Optimization of Extraction Process, Composition and Antioxidant Activity Analysis of Conjugated Phenols from the By-product Residue of Pueraria thomsonii
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摘要: 为提高粉葛加工副产物的综合利用价值，对两种常见副产物粉葛皮及粉葛渣中结合态酚类物质的提取工艺进行优化，采用红外光谱法及扫描电镜，对比提取前后粉葛加工副产物微观结构的变化，采用液质联用技术对结合态酚类物质的组分构成进行表征，并对两种副产物残渣的抗氧化活性进行测定。结果表明，副产物粉葛渣中结合态酚类物质最优提取条件为液料比30:1 mL/g、NaOH溶液水解时间4 h、NaOH溶液浓度3 mol/L，该条件下结合态酚类物质的得率为2.54±0.070 mg/g；副产物粉葛皮中结合态酚类物质最优提取条件为液料比40:1 mL/g，NaOH溶液水解时间5 h，NaOH溶液浓度3 mol/L，该条件下结合态酚类物质得率为5.087±0.155 mg/g。碱水解破坏了粉葛加工副产物中酚类物质与纤维素之间的酯键，整体纤维结构破损，有效促进了结合态酚类物质的释放。副产物粉葛渣及粉葛皮中的结合态酚类物质组成存在较大的差异，粉葛皮中的结合态酚类物质以酚酸类、黄酮类成分为主，而粉葛渣中结合态酚类物质则主要以黄酮类成分为主。粉葛皮及粉葛渣结合态酚类物质均具有较强的抗氧化活性，且粉葛皮中结合态酚类物质抗氧化能力优于粉葛渣。综上，粉葛加工副产物残渣中含有丰富的结合态酚类物质，且抗氧化活性显著，具有较好的开发利用价值。Abstract: To improve the comprehensive utilization value of the by-product residue of Pueraria thomsonii (kudzu), the extraction of conjugated phenolics from two common by-product residues (kudzu peel and kudzu dregs) was optimized. Infrared spectroscopy and scanning electron microscopy were used to compare the microstructure of the by-products of kudzu before and after extraction. The composition of the conjugated phenolics was characterized by LC-MS and the antioxidant activity of the two by-product residues was determined. The results showed that the optimal extraction conditions for the conjugated phenolics in the by-product kudzu dregs were as follows: Liquid to material ratio of 30:1 mL/g, hydrolysis time of NaOH solution of 4 h, and concentration of NaOH solution of 3 mol/L, and the yield of conjugated phenolics under these conditions was 2.54±0.070 mg/g. Accordingly, the optimal extraction conditions for conjugated phenolics in the by-product kudzu bark were 40:1 mL/g liquid/feed ratio, 5 h hydrolysis time in NaOH solution, and 3 mol/L concentration of NaOH solution, and the yield of conjugated phenolics under these conditions was 5.087±0.155 mg/g. The ester bond between phenolics and cellulose in the by-products, and the overall fiber structure was broken, which effectively facilitated the release of conjugated phenolics. The composition and content of conjugated phenolics in the two by-product residues differed greatly, with phenolic acids and flavonoids dominating the conjugated phenolics in kudzu peel, while flavonoids dominated the conjugated phenolics in kudzu dregs. The conjugated phenolics in both kudzu peel and kudzu dregs had strong antioxidant activity, and the antioxidant capacity of conjugated phenolics in kudzu peel was found better than that of kudzu dregs. In conclusion, the by-product residues of kudzu are rich in conjugated phenolics and have significant antioxidant activity, which is of good value for development and utilization.
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粉葛（Pueraria thomsonii Benth）为豆科葛属植物甘葛藤的干燥根，富含多种营养物质及活性成分[1]，民间食用历史悠久[2]。粉葛收获后，经清洗、削皮、破碎、打浆、滤渣、沉淀等工艺后，制得葛粉。葛粉作为优质植物淀粉，是目前市场上接受度最高、市场规模最大的粉葛产品[3]。加工副产物粉葛皮及粉葛渣，富含纤维素、异黄酮、结合态多酚等活性成分[4]。但通常作为废弃物填埋或焚烧，利用价值低且易造成环境污染[5]。其中结合态多酚指多酚通过酯键、糖苷键、醚键等化学键与植物中的纤维素、蛋白质、多糖、脂质等结合的一类物质，具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、降低血糖血脂及保护肝脏等多种生物活性[6−9]，在抑制癌细胞、食品抗氧化、功能食品开发等领域有巨大研究价值。目前鲜见对粉葛废弃物中结合态酚类物质的研究报道。为进一步提高粉葛废弃物的资源利用度和相关产品的开发，本研究对两种常见副产物粉葛皮及粉葛渣中结合态酚类物质的提取工艺进行优化，采用液质联用技术对结合态酚类物质的组分构成进行表征，并对两种副产物残渣的抗氧化活性进行测定，为粉葛加工副产物的综合利用提供理论依据和技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
粉葛加工副产物 取自江西中横葛业大健康产业有限公司，为‘赣葛2号’粉葛提取完葛粉后的加工副产物，分别收集粉葛皮和粉葛渣，冻干后备用；正己烷、甲醇 分析纯，西陇科学股份有限公司；NaOH溶液、碳酸纳、过硫酸钾 分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；盐酸 分析纯，成都市科隆化学品有限公司；没食子酸、福林-酚试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、Trolox 分析纯，北京索莱宝科技有限公司；铁离子还原能力试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司
SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；YGC-12干式氮吹仪 成都雅源科技有限公司；HJ-10数显恒温磁力水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；TOX-100AH超声波清洗机 山东新华医疗器械股份有限公司；NACHTC-15R高速冷冻离心机 杰懋万得福（中山）生物科技有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；AKSW-V-1G实验室超纯水机 成都唐氏康宁科技发展有限公司；IKA RV 10 control V-C auto自动型旋转蒸发仪 艾卡（广州）仪器设备有限公司；Spectrum 3傅里叶变换红外光谱仪 美国Perkin Elmer； Multiskan FC酶标仪 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；AB TRIPLE QUDA 5500液质联用仪 AB SCIEX美国。
1.2 实验方法
1.2.1 粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质的提取
1.2.1.1 脂肪及游离态酚类物质的去除
取冻干后的粉葛皮及粉葛渣，分别加正己烷浸没，于超声波清洗机中超声30 min，随后倾去上清液，加入80%甲醇（含0.1%HCl）浸没。超声提取30 min后离心，去除上清液，将残渣按照同样的方法重复提取5次，直至上清液用福林酚法检测不含酚类物质。收集残渣，分别冷冻干燥后备用。
1.2.1.2 结合态酚类物质的提取
分别称取1 g除去游离态酚类物质的粉葛皮及粉葛渣，置于带搅拌子的三角瓶，加入不同浓度NaOH溶液，充入氮气后橡胶塞密封，50 ℃恒温水浴消化，磁力搅拌至不同时间，待结束后将所得水解液冷却，用浓盐酸调节pH至7.0，离心，取上清液，分别得粉葛皮及粉葛渣结合态酚类物质提取液。
1.2.2 粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质提取工艺优化
1.2.2.1 单因素实验
以NaOH溶液为提取试剂，固定料液比1:30 g/mL、提取时间1 h，分别考察提取试剂浓度（1、2、3、4、5 mol/L）对提取液中结合态酚类物质得率的影响。随后固定氢氧化钠浓度4 mol/L、提取时间1 h，分别考察料液比（1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL）对提取液中结合态酚类物质得率的影响。最后固定氢氧化钠浓度4 mol/L、粉葛渣料液比1:30 g/mL，粉葛皮料液比1:35 g/mL，分别考察提取时间（1、2、3、4、5 h）对提取液中结合态酚类物质得率的影响。
1.2.2.2 正交试验设计
参考单因素实验结果，设计以提取试剂浓度、料液比、提取时间为考察因素的正交试验，分别优化粉葛渣、粉葛皮中结合态酚类物质得提取工艺，正交试验因素水平表见表1、表2。
表 1 粉葛渣结合态酚类物质得提取工艺正交试验因素水平设计Table 1. Orthogonal test factor level design of extraction of conjugated phenolics from kudzu dregs水平 因素 NaOH溶液浓度（mol/L） 料液比（g/mL） 提取时间（h） 1 3 1:25 3 2 4 1:30 4 3 5 1:35 5 表 2 粉葛皮结合态酚类物质得提取工艺正交试验因素水平设计Table 2. Orthogonal test factor level design of extraction of conjugated phenolics from kudzu peel水平 因素 NaOH溶液浓度（mol/L） 料液比（g/mL） 提取时间（h） 1 3 1:30 3 2 4 1:35 4 3 5 1:40 5 1.2.3 结合态酚类物质含量的测定
1.2.3.1 标准曲线的绘制
根据王振宇[10]的方法略作修改，没食子酸120 ℃烘干至恒重，配制成20、40、60、80、100、120、140 μg/mL的系列标准溶液，分别吸取500 μL标准液加入500 μL福林酚试剂（1 mol/L），静置6 min后加入5 mL 7%的Na2CO3溶液，随后加入超纯水10 mL，室温下静置90 min，于760 nm下测定吸光度，根据吸光度和浓度绘制出标准曲线。y表示吸光度值；x表示没食子酸浓度（mg/mL），得回归方程y=0.003x+0.02，R2=0.9987。
1.2.3.2 粉葛渣和粉葛皮中结合态酚类物质含量的测定
分别取粉葛皮及粉葛渣结合态酚类物质提取液，依次加入500 μL福林酚试剂，静置6 min后加入5 mL 7%的Na2CO3溶液，随后加入去纯水10 mL，室温下静置90 min，于760 nm下测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算提取液中总酚的含量，并按下式计算粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质得率。
结合态酚类物质得率(mg/g)=C×V×N1000×m 式中：C为没食子酸溶液质量浓度（μg/mL）；V为溶液体积（mL）；N为稀释倍数；m为样品残渣质量（g）。
1.2.4 粉葛加工副产物残渣提取结合态酚类物质前后红外光谱表征
分别取提取结合态酚类物质前后的粉葛皮、粉葛渣样品1 mg与KBr粉末按1:100混合，研磨压片，扫描400~4000 cm−1红外光谱，采集分辨率为4 cm−1，扫描次数16次。
1.2.5 粉葛加工副产物残渣提取结合态酚类物质前后微观结构表征
分别将提取结合态酚类物质前后的粉葛皮、粉葛渣样品固定在导电胶上，在电压为15 kV条件下喷金抽真空，扫描电镜（SEM）放大2500倍观察样品的形态特征。
1.2.6 粉葛加工副产物残渣提取结合态酚类物质的定性分析
提取液纯化：使用SPE萃取小柱（Oasis HLB 1cc Vac Cartridge）去除多糖、蛋白质及无机盐，SPE柱先用甲醇和纯水平衡，随后上样，加入5%甲醇水溶液除去杂质，然后使用甲醇洗脱，所得洗脱液旋蒸至干后加纯水复溶，冻干得结合态酚类物质冻干粉，用于组分测定及抗氧化分析。采用AB TRIPLE QUDA 5500液质联用仪，分别对粉葛皮及粉葛渣中结合态酚类物质进行定性分析。
色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃，进样量10 μL。以0.1%的甲酸溶液（A）和乙腈（B）为洗脱溶剂；洗脱程序为：0～1 min，95%A，5%B；1～30 min，95%～0%A，5%～100%B；30～32 min，0%A，100% B；32～35 min，5%A，95%B。
质谱条件：电喷雾离子源；在负离子模式下对不同部位粉葛残渣中的化合物进行数据采集。质谱分子质量扫描范围为100～1500 Da。参数设定为：喷雾电压3.5 kV；鞘气（N2）流速35 psi，辅助气（N2）流速10 psi；毛细管温度320 ℃，离子源温度为300 ℃。
1.2.7 结合态酚类物质抗氧化活性测定
1.2.7.1 DPPH·清除率的测定
参考Dżugan等[11]的方法进行调整，以不同质量浓度（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL）Trolox为阳性对照，Trolox和DPPH以80%甲醇水溶液溶解，冻干后的粉葛皮及粉葛渣结合态酚类物质样品以80%甲醇水溶液配制成0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL溶液。在96孔板上依次将200 μL DPPH溶液（0.1 mmol/L）和10 μL不同浓度Trolox溶液或样品溶液混合，于室温避光反应30 min，用酶标仪在510 nm处测定吸光度。平行测定3次。并按公式计算DPPH·清除率。
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A0为甲醇加DPPH-甲醇的吸光度，A1为样品溶液加DPPH-甲醇的吸光度，A2为样品溶液加甲醇的吸光度。
1.2.7.2 ABTS+·清除率的测定
参考Puyou等[12]的方法优化为：0.2 mL浓度为7.4 mmol/L的ABTS溶液和0.2 mL浓度为2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液，混合反应12 h得ABTS工作液母液，稀释母液至734 nm处的吸光值为0.70±0.05，此稀释液为工作液。向96孔板中依次加入200 μL的ABTS工作液和10 μL不同浓度Trolox标准品溶液或样品溶液，37 ℃避光反应15 min后于734 nm下用酶标仪测定其光度。Trolox溶液的质量浓度为0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL，样品的质量浓度为0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL，平行测定3次。并按公式计算ABTS+·清除率。
ABTS+自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 式中：A0为超纯水加ABTS溶液的吸光度，A1为样品溶液加ABTS溶液的吸光度，A2为样品溶液加超纯水的吸光度。
1.2.7.3 FRAP抗氧化活性的测定
取FeSO4·7 H2O用超纯水配制成浓度为100 mmol/L溶液，稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。在96孔板中加入180 μL FRAP工作液，随后空白对组加入5 μL纯水；标准曲线组加入5 μL不同浓度的FeSO4标准液；样品组加入5 μL各样品或不同浓度的Trolox作为阳性对照，轻轻混匀后在37 ℃培养3~5 min后于595 nm测定吸光值。Trolox溶液和样品的质量浓度均设置为0.25、1、2、4、6、10 mg/mL，每个样品平行测定3次。
FeSO4标准曲线：以0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μmol/L的FeSO4标准溶液代替样品绘制标准曲线，得到标准曲线方程y=0.034x+0.083，R2=0.9875。以1 μmol/L的FeSO4吸光度为1个FRAP值，即样品FRAP为样品吸光度与1 μmol/L FeSO4标准溶液吸光度的比值。清除率百分比：定义最高FRAP值为100%，各数值与之的比值即为FRAP清除百分率。
1.3 数据处理
所有数据以平均值±标准差（n=3）表示。采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计分析，Origin 2018软件作图，并采用SPSS 23.0进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 提取试剂浓度对结合态酚类物质提取效率的影响
提取剂NaOH溶液浓度对粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质提取效率的影响如图1所示。随着NaOH溶液浓度的增加，副产物粉葛皮中结合态酚类物质的得率逐渐升高并趋于平稳，当浓度为3、4、5 mol/L时与其他浓度相比具有显著差异（P<0.05）。副产物粉葛渣中结合态酚类物质随着NaOH溶液浓度的增加，得率表现为先升高后略微下降，浓度为3、4、5 mol/L时与其他各浓度相比具有明显差异。这可能是由于粉葛中酚类物质多与多糖、蛋白质等物质共价结合，适当增加NaOH溶液浓度可破坏醚键、酯键和C=C双键等共价结合键，使结合态酚类物质释放便于提取[13]。这可能与解离出来的酚类物质在强碱性条件下容易发生电离有关[14]。副产物粉葛皮与粉葛渣相比，粉葛皮中结合态酚类物质的含量相对更高。这是由于植物生长过程中，结合态酚类物质可使植物有效应对生长过程中所受的外界胁迫，而作为保护组织的外皮需要应对更多的机械损伤、昆虫侵袭、紫外辐射等[14]，因此，粉葛皮中结合态酚类物质的含量相对更高。
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2.1.2 料液比对结合态酚类物质提取效率的影响
料液比对粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质提取效率的影响如图2所示。随着提取溶剂用量的增加，副产物粉葛渣中结合态酚类物质的得率显著增加（P<0.05），当料液比为1:30 g/mL时，副产物粉葛渣中结合态酚类物质的得率达2.436±0.042 mg/g，与1:20、1:25 g/mL具有显著差异（P<0.05），表明提高提取剂用量，可使得更多的结合键暴露在溶剂中[15]，利于结合态酚类物质的提取；继续增加提取溶剂用量，副产物粉葛渣中结合态酚类物质的得率有所下降，这可能是当料液比到达一定程度时，酚类基本溶出，继续增加料液比意义不大，反而会导致后续中和等操作时间增加，酚类物质被氧化[16]。料液比对副产物粉葛皮中结合态酚类物质提取效率的影响与之类似，当料液比为1:35 g/mL时，副产物粉葛皮中结合态酚类物质的得率达3.615±0.273 mg/g。继续增加提取溶剂用量后，得率变化不显著（P>0.05）。
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图 2 不同料液比对结合态酚类物质得率的影响Figure 2. Effect of different ratio of material to liquid on the yield of conjugated phenolics substances2.1.3 提取时间对结合态酚类物质提取效率的影响
提取时间对粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质提取效率的影响如图3所示。增加提取时间有助于粉葛渣中结合态酚类物质的提取，当提取时间4 h时，得率为2.649±0.144 mg/g，但与其他提取时间相比，无显著差异（P>0.05）。而适度延长提取时间对副产物粉葛皮中结合态酚类物质的得率具有显著影响，与1 h相比3、4 h得率均显著提升（P<0.05）。继续延长提取时间，副产物粉葛皮中结合态酚类物质的得率有所下降，可能与NaOH溶液长时间的提取，使得蛋白、多糖等物质在溶剂中不断溶出，阻碍结合酚的提取有关[16]。
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图 3 不同提取时间对结合态酚类物质得率的影响Figure 3. Effect of different extraction time on the yield of conjugated phenolics substances综上，选取料液比1:30 g/mL、提取时间4 h、提取剂浓度4 mol/L NaOH为副产物粉葛渣中结合态酚类物质提取单因素的最适值；选取料液比1:35 g/mL，提取时间4 h、提取剂浓度4 mol/L NaOH为副产物粉葛皮中结合态酚类物质提取单因素的最适值，开展提取工艺优化。
2.2 正交试验结果
在单因素实验基础上，采用正交L9（34）设计法，分别粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质提取工艺进行优化，实验设计及结果见表3及表4。
表 3 粉葛渣提取工艺正交试验设计及结果Table 3. Orthogonal experiment design and results of extraction technology of kudzu dregs试验号 A NaOH溶液浓度 B 料液比 C 提取时间 结合酚得率（mg/g） 1 1（3 mol/L） 1（1:25 g/mL） 1（3 h） 2.242±0.069 2 1 2（1:30 g/mL） 2（4 h） 2.540±0.106 3 1 3（1:35 g/mL） 3（5 h） 2.438±0.175 4 2（4 mol/L） 1 2 2.150±0.224 5 2 2 3 2.340±0.095 6 2 3 1 2.298±0.231 7 3（5 mol/L） 1 3 1.867±0.172 8 3 2 1 2.400±0.176 9 3 3 2 2.287±0.315 K1 2.407 2.086 2.313 K2 2.263 2.427 2.326 K3 2.184 2.341 2.215 R 0.222 0.341 0.111 表 4 粉葛皮提取工艺正交试验设计及结果Table 4. Orthogonal experiment design and results of extraction technology of kudzu peel试验号 A NaOH溶液浓度 B 料液比 C 提取时间 结合酚得率（mg/g） 1 1（3 mol/L） 1（1:30 g/mL） 1（3 h） 4.153±0.045 2 1 2（1:35 g/mL） 2（4 h） 4.923±0.099 3 1 3（1:40 g/mL） 3（5 h） 5.087±0.155 4 2（4 mol/L） 1 2 4.130±0.288 5 2 2 3 5.100±0.282 6 2 3 1 4.823±0.152 7 3（5 mol/L） 1 3 4.287±0.370 8 3 2 1 4.160±0.227 9 3 3 2 4.757±0.321 K1 4.720 4.170 4.378 K2 4.685 4.727 4.603 K3 4.380 4.888 4.804 R 0.340 0.718 0.427 由表3可知，NaOH溶液浓度、料液比、提取时间3个因素的极差大小顺序为RB>RA>RC，即提取料液比是影响副产物粉葛渣中结合态酚类物质的主要因素。粉葛渣最优提取条件组合为A1B2C2，即NaOH溶液浓度为3 mol/L，料液比为1:30 g/mL，提取时间为4 h，在此条件下结合酚得率达2.54±0.07 mg/g。由表4可知，对于副产物粉葛皮中结合态酚类物质提取的影响因素，NaOH溶液浓度、料液比、提取时间3个因素的极差大小顺序为RB>RC>RA，即料液比是影响副产物粉葛皮中结合态酚类物质的主要因素。粉葛皮最优提取条件组合为A1B3C3，即NaOH溶液浓度为3 mol/L，料液比为1:40 g/mL，提取时间为5 h，在此条件下结合酚得率达5.087±0.155 mg/g。李雪峰[17]使用大孔树脂吸附法分离粉葛总多酚，经优化后总酚得率为2.623 mg/g，与本实验中粉葛渣中结合态酚类物质得率相当。
2.3 粉葛加工副产物残渣提取结合态酚类物质前后红外光谱特征
粉葛加工副产物粉葛渣、粉葛皮提取结合态酚类物质前后的红外光谱特征相似。如图4所示，在3412 cm−1均出现宽而强的特征峰，是由O-H基团的伸缩振动引起的[18]，2920 cm−1处为C-H的伸缩振动峰，1400 cm−1范围内的吸收峰是由纤维素葡萄糖单元H-C-H弯曲和伸缩振动引起的，为碳水化合物骨架的典型结构[19]。1622 cm−1附近的吸收峰是C=O的伸缩振动吸，1157 cm−1是半纤维素和纤维素C-O-C基团的特征峰[20]。粉葛渣、粉葛皮提取结合态酚类物质前后，峰形无明显变化，表明提取结合态酚类物质前后粉葛渣及粉葛皮均未出现明显的官能团变化，这与文献[21−22]的研究结果一致。粉葛渣及粉葛皮经碱提取结合态酚类物质后，1738 cm−1处吸收峰消失，该处吸收峰由酯基中C=O伸缩振动引起，表明粉葛渣及粉葛皮中酚类物质与纤维之间的酯键遭到破坏[23]，结合态酚类物质水解释放出来。
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图 4 粉葛加工副产物残渣消化前后的红外光谱图注：A.NaOH溶液消化后的粉葛皮；B.粉葛皮；C.NaOH溶液消化后的粉葛渣；D.粉葛渣。Figure 4. Infrared spectrogram of kudzu by-product residue before and after digestion2.4 粉葛加工副产物残渣提取结合态酚类物质前后微观结构的变化
粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮提取结合态酚类物质前后的微观结构如图5所示。副产物粉葛渣及粉葛皮主要由纤维构成，纤维表面整齐排列着小孔，条理清晰，整体结构完整，可见部分淀粉颗粒或其他物质吸附、包埋于些小孔中。提取结合态酚类物质后，粉葛渣及粉葛皮微观结构变化明显，表现为整体纤维结构破损，表面空洞增加，淀粉颗粒及其他物质从小孔释放，表明碱水解可破坏粉葛纤维结构，有效释放包埋于孔洞内的酚类物质。
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图 5 粉葛加工副产物残渣消化前后的扫描电镜图注：A. 粉葛皮；B. NaOH溶液消化后的粉葛皮；C. 粉葛渣；D. NaOH溶液消化后的粉葛渣。Figure 5. Scanning electron microscope image of by-product residue of kudzu residue before and after digestion2.5 粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质的组成鉴定
粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮提取结合态酚类物质质谱总离子流见图6。结合精确质量数、分子式及碎片离子峰信息，推测了主要色谱峰所对应的酚类物质。保留时间、质谱信息、推测的分子式、化合物及其碎片离子归属等见表5。
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图 6 粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质负离子模式总离子流Figure 6. Negative ion mode total ion flow of conjugated phenolics in by-product residue of kudzu processing由表5可知，粉葛加工副产物残渣中共鉴定出17个主要组分，其中黄酮类化合物7个，酚酸类化合物5个，有机酸类化合物3个，皂苷类化合物1个，其他化合物1个。副产物粉葛皮中检出14种主要化合物，副产物粉葛渣中检出9种主要化合物。结果表明粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮中的结合态酚类物质组成存在较大的差异，副产物粉葛皮中的结合态酚类物质以酚酸类、黄酮类成分为主，而粉葛渣中结合态酚类物质则主要以黄酮类成分为主。有研究表明，粉葛中游离态酚类物质主要为葛根素、大豆苷元、染料木素和鸢尾黄素[24]，与结合态酚类物质组成有一定的差异。副产物粉葛皮及粉葛渣中均含有一定量的对羟基苯甲酸、3'-甲氧基大豆苷元、6,2-二羟基黄酮、α亚麻酸和大豆皂苷I，组分的差异往往会导致功能作用的差异，探究粉葛加工副产物粉葛皮及粉葛渣的组分差异，可为粉葛加工副产物残渣的开发利用提供理论依据。
表 5 不同部位粉葛残渣中结合酚组分分析Table 5. Analysis of conjugated phenolics in different parts of kudzu residue编号 保留时间
（min）分子式 理论分子量
（m/z）精确分子量
（m/z）误差
（ppm）碎片离子（m/z） 化合物 粉葛皮 粉葛渣 类别 1 1.05 C21H22O11 449.1089 449.1083 −1.34 135.05, 151.00, 287.06 圣草酚 + − 黄酮 2 1.62 C13H16O9 315.0722 315.0729 2.22 109.15, 153.18 龙胆异酰葡糖苷 + − 酚酸 3 1.62 C13H16O9 315.0722 315.0731 2.86 153.02, 108.02 二羟基苯甲酸己糖 + − 其他 4 2.55 C7H6O4 153.0193 153.0199 3.92 109.04 甲氧基水杨酸 + − 酚酸 5 3.71 C7H6O3 137.0244 137.0245 0.73 105.05, 121.03, 138.02,
93.05, 119.09对羟基苯甲酸 + + 酚酸 6 3.71 C7H6O3 137.0244 137.0246 1.46 65.10, 93.05 水杨酸 − + 酚酸 7 5.88 C18H16O5 311.0925 311.0924 −0.32 187.05, 205.07 6-乙酰基-2'-甲氧基
黄烷酮+ − 黄酮 8 6.45 C15H10O4 253.0506 253.0508 0.79 169.09, 223.02 6,2-二羟基黄酮 + + 黄酮 9 6.93 C16H12O5 283.0612 283.0613 0.35 201.14, 240.11 3'-甲氧基大豆苷元 + + 黄酮 10 6.97 C11H12O5 223.0612 223.0618 2.69 112.99, 223.06 芥子酸 + − 酚酸 11 8.69 C16H12O7 315.0510 315.0510 0.00 153.02, 217.07 异鼠李素 − + 黄酮 12 8.73 C9H16O4 187.0976 187.0982 3.21 123.01, 125.10, 169.09 壬二酸 + − 有机酸 13 9.26 C15H12O5 271.0612 271.0617 1.84 161.04, 109.04 柚皮素查耳酮 + − 黄酮 14 9.64 C15H10O4 253.0506 253.0505 −0.40 137.03, 199.12 大豆苷元 − + 黄酮 15 13.09 C18H30O3 293.2122 293.2125 1.02 207.93, 177.04, 221.20,
236.15, 275.199（S）-HOTrE + + 有机酸 16 14.47 C18H30O2 277.2173 277.2174 0.36 233.16, 259.14, 121.05 α亚麻酸 + + 有机酸 17 15.06 C48H78O18 941.5115 941.5135 2.12 163.04, 635.36, 519.24, 597.48 大豆皂甙I + + 其他 注：“−”代表未检测到该成分；“+”代表检测到该成分。 2.6 副产物粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质的抗氧化活性
2.6.1 DPPH·清除率
DPPH·清除率常用于评估抗氧化物质的抗氧化活性[25]。由图7可知，随着结合态酚类物质质量浓度的升高，粉葛渣、粉葛皮结合态酚类物质的DPPH·清除率总体呈上升趋势，表明总酚含量与抗氧化活性相关，与Shin等[26]研究结果一致。表明粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质均具有较强的DPPH·清除能力。DPPH·清除率IC50值详见表6，由低到高依次为Trolox 0.26 mg/ mL、粉葛皮结合态酚类物质0.46 mg/mL、粉葛渣结合态酚类物质0.94 mg/mL。粉葛皮结合态酚类物质总体清除率高于粉葛渣结合态酚类物质，且粉葛皮结合态酚类物质的DPPH·清除率在4 mg/mL时与阳性对照Trolox接近，达到了90%以上。
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图 7 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质对DPPH·的清除作用Figure 7. Scavenging of DPPH· by binding phenolic substances in kudzu peel and kudzu dregs表 6 不同样品抗氧化活性的IC50值Table 6. IC50 values of antioxidant activity of different samples样品名称 IC50值（mg/mL） DPPH·清除率 ABTS+·清除率 铁离子还原能力 Trolox 0.26 0.11 1.53 粉葛皮结合态酚类 0.46 0.83 6.44 粉葛渣结合态酚类 0.94 0.99 11.54 2.6.2 ABTS+·清除率
ABTS+·清除率是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法[27]。如图8所示，副产物粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质均有较强的ABTS+·清除能力，且结合态酚类物质的浓度越高，ABTS+·清除能力越强。ABTS+·清除率IC50值由低到高依次为Trolox 0.11 mg/mL、粉葛皮结合态酚类物质0.83 mg/mL、粉葛渣结合态酚类物质0.99 mg/mL。在质量浓度为4 mg/mL时，粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质的ABTS+·清除率均达到80%以上，与阳性对照Trolox相当。粉葛渣与粉葛皮中结合态酚类物质的组分具有较大的差异，其ABTS+·清除能力也有明显的差异，粉葛皮中结合态酚类物质的ABTS+·清除能力相对更强。
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图 8 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质对ABTS+·的清除作用Figure 8. Scavenging of ABTS+· by binding phenolic substances in kudzu peel and kudzu dregs2.6.3 铁离子还原能力
铁离子还原能力通常用于反映物质的总抗氧化能力，广泛运用于食品与保健品的抗氧化能力分析[28]。如图9所示，在低浓度范围内（0~4 mg/mL）Trolox、粉葛皮结合态酚类物质、粉葛渣结合态酚类物质的总抗氧化能力存在明显的剂量效应关系，随着质量浓度的升高，抗氧化能力逐渐增强。铁离子还原率IC50值由低到高依次为Trolox 1.53 mg/mL、粉葛皮结合态酚类物质6.44 mg/mL、粉葛渣结合态酚类物质11.54 mg/mL。由此可见，粉葛皮结合态酚类物质的抗氧化活性更强，但与阳性对照Trolox相比相对较弱。在质量浓度为4 mg/mL后继续增加各样品的浓度（4~10 mg/mL），阳性对照Trolox的铁离子还原能力随浓度增加变化不大。而粉葛皮及粉葛渣结合态酚类物质的总抗氧化能力继续随浓度增加呈比例增加，且剂量-效应线性关系较强。
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图 9 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质的铁离子还原能力Figure 9. Iron reduction ability of conjugated phenolics in kudzu peel and kudzu dregs样品粉葛加工副产物粉葛皮及粉葛渣中结合态酚类物质均具有良好的抗氧化活性，且粉葛皮结合态酚类物质的抗氧化活性明显高于粉葛渣，这与粉葛皮中含有更高含量的结合态酚类物质有关。表明粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质的含量是影响其抗氧化能力的最主要因素。植物外皮作为抵抗外界侵害的重要屏障，会随着植物生长中受到机械损伤或者病原物入侵积累大量酚类物质[29]，这使得植物外皮往往具有更多的酚类物质和更强的抗氧化性活性。粉葛皮中结合态酚类物质中主要以酚酸类及黄酮类物质为主，而粉葛渣中则以黄酮类为主，酚酸类及黄酮类物质因含有酚羟基的结构，可与自由基反应可生成稳定结构，使自由基链反应终止[30−31]，往往具有较高的抗氧化活性。这可能也在一定程度上影响了不同粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质的抗氧化活性。
3. 结论
本研究结果表明粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮中均含有较高含量的结合态酚类物质，但二者所含结合态酚类物质的组分构成有较为显著的差异。碱水解可破坏酚类物质与纤维之间的结合键，有效释放结合态酚类物质。通过体外实验证实了粉葛加工副产物粉葛渣及粉葛皮中的结合态酚类物质均具有显著的抗氧化活性，并呈现出一定的剂量依赖性，表明粉葛加工副产物残渣具有较好的开发利用价值。本研究可为后续粉葛加工副产物的综合利用提供科学依据，并为粉葛加工副产物营养健康功效研究提供理论支撑。
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图 2 不同料液比对结合态酚类物质得率的影响
Figure 2. Effect of different ratio of material to liquid on the yield of conjugated phenolics substances
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图 3 不同提取时间对结合态酚类物质得率的影响
Figure 3. Effect of different extraction time on the yield of conjugated phenolics substances
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图 4 粉葛加工副产物残渣消化前后的红外光谱图
注：A.NaOH溶液消化后的粉葛皮；B.粉葛皮；C.NaOH溶液消化后的粉葛渣；D.粉葛渣。
Figure 4. Infrared spectrogram of kudzu by-product residue before and after digestion
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图 5 粉葛加工副产物残渣消化前后的扫描电镜图
注：A. 粉葛皮；B. NaOH溶液消化后的粉葛皮；C. 粉葛渣；D. NaOH溶液消化后的粉葛渣。
Figure 5. Scanning electron microscope image of by-product residue of kudzu residue before and after digestion
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图 6 粉葛加工副产物残渣中结合态酚类物质负离子模式总离子流
Figure 6. Negative ion mode total ion flow of conjugated phenolics in by-product residue of kudzu processing
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图 7 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质对DPPH·的清除作用
Figure 7. Scavenging of DPPH· by binding phenolic substances in kudzu peel and kudzu dregs
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图 8 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质对ABTS+·的清除作用
Figure 8. Scavenging of ABTS+· by binding phenolic substances in kudzu peel and kudzu dregs
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图 9 粉葛渣及粉葛皮中结合态酚类物质的铁离子还原能力
Figure 9. Iron reduction ability of conjugated phenolics in kudzu peel and kudzu dregs
表 1 粉葛渣结合态酚类物质得提取工艺正交试验因素水平设计
Table 1 Orthogonal test factor level design of extraction of conjugated phenolics from kudzu dregs
水平 因素 NaOH溶液浓度（mol/L） 料液比（g/mL） 提取时间（h） 1 3 1:25 3 2 4 1:30 4 3 5 1:35 5 
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表 2 粉葛皮结合态酚类物质得提取工艺正交试验因素水平设计
Table 2 Orthogonal test factor level design of extraction of conjugated phenolics from kudzu peel
水平 因素 NaOH溶液浓度（mol/L） 料液比（g/mL） 提取时间（h） 1 3 1:30 3 2 4 1:35 4 3 5 1:40 5
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表 3 粉葛渣提取工艺正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal experiment design and results of extraction technology of kudzu dregs
试验号 A NaOH溶液浓度 B 料液比 C 提取时间 结合酚得率（mg/g） 1 1（3 mol/L） 1（1:25 g/mL） 1（3 h） 2.242±0.069 2 1 2（1:30 g/mL） 2（4 h） 2.540±0.106 3 1 3（1:35 g/mL） 3（5 h） 2.438±0.175 4 2（4 mol/L） 1 2 2.150±0.224 5 2 2 3 2.340±0.095 6 2 3 1 2.298±0.231 7 3（5 mol/L） 1 3 1.867±0.172 8 3 2 1 2.400±0.176 9 3 3 2 2.287±0.315 K1 2.407 2.086 2.313 K2 2.263 2.427 2.326 K3 2.184 2.341 2.215 R 0.222 0.341 0.111
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表 4 粉葛皮提取工艺正交试验设计及结果
Table 4 Orthogonal experiment design and results of extraction technology of kudzu peel
试验号 A NaOH溶液浓度 B 料液比 C 提取时间 结合酚得率（mg/g） 1 1（3 mol/L） 1（1:30 g/mL） 1（3 h） 4.153±0.045 2 1 2（1:35 g/mL） 2（4 h） 4.923±0.099 3 1 3（1:40 g/mL） 3（5 h） 5.087±0.155 4 2（4 mol/L） 1 2 4.130±0.288 5 2 2 3 5.100±0.282 6 2 3 1 4.823±0.152 7 3（5 mol/L） 1 3 4.287±0.370 8 3 2 1 4.160±0.227 9 3 3 2 4.757±0.321 K1 4.720 4.170 4.378 K2 4.685 4.727 4.603 K3 4.380 4.888 4.804 R 0.340 0.718 0.427
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表 5 不同部位粉葛残渣中结合酚组分分析
Table 5 Analysis of conjugated phenolics in different parts of kudzu residue
编号 保留时间
（min）分子式 理论分子量
（m/z）精确分子量
（m/z）误差
（ppm）碎片离子（m/z） 化合物 粉葛皮 粉葛渣 类别 1 1.05 C21H22O11 449.1089 449.1083 −1.34 135.05, 151.00, 287.06 圣草酚 + − 黄酮 2 1.62 C13H16O9 315.0722 315.0729 2.22 109.15, 153.18 龙胆异酰葡糖苷 + − 酚酸 3 1.62 C13H16O9 315.0722 315.0731 2.86 153.02, 108.02 二羟基苯甲酸己糖 + − 其他 4 2.55 C7H6O4 153.0193 153.0199 3.92 109.04 甲氧基水杨酸 + − 酚酸 5 3.71 C7H6O3 137.0244 137.0245 0.73 105.05, 121.03, 138.02,
93.05, 119.09对羟基苯甲酸 + + 酚酸 6 3.71 C7H6O3 137.0244 137.0246 1.46 65.10, 93.05 水杨酸 − + 酚酸 7 5.88 C18H16O5 311.0925 311.0924 −0.32 187.05, 205.07 6-乙酰基-2'-甲氧基
黄烷酮+ − 黄酮 8 6.45 C15H10O4 253.0506 253.0508 0.79 169.09, 223.02 6,2-二羟基黄酮 + + 黄酮 9 6.93 C16H12O5 283.0612 283.0613 0.35 201.14, 240.11 3'-甲氧基大豆苷元 + + 黄酮 10 6.97 C11H12O5 223.0612 223.0618 2.69 112.99, 223.06 芥子酸 + − 酚酸 11 8.69 C16H12O7 315.0510 315.0510 0.00 153.02, 217.07 异鼠李素 − + 黄酮 12 8.73 C9H16O4 187.0976 187.0982 3.21 123.01, 125.10, 169.09 壬二酸 + − 有机酸 13 9.26 C15H12O5 271.0612 271.0617 1.84 161.04, 109.04 柚皮素查耳酮 + − 黄酮 14 9.64 C15H10O4 253.0506 253.0505 −0.40 137.03, 199.12 大豆苷元 − + 黄酮 15 13.09 C18H30O3 293.2122 293.2125 1.02 207.93, 177.04, 221.20,
236.15, 275.199（S）-HOTrE + + 有机酸 16 14.47 C18H30O2 277.2173 277.2174 0.36 233.16, 259.14, 121.05 α亚麻酸 + + 有机酸 17 15.06 C48H78O18 941.5115 941.5135 2.12 163.04, 635.36, 519.24, 597.48 大豆皂甙I + + 其他 注：“−”代表未检测到该成分；“+”代表检测到该成分。
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表 6 不同样品抗氧化活性的IC50值
Table 6 IC50 values of antioxidant activity of different samples
样品名称 IC50值（mg/mL） DPPH·清除率 ABTS+·清除率 铁离子还原能力 Trolox 0.26 0.11 1.53 粉葛皮结合态酚类 0.46 0.83 6.44 粉葛渣结合态酚类 0.94 0.99 11.54
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