Cloning and Expression of Marine α-Glucosidase and Its Preparation of High Purity Panose
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摘要: 潘糖是含α-1,6糖苷键的低聚异麦芽糖，α-葡萄糖苷酶是制备潘糖的关键酶制剂。本研究对深海热液口超嗜热古菌（Thermococcus siculi HJ21）中的α-葡萄糖苷酶序列进行合成，并克隆入载体pET29a，在大肠杆菌BL21中表达，通过His Trap HP层析柱纯化获得纯酶，以SDS-PAGE电泳测定α-葡萄糖苷酶分子量，并研究了酶的性质和其转糖苷作用。结果表明：该基因为729 bp，编码242个氨基酸，分子量约为27.2 kDa。该酶最适催化温度和pH分别为40 ℃和6.0。在以果糖为受体，与麦芽糖的比例为1:9，反应10 h时，其潘糖的生成量最高可以达到79.1%。研究结果为古细菌α-葡萄糖苷酶制备高纯度潘糖提供了依据。Abstract: Panose is iso-malto-oligosaccharide contained α-1,6 glycosidic bonds, and α-glucosidase is the key enzyme to produce panose. In this study, the α-glucosidase gene in deep-sea hydrothermal vents thermophilic archaea Thermococcus siculi HJ21 was synthesized, and cloned into the vector pET29a. Then expressed in Escherichia coli BL21 and purified by His Trap HP column. The molecular weight of α-glucosidase was determined by SDS-PAGE. The enzymatic properties and transglycosylation were also investigated. The results showed that the gene of α-glucosidase was 729 bp and encoded 242 amino acids. The molecular weight of α-glucosidase was about 27.2 kDa. Its optimal temperature and pH were 40 ℃ and 6.0 respectively. When the receptor was fructose, and the ratio of fructose and maltose was 1:9, the highest yield of panose could reached 79.1% after 10 h reaction. The results provide a basis for producing high-purity panose by α-glucosidase from archaea.
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Keywords:
- α-glucosidase /
- cloning and expression /
- iso-malto-oligosaccharide /
- trans glycoside /
- panose
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α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3.2.1.20），又称葡萄糖基转移酶，可水解α-1,4糖苷键，并能将游离的葡萄糖分子转移到葡萄糖和麦芽糖等糖类底物上，形成α-1,6-糖苷键的低聚异麦芽糖（Iso-malto-oligosaccharides，IMOs）[1−4]。α-葡萄糖苷酶主要来源于细菌和真菌[5−7]，分子量介于40~150 kDa[8]，在工业上主要用于淀粉的水解和生产低聚异麦芽糖[9]。
IMOs是聚合度为2~10功能性寡糖[10−16]。潘糖是含α-1,6糖苷键的三糖，具有促进益生菌生长代谢、提高机体免疫力和维护肠道健康的作用。α-葡萄糖苷酶是制备IMOs的关键酶制剂，影响IMOs的纯度和功能。低聚异麦芽糖的市场广阔，但低聚异麦芽糖产率低，产品纯度参差不齐[17−19]。目前，我国仍需国外品牌的α-葡萄糖苷酶制剂。因此筛选性质优越的α-葡萄糖苷酶至关重要[20−21]。Kawano等[22]发现的α-葡萄糖苷酶可以制备不同聚合度的低聚异麦芽糖。徐燕衫[17]用黑曲霉α-葡萄糖苷酶转化麦芽糖为IMO，转化率为45%。Zhang等[18]克隆了土芽孢杆菌HTA-462的α-葡萄糖苷酶，在30%麦芽糖浆条件下IMO的转化率为37%。王月宏[19]用α-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的总含量为47.1%。目前，现有α-葡萄糖苷酶转苷率低，产物由不同聚合度的低聚糖组成。
本研究克隆表达了深海热液口超嗜热古菌（Thermococcus siculi HJ21）菌株的α-葡萄糖苷酶，研究了其酶学性质和转糖苷作用。发现其产物主要为潘糖，进一步对转糖基供体、受体最佳比例和最佳反应时间等进行了优化。拟为该酶的应用提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
质粒小提试剂盒、感受态细胞E. coli DH5α、感受态细胞E. coli BL21（DE3） 天根生化科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒 北京酷来搏科技有限公司； Taq PCR Master Mix（2X，blue dye）、TureColor双色预染蛋白Marker、葡萄糖、麦芽糖、潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖标品 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒 Takara；海洋来源T. siculi HJ21 α-葡萄糖苷酶基因 生工生物工程（上海）股份有限公司合成；T. siculi HJ21菌株 为本实验室−80 ℃甘油管保存。
SPX-150B-Z恒温生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HYG全温振荡培养箱 上海欣蕊设备有限公司；SCILOGEX掌上离心机 上海靳澜仪器制造有限公司；SW-CJ-JCU无菌超净台 苏州净化设备有限公司；AKTA蛋白纯化系统 美国GE公司；1510全波长酶标仪、ICS5000离子色谱仪 美国Thermo公司；OIC1618超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物。
1.2 实验方法
1.2.1 α-葡萄糖苷酶基因的克隆
根据α-葡萄糖苷酶基因序列（序列号：EU849121.1）与pET29a质粒基因序列设计引物，如表1所示。
表 1 T. siculi HJ21来源α-葡萄糖苷酶引物设计Table 1. Primer design of α-glucosidase of T. siculi HJ21引物名称 引物序列 HJ21-F 5’-GGAATTCCATATGATGAAAAGCGC
AGAGATTCTGCGAGACGTCGC-3’HJ21-R 5’-ACGCGTCGACAAGGAATGCGT
GCCTGTGCTTGTAGAGTGTAT-3’采用Taq PCR Master Mix扩增目的基因，PCR反应体系：超纯水20 µL，引物F、R（10 µmol/L）各2 µL，HJ21 DNA 1 µL，Taq PCR Master Mix 25 µL；PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，34个循环。用1%琼脂糖凝胶检测目的基因[23]。
将合成的α-葡萄糖苷酶基因质粒转化至E. coli DH5α感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃水浴热激90 s，快速转移至冰浴中2~3 min，每个离心管中加入600 µL无抗生素的LB培养基，混匀置于37 ℃，180 r/min培养1~1.5 h，取菌液100 μL涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB（LBk）固体培养基上，37 ℃培养12~15 h。挑取单菌落接种含LBk培养基，37 ℃培养6~8 h，使用Taq PCR Master Mix扩增目的基因。将PCR扩增成功的菌株寄上海生工测序，并将测序结果与目的基因进行比对，将正确的克隆子培养并保种。
1.2.2 α-葡萄糖苷酶的表达
将提取的E. coli DH5α质粒转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，冰浴30 min，放置42 ℃水浴锅60~90 s，立刻转至冰面2 min，加入600 μL LB液体培养基，恒温摇床，37 ℃，150 r/min培养1.5 h。取菌液100 μL涂布于LBk固体培养基上，37 ℃培养12~14 h，取单菌落接种于LBk液体培养基中，37 ℃ 180 r/min培养4~6 h，OD600 nm约为0.8时，5%接种量接种LBk液体培养基，37 ℃ 180 r/min培养4~5 h，OD600 nm约为0.8时，分别加入终浓度为0.1、0.5和1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），温度为16 ℃，发酵24 h；温度分别设置为12、16、24和32 ℃，180 r/min培养24 h；发酵时间设置为24、48 h。将培养好的菌液8000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀菌体使用PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎30 min，8000 r/min离心10 min，上清液为粗酶液，测定酶活力，酶活最高的一组设为相对酶活100%。
1.2.3 α-葡萄糖苷酶的纯化
根据AKTA蛋白纯化系统操作手册进行实验。将α-葡萄糖苷酶酶粗酶液用0.22 μm滤膜过滤，用AKTA蛋白纯化系统和His Trap HP层析柱纯化。用低浓度洗脱液（含20 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，pH7.4）冲洗3个柱体积，流速为1 mL/min，然后使用高浓度的洗脱液（含400 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，pH7.4）冲洗平衡层析柱。基线平衡后，将过滤的粗酶液样品上样至层析柱，用两种不同浓度的洗脱液洗脱，柱压小于0.45 MPa，洗脱的梯度为0~100%，使用2 mL的EP管收集洗脱液，依据洗脱峰选择对应的收集管，使用BCA蛋白检测试剂盒测定其蛋白含量，根据计算结果确定SDA-PAGE电泳上样量并进行分析。SDS-PAGE凝胶电泳采用5%浓缩胶和12%分离胶，电压80 V 30 min，120 V 45 min。
1.2.4 α-葡萄糖苷酶活力的测定
α-葡萄糖苷酶活性测定底物为对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）。取10 μL 20 mmol/L pNPG，加入50 μL酶液和140 μL 100 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）于最适温度保温20 min，立即加入600 μL 1 mol/L预冷的碳酸钠溶液中止反应并显色，用酶标仪测定405 nm处吸光值。空白对照用缓冲液代替酶液[20]。酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生1 μmol对硝基苯酚（pNP）的酶量为一个活力单位。
1.2.5 α-葡萄糖苷酶的性质分析
1.2.5.1 α-葡萄糖苷酶的最适催化底物
使用不同的催化底物（pNPG、麦芽三糖、麦芽糖，浓度为20 mmol/L）保温20 min后，分别测定酶活力，酶活最高的一组设为相对酶活100%。
1.2.5.2 α-葡萄糖苷酶的最适温度与热稳定性
在不同温度下（30、40、50、60、70、80 ℃）分别测定酶活力，底物为最适底物。将酶在不同温度（30、40、50 ℃）保温不同时间（0、20、40、60、100、120 min）后，检测残余酶活力，以酶活最高的一组为相对酶活100%。
1.2.5.3 α-葡萄糖苷酶的最适pH与pH稳定性
将缓冲液（pH4.0~9.0，终浓度为50 mmol/L）与底物混合，在最适温度下分别测定酶活力，乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0、5.0、6.0）、PBS缓冲液（pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）。
将酶液与不同pH、终浓度50 mmol/L缓冲液混合，40 ℃下，保温1 h检测残余酶活力。乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0、5.0、6.0）、PBS缓冲液（pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0），以酶活最高的一组为相对酶活100%。
1.2.6 α-葡萄糖苷酶转糖苷作用研究
1.2.6.1 α-葡萄糖苷酶转糖苷受体的筛选
以5%的麦芽糖为糖基供体，分别以5%的D-海藻糖、D-果糖、D-葡萄糖为糖基受体，加入相应体积（10 U/mL）的酶，在40 ℃、100 r/min摇床中反应10 h。将反应结束后的产物于沸水中加热5 min，使得α-葡萄糖苷酶失活，并使用离心机10000 r/min离心10 min，取上清约1 mL，使用1 mL的针管注射器吸取上清并通过0.22 μm滤膜过滤，使用薄层层析法和HPLC检测反应产物[24]。根据反应结果挑选D-果糖作进一步研究。转糖苷率计算：转糖苷率（%）=产物峰面积/总峰面积×100。
1.2.6.2 产物的测定
HPLC检测：分别称取相应葡萄糖、麦芽糖、潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖配制成5 mg/mL的标准溶液。5种单糖标品各取100 μL混合制成混合标准品。检测条件：仪器设备：离子色谱仪Thermo Fisher ICS5000，色谱柱：Dionex CarbopacTM PA200（3×150 mm），流动相：A为H2O，B为130 mmol/L NaOH，C为65 mmol/L NaOH和1025 mmol/L NaOAC；流速：0.3 mL/min；进样量25 µL；柱温30 ℃；检测器：电化学检测器[24]。
薄层层析检测：使用层析硅胶GF254薄板。标准品上样量2 μL，样品上样量 1 μL。展开剂：正丁醇:乙醇:水=5:3:2（v/v/v）。展开完毕后用吹风机吹干，喷显色剂于85 ℃烘箱内烘干10 min后观察结果[25]。
1.2.7 α-葡萄糖苷酶的转糖苷条件优化
1.2.7.1 反应时间对转糖苷作用的影响
以麦芽糖为糖基供体，以果糖为糖基受体，加入相应体积的酶，在最适条件下分别反应1、2、5、10、20、30 h。使用薄层层析法和HPLC检测转糖苷产物[24]。
1.2.7.2 糖基供体与受体浓度对转糖苷作用的影响
以5%、10%、15%、20%、25%、30%的麦芽糖为糖基供体，以5%、10%、15%、20%、25%、30%的果糖为糖基受体，加入相应体积的酶，在最适条件下反应10 h。使用薄层层析法和HPLC检测产物。
1.2.7.3 糖基供体与受体比例对转糖苷作用的影响
5%果糖与5%麦芽糖的比例分别为1:1、1:2、1:4、1:9，每份果糖与麦芽糖总用量为3 mL，加入相应体积的酶，在最适条件下反应10 h。使用薄层层析法和HPLC检测产物。
1.2.8 SWISS-MODEL建模
使用SWISS-MODEL（expasy.org）网站，输入α-葡萄糖苷酶序列完成建模。
1.3 数据处理
所有实验均设置三个平行样，数据统计采用Excel软件，制图采用Origin 2018，琼脂糖凝胶图和蛋白电泳图均使用Image Lab图像软件分析。
2. 结果与分析
2.1 HJ21目的基因PCR扩增及重组质粒构建
将重组质粒转化至E. coli DH5α感受态细胞中，从平板中挑取单菌落培养，提取质粒检测见图1，序列长度为6100 bp与构建质粒一致。将阳性克隆寄上海生工测序，序列与目的基因完全相同。将质粒转化至E.coli BL21感受态细胞后培养，用PCR验证目的基因结果见图2，泳道1和2上样量不同，条带位置与基因长度729 bp相符，表明克隆成功。
2.2 α-葡萄糖苷酶的表达
2.2.1 IPTG浓度对α-葡萄糖苷酶表达的影响
IPTG浓度对α-葡萄糖苷酶的表达影响如图3所示，当IPTG浓度在0.1~1 mmol/L范围内，均有酶活，在0.5 mmol/L时酶活最高，说明IPTG浓度过高或者过低都不利于酶的表达。当IPTG浓度较高时，可能会产生毒害作用，从而导致酶活降低[20]。
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2.2.2 诱导温度对α-葡萄糖苷酶表达的影响
诱导温度对α-葡萄糖苷酶的表达影响如图4所示，当诱导温度为12 ℃时酶活最高，随着温度升高酶活逐渐降低，表明该酶在低温下表达较好。
2.2.3 发酵时间对α-葡萄糖苷酶表达的影响
发酵时间对α-葡萄糖苷酶的表达影响如图5所示，诱导24 h的酶活明显高于48 h酶活，当诱导时间过长时，少量的酶可能被降解或失活，酶活降低[19]。因此，选取发酵时间为24 h。
2.3 α-葡萄糖苷酶的纯化
用AKTA蛋白纯化系统和His Trap HP层析柱进行亲和层析纯化α-葡萄糖苷酶。收集酶液后根据预测的等电点继续用离子柱纯化。收集活力峰附近洗脱液，并检测蛋白含量，结果如图6所示，第6、7管洗脱液蛋白含量较高。用12% SDS-PAGE凝胶垂直电泳检测粗酶液及第6、7管洗脱液，考马斯亮蓝染色液染色30 min，脱色12 h，结果见图7。当洗脱梯度为61.4%时洗脱效果最佳，得到单一条带，分子量约为27.2 kDa，与生物信息学分析结果一致，也显著小于现有报道的α-葡萄糖苷酶[8]。
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图 7 α-葡萄糖苷酶纯化后12% SDS-PAGE电泳图注：1：α-葡萄糖苷酶粗酶液；2：6号管洗脱液；3：7号管洗脱液。Figure 7. 12% SDS-PAGE of α-glucosidase after purification2.4 α-葡萄糖苷酶酶学性质
2.4.1 α-葡萄糖苷酶的底物特异性
如图8所示，α-葡萄糖苷酶最适催化底物为pNPG，用麦芽糖和麦芽三糖作为底物时，酶活显著降低（P<0.05），为相对酶活的35%左右，表明该酶水解麦芽糖和麦芽三糖的能力较弱。
2.4.2 α-葡萄糖苷酶的最适作用温度与热稳定性
如图9所示，α-葡萄糖苷酶最适催化温度为40 ℃，40 ℃后酶活急速下降，50 ℃时只有50%的酶活力，80 ℃时，酶活力不足30%。将α-葡萄糖苷酶在30、40 ℃保温2 h后，仍有近96%、100%的酶活，50 ℃保温20 min后则无酶活（图10）。与野生菌表达的酶相比[26]，最适温度由100 ℃下降至40 ℃。该酶基因是从深海液口古菌T. siculi HJ21提取的，然而，经过大肠杆菌重组表达后，其最适催化温度降低为40 ℃，导致其降低的原因有待进一步研究。
2.4.3 α-葡萄糖苷酶的最适pH与pH稳定性
如图11所示，α-葡萄糖苷酶最适催化pH为6.0，该酶对酸性环境很敏感，pH在5.0以下几乎没有酶活，而在碱性环境中依然保持良好的酶活力，pH为9.0时依然有70%的酶活力。在pH为6.0时，稳定性最高，在pH为6~8时能保持75%的酶活力。与野生菌表达的酶相比[26]，最适催化pH下降了1.0。
2.5 α-葡萄糖苷酶转糖苷作用研究
2.5.1 IMOs标准品的检测
如图12所示，葡萄糖的出峰时间为3.900 min，麦芽糖的出峰时间为4.267 min，异麦芽糖的出峰时间为4.417 min，潘糖的出峰时间为5.159 min，异麦芽三糖的出峰时间为6.309 min，以此检测α-葡萄糖苷酶转糖苷产物。
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图 12 标准品色谱图注：G：葡萄糖；Maltose：麦芽糖；IMO2：异麦芽糖；Panose：潘糖；IMO3：异麦芽三糖；图13同。Figure 12. Chromatogram of standard以麦芽糖为糖基供体，以D-果糖、D-葡萄糖、D-海藻糖为糖基受体时，根据薄层层析（TCL）检测结果，仅D-果糖表现出转糖苷活性。而D-葡萄糖和D-海藻糖不具有转糖苷活性，选取D-果糖进行下一步研究。
2.5.2 反应时间对转糖苷作用的影响
图13显示，以5%的麦芽糖为糖基供体，5%的果糖为糖基受体时，低聚糖的产量随着时间增加而增加。根据图13的检测结果，选取反应10、20和30 h产物进行HPLC检测并计算转糖苷率，结果见图14。当反应时间为10 h时，以果糖为受体的转糖苷率达到36.5%，随着时间的增加，转糖苷率有所下降。转糖苷反应以10 h为宜。
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图 13 果糖为受体的TCL结果注：M：标准品，1~6：反应1、2、5、10、20、30 h。Figure 13. TCL results of fructose as acceptor2.5.3 糖基供体和受体浓度对转糖苷作用的影响
由图15可知，转糖苷率随着供体和受体浓度的增加而逐渐降低，浓度为5%转糖苷率最高，达到36.5%。当浓度达到30%时，其转苷效率仅有14.8%，这与加酶量有关，当加酶量较少时，转苷反应的效率降低，转糖苷率也降低[24]。
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图 15 麦芽糖和果糖浓度对转糖苷率的影响Figure 15. Effect of maltose and fructose concentrations on trans glycoside rate2.5.4 麦芽糖和果糖比例对转糖苷作用的影响
由表2可知，当果糖和麦芽糖的比例为1:9时，产物主要为潘糖，转糖苷率最高，可以达到79.1%。
表 2 不同比例的麦芽糖和果糖的转糖苷作用Table 2. Transglycosylation of different ratios of maltose and fructose果糖:麦芽糖 潘糖
（mg/L）麦芽糖
（mg/L）葡萄糖
（mg/L）转糖苷率
（%）1:1 1549.2±77.32 0 2261.2±58.35 36.5±3.31d 1:2 1857.5±81.53 0 1109.8±54.26 52.4±1.16c 1:4 3007.2±78.34 0 1231.4±37.51 66.6±1.54b 1:9 5816.1±94.89 0 1223.8±29.87 79.1±2.01a 3. 讨论
本研究的α-葡萄糖苷酶来自深海热液口的超嗜热古菌（T. siculi HJ21），野生菌产的酶最适作用温度为100 ℃，然而，在E. coli BL21克隆表达后的最适作用温度仅为40 ℃。根据SWISS-MODEL建模可知，该酶的三维结构模型呈现弯曲线型，两个结构域仅由甘氨酸和谷氨酸相连（图16箭头处），可能是影响其热稳定性的原因之一。
表达后该酶依然具有其催化活性。推测其稳定性下降的原因还有：一是古菌的基因在细菌表达导致的翻译和折叠差异；二是伴侣蛋白的缺失，伴侣蛋白对蛋白质的正确折叠有着重要作用[27−29]。胡迪[30]通过克隆一种分子伴侣基因EmClpK，构建了原核表达载体pET（EmClpK），发现EmClpK过表达时甚至提高了重组大肠杆菌的耐热性。Zavilgelsk等[31]研究发现ATP依赖性分子伴侣ClpA和ClpB可以显著提高细菌细胞中荧光素酶的热稳定性。最后，氨基酸修饰也是影响热稳定性的重要因素。钮成拓[32]研究发现对β-葡聚糖酶表面赖氨酸进行化学修饰，发现赖氨酸ε-氨基基团的修饰可提高酶热稳定性。李同彪等[33]通过引入芳香族氨基酸残基（P9Y、H14F）构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34，并成功使其最适温度提升了8 ℃。
本研究中α-葡萄糖苷酶的最适催化pH为6.0，并且在pH6.0~9.0都拥有非常好的稳定性。该酶具有良好的转糖苷性能，在以果糖为受体时，其潘糖的生成量可以达到79%以上。王月宏[19]利用麦芽糖做底物，可以获得52%的低聚异麦芽糖，其主要产物有异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，其中潘糖含量仅为16%。马梅[34]研究的重组α-葡萄糖苷酶214233-GS115在最适条件下葡萄糖浓度为91.44 mg/mL，异麦芽糖浓度为58.15 mg/mL，潘糖浓度为88.60 mg/L，转苷率为48.92%。综上，本研究的α-葡萄糖苷酶转糖苷率高，产物主要为潘糖，据现有文献报道，79%的潘糖的生成量是最高的。该酶在制备高纯度潘糖方面具有应用潜力。
4. 结论
选用E.coli BL21克隆表达了海洋古菌T. siculi HJ21 α-葡萄糖苷酶，该基因为729 bp，编码242个氨基酸。在0.5 mmol/L IPTG，12 ℃诱导24 h条件下产酶最高。经AKTA蛋白纯化系统和His Trap HP层析柱纯化得到分子量约为27.2 kDa。该酶最适底物为pNPG，最适作用温度和pH分别为40 ℃和6.0，热稳定性和pH稳定性好。该酶的转糖苷活性高，在以果糖为受体，与麦芽糖的比例为1:9，反应10 h时，其潘糖的生成量最高可以达到79.1%，产物中潘糖的纯度高。该酶具有制备高纯度潘糖的应用前景。
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图 7 α-葡萄糖苷酶纯化后12% SDS-PAGE电泳图
注：1：α-葡萄糖苷酶粗酶液；2：6号管洗脱液；3：7号管洗脱液。
Figure 7. 12% SDS-PAGE of α-glucosidase after purification
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图 12 标准品色谱图
注：G：葡萄糖；Maltose：麦芽糖；IMO2：异麦芽糖；Panose：潘糖；IMO3：异麦芽三糖；图13同。
Figure 12. Chromatogram of standard
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图 13 果糖为受体的TCL结果
注：M：标准品，1~6：反应1、2、5、10、20、30 h。
Figure 13. TCL results of fructose as acceptor
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图 15 麦芽糖和果糖浓度对转糖苷率的影响
Figure 15. Effect of maltose and fructose concentrations on trans glycoside rate
表 1 T. siculi HJ21来源α-葡萄糖苷酶引物设计
Table 1 Primer design of α-glucosidase of T. siculi HJ21
引物名称 引物序列 HJ21-F 5’-GGAATTCCATATGATGAAAAGCGC
AGAGATTCTGCGAGACGTCGC-3’HJ21-R 5’-ACGCGTCGACAAGGAATGCGT
GCCTGTGCTTGTAGAGTGTAT-3’
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表 2 不同比例的麦芽糖和果糖的转糖苷作用
Table 2 Transglycosylation of different ratios of maltose and fructose
果糖:麦芽糖 潘糖
（mg/L）麦芽糖
（mg/L）葡萄糖
（mg/L）转糖苷率
（%）1:1 1549.2±77.32 0 2261.2±58.35 36.5±3.31d 1:2 1857.5±81.53 0 1109.8±54.26 52.4±1.16c 1:4 3007.2±78.34 0 1231.4±37.51 66.6±1.54b 1:9 5816.1±94.89 0 1223.8±29.87 79.1±2.01a
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