Preparation Process of Alkali-extracted Polysaccharides from Abalone Viscera and Its Repair Activity against H2O2 Oxidative Damage in L929 Cells
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摘要: 目的：优化鲍鱼脏器碱提多糖（Alkali-extracted abalone viscera polysaccharides，Aavp）提取工艺，并研究纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的预防和修复作用，以期为鲍鱼脏器碱提多糖的开发及应用提供参考。方法：通过热碱提醇沉法获得鲍鱼脏器碱提粗多糖，并利用响应面法优化提取工艺，最后分析纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的预防和修复能力。结果：鲍鱼脏器碱提粗多糖最佳提取工艺条件为：料液比1:150 g/mL，提取时间2 h，提取温度70 ℃，在此条件下，鲍鱼脏器碱提粗多糖得率为8.57%。在L929细胞H2O2氧化损伤预防试验中，不同剂量的纯化Aavp（20、50和100 μg/mL）对L929细胞氧化损伤均具有极显著的预防作用（P<0.001），但没有表现出剂量效应，其中中剂量组（50 μg/mL）的细胞存活率最高（71.94%±3.08%），略优于阳性对照的维生素E组，但无显著性差异。在修复试验中，不同剂量的纯化Aavp（20、50和100 μg/mL）对L929细胞氧化损伤均具有极显著的修复效果（P<0.001），并呈现剂量效应，而高剂量组（100 μg/mL）的细胞存活率最高（90.93%±1.17%），略高于阳性对照的维生素E组（87.96%±3.05%）。结果表明鲍鱼脏器碱提多糖对L929细胞H2O2氧化损伤具有出较好的预防和修复作用。结论：鲍鱼脏器碱提多糖具有一定的L929细胞H2O2氧化损伤修复能力。Abstract: Objective: The extraction process of alkali-extracted abalone viscera polysaccharides (Aavp) was optimized, and the preventive and repair effects of purified Aavp on H2O2 oxidative damage on L929 cells were studied to provide a reference for the development and application of Aavps. Methods: Crude Aavp was obtained by hot alkali extraction followed by alcohol precipitation, and its extraction process was optimized by the response surface method. The preventive and repair abilities of H2O2 oxidative damage on L929 cells were analyzed. Resulst: The optimum extraction conditions of crude Aavps were as follows: Solid-liquid ratio of 1:150 g/mL, extraction time of 2 h, and extraction temperature of 70 ℃. Under these optimal conditions, the yield of crude Aavp was 8.57%. In the prevention test of H2O2 oxidative damage on L929 cells, different doses of purified Aavp (20, 50 and 100 μg/mL) had a significant preventive effect on L929 cell oxidative damage (P<0.001) but did not show a dose effect. The cell survival rate of the middle dose group (50 μg/mL) was the highest (71.94%±3.08%), which was slightly better than the positive control vitamin E group but not significant. In the repair test, different doses of purified Aavp (20, 50 and 100 μg/mL) had a significant repair effect on the oxidative damage of L929 cells (P<0.001) and showed a dose effect. In contrast, the cell survival rate of the high-dose group (100 μg/mL) was the highest (90.93%±1.17%), slightly higher than that of the positive control vitamin E group (87.96%±3.05%). The results showed that purified Aavp showed an excellent preventive and repair effect on H2O2 oxidative damage in L929 cells. Conclusion: Aavp has an ability to repair H2O2 oxidative damage of L929 cells.
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鲍鱼作为一种美味珍馐，肉质细嫩，营养丰富，蛋白质占总质量18.92%~21.63%，亦含多糖、维生素和微量元素等营养成分[1−3]。鲍鱼脏器多糖是一种从鲍鱼内脏中提取的天然活性物质，具有多种生物功能[4−9]。研究表明，鲍鱼脏器多糖具有显著的免疫调节作用[5−6]，能够增强机体的免疫功能，提高抵抗力，对抗各种病原体。并且，鲍鱼脏器多糖还具有抗肿瘤活性[10]，能够抑制肿瘤细胞的生长和扩散，对预防和治疗癌症具有积极的作用。此外，鲍鱼脏器多糖还能够减轻炎症反应，保护细胞免受氧化损伤，对治疗炎症性疾病和延缓衰老具有重要意义[11−13]。因此，鲍鱼脏器多糖是一种具有重要价值的生物活性物质，其应用研究可为人类健康和相关产业的发展提供新的思路和方向，对鲍鱼脏器多糖的研究具有重要的科学价值和实际意义，值得进一步深入探究。然而，在鲍鱼产业中，鲍鱼可食用部分仅占总质量的60%~70%[14−16]，这意味着有大部分鲍鱼软组织如脏器等将被废弃，导致环境受到污染，资源被浪费。因此，从鲍鱼脏器中提取多糖可实现鲍鱼废弃资源的有效利用，提升鲍鱼产业价值链，具有重要的经济学价值和意义。
鲍鱼脏器多糖的提取方法有热水浸提、碱水浸提和酶法提取等[17]。热水浸提提取效率不高，提取时间也较长；酶法成本高，对多糖结构影响大；碱水浸提成本较低，效率也高，但pH等条件要严格控制，防止多糖降解[18−19]。碱水浸提法适合提取海洋生物多糖（酸性多糖）[20]。但是，碱水浸提的鲍鱼脏器多糖报道鲜有出现。因此，优化碱水浸提的鲍鱼脏器多糖提取率，并探索其对细胞氧化的修复活性，具有一定的研究价值和意义。
本文采用热碱水浸提法提取鲍鱼脏器碱提多糖（Aavp），并对其提取条件进行响应面优化，最后检测其对L929细胞氧化损伤的修复能力。本文聚焦于鲍鱼产业经济附加值的提高，利用废弃的鲍鱼脏器资源，为鲍鱼产业的可持续发展提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
杂色鲍（Haliotis diversicolor） 福建省东山县长盛食品有限公司；成纤维细胞L929 中国科学院上海细胞库；RPMI Medium 1640、胎牛血清 美国Gibco公司；透析袋MD77（3.5 kDa） 美国Viskase公司；CCK-8试剂盒 美国Solarbio公司；硫酸（98%）、苯酚、乙醇、盐酸（37%）、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、H2O2（30%）等 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
UV-2102PC型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Senco R1002B旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；HF safe生物安全柜 上海力申科学仪器有限公司；Heracell 240i GP二氧化碳培养箱 美国赛默飞世尔科技有限公司；Infinite M200PRO全波长酶标仪 瑞士TECAN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鲍鱼脏器碱提多糖提取工艺
采用林志超等[21]的方法。具体工艺如下：a.鲍鱼脏器冻干粉制备。将鲍鱼脏器上的结缔组织及脂肪组织除去，并对消化道进行清洗，去除食物残渣，匀浆后−20 ℃冷冻48 h，60 ℃真空冷冻干燥48 h，再研磨过30目筛即得鲍鱼脏器冻干粉。b.鲍鱼脏器脱脂。取冻干粉10 g，加入4倍质量的95%乙醇，在60 ℃下回流6 h进行脱脂反应[22]，重复2次，过滤并干燥去除乙醇后得脱脂的鲍鱼脏器。c.水溶性鲍鱼脏器多糖制备。取脱脂的鲍鱼脏器10 g，加入8倍质量的超纯水，在95 ℃下反应3 h，重复3次，过滤得水溶性鲍鱼脏器多糖提取液，滤渣备用。d.鲍鱼脏器碱提粗多糖制备。准确称取一定质量的上述滤渣，在一定温度下，加入一定体积的0.5 mol/L氢氧化钠溶液，经机械搅拌（30 r/min）提取一定时间，重复2次，离心（10000 r/min，20 ℃，10 min），合并上清液。调节上清液至pH7，经旋转蒸发浓缩至三分之一体积，浓缩液加入4倍质量的95%乙醇混匀过夜以沉淀多糖，离心（12000 r/min，20 ℃，15 min），沉淀用少量超纯水溶解，并旋转蒸发去除残余乙醇（60 ℃）。再经超滤（5 kDa）浓缩和除盐，Sevage法去除蛋白质[23]，旋转蒸发去除有机溶剂，按步骤a的冻干工艺冻干备用。
1.2.2 多糖含量及多糖得率计算
以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定多糖含量[24]，其标准曲线回归方程为y=0.0125x+0.0625，R2=0.9983。分别按公式（1）和（2）计算多糖含量及多糖得率。
D(%)=c×v×n×0.9m1×100 (1) 式中，D：纯化后冻干粉多糖含量，%；c：样品溶液多糖浓度，mg/mL；v：溶液总体积，mL；n：稀释倍数；m1：鲍鱼脏器多糖冻干粉质量，g；0.9：多糖校正系数。
G(%)=c×v×n×0.9m2×100 (2) 式中，G：鲍鱼脏器冻干粉多糖得率，%；c：样品溶液多糖浓度，mg/mL；v：溶液总体积，mL；n：稀释倍数；m2：鲍鱼脏器冻干粉质量，g；0.9：多糖校正系数。
1.2.3 单因素实验
杂色鲍脏器冻干粉经过充分水提后，后续碱提工艺可进一步优化，提高鲍鱼脏器碱提粗多糖的得率。
1.2.3.1 料液比对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
设置提取温度70 ℃，提取时间3 h，考察料液比（分别为1:50、1:100 、1:150 、1:200 和1:250 g/mL）对粗多糖得率的影响。
1.2.3.2 提取时间对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
设置料液比1:150 g/mL，提取温度70 ℃，考察提取时间（分别为1、2、3、4和5 h）对粗多糖得率的影响。
1.2.3.3 提取温度对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
设置料液比1:150 g/mL，提取时间3 h，考察温度（分别为50、60、70、80和90 ℃）对粗多糖得率的影响。
1.2.4 响应面试验
根据单因素实验的最佳参数，选取三个影响因素：料液比（X1），提取时间（X2）和提取温度（X3），以粗多糖得率（Y）为响应值，创建三因素三水平的Box-Benhnken试验，并通过对试验结果的回归方差分析，优化鲍鱼脏器碱提粗多糖的提取工艺参数，试验因素水平见表1。
表 1 响应面试验因素和水平Table 1. Factors and levels of response surface test水平 因素 X1料液比
（g/mL）X2提取时间
（h）X3提取温度
（℃）−1 1:200 1 60 0 1:150 2 70 1 1:100 3 80 1.2.5 鲍鱼脏器碱提粗多糖纯化
采用林志超等[21]的方法进行纯化：5 g鲍鱼脏器碱提粗多糖充分溶解于40 mL Tris-HCl 溶液（pH7.2，50 mmol/L），上DEAE Sepharos Fast Flow柱（规格为Φ 5.0 cm×25 cm），0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，流速为2 mL/min，采用部分收集器收集洗脱液，检测各收集管的多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集含有多糖的洗脱液，旋转蒸发浓缩，再真空冷冻干燥得酸性多糖。取40 mg上述酸性多糖样品溶于1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶液中，采用Sephacryl S-400 HR柱（规格为Φ 2.6 cm×90 cm）层析纯化，流速30 mL/h，采用部分收集器收集洗脱液，检测各收集管的多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集含有多糖的洗脱液，旋转蒸发浓缩后，放入透析袋中（截留分子量为3.5 kDa），超纯水透析（4 ℃）至检测不出Cl−（AgNO3沉淀法[25]），真空冷冻干燥（冻干条件同方法1.2.1所述）得纯化多糖（命名为纯化Aavp），经HPLC分析其纯度为98.66%。
1.2.6 细胞培养
取复苏的L929细胞，选用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在5% CO2、37 ℃饱和湿度培养箱内培养，每隔1 d换液1次[26]。
1.2.7 L929细胞氧化损伤模型的建立
参考齐佳等[27]的方法加以改进：设空白组（只含培养基，无细胞）、对照组（只含培养基，有细胞）和H2O2处理组（有细胞，含培养基和浓度分别为50、100、150、200、250和300 μmol/L的H2O2），每个浓度设3个平行孔。取对数生长期的L929细胞，以2×104个/孔接种于已加好RPMI 1640培养基的96孔板中培养。24 h后，空白组和对照组换RPMI 1640培养基继续培养，H2O2组分别换上含不同浓度H2O2的RPMI 1640培养基继续培养，24 h后每孔加入10 μL CKK-8试剂，反应2 h，在酶标仪450 nm测量各孔吸光度（A）值。按照公式（3）计算细胞存活率。
Y(%)=Ax−A0Ac−A0×100 (3) 式中，Y：细胞存活率，%；A0：空白组吸光值；Ac：对照组吸光值；Ax：H2O2处理组吸光值。
1.2.8 多糖对L929细胞氧化损伤的预防作用
取对数生长期的L929细胞，接种于96孔板中（2×104个/孔），实验分组为：空白组（仅接种细胞）、模型组、阳性对照组和给药组。具体方法见表2。
表 2 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的预防作用Table 2. Preventive effect of purified Aavp on oxidative damage of L929 cells组别 第一阶段 第二阶段 空白组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加RPMI 1640培养基，培养24 h 模型组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 阳性对照组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+50 μmol/L VE），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 低剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+20 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 中剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+50 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 高剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+100 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 培养结束后向每孔加入10 μL CKK-8试剂，2 h后在酶标仪450 nm测量各孔吸光度（A）值。按照公式（4）计算细胞存活率。
Y(%)=Ay−A0Ac−A0×100 (4) 式中，Y：细胞存活率，%；A0：培养基吸光值；Ac：空白组吸光值；Ay：模型组、阳性对照组或给药组吸光值。
1.2.9 多糖对L929细胞氧化损伤的修复作用
取对数生长期的L929细胞，接种于96孔板中（2×104个/孔），实验分组为：空白组（仅接种细胞）、模型组、阳性对照组和给药组。具体方法见表3。
表 3 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的修复作用Table 3. Repair effect of purified Aavp on oxidative damage of L929 cells组别 第一阶段 第二阶段 空白组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加RPMI 1640培养基，培养24 h 模型组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 阳性对照组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+50 μmol/L VE），培养24 h 低剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+20 μg/L Aavp），培养24 h 中剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+50 μg/L Aavp），培养24 h 高剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+100 μg/L Aavp），培养24 h 培养结束后空白组向每孔加入10 μL CKK-8试剂，2 h后在酶标仪450 nm测量各孔吸光度值。按照公式（4）计算细胞存活率。
1.3 数据处理
试验重复三次，利用Design Expert 8.0.6进行数据统计分析，采用Origin 2017软件绘图，SPSS 26.0软件进行显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 料液比对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
由图1可知，多糖得率随料液比的增大而急剧提高，这可能因为溶剂大量增加，使得物料分散更加充分，传质效率增加。当料液比为1:150（g/mL）时，多糖得率达到最高，为7.67%。当料液比继续增大，粗多糖得率出现下降，但下降的幅度较小，这可能是因为过多溶剂会使体系的传热功能下降，不利于多糖的溶出，导致多糖得率降低[28]。此外，提取体系过大也影响粗多糖的后续处理成本，所以综合考虑，选取料液比为1:150（g/mL）。
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2.1.2 提取时间对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
如图2显示，随着提取时间的增加，粗多糖得率先上升后下降，当提取时间为2 h时，粗多糖得率为最高值8.15%。这可能是由于当提取时间低于2 h时，增加时间可加强氢氧化钠在物料中的渗透和积累，进而促进多糖与物料组织连接的氢键断裂；但随着提取时间继续延长，部分多糖的结构被破坏，故导致多糖得率开始降低[29]。因此综合考虑，选择提取时间为2 h。
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图 2 不同提取时间对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响Figure 2. Effect of different extraction times on the yields of crude Aavp2.1.3 提取温度对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
图3可以看出，温度对多糖得率有较大影响，随着温度的升高，分子的热运动加快，多糖传质效率提高，因此得率逐渐增加。当温度为70 ℃时，多糖得率达最高8.08%。当温度高于70 ℃时，多糖得率急剧下降，这可能是因为在高温碱性条件下，多糖发生裂解，导致多糖得率下降[24]。
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图 3 不同提取温度对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响Figure 3. Effect of different extraction temperatures on the yields of crude Aavp2.2 响应面优化分析
2.2.1 响应面试验结果
通过单因素实验，可选取料液比为1:150 g/mL，提取时间为2 h，提取温度为70 ℃为后续响应面分析因素中点。并采用Box-Behnken Design进行响应面优化设计，结果见表4。
表 4 响应面试验设计及结果Table 4. Design and the results of response surface experimental试验号 X1 X2 X3 Y 料液比 提取时间 提取温度 粗多糖得率（%） 1 −1 −1 0 7.57 2 1 −1 0 7.31 3 −1 1 0 7.34 4 1 1 0 7.10 5 −1 0 −1 7.50 6 1 0 −1 7.33 7 −1 0 1 7.48 8 1 0 1 6.94 9 0 −1 −1 7.48 10 0 1 −1 7.31 11 0 −1 1 7.25 12 0 1 1 7.11 13 0 0 0 8.54 14 0 0 0 8.61 15 0 0 0 8.57 16 0 0 0 8.55 17 0 0 0 8.62 2.2.2 模型的建立和显著性检验
根据上述结果分析，以鲍鱼脏器碱提粗多糖得率为响应值（Y），得到粗多糖得率对料液比（X1）、提取时间（X2）和提取温度（X3）的回归方程为：Y=8.58−0.1509X1−0.0949X2−0.1056X3+0.0051X1X2−0.0909X1X3+0.0097X2X3−0.6111X12−0.6366X22−0.6531X32。回归模型的方差分析及显著性分析见表5。
表 5 回归模型方差分析Table 5. ANOVA analysis for response surface regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 6.05 9 0.6720 419.66 <0.0001 *** X1 0.1822 1 0.1822 113.78 <0.0001 *** X2 0.072 1 0.072 44.99 0.0003 *** X3 0.0893 1 0.0893 55.75 <0.0001 *** X1X2 0.0001 1 0.0001 0.0643 0.8071 X1X3 0.0331 1 0.0331 20.64 0.0027 ** X2X3 0.0004 1 0.0004 0.2338 0.6435 X12 1.57 1 1.57 982.07 <0.0001 *** X22 1.71 1 1.71 1065.48 <0.0001 *** X32 1.8 1 1.8 1121.52 <0.0001 *** 残差 0.0112 7 0.0016 失拟项 0.0069 3 0.0023 2.16 0.2355 不显著 纯误差 0.0043 4 0.0011 总离差 6.06 16 注：本模型R2=0.9982，R2Adj=0.9958，R2Pred=0.9806，Adeq Precision=52.5128，C.V.=0.5209%；***代表极显著，P<0.001，**代表较显著，P<0.01；*代表显著，P<0.05；P>0.05，代表不显著。 由表5可知，各试验因子与响应面值的关系中，因变量和全体自变量之间的决定系数R2=0.9982，模型极显著（P<0.001），失拟项（F值为2.16）不显著（P>0.05），说明该试验方法可靠性强，准确度高。整体来看，回归模型的拟合程度较好，可用于鲍鱼脏器碱提粗多糖提取优化的试验设计和结果分析预测。回归模型中，一次项（X1、X2和X3）和平方项（X12、X22和X32）极显著（P<0.001），交互项X1X3较显著（P<0.01），说明料液比、提取温度和提取时间对多糖得率均有极显著影响，且显著性顺序为X1（料液比）>X3（提取温度）>X2（提取时间）。
2.2.3 响应曲面分析
根据回归方程，可获得鲍鱼脏器碱提粗多糖提取工艺的两两因素交互作用的响应面及等高线图，如图4所示。响应面和等高线的形状反映出交互效应的强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形表示交互作用显著[29−30]。图4B和图4E可以看出，料液比和提取温度交互响应面坡度较陡，对应的等高线密集，且呈椭圆形，说明二者交互作用对粗多糖得率有较显著影响。当提取温度为70 ℃时，随着料液比的增加，鲍鱼脏器碱提粗多糖得率呈现先上升后下降的趋势，并在接近等高线圆心处达到极值。从图4A和图4C可知，虽然提取时间和提取温度/料液比的响应面坡度也较陡，但对应的图4D和图4F等高线均为圆形，说明其交互作用不显著。
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图 4 各因素对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的交互作用响应面和等高线图Figure 4. Response surface plots and contour plots of the effects of the interaction of various factors to the yields of crude Aavp2.2.4 最佳工艺的确定及验证
根据响应面优化结果及Design-Expert V8.0.6.1软件预测分析，得到鲍鱼脏器碱提粗多糖最佳提取工艺条件为：料液比1:150，提取时间1.93 h，提取温度69.26 ℃。此条件下粗多糖得率预测值为8.59%。根据实际操作情况（优化参数修改为：液料比1:150，提取时间2 h，提取温度70 ℃）重复试验3次，测得鲍鱼脏器碱提粗多糖得率平均为8.57%，与预测值相差不大，高于文献报道的高压脉冲电场提取法的多糖得率（3%）[31]以及酶法辅助提取的得率（6.5%）[32]，说明采用响应面优化得到的最佳条件可靠性好。
2.3 纯化Aavp修复L929细胞H2O2氧化损伤
2.3.1 L929细胞氧化损伤模型的建立
如图5所示，对照组（H2O2浓度为0 μmol/L）的细胞存活率为100%±1.51%，随着H2O2浓度越来越高（50、100、150、200、250和300 μmol/L），L929细胞的存活率也随之下降，分别为83.34%±1.20%、76.23%±2.22%、60.90%±2.81%、53.34%±4.10%、45.48%±5.21%和42.22%±3.42%。随着H2O2浓度的上升，细胞也逐步出现形态变圆、漂浮、细胞结构不清等情况。如果H2O2浓度过低，对细胞存活率影响太小，试验辨识度不大；如果H2O2浓度过高，则大量细胞出现凋亡甚至死亡，可能导致试验失败。综合考虑，选择H2O2浓度为150 μmol/L（此时细胞存活率为60.90%±2.81%）进行后续研究。
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图 5 建立L929细胞H2O2氧化损伤模型Figure 5. Establishment the model of H2O2 oxidative damage of L929 cells2.3.2 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的预防作用
图6显示的是先用维生素E或Aavp处理，再进行H2O2氧化损伤的结果。设定空白组细胞存活率为100%±2.98%，模型组细胞存活率则为63.45%±1.02%，极显著低于空白组（P<0.001），说明H2O2对L929细胞的氧化损伤模型建立成功。阳性对照组细胞存活率为70.82%±1.99%，极显著高于模型组（P<0.001），说明作为阳性对照的维生素E，对细胞氧化损伤具有一定预防作用。低、中和高剂量组细胞存活率分别为69.27%±1.78%、71.94%±3.08%和66.13%±1.33%。与空白组和模型组相比，不同剂量的Aavp对L929细胞氧化损伤均具有极显著的预防作用（P<0.001），但是没有表现出剂量效应；与阳性对照组相比，不同剂量的Aavp组并未表现出明显的差异性，但中剂量组效果略优于阳性对照组。
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图 6 纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的预防作用注：*、#和△分别代表不同剂量药组分别与空白组、模型组和阳性对照组比较，***、###、△△△代表极显著，P<0.001；**、##、△△代表较显著，P<0.01；*、#、△代表显著，P<0.05；图7同。Figure 6. Preventive effect of purified Aavp on H2O2 oxidative damage in L929 cells2.3.3 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的修复作用
如图7所示，当维生素E或不同浓度的纯化Aavp与H2O2同时处理细胞时，阳性对照组细胞存活率为87.96%±3.05%，极显著低于空白组（100%±1.99%），但极显著高于模型组（60.20%±1.56%）（P<0.001），说明作为阳性对照的维生素E对L929细胞氧化损伤具有修复作用。低、中和高剂量组细胞存活率分别为63.99%±0.89%、73.24%±2.92%和90.93%±1.17%。与空白组和模型组相比，在试验范围内高、中、低浓度的Aavp对L929细胞氧化损伤均具有极显著的修复作用（P<0.001），且表现出剂量效应；与阳性对照组相比，低、中剂量组的修复效果明显更差，但高剂量组的细胞修复效果略优于阳性对照组。
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图 7 纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的修复作用Figure 7. Repair effect of crude Aavp on H2O2 oxidative damage in L929 cells3. 结论
本研究通过单因素实验及响应面试验，优化鲍鱼脏器碱提粗多糖的提取工艺，并测试鲍鱼脏器碱提粗多糖对L929细胞的H2O2氧化损伤模型的修复效果。结果显示，鲍鱼脏器碱提粗多糖最佳提取工艺条件为：液料比1:150，提取时间2 h，提取温度70 ℃，该条件下鲍鱼脏器碱提粗多糖得率为8.57%。纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤具有较好的预防和修复作用。在预防试验中，与模型组相比，不同剂量的Aavp对L929细胞氧化损伤均具有极显著的预防作用，但没有表现出剂量效应，其中中剂量组的细胞存活率最高（71.94%±3.08%）；与阳性对照组相比，不同剂量的Aavp组并未表现出明显的差异性，但中剂量组效果略优于阳性对照组。在修复试验中，不同剂量的Aavp对L929细胞氧化损伤均具有极显著的修复效果，并呈现剂量效应，而高剂量组的细胞存活率最高（90.93%±1.17%），略高于阳性对照的维生素E组（87.96±3.05%）；但与阳性对照组相比，低、中剂量组的修复效果明显更差。本研究初步探讨了Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤修复作用，为Aavp后续开发提供了思路。但是，Aavp对L929细胞的修复机制尚未明确，还有待进一步探究。
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图 2 不同提取时间对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
Figure 2. Effect of different extraction times on the yields of crude Aavp
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图 3 不同提取温度对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的影响
Figure 3. Effect of different extraction temperatures on the yields of crude Aavp
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图 4 各因素对鲍鱼脏器碱提粗多糖得率的交互作用响应面和等高线图
Figure 4. Response surface plots and contour plots of the effects of the interaction of various factors to the yields of crude Aavp
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图 5 建立L929细胞H2O2氧化损伤模型
Figure 5. Establishment the model of H2O2 oxidative damage of L929 cells
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图 6 纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的预防作用
注：*、#和△分别代表不同剂量药组分别与空白组、模型组和阳性对照组比较，***、###、△△△代表极显著，P<0.001；**、##、△△代表较显著，P<0.01；*、#、△代表显著，P<0.05；图7同。
Figure 6. Preventive effect of purified Aavp on H2O2 oxidative damage in L929 cells
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图 7 纯化Aavp对L929细胞H2O2氧化损伤的修复作用
Figure 7. Repair effect of crude Aavp on H2O2 oxidative damage in L929 cells
表 1 响应面试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 因素 X1料液比
（g/mL）X2提取时间
（h）X3提取温度
（℃）−1 1:200 1 60 0 1:150 2 70 1 1:100 3 80 
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表 2 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的预防作用
Table 2 Preventive effect of purified Aavp on oxidative damage of L929 cells
组别 第一阶段 第二阶段 空白组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加RPMI 1640培养基，培养24 h 模型组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 阳性对照组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+50 μmol/L VE），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 低剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+20 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 中剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+50 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 高剂量给药组 接种细胞于（RPMI 1640培养基+100 μg/L Aavp），培养24 h 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h
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表 3 纯化Aavp对L929细胞氧化损伤的修复作用
Table 3 Repair effect of purified Aavp on oxidative damage of L929 cells
组别 第一阶段 第二阶段 空白组 接种细胞于RPMI 1640培养基，培养24 h 换液，加RPMI 1640培养基，培养24 h 模型组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2），培养24 h 阳性对照组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+50 μmol/L VE），培养24 h 低剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+20 μg/L Aavp），培养24 h 中剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+50 μg/L Aavp），培养24 h 高剂量给药组 换液，加（RPMI 1640培养基+150 μmol/L H2O2+100 μg/L Aavp），培养24 h
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表 4 响应面试验设计及结果
Table 4 Design and the results of response surface experimental
试验号 X1 X2 X3 Y 料液比 提取时间 提取温度 粗多糖得率（%） 1 −1 −1 0 7.57 2 1 −1 0 7.31 3 −1 1 0 7.34 4 1 1 0 7.10 5 −1 0 −1 7.50 6 1 0 −1 7.33 7 −1 0 1 7.48 8 1 0 1 6.94 9 0 −1 −1 7.48 10 0 1 −1 7.31 11 0 −1 1 7.25 12 0 1 1 7.11 13 0 0 0 8.54 14 0 0 0 8.61 15 0 0 0 8.57 16 0 0 0 8.55 17 0 0 0 8.62
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表 5 回归模型方差分析
Table 5 ANOVA analysis for response surface regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 6.05 9 0.6720 419.66 <0.0001 *** X1 0.1822 1 0.1822 113.78 <0.0001 *** X2 0.072 1 0.072 44.99 0.0003 *** X3 0.0893 1 0.0893 55.75 <0.0001 *** X1X2 0.0001 1 0.0001 0.0643 0.8071 X1X3 0.0331 1 0.0331 20.64 0.0027 ** X2X3 0.0004 1 0.0004 0.2338 0.6435 X12 1.57 1 1.57 982.07 <0.0001 *** X22 1.71 1 1.71 1065.48 <0.0001 *** X32 1.8 1 1.8 1121.52 <0.0001 *** 残差 0.0112 7 0.0016 失拟项 0.0069 3 0.0023 2.16 0.2355 不显著 纯误差 0.0043 4 0.0011 总离差 6.06 16 注：本模型R2=0.9982，R2Adj=0.9958，R2Pred=0.9806，Adeq Precision=52.5128，C.V.=0.5209%；***代表极显著，P<0.001，**代表较显著，P<0.01；*代表显著，P<0.05；P>0.05，代表不显著。
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