠内毒素和脂质过氧化，而且能降低炎症因子的水平[33−34]。此外，精氨酸是由精氨酸合成酶催化脯氨酸形成的，并能通过一氧化氮合酶氧化成瓜氨酸，瓜氨酸随即水解成鸟氨酸[35]。相关研究表明鸟氨酸能激活尿素合成过程的关键酶-鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸合成酶，与循环中的氨结合，使尿素的合成加快，氨代谢加快，从而恢复肝细胞功能[36−38]。在本实验血清代谢组和肝脏代谢组中都出现氨基酸相关代谢通路紊乱，ALD模型组与空白组相比小鼠血清中L-脯氨酸、鸟氨酸下降，表明酒精性肝损伤加快了鸟氨酸、L-脯氨酸的分解，导致其含量下降从而使精氨酸的合成受阻。而葛根素给药组能回调L-脯氨酸、鸟氨酸的水平，因此，葛根素干预差异代谢物L-脯氨酸、鸟氨酸上调可能是通过调节精氨酸的生物合成和代谢进而影响尿素代谢对酒精性肝损伤产生保护作用。
甘油磷脂参与各种神经和细胞内信号的传导，是细胞膜的重要组成成分。此外，它还涉及到胆汁的合成，细胞信号传导，以及保持机体正常的新陈代谢[39]，其主要的生物形式包括磷脂酰胆碱（Phosphatidyl choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）[40−42]。赖氨酰乙醇胺（Lysine ethanolamine，LysoPE）是通过PE水解产生的，文献研究表明LysoPE是评估肝功能衰竭严重程度的标志物，通常情况下，它在细胞或组织中的含量极低，如果含量过高，不仅会损坏细胞膜的结构，而且会影响机体正常的功能[43]，此外，Bian等[44]发现酒精性肝损伤小鼠血清中含有的溶血磷脂酰胆碱的浓度高于正常小鼠并且证明桑椹多糖通过调节溶血磷脂酰胆碱的浓度来减轻小鼠酒精性肝损伤。本实验肝脏代谢组结果表明，模型组肝组织中赖氨酰乙醇胺（18:1（9Z）/0:0）、赖氨酰乙醇胺（18:2（9Z，12Z）/0:0）含量显著升高，而给与葛根素干预后其水平显著下调，表明葛根素可能通过调节LysoPE影响磷脂酰肌醇信号的传导，在一定程度上缓解甘油磷脂代谢紊乱，从而对酒精性肝损伤产生保护作用。
4. 结论
从肝脏指标可以看出，经葛根素治疗后，ALD小鼠的肝功能得到恢复，同时，从病理结果可以看出，葛根素可以恢复由酒精摄入导致的肝损伤。血清和肝脏代谢组数据的PCA结果显示三组样本的代谢成分呈现分离趋势，尤其是空白组和模型组，发生明显分离，表明酒精引起了小鼠体内代谢紊乱，代谢通路富集分析结果表明酒精性肝损伤是多条代谢通路共同紊乱的结果，葛根素主要通过恢复氨基酸的合成与代谢、下调肌醇、促进赖氨酰乙醇胺降解，改善肝脏甘油磷脂代谢。同时，葛根素可能还通过调节嘌呤、黄嘌呤、牛磺酸、尿苷等相关代谢物含量进而参与调控嘌呤代谢、初级胆汁酸代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢等代谢通路来改善由酒精引起的肝损伤。葛根作为一种药食同源的中药，从中提取的葛根素，安全性高，且具有多种药理活性，将其开发为具有保肝活性的功能性食品具有实际应用价值。
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图 1 各组小鼠肝组织切片（HE，200×）
Figure 1. Liver tissue sections from various groups of mice (HE, 200×)
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图 2 各组小鼠肝组织病理评分比较（n=6）
注：**表示与空白组比较，P<0.01；#表示与模型组比较，P<0.05。
Figure 2. Comparison of liver histopathological scores of mice in each group (n=6)
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图 3 各组小鼠血清PCA 3D得分散点
Figure 3. Points of dispersion of serum PCA 3D in each group of mice
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图 5 OPLS-DA 评分及置换检验和火山图
注:A模型组与葛根素组的置换检验；B为模型组和葛根素组差异代谢物火山图。
Figure 5. OPLS-DA score and replacement test and volcano plots
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图 6 分层聚类分析作为空白组、模型组和PUE组的热图
Figure 6. Hierarchical cluster analysis as heat maps for blank, model and PUE groups
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图 7 血清代谢物通路分析
注：a. 精氨酸和脯氨酸代谢；b. 精氨酸的生物合成；c. 卟啉和叶绿素代谢；d. 谷胱甘肽代谢；e. 氨基酰-tRNA的生物合成。
Figure 7. Pathway analysis of serum metabolites
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图 8 各组小鼠肝脏PCA 3D得分散点
Figure 8. Points of dispersion of PCA 3D in the liver of each group of mice
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图 10 OPLS-DA评分及置换检验和火山图
注：A为空白组和模型组置换检验；B为火山图。
Figure 10. OPLS-DA scores and permutation tests and volcano diagrams
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图 11 分层聚类分析作为空白组、模型组和PUE组的热图
Figure 11. Hierarchical clustering analysis presented as a heatmap for control, model and PUE groups
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图 12 肝脏代谢物通路分析
注：a. 磷脂酰肌醇信号系统；b. 肌醇磷酸盐代谢；c. 牛磺酸和低牛磺酸代谢；d. 精氨酸的生物合成；e. 淀粉和蔗糖代谢；f. 泛醌和其他萜类-醌的生物合成；g. 淀粉和蔗糖代谢；h. 半乳糖代谢；i. 半乳糖代谢；j. 酪氨酸代谢；k. 初级胆汁酸的生物合成；m. 类固醇激素的生物合成；l. 嘌呤代谢。
Figure 12. Analysis of hepatic metabolite pathways
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图 13 血清代谢产物与肝脏代谢产物的相关性
Figure 13. Correlation of serum metabolites with hepatic metabolites
表 1 葛根素对小鼠血清中AST、ALT含量的的影响
Table 1 Effects of puerarin on serum levels of AST and ALT in mice
组别 AST（U/g prot） ALT（U/g prot） 空白组 13.4±3.26 12.47±2.83 模型组 20.88±2.21* 18.75±3.791* 联苯双酯组 13.51±2.193## 12.34±1.533## 葛根素组 14.01±1.343## 14.92±3.252# 注：*表示与空白组比较，P<0.01；#表示与模型组比较，P<0.05；##表示与模型组比较，P<0.05。 
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表 2 各组小鼠血清差异代谢物分析
Table 2 Analysis of differential metabolites of mouse serum in each group
No 代谢产物 VIP
（模型组/空白组）P
（模型组/空白组）VIP
（模型组/葛根组）P
（模型组/葛根素组）（模型组/空白组） （模型组/葛根素组） 1 N-甲基烟酰胺 1.96 0.0066 1.45 0.0451 ↓## ↑# 2 胆绿素 2.12 0.0001 1.90 0.0084 ↓## ↑## 3 白青霉烯 2.19 0.0157 2.22 0.0001 ↓# ↑## 4 L-脯氨酸 2.00 0.0091 1.74 0.0232 ↓## ↑# 5 鸟氨酸 2.04 0.0074 1.58 0.0396 ↓## ↑# 6 假尿苷 1.62 0.0137 1.59 0.0281 ↓# ↑# 7 赤藓醇 1.82 0.0249 2.52 0.0011 ↓# ↑## 8 （2R,3R,4R）-2-氨基-4-羟基-
3-甲基戊酸2.26 0.0081 1.85 0.0296 ↑## ↓# 9 3-羟基异戊酸 1.68 0.0189 1.78 0.0138 ↑# ↓# 10 9,10-二羟基硬脂酸 1.55 0.0371 1.70 0.0456 ↑# ↓# 11 （R）-3-羟基十四酸 1.57 0.0484 1.81 0.02851 ↑# ↓# 注：↑相对表达上调；↓相对表达下调；# P<0.05，##P<0.01
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表 3 各组小鼠肝脏差异代谢物分析
Table 3 Analysis of differential metabolites in the liver of various groups of mice
No. 代谢产物 VIP
（模型组/空白组）P
（模型组/空白组）VIP
（模型组/葛根素组）P
（模型组/葛根素组）（模型组/空白组） （模型组/葛根素组） 1 O-丙酰基肉碱 1.79 0.0028 1.66 0.0184 ↓## ↑# 2 3-氨基-2-哌啶酮 1.75 0.0012 1.80 0.0067 ↑## ↑## 3 瓜氨酸 1.56 0.0004 1.20 0.0399 ↓## ↑# 4 戊基丝氨酸 1.62 0.0098 1.81 0.0019 ↑## ↓## 5 N-丙酰基甘氨酸 1.33 0.0352 1.93 0.0007 ↑# ↓## 6 高柑橘酸 1.54 0.0005 2.08 0.0036 ↑## ↓## 7 香草酸 1.79 0.0005 2.13 0.0005 ↑## ↓## 8 L-茶氨酸 1.87 0.0002 1.40 0.0181 ↑## ↓# 9 丙氨酰-缬氨酸 1.77 0.0010 2.04 0.0009 ↑## ↓## 10 9,10-二羟基硬脂酸 1.33 0.0304 1.77 0.0193 ↑# ↓# 11 组氨酰色氨酸 1.79 0.0084 1.38 0.0421 ↑## ↓# 12 丝氨酰天冬酰胺 1.63 0.0227 1.47 0.0174 ↑# ↓# 13 天冬酰胺酰-精氨酸 1.57 0.0076 1.81 0.0112 ↑## ↓# 14 酪氨酰-γ-谷氨酸 1.81 0.0214 1.81 0.0385 ↑# ↓# 15 缬氨酰-谷氨酰胺 1.49 0.0188 1.63 0.0244 ↑# ↓# 16 二氨基亚硒酸 1.71 0.0221 1.74 0.0335 ↑# ↓# 17 麦芽四糖 1.85 0.0186 1.27 0.1438 ↑# ↓# 18 肌醇 1.67 0.0107 1.70 0.0103 ↑# ↓# 19 D-麦芽糖 1.75 0.0177 1.19 0.0496 ↑# ↓# 20 麦芽糖 1.65 0.0163 1.32 0.0322 ↑# ↓# 21 胆固醇硫酸盐 1.48 0.0131 1.49 0.0219 ↑# ↓# 22 1D-1,3,4,6-四磷酸肌醇 1.62 0.0085 1.64 0.0133 ↑## ↓# 23 赖氨酰乙醇胺（18:1（9Z）/0:0） 1.90 0.0003 1.41 0.0418 ↑## ↓# 24 赖氨酰乙醇胺
（18:2（9Z,12Z）/0:0）1.61 0.0030 1.55 0.0211 ↑## ↓# 25 11，12-二甲氧基二氢卡瓦因 1.74 0.0031 1.61 0.0242 ↑## ↓# 26 7-甲基鸟苷 1.55 0.0129 1.44 0.0472 ↑# ↓# 27 乙酰高丝氨酸 1.27 0.0271 1.80 0.0020 ↑# ↓## 28 色氨酰-缬氨酸 1.76 0.0007 1.77 0.0004 ↑## ↓## 29 嘌呤 1.60 0.0059 1.52 0.0163 ↑## ↓# 30 黄嘌呤 1.81 0.0005 1.64 0.0081 ↑## ↓## 31 牛磺酸 1.53 0.0044 1.06 0.0498 ↑## ↓# 32 乙酰甘露胺 1.33 0.0475 1.46 0.0345 ↑# ↓# 注：↑相对表达上调；↓相对表达下调；# P<0.05，##P<0.01
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