Purification and Component Analysis of Total Flavonoids from Sea Buckthorn Peel Residue and Its Anti-Pancreatic Lipase
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摘要: 为了明确沙棘果皮渣中总黄酮纯化物（TFSE）对胰脂肪酶的抑制作用，本文通过静态及动态吸附解析实验，优化了AB-8大孔树脂纯化沙棘果皮渣总黄酮粗提物（TFCE）的条件；采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UPLC-Q-MS）分析TFSE组成成分；对硝基苯基丁酸酯法结合酶反应动力学探究TFSE对胰脂肪酶抑制效果及抑制类型。结果表明，AB-8大孔树脂最佳纯化条件为上样液浓度2.2 mg/mL、上样液pH 5.0、上样体积140 mL，上样流速1.0 mL/min；洗脱液乙醇体积分数75%、洗脱剂用量120 mL、洗脱流速1.5 mL/min，在此条件下分离纯化，TFSE纯度由9.786%提高到50.204%；从TFSE中鉴定出39种酚类化合物，以芦丁、儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等黄酮类化合物为主；TFSE对胰脂肪酶有较好的抑制作用，其IC50值为12.46 mg/mL，并通过Lineweaver-Burk双倒数作图法测出其抑制类型为非竞争性抑制，抑制常数Ki=10.21 mg/mL。TFSE具有良好的胰脂肪酶抑制活性，对于提高沙棘果皮渣产品的附加值具有重要意义。Abstract: In order to clarify the inhibition of total flavonoids purified extract (TFSE) of sea buckthorn peel residue on pancreatic lipase, this research optimized the purification condition of total flavonoids crude extract (TFCE) of sea buckthorn peel residue using AB-8 macroporous resin by means of static and dynamic adsorption and desorption experiment. Ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-Q-MS) was used to analyze the component of TFSE. In addition, the inhibitory effect and types of TFSE on pancreatic lipase were explored through the method of nitrophenyl butyrate combined with enzymatic reaction kinetics. The results showed that the optimal purification conditions for AB-8 macroporous resin were a sample concentration of 2.2 mg/mL, a sample pH of 5.0, a sample volume of 140 mL, and a sample flow rate of 1.0 mL/min. The volume fraction of ethanol was 75% with the eluent being 120 mL and the elution flow rate being 1.5 mL/min. After separation and purification under these conditions, the purity of TFSE increased from 9.786% to 50.204%. The total of 39 phenolic compounds were identified from TFSE with flavonoids like rutin, catechins, and quercetin-3-O-glucoside being the main compounds. TFSE had a strong inhibition on pancreatic lipase with the IC50 being 12.46 mg/mL. In addition, the inhibition type was determined to be non-competitive inhibition by using double reciprocal plot method of Lineweaver-Burk with an inhibition constant Ki being 10.21 mg/mL. TFSE has better inhibitory activity on pancreatic lipase, which is of great significance for improving the added value of sea buckthorn peel residue products.
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沙棘（Hippophae rhamnoides L.）隶属胡颓子科沙棘属，是一种具有重要生态和经济价值的多年生落叶灌木或小乔木，具有药食同源性。沙棘中的天然活性成分因其天然来源、结构多样、副作用小、高效等其他优点对高脂血症、心血管疾病和动脉粥样硬化等疾病有良好的治疗作用，受到人们的广泛青睐[1]。目前，沙棘加工主要以果实精深加工为主，而作为副产物的沙棘果皮渣被当作饲料或丢弃，不仅造成资源浪费，对环境还产生一定污染[2]。这些果皮渣富含黄酮、多酚、膳食纤维等多种生物活性物质，其中的黄酮类化合物作为果皮渣中的主要活性成分，具有降血脂、抗氧化和保护肝脏等多种生物活性，可提取开发多种高附加值的产品，从而加强沙棘综合利用，提高沙棘产业经济效益[3]。目前已有的分离纯化黄酮技术主要有超临界萃取法、膜过滤法、柱层析法等[4]。在多种纯化方法中大孔树脂具有操作简便、理化性质稳定、环保、能较好保持化合物原本活性等优点[5]，故选择大孔树脂法对沙棘果皮渣黄酮进行初步分离纯化，对解决沙棘果皮渣的资源浪费问题具有重要意义。
已知人体过量摄入脂肪会造成脂质代谢紊乱，由此引发高脂血症等一系列心脑血管疾病。胰脂肪酶是甘油三酯在胃肠道水解的关键酶，抑制其活性可减少食物中摄入脂肪的水解和吸收，有效地改善肥胖等各种慢性病[6]。奥利司他作为一种特异性的胃肠道脂肪酶抑制剂，主要是通过抑制甘油三酯的吸收来治疗肥胖，但会引起一系列胃肠道不适的副作用[7]。目前，研究人员的重点是寻找脂肪酶活性的天然抑制剂[8]。研究发现天然胰脂肪酶抑制剂通常来源于药用植物、蔬菜、水果中含有的天然活性化合物以及微生物代谢产物、真菌等[9−10]。在不同的植物代谢产物中，黄酮类化合物对胰脂肪酶的抑制作用更为突出。如HONG等[11]发现大豆叶中香叶木素和黄豆黄素这两种黄酮类化合物是胰脂肪酶的竞争抑制剂。HUANG等[12]对不同柑橘皮中的黄酮类化合物进行研究，发现黄酮类化合物主要是通过影响胰脂肪酶的原始构象和活性位点，有效地抑制胰脂肪酶的体外活性。而沙棘果皮渣中总黄酮纯化物（TFSE）作为天然植物活性成分，关于其对胰脂肪酶的抑制作用尚未见报道，因此研究TFSE对胰脂肪酶活性的影响，可为开发具有调节脂代谢紊乱的功能因子提供新的思路，同时为指导沙棘果皮渣的精深加工利用提供新的途径。
本实验采用AB-8大孔树脂对沙棘果皮渣的纯化工艺参数进行优化，研究静态吸附和动态吸附过程中影响沙棘果皮渣总黄酮吸附效果的因素，借助UPLC-Q-MS联用技术对TFSE的结构进行鉴定，并研究其对胰脂肪酶的抑制作用，以期为提高新疆沙棘果皮渣产品的附加值与促进天然的降血脂保健食品的开发提供必要的理论基础和依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙棘果皮渣 新疆阿勒泰地区慧华生物科技有限公司；芦丁标准品（HPLC≥98%）、三羟甲基氨基甲烷 上海蓝季生物科技有限公司；猪胰脂肪酶（TypeⅡ，≥125 U/mg）、奥利司他（≥98%）、4-硝基苯丁酸酯（≥98%）、对硝基苯酚 美国Sigma-Aldrich公司；α-萘酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AB-8大孔树脂 天津市光复精细化工研究所；甲醇、乙腈、乙酸 色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
UV-2700 紫外分光光度计 日本岛津公司；Y0062电子天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；STGL-18M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；ALPHA2-4 LSCplus冷冻干燥机 德国 Martin Christ公司；Bio-rad xMark酶标仪 美国伯乐公司；16×200 mm层析柱 瑞达恒辉；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；BT100N蠕动泵 保定申辰泵业有限公司；BSZ-100自动部分收集器 上海嘉鹏科技有限公司；Q Exactive超高效液相色谱、Vanquis超高压液相色谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘果皮渣总黄酮粗提物（TFCE）的制备
根据本实验室前期对提取条件的优化，得到TFCE的制备方法。将沙棘果皮渣过40目筛，精确称量2.0 g后加入体积分数59%的乙醇，在液料比40 mL/g，超声温度59 ℃，超声时间39 min条件下结合超声波辅助提取，合并两次提取液减压浓缩后蒸至浸膏状，得到TFCE，在4 ℃冷藏备用。
1.2.2 沙棘果皮渣总黄酮含量的测定
参照陈燕玲[13]的比色法，绘制芦丁标准曲线。配制浓度0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，所得的标准曲线为：y=12.04x+0.0028，R2=0.9996。在0~0.048 mg/mL范围内线性关系良好。取“1.2.1”的提取物按上述方法于510 nm测定吸光值。总黄酮含量计算公式计算如下：
沙棘果皮渣总黄酮含量(mg/g)=测得质量浓度(mg/mL)×稀释倍数×提取液体积(mL)沙棘果皮渣质量(g) 1.2.3 AB-8大孔树脂纯化TFCE
1.2.3.1 大孔树脂预处理
参考文献[14]，选择AB-8大孔树脂进行精制TFCE的研究，其预处理方法参照文献[15]。
1.2.3.2 静态吸附与解析附动力学曲线
准确称取1 g湿树脂，加入50 mL质量浓度为1.65 mg/mL的样液，避光密封，并置恒温振荡器中，在30 ℃条件下，以120 r/min振荡12 h，根据公式计算吸附率。将吸附饱和的树脂洗至洗出液无色为止，加入50 mL 95%乙醇振荡9 h，根据公式计算解析率。
1.2.3.3 AB-8大孔树脂对沙棘果皮渣总黄酮的静态吸附与解析性能的影响
按照“1.2.3.2”所述方法，研究总黄酮质量浓度（0.66、1.1、1.65、2.2、2.75、3.3 mg/mL）、pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）对AB-8大孔树脂吸附效果的影响，根据公式计算吸附率、吸附量；按照优选的吸附条件进行吸附，吸附饱和经水洗后加入50 mL洗脱液，置于恒温培养箱中振荡4 h，研究洗脱液乙醇体积分数（35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%）对洗脱效果的影响。收集流出液，前10 mL弃去，测定总黄酮浓度，根据公式计算总黄酮解析率、解析量。
吸附量(mg/g)=(P1−P2)V1M 吸附率(%)=(P1−P2P1)×100 解析量(mg/g)=P3V2M 解析率(%)=(P3V2(P1−P2)V1)×100 式中：P1、P2、P3分别表示原料液、流出液和洗脱液的总黄酮质量浓度（mg/mL）；V1、V2表示原料液和洗脱液的体积（mL）；M为大孔树脂质量（g）。
1.2.3.4 动态吸附泄漏曲线制备
准确称取10 g湿树脂进行湿法装柱，待层析柱吸附平衡后，根据“1.2.3.3”节中最佳工艺优化所得条件以1.0 mL/min流速进行上样，每10 mL收集1管，分段收集流出液，测定总黄酮含量。以总黄酮质量浓度（mg/mL）为纵坐标，洗脱管数为横坐标绘制动态吸附泄漏曲线[16]。
1.2.3.5 AB-8大孔树脂对沙棘果皮渣总黄酮的动态吸附与解析性能的影响
按照“1.2.3.4”所述方法，分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速通过，确定最佳上样流速。按照优选的吸附条件进行吸附，吸附饱和后以1.0 mL/min的速度经去离子水洗脱，直至洗脱液不发生Molish反应，确定最佳水洗体积。水洗后用75%乙醇溶液进行洗脱，分别将洗脱流速调为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，确定最佳洗脱流速，绘制动态上样和洗脱曲线。
1.2.3.6 验证实验
将收集的洗脱液合并后旋转浓缩至无醇味，于真空冷冻干燥机上冻干，根据公式计算纯化前后黄酮类物质纯度差异。
纯度(%)=黄酮类化合物浓度(mg/mL)×溶液体积(mL)干燥后样品质量(mg)×100 1.2.4 UPLC-Q-MS分析TFSE成分
1.2.4.1 供试品溶液的配制
精密称取50.5 mg TFSE至离心管中，加入0.5 mL 80%甲醇水溶液（含0.2%维生素C），涡旋混匀，室温超声提取30 min，以12000 r/min离心10 min，取上清液，重复提取两次，将两次上清液合并混匀，稀释5倍后经0.22 μm滤膜过滤作为供试品溶液，待上机检测。
1.2.4.2 系列混合标准品溶液的配制
分别精密称取实验所需标准品，加入甲醇配成10 mg/mL单标母液，取适量单标母液混合配制成1、10或20 μg/mL的混合标准品溶液保存备用。根据下列浓度范围将混合标准品溶液配制成为系列混合标准品使用溶液待上机检测：没食子酸、4-羟基苯甲酸、儿茶素、香草酸、表儿茶素、二氢杨梅素、香草醛、芦丁、水杨酸、牡荆素、反式阿魏酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、二氢槲皮素、苯甲酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、二氢山奈酚、木犀草素、槲皮素、氢化肉桂酸、反式肉桂酸、柚皮苷查尔酮、柚皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素浓度范围为0.001~0.5 μg/mL；原儿茶酸、原儿茶醛、邻苯二甲酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、丁香醛、芥子酸、木犀草苷、4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷、白藜芦醇、大豆甙元、根皮素、异甘草素浓度范围为0.01~5 μg/mL，棉酚浓度范围为0.02~10 μg/mL。
1.2.4.3 色谱条件
参考文献[17−18]，对UPLC-Q-MS分析TFSE成分的程序略作修改，色谱柱：Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A相超纯水（含0.1%甲酸），B相乙腈（含0.1%甲酸）；洗脱梯度：0~2 min，A：90%；2~6 min，A：90%~40%；6~9 min，A：40%；9~9.1 min，A：40%~90%；9.1~12 min，A：90%；进样量2 μL；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃。
1.2.4.4 质谱条件
扫描模式为单离子检测（SIM）模式；扫描方式为负离子。一级扫描范围（m/z）：100~900，离子喷雾电压为−2800 V；鞘气40 arb；辅助气10 arb；温度350 ℃；离子传输管温度320 ℃。
1.2.5 TFSE对胰脂肪酶的抑制作用
1.2.5.1 PNP（对硝基苯酚）标准曲线绘制
称取0.07 g PNP用Tirs-HCl缓冲液（0.1 mol/L，5 mmol/L CaCl2，pH7.0，下同）配制成浓度为5 mmol/L的母液，将其稀释成不同浓度，各取200 μL至96孔板中，于405 nm波长处测定吸光度，以PNP浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标绘制标曲，得到回归方程为y=6.471x+0.0202，R2=0.9999。
1.2.5.2 纯化组分对胰脂肪酶活性抑制率的测定
参考晏幸等[19]的方法稍作修改。将胰脂肪酶溶于Tri-HCl缓冲液中得到0.05 mg/mL酶液。取18 μL 4-硝基苯丁酸酯（p-NPB）溶于二甲基亚砜中，制得浓度为10 mmol/L的p-NPB溶液。TFSE溶于Tris-HCl缓冲液中以制备各黄酮组分溶液。取20 μL浓度分别为2、4、6、8、10、14、18 mg/mL的黄酮组分溶液和50 μL胰脂肪酶溶液与100 μL缓冲溶液混合均匀，于37 ℃下孵育15 min，立即加入30 μL p-NPB溶液，在37 ℃下反应20 min，测定各反应体系在405 nm波长处的吸光度。奥利司他用少量二甲亚砜溶解作为阳性对照。计算公式如下所示：
抑制率(%)=(1−B−bA−a)×100 式中：A：对照实验组的吸光度值（酶和底物）；a：对照空白组的吸光度值（底物）；B：样品实验组的吸光度值（酶、抑制剂和底物）；b：样品空白组的吸光度值（抑制剂和底物）。
1.2.5.3 纯化组分抑制胰脂肪酶的酶动力学特征
酶促反应动力学分析参照文献[20−21]所述方法。固定p-NPB溶液质量浓度为10 mmol/L，分别测定不同浓度（0、10、14、18 mg/mL）的样品对不同酶液浓度（0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 mg/mL）的酶促反应初速度，反应条件和体系与“1.2.5.2”节相同，以横坐标为酶液浓度，将反应后的体系吸光度除以反应时间为反应速率（V），以反应速率为纵坐标，绘制酶促反应动力学曲线。按照上述的操作步骤，固定酶液质量浓度为0.04 mg/mL，分别测定不同浓度的样品在不同底物p-NPB浓度（0.5、1、2、4、6、8、10 mmol/L）下的反应初速度。每个实验重复三次，以反应速率的倒数（1/[V]）对p-NPB底物质量浓度的倒数（1/[S]）作图，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线。
1.3 数据处理
以上实验重复3次，所有数据的显著性采用SPSS 19.0进行处理，实验结果以“平均值±标准差”表示；采用OriginPro 2019b软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 AB-8大孔树脂静态吸附与解析实验结果分析
2.1.1 静态吸附动力学曲线
图1为AB-8大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线，从曲线中可看出，在吸附初始阶段吸附速率呈现快速上升的趋势，当吸附时间为8 h时，吸附率逐渐达到平衡，此时吸附率为71.39%±0.26%，当吸附时间达到10 h，吸附率没有明显增加，说明AB-8大孔树脂达到饱和状态，此时吸附率为73.11%±0.63%。考虑到节约时间与物力成本，选择8 h为静态吸附饱和时间。
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2.1.2 静态解析附动力学曲线
图2为AB-8大孔树脂静态解析动力学曲线，在前4 h之内，AB-8树脂能快速解析沙棘果皮渣里的黄酮，解析率随着解析时间的延长而上升，当达到4 h时，解析率为90.43%±0.28%，之后由于解析浓度增大，会再次发生复吸，直到解析率逐渐平稳后达到饱和状态。这一现象与王竞珮[22]对甜樱桃果多酚经大孔树脂纯化的研究结论相似。分析可能的原因是：AB-8大孔树脂吸附极性较弱的黄酮类化合物，而乙醇体积分数过高会呈现一定的弱极性，与树脂接触后会减少黄酮类化合物与大孔树脂之间的吸附力，黄酮类化合物易被解析下来；随着解析液与树脂接触时间增加，一些与黄酮极性相似的杂质也会竞争脱附，同时解析液中高浓度的黄酮再次与弱极性的大孔树脂结合，出现了复吸的情况，从而影响解析率。故选择解析时间为4 h。
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图 2 AB-8大孔树脂静态解析动力学曲线Figure 2. Static desorption kinetics curve of AB-8 macroporous resin2.1.3 样液pH对静态吸附的影响
图3反映了样液pH对AB-8大孔树脂静态吸附的影响，在不同pH下，吸附率和吸附量变化差异显著（P<0.05）。随着上样液pH的增大，AB-8大孔树脂对沙棘果皮渣黄酮类化合物的吸附率和吸附量先增加后减小。当pH5时，树脂的吸附效果最佳，吸附率和吸附量分别为70.38%±0.45%、58.48±0.23 mg/g，分析原因可能是：黄酮类物质因含有酚羟基而呈现出一定的酸性，因此在酸性条件下性质稳定，更容易与大孔树脂产生氢键作用而被吸附。但是过酸过碱都会影响黄酮的存在形式，强酸条件下，黄酮类化合物形成烊盐，影响吸附效果；当溶液为碱性环境时，黄酮类化合物结构改变，易分解产生沉淀，使得树脂无法吸附，从而降低吸附率和吸附量[23−24]。因此pH5比较适宜大孔树脂的吸附，故选择pH5为最适的样液pH。
2.1.4 样液浓度对静态吸附的影响
图4反映了样液浓度对AB-8大孔树脂静态吸附的影响，在不同样液浓度下，吸附率和吸附量呈现显著差异（P<0.05），随着样液浓度的增加，大孔树脂的吸附量逐渐升高，但吸附率逐渐降低。当样液浓度为0.66 mg/mL时，吸附率为77.47%±0.25%，吸附量为25.61±0.12 mg/g，此时吸附量过低使得大孔树脂未能被充分利用，造成树脂的浪费；当样液浓度为3.30 mg/mL时，吸附率为49.23%±0.23%，吸附量为81.26±0.32 mg/g，此时吸附率过低，可能是由于杂质过多，与黄酮类化合物竞争树脂的位点，使得黄酮类物质未能被充分吸附[25]。当样液浓度为2.20 mg/mL时，大孔树脂的吸附率为64.34%±0.29%，吸附量为71.01±0.36 mg/g，此时大孔树脂吸附率和吸附量都较为合适，这与张冀凡[15]对红花玉兰黄酮研究结果相似，从节约成本和增加纯化效率方面来看，为了确保可以提取更多的黄酮，并考虑到实际应用情况，优先考虑吸附量，故选择2.20 mg/mL作为最适的上样浓度。
2.1.5 乙醇体积分数对静态解析附的影响
图5反映了在不同乙醇体积分数对AB-8大孔树脂静态解析率的影响，可以看出其变化差异显著（P<0.05）。当乙醇体积分数为75%时，解析率与解析量达到最大值，分别为90.88%±0.45%与64.83±0.36 mg/g，这是因为具有糖苷键与酚羟基结构的黄酮化合物水溶液呈弱极性，而中等极性的洗脱剂与黄酮结构相似，易于和AB-8大孔树脂形成氢键，将吸附在树脂上的黄酮类物质置换洗脱下来，从而提高其解析效果。洗脱剂极性过高或过低均难以和大孔树脂结合，过高不仅会造成试剂的浪费，还会将与黄酮结构相似的化合物提取出来[26]。综合考虑，选择体积分数为75%的乙醇作为洗脱剂。
2.2 AB-8大孔树脂动态吸附与解析实验结果分析
2.2.1 泄露曲线
泄漏点是指流出液中黄酮浓度达到上样液浓度的10%时的上样体积，此时可停止上样。当达到上样液浓度的100%时，称为饱和点[27]。如图6所示，流出液黄酮类物质浓度随上样液体积的增加逐渐上升。当上样体积达到14管时，流出液中黄酮类物质的浓度为0.22±0.029 mg/mL，达到上样液黄酮浓度（2.20 mg/mL）的十分之一，为树脂的泄漏点，故选择14管（140 mL）为最佳上样体积。随着样液不断泄露，达到36管时，流出液黄酮类物质浓度为2.20±0.0048 mg/mL，流出液中黄酮浓度基本与上样液浓度接近，认为此时流出液体积达到饱和点。
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图 6 AB-8大孔树脂动态吸附泄漏曲线Figure 6. Dynamic adsorption leakage curve of AB-8 macroporous resin2.2.2 上样流速与洗脱流速
由图7A可知，随着上样体积的增加，流出液中黄酮的浓度也在增加。当上样流速从0.5 mL/min增加至2.5 mL/min时，达到树脂吸附泄露点的上样体积分别为160、140、120、100、80 mL。这是因为在较低流速的情况下，黄酮类物质可以与大孔树脂进行充分接触，树脂能够被完全吸附，所以泄露点出现较晚，但纯化循环周期长；当流速过快时，黄酮类物质在大孔树脂中停留时间较短，吸附不完全，使得吸附率与吸附量较低[28]。综合考虑实际应用，最终确定最佳上样流速为1.0 mL/min。由图7B可知，当洗脱流速小于1.5 mL/min时，洗脱曲线尖锐且对称性较好，拖尾也不明显，解析效果好；当洗脱液流速大于1.5 mL/min逐渐增加时，洗脱曲线逐渐变宽，拖尾现象较为明显。如果单从解析率与拖尾是否明显的角度考虑，应该选择1.0 mL/min作为最佳洗脱流速，但是如果流速过慢，会延长分离周期增加工作时长。考虑到节约时间成本与有机溶剂用量，故选择洗脱流速1.5 mL/min。
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图 7 不同上样流速（A）和洗脱流速（B）对吸附与解析效果的影响Figure 7. Effect of different loading sample flow rate and elution flow rate on absorption and desorption2.2.3 洗脱曲线
根据上述所得结果，选用75%乙醇以1.5 mL/min的洗脱流速进行洗脱。由图8可看出，随着洗脱液流出体积的增加，黄酮类物质浓度呈现先上升后下降的趋势。当洗脱液流出体积达到50 mL时，洗脱液中黄酮类物质的浓度达到最高；当洗脱液流出体积继续增加，洗脱液中黄酮浓度显著下降（P<0.05）；当洗脱液体积为120 mL时，黄酮浓度趋于平稳（P>0.05），几乎为0，说明该洗脱条件下能够使黄酮全部洗脱下来，因此选择120 mL为最佳洗脱体积。
2.3 最佳纯化工艺验证
按AB-8大孔树脂的初步分离纯化TFCE工艺，进行3次重复实验。经计算总黄酮纯度分别为50.138%、50.277%、50.197%，其平均值为50.204%，相较纯化前（9.786%）提高了5.13倍。杨果等[29]采用AB-8大孔树脂纯化西番莲果皮黄酮，产物的黄酮含量比纯化前提高约为2.63倍；HOU等[30]采用AB-8大孔树脂纯化山楂黄酮，产物的黄酮含量比纯化前提高约4.76倍。可见AB-8大孔树脂对黄酮类物质有较好的分离纯化效果，并且纯化工艺提高了黄酮类化合物的纯度。
2.4 UPLC-Q-MS 成分分析
采用UPLC-Q-MS法对TFSE中的成分进行定量分析，并通过负离子模式对其进行识别，通过对比混标和样品的总离子流色谱图（见图9A和9B），并结合质谱数据和参考文献可初步分析出纯化成分，有利于进一步阐明其药效物质基础，为沙棘果皮渣后期的体外研究开发提供理论依据。
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图 9 UPLC-Q-MS在负离子模式（A）混标和（B）TFSE的总离子流图（TIC）Figure 9. UPLC-Q-MS in negative ion mode (A) mixed standard and (B) TFSE trace particle flow diagram (TIC)表1列出了TFSE的主要组分，共鉴定出39种酚类化合物，主要是以黄酮类化合物为主，其中20种化合物属于黄酮类化合物，2种化合物属于多酚类化合物，17种化合物属于酚酸类化合物。由图9和表1可知，对比混标，除柚皮苷查尔酮未检出外，其他物质均检出，其中芦丁是TFSE中含量最多的化合物，含量达到1348.811±0.179 ng/mg，儿茶素含量为994.812±0.845 ng/mg、槲皮素-3-O-葡萄糖苷含量为558.638±0.391 ng/mg、山奈酚-3-O-葡萄糖苷含量为102.69±0.427 ng/mg、异鼠李素含量为182.445±0.62 ng/mg、槲皮素含量为111.289±0.254 ng/mg。郭建峰等[31]采用HPLC-Q-MS技术对沙棘叶中的化学成分进行分析，检测出15种类黄酮成分，发现其中有14种黄酮与本研究相同，与其相比本研究的TFSE中检测出其未含有的木犀草苷、4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、大豆甙元、根皮素、异甘草素。因此，本研究认为通过AB-8大孔树脂纯化的方式可以较好地提取出黄酮及酚酸类物质，对于沙棘果皮渣黄酮类化合物的检出及今后开发沙棘副产品将起到积极的推动作用。
表 1 TFSE结构分析鉴定结果Table 1. Identification and analysis of flavonoids from TFSE峰号 保留时间（min） 中文名称 英文名称 分子式 [M-H]− （m/z） 含量（ng/mg） 分类 1 0.99 没食子酸 Gallic acid C7H6O5 169.014 3.007±0.446 酚酸类 2 1.91 原儿茶酸 3,4-Dihydroxybenzoic acid C7H6O4 153.019 2.548±0.578 酚酸类 3 3.19 原儿茶醛 Protocatechualdehyde C7H6O3 137.024 18.988±0.384 酚酸类 4 3.3 邻苯二甲酸 Phthalic acid C8H6O4 165.019 0.601±0.173 酚酸类 5 3.4 4-羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid C7H6O3 137.024 1.33±0.155 酚酸类 6 3.98 儿茶素 Catechin C15H14O6 289.072 994.812±0.845 黄酮类 7 4.19 香草酸 Vanillic acid C8H8O4 167.035 21.603±0.628 酚酸类 8 4.34 咖啡酸 Caffeic acid C9H8O4 179.035 0.726±0.048 酚酸类 9 4.55 丁香酸 Syringic acid C9H10O5 197.046 7.284±0.162 酚酸类 10 4.81 表儿茶素 Epicatechin C15H14O6 289.072 82.49±0.135 黄酮类 11 4.85 二氢杨梅素 Dihydromyricetin C15H12O8 319.046 22.136±0.422 黄酮类 12 5.17 香草醛 Vanillin C8H8O3 151.04 12.488±0.151 酚酸类 13 5.32 对香豆酸 p-Hydroxycinnamic acid C9H8O3 163.04 34.16±0.485 酚酸类 14 5.49 丁香醛 Syringaldehyde C9H10O4 181.051 5.63±0.648 酚酸类 15 5.6 芦丁 Rutin C27H30O16 609.146 1348.811±0.179 黄酮类 16 5.6 水杨酸 Salicylic acid C7H6O3 137.024 7.591±0.466 酚酸类 17 5.64 牡荆素 Vitexin C21H20O10 431.098 0.05±0.043 黄酮类 18 5.68 反式阿魏酸 Trans-Ferulic acid C10H10O4 193.051 12.291±0.686 酚酸类 19 5.71 芥子酸 Sinapic acid C11H12O5 223.061 22.333±0.56 酚酸类 20 5.75 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 Quercetin 3-β-D-glucoside C21H20O12 463.088 558.638±0.391 黄酮类 21 5.78 木犀草苷 Luteoloside C21H20O11 447.093 0.132±0.006 黄酮类 22 5.85 二氢槲皮素 （+）-Dihydroquercetin C15H12O7 303.051 30.906±0.347 黄酮类 23 5.88 4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷 Genistin C21H20O10 431.098 0.364±0.048 黄酮类 24 6.05 苯甲酸 Benzoic acid C7H6O2 121.03 43.597±0.731 酚酸类 25 6.05 山奈酚-3-O-葡萄糖苷 Kaempferol-3-O-glucoside C21H20O11 447.093 102.69±0.427 黄酮类 26 6.44 二氢山奈酚 （+）-Dihydrokaempferol C15H12O6 287.056 2.903±0.029 黄酮类 27 6.69 白藜芦醇 Resveratrol C14H12O3 227.071 0.608±0.011 多酚类 28 6.81 大豆甙元 Daidzein C15H10O4 253.051 0.008±0.004 黄酮类 29 7.05 木犀草素 Luteolin C15H10O6 285.04 0.87±0.016 黄酮类 30 7.09 槲皮素 Quercetin C15H10O7 301.035 111.289±0.254 黄酮类 31 7.14 氢化肉桂酸 Hydrocinnamic acid C9H10O2 149.061 2.921±0.39 酚酸类 32 7.24 反式肉桂酸 Trans-Cinnamic acid C9H8O2 147.045 4.106±0.44 酚酸类 33 − 柚皮苷查尔酮 Naringenin chalcone C15H12O5 − − 黄酮类 34 7.55 根皮素 Phloretin C15H14O5 273.077 0.089±0.011 黄酮类 35 7.58 柚皮素 Naringenin C15H12O5 271.061 3.32±0.439 黄酮类 36 7.58 芹菜素 Apigenin C15H10O5 269.046 0.269±0.014 黄酮类 37 7.67 山奈酚 Kaempferol C15H10O6 285.04 21.144±0.286 黄酮类 38 7.73 异鼠李素 Isorhamnetin C16H12O7 315.051 182.445±0.62 黄酮类 39 7.93 异甘草素 Isoliquiritigenin C15H12O4 255.066 0.007±0.001 黄酮类 40 9.76 棉酚 Gossypol C30H30O8 517.187 0.344±0.024 多酚类 2.5 TFSE对胰脂肪酶的抑制作用强度
由图10可知，在样品浓度2~18 mg/mL范围内，随着浓度的增加，TFSE对胰脂肪酶抑制作用显著增加（P<0.05），这是因为黄酮类化合物可以通过疏水缔合或与极性基团形成氢键与酶相互作用，从而改变酶的结构并影响其活性。通过线性拟合计算其半抑制浓度IC50值为12.46 mg/mL，阳性对照奥利司他IC50值为0.89 μg/mL。相比于其他天然产物中提取到的胰脂肪酶抑制剂，例如，林海生等[32]用超声波辅助提取法获得的红江橙果皮黄酮（IC50值为28.54 mg/mL）、安欢等[33]研究的苦瓜多糖（IC50值为29.86 mg/mL），TFSE表现出较好的胰脂肪酶抑制作用，有望作为一种潜在的胰脂肪酶抑制剂。
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图 10 TFSE和奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用Figure 10. Inhibition of TFSE and orlistat on panreatic lipase2.6 纯化组分对胰脂肪酶的抑制作用类型
为了研究TFSE对胰脂肪酶的抑制类型，固定底物浓度不变，在不同浓度抑制剂存在下，绘制了不同胰脂肪酶浓度下反应速率的线性回归曲线。如图11所示，图中的四条回归曲线给出了一组以不同斜率穿过原点的直线，且随着抑制剂浓度的增加，其斜率逐渐降低，这些结果表明TFSE是通过非共价键的形式与酶可逆结合，进而引起胰脂肪酶活力的降低或丧失而导致催化效率降低，而不是通过降低有效酶量导致反应速率降低，因此对胰脂肪酶的作用方式属于可逆型抑制[34]。
TFSE对胰脂肪酶作用得到的Lineweaver-Burk结果如图12所示，当底物浓度为0.5~10 mmol/L时，改变抑制剂的浓度，直线相交在X轴，并且截距不变，斜率变大，即米氏常数Km不变，Vm值变小，表明TFSE对胰脂肪酶的抑制作用类型是非竞争性抑制。此结果与枸杞叶黄酮[35]、长茎葡萄蕨藻提取物[36]对胰脂肪酶的抑制作用类型相似。非竞争性抑制的抑制程度仅仅受抑制剂的浓度影响，即TFSE能够通过与游离胰脂肪酶独立结合来抑制酶的催化作用，与底物之间不存在竞争关系，意味着其抑制作用不会受食物中脂肪的浓度影响，这为有效地将TFSE开发为胰脂肪酶抑制剂提供了理论基础。
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图 12 TFSE对胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk双倒数曲线图Figure 12. Lineweaver-Burk double reciprocal curve plots of TFSE against pancreatic lipaseKi值是解离常数，反映了酶与抑制剂复合物之间的亲和力程度，Ki越小，说明酶与抑制剂亲和力越强，其抑制作用越强。黄雪薇等[37]发现板栗壳黄酮化合物对胰脂肪酶抑制类型为非竞争性抑制，Ki=53.19 mg/mL；通过不同浓度抑制剂的双倒数斜率对抑制剂浓度进行的二次作图，线性拟合的曲线为y=3.8623x+39.437，R2=0.9088，计算得抑制常数Ki=10.21 mg/mL，TFSE的抑制常数Ki小于黄雪薇等板栗壳黄酮对胰脂肪酶的Ki值，表明TFSE和胰脂肪酶结合紧密，因此抑制效果强。
3. 结论
本实验采用大孔树脂对TFCE进行纯化。通过静态吸附、解析以及动力学特征分析，优化纯化工艺，并确定最佳纯化条件为：浓度2.2 mg/mL，pH 5的上样液以1.0 mL/min流速上样140 mL；采用75%乙醇作为洗脱剂，在1.5 mL/min流速下洗脱120 mL，此条件下的总黄酮纯度由纯化前9.786%提高到50.204%，说明AB-8适合沙棘果皮渣总黄酮提取物的分离纯化。采用UPLC-Q-MS技术对TFSE的进行结构分析，其中含量较高的为芦丁、儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素等黄酮类化合物。并且初步研究TFSE对胰脂肪酶的抑制效果，结果表明，TFSE对胰脂肪酶具有较好的抑制作用，其IC50值为12.46 mg/mL，通过Lineweaver-Burk法证明TFSE抑制类型为非竞争性抑制。该结果说明TFSE是一种天然安全的胰脂肪酶抑制剂，并且为深入理解沙棘果皮渣加工副产品的降脂机制及进一步开发利用沙棘果皮渣提供了理论依据，对于解决沙棘果皮渣的资源浪费问题具有重要意义。
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图 2 AB-8大孔树脂静态解析动力学曲线
Figure 2. Static desorption kinetics curve of AB-8 macroporous resin
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图 6 AB-8大孔树脂动态吸附泄漏曲线
Figure 6. Dynamic adsorption leakage curve of AB-8 macroporous resin
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图 7 不同上样流速（A）和洗脱流速（B）对吸附与解析效果的影响
Figure 7. Effect of different loading sample flow rate and elution flow rate on absorption and desorption
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图 9 UPLC-Q-MS在负离子模式（A）混标和（B）TFSE的总离子流图（TIC）
Figure 9. UPLC-Q-MS in negative ion mode (A) mixed standard and (B) TFSE trace particle flow diagram (TIC)
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图 10 TFSE和奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用
Figure 10. Inhibition of TFSE and orlistat on panreatic lipase
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图 12 TFSE对胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk双倒数曲线图
Figure 12. Lineweaver-Burk double reciprocal curve plots of TFSE against pancreatic lipase
表 1 TFSE结构分析鉴定结果
Table 1 Identification and analysis of flavonoids from TFSE
峰号 保留时间（min） 中文名称 英文名称 分子式 [M-H]− （m/z） 含量（ng/mg） 分类 1 0.99 没食子酸 Gallic acid C7H6O5 169.014 3.007±0.446 酚酸类 2 1.91 原儿茶酸 3,4-Dihydroxybenzoic acid C7H6O4 153.019 2.548±0.578 酚酸类 3 3.19 原儿茶醛 Protocatechualdehyde C7H6O3 137.024 18.988±0.384 酚酸类 4 3.3 邻苯二甲酸 Phthalic acid C8H6O4 165.019 0.601±0.173 酚酸类 5 3.4 4-羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid C7H6O3 137.024 1.33±0.155 酚酸类 6 3.98 儿茶素 Catechin C15H14O6 289.072 994.812±0.845 黄酮类 7 4.19 香草酸 Vanillic acid C8H8O4 167.035 21.603±0.628 酚酸类 8 4.34 咖啡酸 Caffeic acid C9H8O4 179.035 0.726±0.048 酚酸类 9 4.55 丁香酸 Syringic acid C9H10O5 197.046 7.284±0.162 酚酸类 10 4.81 表儿茶素 Epicatechin C15H14O6 289.072 82.49±0.135 黄酮类 11 4.85 二氢杨梅素 Dihydromyricetin C15H12O8 319.046 22.136±0.422 黄酮类 12 5.17 香草醛 Vanillin C8H8O3 151.04 12.488±0.151 酚酸类 13 5.32 对香豆酸 p-Hydroxycinnamic acid C9H8O3 163.04 34.16±0.485 酚酸类 14 5.49 丁香醛 Syringaldehyde C9H10O4 181.051 5.63±0.648 酚酸类 15 5.6 芦丁 Rutin C27H30O16 609.146 1348.811±0.179 黄酮类 16 5.6 水杨酸 Salicylic acid C7H6O3 137.024 7.591±0.466 酚酸类 17 5.64 牡荆素 Vitexin C21H20O10 431.098 0.05±0.043 黄酮类 18 5.68 反式阿魏酸 Trans-Ferulic acid C10H10O4 193.051 12.291±0.686 酚酸类 19 5.71 芥子酸 Sinapic acid C11H12O5 223.061 22.333±0.56 酚酸类 20 5.75 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 Quercetin 3-β-D-glucoside C21H20O12 463.088 558.638±0.391 黄酮类 21 5.78 木犀草苷 Luteoloside C21H20O11 447.093 0.132±0.006 黄酮类 22 5.85 二氢槲皮素 （+）-Dihydroquercetin C15H12O7 303.051 30.906±0.347 黄酮类 23 5.88 4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷 Genistin C21H20O10 431.098 0.364±0.048 黄酮类 24 6.05 苯甲酸 Benzoic acid C7H6O2 121.03 43.597±0.731 酚酸类 25 6.05 山奈酚-3-O-葡萄糖苷 Kaempferol-3-O-glucoside C21H20O11 447.093 102.69±0.427 黄酮类 26 6.44 二氢山奈酚 （+）-Dihydrokaempferol C15H12O6 287.056 2.903±0.029 黄酮类 27 6.69 白藜芦醇 Resveratrol C14H12O3 227.071 0.608±0.011 多酚类 28 6.81 大豆甙元 Daidzein C15H10O4 253.051 0.008±0.004 黄酮类 29 7.05 木犀草素 Luteolin C15H10O6 285.04 0.87±0.016 黄酮类 30 7.09 槲皮素 Quercetin C15H10O7 301.035 111.289±0.254 黄酮类 31 7.14 氢化肉桂酸 Hydrocinnamic acid C9H10O2 149.061 2.921±0.39 酚酸类 32 7.24 反式肉桂酸 Trans-Cinnamic acid C9H8O2 147.045 4.106±0.44 酚酸类 33 − 柚皮苷查尔酮 Naringenin chalcone C15H12O5 − − 黄酮类 34 7.55 根皮素 Phloretin C15H14O5 273.077 0.089±0.011 黄酮类 35 7.58 柚皮素 Naringenin C15H12O5 271.061 3.32±0.439 黄酮类 36 7.58 芹菜素 Apigenin C15H10O5 269.046 0.269±0.014 黄酮类 37 7.67 山奈酚 Kaempferol C15H10O6 285.04 21.144±0.286 黄酮类 38 7.73 异鼠李素 Isorhamnetin C16H12O7 315.051 182.445±0.62 黄酮类 39 7.93 异甘草素 Isoliquiritigenin C15H12O4 255.066 0.007±0.001 黄酮类 40 9.76 棉酚 Gossypol C30H30O8 517.187 0.344±0.024 多酚类 
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