Physicochemical Properties and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sargassum fusiforme Prepared by Six Combined Enzymatic Methods
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摘要: 目的：探究不同组合酶制备的羊栖菜多糖的理化性质及功能变化。方法：应用纤维素酶-碱性蛋白酶（C-A）、果胶酶-碱性蛋白酶（P-A）、黏酶-碱性蛋白酶（V-A）、纤维素酶-中性蛋白酶（C-N）、果胶酶-中性蛋白酶（P-N）、黏酶-中性蛋白酶（V-N）6种组合酶对羊栖菜多糖进行辅助提取，分析6种组合酶制备的羊栖菜多糖的理化性质、结构组成和体内外抗氧化活性。结果：不同组合酶制备的羊栖菜多糖的总糖、糖醛酸、硫酸根等含量变化较大，单糖组成和化学结构相似，其中C-N组的总糖含量及多糖得率最高。V-N组的多糖Fe2+还原力和DPPH自由基清除能力最高，分别达到0.103±0.003（Abs）和0.540±0.022（mg/mL）（IC50），P-N组的多糖羟自由基清除能力最高，达到1.341±0.265（mg/mL）（IC50）。不同组合酶制备的羊栖菜多糖对AAPH（偶氮二异丁脒盐酸盐）诱导的氧化应激起到不同的保护作用，其中，与NO组相比，P-A、C-A、V-A和P-N组的多糖具有更强的降活性氧水平，P-A、P-N、V-N组的多糖具有显著的脂质过氧化抑制作用，与诱导组相比，C-N和V-N组的多糖显著提高CAT酶活性（P<0.01），P-A和C-N组的多糖显著提高T-SOD酶活性（P<0.01），P-A和V-N组的多糖显著降低MDA含量（P<0.01），P-A、P-N组的多糖能使gpx1b、NF-κB基因表达显著上调（P<0.01）。结论：不同组合酶制备的羊栖菜多糖的理化性质有所改变，但结构组成不变，不同组合酶处理能不同程度改善多糖的抗氧化活性。本研究为定向开发羊栖菜功能多糖提供了参考。Abstract: Objective: To investigate the physicochemical properties and functional changes of the polysaccharides prepared from Sargassum fusiforme by different combinations of enzymes. Methods: Six enzyme combinations of cellulase-alcalase (C-A), pectinase-alcalase (P-A), viscozyme-alcalase (V-A), cellulase-neutrase (C-N), pectinase-neutrase (P-N), and viscozyme-neutrase (V-N) were used to assist the extraction of polysaccharides from Sargassum fusiforme. The physicochemical properties, structural composition, and antioxidant activity in vitro and in vivo of Sargassum fusiforme polysaccharides prepared by six combined enzymes were analyzed. Results: The contents of total sugar, uronic acid and sulfate in the polysaccharides prepared by the six combined enzymes changed greatly, and the monosaccharide composition and chemical structure were similar. The total sugar content and polysaccharide yield of the C-N group were the highest. The reducing power of Fe2+ and DPPH radical scavenging capacity of polysaccharides were the highest in the V-N group, amounting to 0.103±0.003 (Abs) and 0.540±0.022 (mg/mL) (IC50), respectively, and in the P-N group, the hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharides was the highest at 1.341±0.265 (mg/mL) (IC50). The polysaccharides prepared by different combined enzymes had different protective effects on AAPH-induced oxidative stress. Among them, compared with the NO group, the polysaccharides in the P-A, C-A, V-A and P-N groups had a stronger ability to reduce reactive oxygen species. The polysaccharides in the P-A, P-N and V-N groups had significant lipid peroxidation inhibition. Compared with the induction group, the polysaccharides in the C-N and V-N groups significantly increased CAT enzyme activity (P<0.01), and the polysaccharides in the P-A and C-N groups significantly increased T-SOD enzyme activity (P<0.01). The polysaccharides in the P-A and V-N groups had the best ability to reduce MDA content (P<0.01). The polysaccharides in the P-A and P-N groups could significantly up-regulate the expression of gpx1b and NF-κB genes (P<0.01). Conclusion: The physicochemical properties of Sargassum fusiforme polysaccharides prepared by different combined enzymes changed, but the structural composition remained unchanged, and their antioxidant activities in vitro and in vivo were improved to varying degrees. This study provides a reference for the directional development of functional polysaccharides from Sargassum fusiforme.
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羊栖菜（Sargassum fusiforme 或 Hizikia fusiformis）习称“小叶海藻”，又名海大麦、大麦菜，属于褐藻门马尾藻科马尾藻属的一种海洋孢子植物[1−2]。羊栖菜中富含多种营养物质，例如羊栖菜多糖、多酚、甾醇、碘、铁等，相关文献报道羊栖菜及其主要活性成分具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4−6]、抗衰老[7]、抗凝血[8]、降低血糖[9−10]、抗病毒[11−12]、抗菌[13]、抗神经炎症活性[14]、提高记忆力[15]等生物活性功能，对人体健康具有重要作用。
近年来许多学者在羊栖菜多糖组分的分离、纯化、组成分析及生物活性等方面做了大量工作，研究结果均确证了羊栖菜多糖的价值，可用于开发促进健康的天然产品。目前，羊栖菜多糖常用的提取方法有热水提取法、酸碱提取法、超声波辅助法等，但热水提取耗时长、提取率低，酸、碱提取法容易破坏羊栖菜多糖活性结构，超声波提取法耗时长，造价较贵，而不同提取方法得到的活性多糖的理化性质和功能特性有所差异[16]，因此选取恰当的提取方法，保持多糖的活性是一项重要研究内容[17]。研究表明，酶解法不仅可以将藻类的细胞壁、细胞膜降解，使细胞内活性成分释放，而且能定向将大分子多糖降解成小分子片段，相比其他提取方式，酶解法能够提高产率、维持功能活性，甚至还可以增强生物活性[18−20]。KANG等[21]比较了五种糖化酶和五种蛋白酶提取马尾藻中的多糖，发现酶解后多糖的产率以及生物活性显著变化，其中纤维素酶的提取物具有最强的DPPH自由基和过氧化氢清除活性。虽然单酶酶解法可以将羊栖菜多糖提取出来，但由于羊栖菜中含有多糖、蛋白质、胶质等复杂大分子，一种酶的效果可能存在降解不完全的现象，因此，应用组合酶解法，将碳水化合物酶与蛋白酶结合，分别作用于大分子多糖和蛋白质，破坏细胞壁，促进羊栖菜的充分降解，可能会达到更好的提取效果。
本研究以羊栖菜为原料，将碳水化合物酶与蛋白酶组合，采用了纤维素酶-碱性蛋白酶（C-A）、果胶酶-碱性蛋白酶（P-A）、黏酶-碱性蛋白酶（V-A）、纤维素酶-中性蛋白酶（C-N）、果胶酶-中性蛋白酶（P-N）、黏酶-中性蛋白酶（V-N）6种组合酶来降解羊栖菜，提取羊栖菜多糖，并分析多糖的理化性质及抗氧化活性，以期为筛选更好的羊栖菜功能多糖提取方法提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
干羊栖菜 产地浙江温州，常温保存，由温州佳海食品有限公司提供；斑马鱼 Hunter Biotech（中国杭州）；纤维素酶（Celluclast 1.5 L，700 EGU/g，简称C）、果胶酶（Pectinase XXL，10000 PECTU/g，简称P）、黏性酶（Viscozyme L，300 AGU/mL，简称V）、碱性蛋白酶（Alcalase 2.4 L FG，2.4 AU/g，简称A）、中性蛋白酶（Neutrase 0.8 L，0.8 AU/g，简称N） 丹麦Novozymes公司；1,1-二苯-2-苦基肼（DPPH）、三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐）、偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH）、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、1,3-双（二苯基膦）丙烷（DPPP） 美国Sigma公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；HiScript III RT SuperMix for qP试剂盒 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；TransStart Top qPCR试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；岩藻多糖（Fucoidan，简称FUC；水分≤10%，总糖≥50%，岩藻糖≥15%，硫酸基≥20%） 山东洁晶集团股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯级。
1260高效液相色谱仪 美国Agilent；FD-1-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；RE-200旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Sorvall ST 16R高速冷冻离心机 美国Thermo fisher scientific；Epoch酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；TENSOR27红外光谱仪 德国布鲁克光谱仪器公司；T6紫外可见分光度计 北京普析通用仪器有限公司；JSM-IT200扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM） 日本电子JEOL。
1.2 实验方法
1.2.1 组合酶提取羊栖菜多糖的制备工艺
参考魏玉等[22]方法进行如下提取实验：羊栖菜经清洗、烘干、粉碎后，60目过筛备用。准确称取20.0 g羊栖菜干粉，以料液比1:10加入纯净水并搅拌均匀，沸水浴10 min，冷却后，先调节酶1的pH，酶添加量为2.5%（底物的质量分数），在反应温度下置于恒温摇床（100 r/min）中1 h，再调节到酶2的最适pH，酶添加量为2.5%，置于恒温摇床（100 r/min）中1 h。酶解结束后，沸水浴中灭酶10 min，离心（4000 r/min，10 min），收集上清液，加入并调节乙醇终浓度为75%，静置过夜，离心，取沉淀溶于水，加入Sevag试剂（正丁醇:氯仿=1:4）除蛋白，醇沉过夜，离心（4000 r/min，10 min），取沉淀冷冻干燥，得到羊栖菜多糖样品备用。水提法对照组（NO）的提取条件为70 ℃下提取2 h，其余步骤一致。不同组合酶的反应条件见表1。
表 1 不同组合酶的反应条件Table 1. Reaction conditions of different combined enzymes酶1-酶2 反应条件 pH1 pH2 温度（℃） P-A 3 8 50 C-A 4.5 8 50 V-A 4.5 8 50 P-N 3 8 50 C-N 4.5 8 50 V-N 4.5 8 50 1.2.2 多糖的化学成分和单糖组成分析
采用苯酚-硫酸法[23]测定总糖含量，以葡萄糖为标准品，得到葡萄糖标准曲线为y=15.054x+0.0008，R2=0.9998。样品中糖含量测定：取样品溶液l mL，加入苯酚试剂0.5 mL，浓硫酸2.5 mL，按照制备标准曲线的方法操作，测定吸光度。将吸光度代入标准曲线，计算得到样品中的总糖含量。
采用间羟基联苯法[24]测定糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸为标准品，得到葡萄糖醛酸标准曲线为y=0.0016x−0.0017，R2=0.9983。样品处理：配制0.1 mg/mL待测样品，然后取待测样品溶液0.5 mL，加去离子补足至1 mL。按照制备标准曲线的方法操作，测定吸光度。将吸光度代入标准曲线，计算得到样品中的糖醛酸含量。
采用硫酸钡比浊法[24]测定硫酸根含量，以K2SO4为标准品，得到K2SO4标准曲线为y=0.0013x+0.0067，R2=0.9958。样品处理：准确称取10 mg样品在消化瓶中，用5 mL的1 mol/L HCl溶解，密封，并于120 ℃条件下密闭反应5 h。冷却后，加1 mol/L盐酸至原来体积，离心（4000 r/min，10 min），除去不溶物。按照制备标准曲线的方法操作，测定吸光度。将吸光度代入标准曲线，计算得到样品中的硫酸根含量。
羊栖菜多糖得率的计算：
多糖得率(%)=提取的多糖质量(g)干羊栖菜的质量(g)×100 (1) 采用PMP衍生化法测定单糖组成，参照LIU等[25]的方法，略作修改，羊栖菜多糖用三氟乙酸（TFA）水解，于120 ℃干燥箱，处理1 h。然后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化，在高效液相色谱（HPLC）上进行单糖组成分析。色谱柱为Xbrige C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），温度为25 ℃，UV检测波长为254 nm。流动相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）和乙腈（83:17，v/v），流速为1 mL/min。
1.2.3 多糖的相对分子量的测定
参照JIN等[26]的方法测定多糖的相对分子质量，略作修改。色谱柱为TSKG3000PWXL型凝胶柱（300 mm×7.8 mm，10 μm），柱温为30 ℃，流动相为0.7% Na2SO4，进样量：20 μL，流速为0.6 mL/min。在此条件下，根据不同分子量标准品得到标准曲线公式为：y=−0.3678x+2.1287，R²=0.9966。不同组合酶制备的羊栖菜多糖，按上述方法测定3次，根据标准曲线计算平均分子量。
1.2.4 傅里叶变换红外光谱分析
将不同组合酶制备的羊栖菜多糖样品（1.0 mg）与100 mg溴化钾（KBr）混合，并压入圆盘，采用傅里叶变换红外（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）光谱分析[27]方法获取羊栖菜多糖的光谱图像，并进行分析。
1.2.5 多糖的微观结构表征
将不同组合酶制备的羊栖菜多糖样品粉末平铺到试样支架上并喷上金粉，随后，在15 kV电压下，通过扫描电子显微镜（SEM）分析样品，并在200×观察样品的微观表面结构。
1.2.6 羊栖菜多糖体外抗氧化活性的测定
参照张小龙等[28]方法，略作修改，测定羟自由基清除能力：分别取浓度为0.8、1、2、2.5、5 mg/mL的样品1 mL，依次加入1 mL蒸馏水，1 mL 3.0 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 9.0 mmol/L H2O2，1 mL 9.0 mmol/L水杨酸，混匀，于37 ℃水浴30 min，取出冷却，于510 nm处测定吸光值。羟自由基清除率计算公式见式（2），羟自由基清除能力以IC50呈现。
羟自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (2) 式中：A1为加多糖溶液反应的吸光度；A2为加多糖溶液，以无水乙醇代替水杨酸反应的吸光度；A0为加蒸馏水代替多糖溶液反应的吸光度。半抑制率IC50：自由基清除率为50%时样品浓度。
参照王雪等[29]的方法，略作修改，测定DPPH自由基清除能力：分别取浓度为0.8、1、2、2.5、5 mg/mL的样品2 mL于试管中，加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。DPPH自由基清除率计算公式见式（3），DPPH自由基清除能力以IC50呈现。
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (3) 式中：A1为加多糖溶液反应的吸光度；A2为加多糖溶液，以无水乙醇代替DPPH反应的吸光度；A0为加蒸馏水代替多糖溶液反应的吸光度。半抑制率IC50：自由基清除率为50%时样品浓度。
参照王雪等[29]的方法，略作修改，测定Fe2+还原力：向1 mL浓度为1 mg/mL的样品中依次加入2.5 mL PBS（pH6.6）缓冲液，2.5 mL 1%（w/v）铁氰化钾溶液，混匀，于50 ℃下反应20 min后，加入1 mL 10%（w/v）三氯乙酸溶液，若有沉淀，离心除去，吸取2.5 mL上清液依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%（w/v）三氯化铁溶液，混匀，在700 nm处测定吸光值，以吸光值来表示Fe2+还原力大小。以蒸馏水代替样品作空白对照。
1.2.7 羊栖菜多糖对AAPH诱导的斑马鱼氧化应激模型的保护作用
1.2.7.1 斑马鱼饲养和模型组处理
斑马鱼饲养和繁殖参照KIM等[30]的方法。挑选受精后8 h的胚胎，将12个胚胎转移到含有胚胎培养基的12孔板中，实验分为空白组（2 mL胚胎培养液）、AAPH诱导组（2 mL胚胎培养液配制的20 mmol/L AAPH）、AAPH诱导+羊栖菜多糖组（2 mL胚胎培养液配制为200 μg/mL的不同组合酶制备的羊栖菜多糖处理1 h，再加入2 mL胚胎培养液配制的20 mmol/L AAPH处理24 h）、阳性组（2 mL胚胎培养液配制为200 μg/mL的FUC处理1 h，再加入2 mL胚胎培养液配制的20 mmol/L AAPH处理24 h），之后替换成胚胎培养液继续培育。
1.2.7.2 AAPH诱导的斑马鱼体内ROS产生和脂质过氧化分析
参照OH等[31]的方法，将培养3 dpf的胚胎，分别用DCFH-DA（20 μg/mL）、DPPP（25 μg/mL）处理，并在室温下避光孵育1 h后，荧光显微镜拍照，最后用Image J软件量化数据。通过将空白组的值固定为比较的指标来计算各组荧光强度的差异。
1.2.7.3 斑马鱼体内过氧化物酶活性的测定
MDA含量、T-SOD和CAT活性根据试剂盒说明书测定，以空白组为固定值进行归一化处理。
1.2.7.4 斑马鱼体内氧化应激相关基因的检测
斑马鱼幼鱼按TotalRNAKit试剂盒说明提取总RNA，计算RNA浓度后，反转录得到cDNA，按照表2中设计的引物（引物由北京擎科生物科技有限公司合成），以β-actin作为内参基因，采用qRT-PCR方法对氧化应激相关的gpx1b、NF-κB基因表达水平进行检测分析，热循环条件为94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，共45个循环。
表 2 引物序列和信息Table 2. Primer sequence and information引物 序列（5’-3’） gpx1b F TTCCCAAGCGATGAGCCAAT gpx1b R TTGATGTCTCCGTCGATGCC NF-κB F GATCATCGAGCAGCCTAAATC NF-κB R CCCACTGTAGTTGTGAACCCT β-actin F GCCAACAGAGAGAAGATGACACAG β-actin R CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG 1.3 数据处理
使用Origin 2018和GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行处理，实验结果以“平均值±标准偏差”表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 羊栖菜多糖的化学组成和相对分子量分布
不同组合酶制备羊栖菜多糖的化学结构和分子量如表3所示，多糖的分子量范围介于5.74 kDa和26.70 kDa之间，NO组的平均分子量为18.86±0.16 kDa，P-A、C-A、P-N、V-N组的分子量均呈单个对称峰，表明它们都是均匀的多糖[32]，而V-A（25.98±0.67 kDa、7.21±0.04 kDa）、C-N（26.70±0.32 kDa、5.74±0.29 kDa）则表现出多个不对称峰，表明V-A、C-N组的多糖不是均一的多糖。V-N组的多糖分子量降低，说明多糖中的部分糖苷键和氨基酸片段被水解，与文献中报道一致[33−34]。孔秋红等[35]采用纤维素酶辅助提取羊栖菜多糖的平均分子量与热水提取的多糖分子量相比并未下降反而升高，CHI等[36]用纤维素酶辅助提取浒苔多糖，也有相似的结果；本研究使用组合酶解除V-N组外，也出现了产物分子量提高的现象，这可能是酶破坏了细胞壁，细胞内的大分子多糖溶出，被降解成分子量大小不一的多糖，分子量较大的多糖被乙醇醇沉下来，而一部分小分子多糖则溶解在上清液中，并未被乙醇醇沉下来，导致检测出的多糖分子量变大。不同组合酶对羊栖菜的作用不同，多糖溶出也不同，C-A、P-N和C-N组的多糖得率较高，可能是纤维素酶和中性蛋白酶能够很好地破坏细胞壁使得多糖溶出。与NO组相比，C-N和V-N组的总糖含量显著升高（P<0.05），其余组变化不显著（P>0.05），进一步说明可能是中性蛋白酶更好地破坏细胞壁。P-A、C-A、P-N组的多糖硫酸根含量显著升高（P<0.05），可能是由于酶水解了糖苷键或使得分子构象发生变化，使得硫酸基团暴露出来[37]。P-A组的多糖糖醛酸含量显著升高（P<0.05），可能是褐藻胶被降解成α-L-古罗糖醛酸与β-D-甘露糖醛酸。
表 3 不同组合酶制备羊栖菜多糖的理化性质Table 3. Physicochemical properties of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes样品 NO P-A C-A V-A P-N C-N V-N 分子量（kDa） 18.86±0.16d 21.51±0.20c 25.58±0.36b 25.98±0.67b
7.21±0.0421.11±0.16c 26.70±0.32a
5.74±0.2917.45±0.33e 总糖含量（%） 46.33±0.04c 48.63±0.07bc 52.50±0.04bc 50.05±0.02bc 45.97±0.04c 60.59±0.02a 56.12±0.01b 糖醛酸含量（%） 23.47±0.02bc 36.5±0.12a 18.66±0.03c 25.4±0.01bc 23.36±0.01bc 25.43±0.01bc 31.54±0.06ab 硫酸根含量（%） 15.52±0.01c 34.51±0.02a 31.55±0.01a 23.67±0.04b 30.97±0.05a 18.81±0.01bc 22.9±0b 多糖得率（%） 5.6±0.33c 6.05±0.14bc 6.56±0.22ab 6.00±0.24bc 6.56±0.39ab 6.86±0.44a 5.71±0.26c 注：同一行的差异显著性使用小写字母表示，字母不同代表差异显著（P<0.05）；NO热水提取多糖，P-A果胶酶-碱性蛋白酶，C-A纤维素酶-碱性蛋白酶，V-A黏酶-碱性蛋白酶，P-N果胶酶-中性蛋白酶，C-N纤维素酶-中性蛋白酶，V-N黏酶-中性蛋白酶，表4同。 2.2 羊栖菜多糖的傅里叶红外光谱分析和微观结构表征结果
通过FT-IR分析不同组合酶制备的羊栖菜多糖，发现不同组合酶制备的羊栖菜多糖主要吸收峰相似，表明这些羊栖菜多糖具有相似的化学基团。如图1所示，在3432.74~3441.75 cm−1处的拉伸振动和2928.55~2926.69 cm−1处分别为O-H和C-H拉伸[38]；在1622.27~1615.74 cm−1处为糖醛酸的羧基中对称和不对称C=O的拉伸振动引起的[39]。在1253.38~1251.58 cm−1处的吸收峰为S=O基团[40]。此外，在1041.8~1042.33 cm−1处的强吸收峰为吡喃糖环的拉伸振动[15]。这些结果说明，不同组合酶制备的羊栖菜多糖有相似的化学基团，酶解并没有改变羊栖菜多糖的基团，这可能是酶的作用位点在羊栖菜多糖分子的支链上，并不破坏羊栖菜多糖的主要结构。
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采用SEM在200×下观察各多糖样品的表观形态见图2，从图中可以看出，在200×下，不同组合酶制备羊栖菜多糖的表观形态基本相似，表面都呈颗粒状，形状不规则。结果表明，酶解并没有改变羊栖菜多糖的表观形态。
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图 2 SEM观察不同组合酶制备羊栖菜多糖的表观形态Figure 2. SEM observation on the apparent morphology of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes2.3 羊栖菜多糖的单糖组成分析结果
不同组合酶制备羊栖菜多糖的单糖组成如图3所示。从图中可以看出，与水提法制备的羊栖菜多糖相比，酶解后羊栖菜多糖的单糖组分没有发生变化，各组产物均由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖等7种单糖组成，其中岩藻糖和半乳糖比例较高，与孔秋红等[35]、胡晨曦[41]研究一致。通过表4可知，酶解改变了羊栖菜多糖的单糖比例，这可能是由于不同的组合酶对羊栖菜的降解部位不同，对糖蛋白的降解程度不同导致其含量发生了一定的变化，这与CHI等[36]和CHEN等[42]的研究结果一致。
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图 3 不同组合酶制备羊栖菜多糖的单糖组成图谱注：1.甘露糖（Man），2.鼠李糖（Rha），3.葡萄糖醛酸（GluA），4.半乳糖醛酸（GalA），5.葡萄糖（Glu），6.半乳糖（Gal），7.木糖（Xyl），8.阿拉伯糖（Ara），9.岩藻糖（Fuc）。Figure 3. Monosaccharide composition of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes表 4 不同组合酶制备羊栖菜多糖的单糖组成摩尔比数据Table 4. Monosaccharide composition molar ratio of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes样品 NO P-A C-A V-A P-N C-N V-N Man 0.100 0.072 0.054 0.077 0.053 0.183 0.216 Rha 0.015 0.086 0.057 0.147 0.043 0.081 0.101 GluA 0.050 0.042 0.046 0.018 0.042 0.005 0.007 Glu 0.061 0.026 0.045 0.052 0.065 0.038 0.039 Gal 0.213 0.208 0.234 0.153 0.219 0.191 0.172 Xyl 0.078 0.086 0.093 0.063 0.092 0.095 0.067 Fuc 0.484 0.481 0.472 0.490 0.485 0.406 0.397 2.4 羊栖菜多糖的体外抗氧化活性
羊栖菜多糖样品抗氧化活性如图4所示，与水提的多糖相比，酶处理的多糖Fe2+还原力和DPPH自由基清除能力明显升高。在1 mg/mL浓度下，比较研究不同组合酶制备的羊栖菜多糖的还原力，结果如图4a所示，与NO组相比，P-N、C-N、V-N组的多糖Fe2+还原力显著提高，其中V-N组的还原力最高，OD值达到0.103±0.003（P<0.01），其次是C-N组，OD值达到0.101±0.003（P<0.05），以及P-N组，OD值达到0.100±0.001（P<0.05）。如图4b所示，DPPH自由基清除能力最高的是V-N组多糖，其IC50值为0.540±0.022 mg/mL（P<0.01），其次是C-N组的0.648±0.023 mg/mL（P<0.01），以及P-N组的0.682±0.093 mg/mL（P<0.01）。如图4c所示，P-N组的多糖羟自由基清除能力最高，IC50值为1.341±0.265 mg/mL（P<0.05）。SU等[40]研究表明分子量越小的多糖抗氧化活性越强，如表3中所示，V-N组的分子量显著低于NO组（P<0.05），有更高的抗氧化活性，还有研究表明[24]多糖的抗氧化活性与硫酸根含量相关，P-N组的硫酸根含量显著高于NO组（P<0.05），有更高的羟自由基清除能力。
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图 4 不同组合酶制备羊栖菜多糖的体外抗氧化活性注：（a）还原力，（b）DPPH自由基清除能力，（c）羟自由基清除能力；*表示NO组与P-A、C-A、V-A、P-N、C-N、V-N组之间比较；*P<0.05，**P<0.01；ns，无显著性差异。Figure 4. In vitro antioxidant activity of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes2.5 羊栖菜多糖对AAPH诱导的斑马鱼氧化应激模型的保护作用评价
2.5.1 羊栖菜多糖对AAPH诱导的斑马鱼体内活性氧产生和脂质过氧化的影响结果
斑马鱼常用于研究天然产物在动物体内的氧化应激模型，当机体部分防御机制无法控制诱导蛋白质、脂质和DNA氧化损伤的反应性物质时，就会发生氧化应激[30]。斑马鱼体内抗氧化结果如图5a所示，斑马鱼幼鱼经AAPH药物处理后，活性氧水平急剧增加。除C-N和V-N组的多糖外，其他组的多糖均能起到保护作用，其中P-A、C-A、V-A和P-N组的多糖降活性氧能力与商业抗氧化多糖岩藻多糖（FUC）效果相当（P>0.05）。如图5b所示，AAPH诱导组显示由DPPP荧光探针确定的脂质过氧化增加，与NO组相比，P-A、P-N、V-N组的多糖具有显著的脂质过氧化抑制作用（P<0.01）。其中，P-A和V-N组的多糖与FUC降脂质过氧化能力相当。综上，在不同组合酶制备的羊栖菜多糖中，P-A和P-N组的多糖具有显著的体内抗氧化能力。研究表明羊栖菜多糖的糖醛酸含量可能在抗氧化活性中发挥重要作用，其通过断裂糖苷键与自由基反应来提高抗氧化活性[43−44]，表3中显示，P-A组的糖醛酸含量最高，具有较强的抗氧化活性，P-N组有较高的硫酸根含量，使得P-N有较强的抗氧化活性。结果表明，酶解的羊栖菜多糖在一定程度上能改善由AAPH诱导的斑马鱼氧化损伤。
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图 5 不同组合酶制备羊栖菜多糖的降低活性氧生成（a）和脂质过氧化（b）的作用注：*表示AAPH组与NO、P-A、C-A、V-A、P-N、C-N、V-N、FUC组之间比较，*P<0.05，**P<0.01；#表示空白组（Control）与AAPH组之间比较，#P<0.05，##P<0.01；ns，无显著性差异；图6、图7同。Figure 5. Reduction of reactive oxygen species generation (a) and lipid peroxidation (b) by different combined enzymes for the preparation of polysaccharide from Sargassum fusiforme2.5.2 羊栖菜多糖对AAPH诱导的斑马鱼体内过氧化物酶活性的影响结果
T-SOD是人体内最重要的抗氧化酶，可将氧自由基转化为H2O2，再联合CAT酶和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）降解H2O2，清除机体内过量的自由基[45]。MDA是脂质过氧化的终产物之一，其水平高低直接反映了机体的脂质过氧化水平[46]。羊栖菜多糖对过氧化物酶的影响如图6所示。由图6a可知AAPH处理引起了氧化应激，以致机体CAT酶活力显著降低（P<0.01），多糖处理后CAT酶活力有不同程度的提高；NO、C-N、V-N组的多糖显著（P<0.01）提高了CAT酶活力，效果与FUC相当（P>0.05）。由图6b可知，经AAPH处理后的斑马鱼体内T-SOD酶活力较空白组显著降低（P<0.01），NO、P-A、C-A和C-N组的多糖处理斑马鱼后，T-SOD酶活力较AAPH诱导组显著提高（P<0.01），可见这几组多糖对机体具有保护作用。由图6c可知，经AAPH处理后斑马鱼体内的MDA含量较空白组显著升高（P<0.01），多糖处理后发现NO组的多糖没有降低MDA的含量，P-A、V-N组显著降低了MDA的含量（P<0.01），且与FUC组没有显著性差异（P>0.05）。上述结果表明C-N组的多糖能够显著提高T-SOD酶和CAT酶的活性（P<0.01），进而有效地清除体内过量的自由基，P-A和V-N组的多糖显著降低MDA的含量（P<0.01），降低体内的脂质过氧化水平，这与体外的抗氧化实验结果中，C-N与V-N组的多糖有显著（P<0.05）的DPPH自由基清除能力和Fe2+还原力对应。
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图 6 不同组合酶制备羊栖菜多糖的过氧化物酶活性注：（a）CAT，（b）T-SOD，（c）MDA。Figure 6. Peroxidase activity of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes2.5.3 斑马鱼体内氧化应激相关基因的表达
gpx1b是编码GPX酶的基因，GPX酶将谷胱甘肽变成过氧化谷胱甘肽，清除机体内过多的氧自由基和过氧化物[47]，抑制活性氧水平。NF-κB与炎症反应和氧化应激相关，马天宇[48]的研究表明当gpx1过表达会激发NF-κB的表达。图7a为基因gpx1b在斑马鱼体内的mRNA相对表达水平，与空白组相比，AAPH显著降低基因gpx1b的表达水平（P<0.01）。P-A、P-N组的gpx1b基因mRNA相对表达水平与AAPH诱导组相比显著上调（P<0.01），FUC组没有显著提高gpx1b基因的表达量（P>0.05）。如图7b所示，与空白组相比，AAPH极显著降低基因NF-κB的表达水平（P<0.01），羊栖菜多糖处理后，基因NF-κB表达水平进一步上调，其中，V-N、P-A、P-N、C-A组处理显著提高了基因NF-κB的表达（P<0.01），且P-A组的表达量显著高于FUC组的表达量（P<0.01）。与NO组相比，P-A、P-N组的多糖显著提高gpx1b、NF-κB基因表达（P<0.01），可能是果胶酶能更好地破坏细胞壁，使细胞内的多糖溶出，水解α-1,4糖苷键使得活性多糖暴露出来，增强了多糖的抗氧化活性，同时也可能与P-A、P-N有较高糖醛酸和硫酸根含量有关，这与杨斯淇[37]的结果一致。这表明P-A和P-N组的多糖能够使斑马鱼体内谷胱甘肽过氧化物酶表达，进而清除体内过量自由基，达到抗氧化的效果，体内抗氧化能力与AAPH诱导的斑马鱼体内活性氧产生和脂质过氧化的结果对应。
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图 7 不同组合酶制备羊栖菜多糖的抗氧化相关基因的表达水平注：（a）gpx1b基因，（b）NF-κB基因。Figure 7. Expression level of antioxidant-related genes in Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes3. 结 论
本文采用不同组合酶制备羊栖菜多糖，并比较了产物的理化性质、多糖得率和抗氧化活性。结果表明，不同组合酶制备的羊栖菜多糖分子量存在明显差异，在（5.74±0.29）~（26.70±0.32）kDa之间；C-N组多糖得率和总糖含量最高，分别为6.86%±0.44%、60.59%±0.02%，P-A组有最高的糖醛酸和硫酸根含量，分别为36.5%±0.12%和34.51%±0.02%。这些不同组合酶制备的羊栖菜多糖的单糖组成相同，主要由岩藻糖、半乳糖、甘露糖等组成。傅里叶变换红外光谱分析发现各组羊栖菜多糖的化学基团相似，这说明酶解并不改变多糖的主要结构。不同组合酶制备的羊栖菜多糖抗氧化能力各有不同，与NO组羊栖菜多糖相比，P-N组的多糖具有更好的还原力、羟自由基清除能力和DPPH自由基清除能力；C-N组的多糖极显著提高了斑马鱼模型中的CAT、T-SOD活力（P<0.01），P-A和V-N组多糖显著降低了斑马鱼模型中MDA含量（P<0.01）；P-A、P-N组的多糖能够极显著提高斑马鱼幼鱼体内gpx1b和NF-κB基因表达（P<0.01），对AAPH诱导的斑马鱼体内的氧化应激有保护作用。综上所述，不同组合酶制备的羊栖菜多糖，理化性质差异显著，结构组成不变，与水提多糖相比，不同组合酶处理能不同程度改善羊栖菜多糖的抗氧化活性。本研究为定向开发羊栖菜功能多糖提供了参考。
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图 2 SEM观察不同组合酶制备羊栖菜多糖的表观形态
Figure 2. SEM observation on the apparent morphology of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
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图 3 不同组合酶制备羊栖菜多糖的单糖组成图谱
注：1.甘露糖（Man），2.鼠李糖（Rha），3.葡萄糖醛酸（GluA），4.半乳糖醛酸（GalA），5.葡萄糖（Glu），6.半乳糖（Gal），7.木糖（Xyl），8.阿拉伯糖（Ara），9.岩藻糖（Fuc）。
Figure 3. Monosaccharide composition of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
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图 4 不同组合酶制备羊栖菜多糖的体外抗氧化活性
注：（a）还原力，（b）DPPH自由基清除能力，（c）羟自由基清除能力；*表示NO组与P-A、C-A、V-A、P-N、C-N、V-N组之间比较；*P<0.05，**P<0.01；ns，无显著性差异。
Figure 4. In vitro antioxidant activity of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
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图 5 不同组合酶制备羊栖菜多糖的降低活性氧生成（a）和脂质过氧化（b）的作用
注：*表示AAPH组与NO、P-A、C-A、V-A、P-N、C-N、V-N、FUC组之间比较，*P<0.05，**P<0.01；#表示空白组（Control）与AAPH组之间比较，#P<0.05，##P<0.01；ns，无显著性差异；图6、图7同。
Figure 5. Reduction of reactive oxygen species generation (a) and lipid peroxidation (b) by different combined enzymes for the preparation of polysaccharide from Sargassum fusiforme
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图 6 不同组合酶制备羊栖菜多糖的过氧化物酶活性
注：（a）CAT，（b）T-SOD，（c）MDA。
Figure 6. Peroxidase activity of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
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图 7 不同组合酶制备羊栖菜多糖的抗氧化相关基因的表达水平
注：（a）gpx1b基因，（b）NF-κB基因。
Figure 7. Expression level of antioxidant-related genes in Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
表 1 不同组合酶的反应条件
Table 1 Reaction conditions of different combined enzymes
酶1-酶2 反应条件 pH1 pH2 温度（℃） P-A 3 8 50 C-A 4.5 8 50 V-A 4.5 8 50 P-N 3 8 50 C-N 4.5 8 50 V-N 4.5 8 50 
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表 2 引物序列和信息
Table 2 Primer sequence and information
引物 序列（5’-3’） gpx1b F TTCCCAAGCGATGAGCCAAT gpx1b R TTGATGTCTCCGTCGATGCC NF-κB F GATCATCGAGCAGCCTAAATC NF-κB R CCCACTGTAGTTGTGAACCCT β-actin F GCCAACAGAGAGAAGATGACACAG β-actin R CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG
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表 3 不同组合酶制备羊栖菜多糖的理化性质
Table 3 Physicochemical properties of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
样品 NO P-A C-A V-A P-N C-N V-N 分子量（kDa） 18.86±0.16d 21.51±0.20c 25.58±0.36b 25.98±0.67b
7.21±0.0421.11±0.16c 26.70±0.32a
5.74±0.2917.45±0.33e 总糖含量（%） 46.33±0.04c 48.63±0.07bc 52.50±0.04bc 50.05±0.02bc 45.97±0.04c 60.59±0.02a 56.12±0.01b 糖醛酸含量（%） 23.47±0.02bc 36.5±0.12a 18.66±0.03c 25.4±0.01bc 23.36±0.01bc 25.43±0.01bc 31.54±0.06ab 硫酸根含量（%） 15.52±0.01c 34.51±0.02a 31.55±0.01a 23.67±0.04b 30.97±0.05a 18.81±0.01bc 22.9±0b 多糖得率（%） 5.6±0.33c 6.05±0.14bc 6.56±0.22ab 6.00±0.24bc 6.56±0.39ab 6.86±0.44a 5.71±0.26c 注：同一行的差异显著性使用小写字母表示，字母不同代表差异显著（P<0.05）；NO热水提取多糖，P-A果胶酶-碱性蛋白酶，C-A纤维素酶-碱性蛋白酶，V-A黏酶-碱性蛋白酶，P-N果胶酶-中性蛋白酶，C-N纤维素酶-中性蛋白酶，V-N黏酶-中性蛋白酶，表4同。
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表 4 不同组合酶制备羊栖菜多糖的单糖组成摩尔比数据
Table 4 Monosaccharide composition molar ratio of Sargassum fusiforme polysaccharide prepared by different combined enzymes
样品 NO P-A C-A V-A P-N C-N V-N Man 0.100 0.072 0.054 0.077 0.053 0.183 0.216 Rha 0.015 0.086 0.057 0.147 0.043 0.081 0.101 GluA 0.050 0.042 0.046 0.018 0.042 0.005 0.007 Glu 0.061 0.026 0.045 0.052 0.065 0.038 0.039 Gal 0.213 0.208 0.234 0.153 0.219 0.191 0.172 Xyl 0.078 0.086 0.093 0.063 0.092 0.095 0.067 Fuc 0.484 0.481 0.472 0.490 0.485 0.406 0.397
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