Dynamic Changes of Physicochemical Quality, Flavor and Fungal Community Structure during Medium-High Temperature Daqu Fermentation Process in Xufang Region
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摘要: 中高温大曲是浓香型白酒生产的主要糖化发酵剂，本研究以不同发酵阶段的中高温大曲为研究对象，通过采用国标方法、人工智能传感技术和高通量测序技术，对中高温大曲发酵过程中的理化性质、风味、滋味及真菌群落结构变化进行了综合分析，探讨了中高温大曲品质指标与优势真菌属之间的相关关系。研究发现，随着发酵进行，中高温大曲中的水分、有机硫化物、萜烯类、氢氧化物含量以及涩味逐渐降低，而咸味逐渐升高。中高温大曲的真菌群落结构在发酵早期已形成，但是随着发酵进行，真菌群落多样性逐渐降低，同时部分菌属的相对含量亦会发生较大改变。具体而言，复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）的相对含量逐渐下降，嗜热子囊菌属（Thermoascus）和假丝酵母属（Candida）的相对含量逐渐升高，并成为了发酵后期的优势菌。普氏分析和相关性分析发现，真菌群落结构与中高温大曲整体的风味指标和滋味指标显著相关（P<0.05）。其中，酿酒酵母与酒曲中芳香类化合物、烷烃芳香成分、乙醇的合成密切相关；嗜热子囊菌属可能具有抑制有机硫化物和萜烯类化合物产生的功能；根霉属（Rhizopus）则具有抑制涩味物质形成的作用。本研究深化了人们对中高温大曲生产过程中真菌群落及品质特性变化规律的认识，同时为相关企业改进产品制作工艺和提高产品品质提供了有益的参考。Abstract: In this study, medium-high temperature Daqu (MHTD), the primary saccharification and fermentation agent in the production of strong-aroma Baijiu, was investigated across different fermentation stages. Employing national standard methods, artificial intelligence sensing technology, and high-throughput sequencing techniques, a comprehensive analysis was conducted to investigate the physicochemical properties, flavor, taste, and changes in fungal community structure during the MHTD fermentation process. The correlation between quality indicators of MHTD and dominant fungal genera was also explored. The results revealed that, during fermentation, the moisture content, levels of organic sulfur compounds, terpenes, hydroxides, and astringency gradually decreased in MHTD, while saltiness steadily increased. The fungal community structure of MHTD was established in the early stages of fermentation. However, as fermentation progressed, fungal community diversity gradually decreased, accompanied by significant changes in the relative abundance of certain genera. Specifically, the relative abundance of Saccharomycopsis gradually decreased, while Thermoascus and Candida increased, becoming dominant in the later stages of fermentation. Procrustes analysis and correlation analyses indicated a significant correlation (P<0.05) between fungal community structure and flavor and taste indicators of MHTD. Specifically, Saccharomyces showed a close relationship with the synthesis of aromatic compounds, alkane aromatic components, and ethanol in Daqu. Thermoascus, on the other hand, might play a role in inhibiting the production of organic sulfur compounds and terpene compounds. The genus Rhizopus demonstrated inhibitory effects on the formation of astringent substances. This study enhances the understanding of the dynamics of fungal communities and quality changes during MHTD production, providing valuable insights for improving production processes and enhancing product quality for relevant industries.
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浓香型白酒作为我国白酒三大基本香型之一，具有“窖香浓郁、绵柔醇甜、尾净香长”等特点，其销量长期占据白酒市场的主导地位[1]。中高温大曲作为浓香型白酒生产的主要糖化发酵剂，其质量是影响最终产品品质的主要因素之一[2]。因此，近年来如何对中高温大曲发酵过程进行有效控制，从而提升其生产性能已成为浓香型白酒发酵领域的研究热点之一。中高温大曲的制作一般经历配料、制坯和培曲发酵等步骤，在培曲发酵阶段，人们会通过反复的开闭门窗和揭盖草帘等操作控制发酵室的温度、湿度等环境条件。这些操作过程有利于酒曲中有益微生物的生长和代谢，促进了与白酒发酵相关的功能酶和风味物质的积累[3]。其中大曲来源的真菌对于发酵原料的降解、酒精产生、风味物质形成等多个过程至关重要[4]。例如，曲霉菌会在白酒发酵过程中产生多种酶，将淀粉类物质降解为更容易被微生物利用的小分子糖类[5]，而毕赤酵母菌则能够利用蔗糖和葡萄糖产生乙醇、乙酸乙酯、4-羟基-2-丁酮等多种风味物质[6]。截止目前关于中高温大曲的研究主要集中于大曲微生物群落结构解析[7]、大曲中潜在功能菌株的分离及应用[8−9]等方面。这些研究结果表明，中高温大曲中的优势真菌属主要包括曲霉属、热子囊菌属、嗜热真菌属，以及酿酒酵母、毕赤酵母属等酵母菌类群。此外，通过对酒曲中的目的菌株进行分离筛选，并强化应用，已被证明是提高基酒出酒率和酒精度的有效手段之一。然而，目前对于中高温大曲发酵过程中涉及的理化品质、风味品质以及真菌群落结构变化规律的深入研究较为有限。与此同时，中高温大曲品质指标与大曲中真菌群落结构之间的相互关系也尚未得到充分的揭示。
在研究技术方面，近年来随着分子生物学技术和测序技术的发展，高通量测序技术在各类复杂样品微生物群落结构解析方面的应用越来越广泛，并且取得了一系列的研究成果。XIAO等[10]研究发现，生物热是促进中温大曲功能性微生物群形成的主要内源性驱动因素；ZHANG等[11]发现微生物的代谢作用会影响大曲的风味形成；LIU等[12]则发现微生物群落结构和多样性的差异会对白酒风味的形成产生一定影响。在酒曲风味和滋味评价方面，除了传统的感官评定方法外，各类人工智能传感技术的应用日益广泛。其中，电子鼻和电子舌作为现代仿生学设备，通过传感器阵列模拟人类嗅觉和味觉系统，能够提供客观、准确的评价结果。例如，CAI等[13]采用电子鼻、电子舌以及高通量测序技术相结合的方法，成功揭示了酱香型白酒酿造所使用的三种不同颜色高温大曲真菌多样性以及白酒的风味和滋味品质特征，丰富和完善了人们对高温大曲的认识。由此可见，高通量测序技术和人工智能传感技术相结合在产品微生物群落结构解析及风味品质评价方面具有重要的应用价值。
本研究以中高温大曲发酵过程中3个关键时间节点，即潮火期（8 d）、后火期（19 d）和成熟期（30 d）的酒曲为研究对象，采用国标方法、人工智能传感技术和高通量测序技术，对不同发酵阶段中高温大曲理化性质、风味、滋味及真菌群落结构的变化规律进行了综合分析，探讨了中高温大曲品质指标与真菌微生物之间的相关关系。研究结果将有助于深化人们对中高温大曲生产过程中品质特性及真菌群落变化规律的认识，同时为相关企业改进产品制作工艺和提高产品品质提供了有益的参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
中高温大曲 采集自山东梁山某制曲厂，其中发酵时间处于潮火期（8 d）、后火期（19 d）和成熟期（30 d）的大曲样品分别为5份、5份和4份，共计14份。为确保样品具有足够的代表性及不同发酵阶段的样品具有可比性，本研究所有不同发酵阶段的样品均在公司经验丰富的生产工人协助下从所选定曲房的不同位置采集，曲块采集之后当天即完成样品的粉碎和过筛处理。具体操作为每份实验样品由曲房靠近门口、曲房中间及曲房靠近窗户相似高度的位置各选取一个曲块充分粉碎混匀后得到。为尽量避免酒曲在粉碎过程中的交叉污染，粉碎操作在开放的环境中进行，曲块在粉碎并充分混匀得到实验样品之后均使用高压冲气枪彻底清理粉碎机的叶片、磨膛和死角，确保不会对后续样品造成污染。实验样品采集后在低温冷链环境下尽快运抵实验室，于−20 ℃保存备用；氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、葡萄糖、可溶性淀粉、碘、碘化钾、无水乙酸钠、乙酸、乙醇、甲醛 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；基因组提取试剂盒 德国QIAGEN公司；rTaq酶、10×Buffer、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 北京全式金生物技术有限公司；清洁试剂盒 Axygen生物技术有限公司。
FA2204C电子天平 上海越平科学仪器（制造）有限公司；Veriti FAST梯度PCR仪 美国ABI公司；Illumina MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司；R930机架式服务器 美国Dell公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；SA402B电子舌 日本INSENT公司。
1.2 实验方法
1.2.1 不同发酵时间中高温大曲理化指标的测定
水分含量、酸度、氨基酸态氮、淀粉含量、液化力、糖化力、发酵力和酯化力均参照QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》进行测定。
1.2.2 不同发酵时间中高温大曲风味指标的测定
分别取5 g中高温大曲样品装于顶空瓶中，每份样品称取3个平行。顶空瓶密封后在室温条件下静置12 h，使风味物质充分挥发于顶空瓶后进行检测。电子鼻仪器由W1C（对芳香型化合物敏感）、W5S（对氢氧化物敏感）、W3C（对芳香型化合物敏感）、W6S（对氢化物敏感）、W5C（对烷烃芳香成分敏感）、W1S（对甲烷敏感）、W1W（对有机硫化物和萜烯类敏感）、W2S（对乙醇敏感）、W2W（对有机硫化物敏感）和W3S（对烷烃类敏感）共计10个金属传感器组成。电子鼻测试条件如下：传感器自洁时间200 s，传感器调零时间5 s，样品准备时间5 s，样品分析测定时间60 s，每间隔1 s测定一个数值，选取49、50、51 s时间对应的传感器数值进行求取平均值用于后续分析。
1.2.3 不同发酵时间中高温大曲滋味指标的测定
取不同发酵时间的中高温大曲样品各30 g分别溶解于120 mL纯水中，充分混匀。在室温下静置30 min后于10000 r/min转速下离心10 min，取上清液进行抽滤后装入样品瓶备用。电子舌仪器由酸味、苦味、涩味、咸味、鲜、后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度共计8个传感器组成，测试前需使用饱和KCl溶液对参比电极进行活化，随后进行传感器的安装。样品测试前，为了确保结果的稳定性和准确性，需要进行电子舌自检，自检通过后将经过前处理的中高温大曲样品滤液各取90 mL装入电子舌检测杯中。每个样品测定3次，取平均值用于后续分析。
1.2.4 不同发酵时间中高温大曲中真菌微生物的高通量测序
使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因组提取试剂盒对中高温大曲的总DNA进行提取，具体方法按照试剂盒说明书进行。对经1%琼脂糖电泳检测合格的中高温大曲微生物的总DNA，使用正反向引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'和ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对其中的真菌ITS区进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。将经1.5%琼脂糖电泳检测合格的PCR扩增产物送往上海美吉生物医药有限公司进行高通量测序
1.2.5 测序数据的生物信息学分析
使用QIIME平台（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.9.1）对下机测序数据进行真菌群落结构和多样性的分析。具体而言，使用FLASH软件按照重叠区碱基数≥10 bp、错配率≤20%的参数设置拼接成对的双端序列；使用PyNAST软件进行序列比对和校准；使用uclust工具按照97%的相似度划分操作单元（Operational Taxonomic Units，OTU）；使用vsearch软件识别和去除嵌合体；通过比对UNITE数据库（V9.0）确定各OTU的分类学地位；在相同测序深度下计算各样品的α多样性指数，评价样品中真菌群落结构的丰度和多样性。
1.3 数据处理
使用Origin 2018软件绘制理化指标折线图、风味及滋味指标雷达图、α多样性指数折线图和优势真菌门和属平均相对含量的堆积柱状图，使用R（v4.1.3）软件的vegan包（v2.6）进行普氏分析，使用Cytoscape软件绘制相关性网络图。使用Past3软件中的Mann-Whitney检验对理化指标、风味指标、滋味指标、优势真菌门和优势真菌属之间的差异性进行分析。
2. 结果与分析
2.1 不同发酵阶段中高温大曲理化性质分析
本研究对中高温大曲发酵过程中的理化指标进行了检测，结果如图1所示。
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图 1 不同发酵阶段中高温大曲的理化指标注：不同小写字母表示同一指标不同发酵阶段差异显著（P<0.05）；图3同。Figure 1. Physicochemical parameters in medium-high-temperature daqu at different fermentation times由图1（a）和（c）可知，随着发酵的进行，水分含量、酸度和氨基酸态氮指标逐渐下降，且潮火期和成熟期之间存在显著差异（P<0.05）。由图1（b）和（d）可知，中高温大曲后火期与潮火期相比，液化力和发酵力均显著下降（P<0.05），糖化力和酯化力虽然也有下降的趋势，但与潮火期差异不显著（P>0.05）。成熟期与后火期相比，发酵力、糖化力和酯化力均出现了上升的趋势，其中糖化力和酯化力显著升高（P<0.05），液化力则有持续下降的趋势，但是差异性不显著（P>0.05）。
随着发酵的进行，曲房及曲块的温度逐渐升高，曲块中的水分大量蒸发，这可能是曲块中水分含量下降的主要原因。酸度呈现持续下降的趋势则可能与中高温大曲发酵至中期之后，曲块温度的升高抑制了产酸微生物的繁殖代谢，同时部分微生物消耗有机酸形成酯类等化合物有关[14]。此外，本研究发现随着发酵的进行，单位重量大曲中检测到的淀粉含量呈现出逐渐上升的趋势。由于淀粉在发酵过程中绝对质量不会出现增加，推测该结果的出现主要与发酵导致的曲块中水分含量持续下降有关[15]。
液化力、糖化力、发酵力和酯化力是反映大曲质量和发酵特性变化的重要功能指标。根据国标QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》中对上述指标的定义，液化力是酒曲将淀粉从高分子状态转化为低分子状态的能力。本研究发现中高温大曲的液化力在潮火期处于最高值，随着发酵时间的延长其呈现明显下降的趋势。基于李燕荣等[16]的研究结果可知，在潮火期中高温大曲中霉菌的可培养数量处于峰值，随着曲温的不断升高，至大火期霉菌的数量急剧下降，并且在后火期其数量呈现进一步下降的趋势。由于霉菌是大曲中淀粉酶的主要生产菌，能够促进淀粉的分解转化[17]，其数量直接关系到酒曲液化力高低，霉菌数量在潮火期之后逐渐降低可能是中高温大曲液化力呈现上述变化趋势的主要原因。
糖化力反映了酒曲将淀粉转化为葡萄糖的能力，酯化力反映了大曲催化游离有机酸与乙醇合成酯的能力。本研究发现中高温大曲不同发酵时间的糖化力和酯化力变化趋势具有一定的相似性。刘敏芳等[18]和曹敬华等[19]分别对山西省某清香大曲中单品种后火曲和湖北省某酒厂高温大曲进行了研究，发现在酒曲的发酵初期，其糖化力普遍表现出一定程度的下降。这与本研究中高温大曲发酵初期糖化力的变化趋势一致，尽管在本研究中潮火期和后火期之间的差异性不显著。导致这一结果的主要原因可能与中高温大曲的制曲原料为小麦，在成熟的小麦种子内存在有大量游离态和束缚态的α淀粉酶、β淀粉酶等各种酶类，随着发酵的进行，原料中的各种酶类受高温的影响逐渐失活，导致糖化力在发酵初期出现了一定程度的降低[20−21]。酯化力在后火期与潮火期相比出现一定程度的下降，可能与后火期酒曲中的霉菌和酵母菌受发酵温度升高和大曲水分下降影响导致的其生长和代谢受到一定程度抑制有关，微生物菌群的这种变化会导致酯化力出现一定程度降低[14]。
发酵力反映了大曲将糖转变为乙醇的能力，已有的研究表明酵母菌是酒曲中乙醇的主要生产者，酒曲中酵母菌的丰度越高其发酵力一般也越强[22]。由于酵母菌对高温的耐受能力有限，导致其一般在酒曲生产的前期阶段最为丰富[23]。本研究中，后火期中高温大曲的发酵力与潮火期相比显著下降，可能与酒曲在进入后火期的过程中经历了高温发酵阶段，导致大量酵母菌死亡有很大关系。而随着发酵时间的延长，至成熟期的过程中曲房温度逐渐降低，各种不耐高温的微生物再次大量分裂繁殖，曲块中相关微生物丰富再次出现回升，导致发酵力、糖化力和酯化力等检测指标也出现了再次升高的现象[24]。
2.2 不同发酵阶段中高温大曲风味指标和滋味指标分析
本研究通过电子鼻和电子舌技术对不同发酵阶段中高温大曲的风味指标和滋味指标进行了测定，结果如图2所示。
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图 2 不同发酵阶段中高温大曲风味指标（a）和滋味指标（b）雷达图Figure 2. Radar chart of flavor index (a) and taste index (b) of medium-high temperature Daqu at different fermentation times由图2（a）可知，中高温大曲不同发酵阶段的样品中，W1W和W5S传感器呈现较高的响应值，表明大曲中含有丰富的有机硫化物、萜类物质和氮氢化物。然而，由于电子鼻设备无法具体检测这些化合物的组成，且不同化合物的风味特征有较大差异，因此对于中高温大曲具体的风味品质，仍需进一步深入研究以揭示。经Mann-Whitney检验发现，后火期与潮火期中高温大曲相比，几乎所有的风味指标均发生了显著变化，其中对芳香类物质比较敏感的传感器（W1C、W3C、W5C）响应值显著升高（P<0.05），而对烷烃类、氢氧化物、有机硫化物等风味物质比较敏感的传感器（W1W、W2W、W1S、W3S、W5S、W6S）响应值出现了显著的下降（P<0.05）。成熟期与后火期中高温大曲相比，没有传感器响应值显著升高（P>0.05），仅有W1W和W3S的响应值出现了显著下降（P<0.05）。由图2（b）可知，中高温大曲滋味指标中鲜味和咸味的传感器响应值最高，酸味和涩味的传感器响应值最低。随着发酵的进行，中高温大曲后火期与潮火期相比，酸度和涩味指标显著下降（P<0.05），丰度、咸味和鲜味指标显著升高（P<0.05）。成熟期与后火期中高温大曲相比，仅有咸味指标显著升高（P<0.05），而涩味、后味A、后味B、丰度和鲜味指标出现了显著的下降（P<0.05）。
风味和滋味品质是白酒产品风格特征的重要影响因素，本研究结果发现中高温大曲发酵过程中一部分风味和滋味指标检测值发生了显著变化，基于前人和本研究后续微生物的分析结果，导致上述变化的原因可能与酒曲中微生物的代谢活动存在很大的关系。本研究结果发现后火期与潮火期相比酒曲中芳香类物质含量显著升高、酸味显著下降，导致该结果可能的原因如下，一方面，在酒曲发酵过程中，随着温度升高Thermoascus等耐热菌属的丰度急剧增加[10]，这些菌在降解碳水化合物和生产己酸乙酯等芳香酯类化合物方面发挥着重要作用[25]；另一方面，本研究及前人研究结果均表明Thermoascus与酒曲酸度呈现一定负相关关系[26]。这可能是出现上述结果的主要原因。此外，本研究发现，随着发酵进行酒曲咸味持续升高，涩味、W1W和W3S持续下降。咸味主要与酒曲中无机盐的浓度紧密相关，而发酵过程中酒曲水分的蒸发会导致单位质量酒曲内无机盐含量的上升，这可能是造成咸味不断增强的主要原因。涩味主要与酒曲中的多酚类物质有关[27]，本研究后续结果发现，涩味与根霉属微生物存在极显著的负相关关系（P<0.05），W1W与Thermoascus存在极显著负相关关系（P<0.05），表明微生物的代谢活动可能是导致酒曲中涩味随着发酵持续下降的主要原因。
2.3 不同发酵阶段中高温大曲群落α多样性分析
本研究对采集的14份不同发酵阶段中高温大曲样品进行了高通量测序，进而解析了其真菌群落多样性信息。所有样本测序数据经过数据质量控制后共得到606546条高质量真菌序列，平均每个样品测得43324条序列，在97%相似度条件下对序列进行聚类后共得到1881个OTUs。通过对不同阶段样品中真菌的α多样性指数进行计算，结果如图3所示。
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图 3 不同发酵阶段中高温大曲的α多样性指数Figure 3. α Diversity index of medium-high temperature Daqu at different fermentation times由图3（a）和（b）可知，潮火期时中高温酒曲真菌的发现物种数指标和香农指数最高，发酵至后火期时，上述两个指标出现了下降的趋势，其中香农指数显著下降（P<0.05）。发酵至成熟期时，发现物种数指标有所回升，但是香农指数持续下降。成熟期与后火期相比，两个指标的变化均不显著（P>0.05）。
中高温大曲的发酵会经历先升温后降温的变化过程，其最高发酵温度可以达到59 ℃以上[28]。而多数真菌的致死温度范围为50~60 ℃[29]，因此随着大曲发酵温度的升高，至发酵中期时真菌会出现大量的死亡，这可能是导致发酵至后火期时发现物种数指标出现小幅下降的主要原因。同时值得注意的是，后火期不同样品的α多样性指标存在较大差异，该结果出现的可能原因如下：潮火期至后火期微生物生长迅速，曲房不同位置曲块发酵微环境差异对酒曲中微生物组成的影响较大[10]，由于本研究在采样时尽可能采集了曲房不同位置的曲块样品，这可能是导致不同曲块间真菌α多样性指数存在较大差异的主要原因。而发酵至成熟期时，发酵温度较发酵中期会出现一定的回落，一些不耐高温的真菌在这个时期会进一步生长繁殖，从而使得发现物种数指数出现了小幅的升高。然而，中高温大曲从潮火期至成熟期发酵过程中，香农指数呈现出了持续下降的趋势，这表明随着发酵进行，酒曲中真菌群落多样性和复杂性逐渐降低。在中高温大曲发酵过程中，某些真菌类群由于具有较强的环境适应性或营养竞争力，逐渐演变为优势菌种。同时，那些对环境变化敏感或营养需求较高的真菌类群则可能因无法适应新的发酵环境而逐渐消失。这些因素的共同作用可能是导致香农指数持续下降的主要原因。
2.4 不同发酵阶段中高温大曲群落组成分析
本研究进一步对不同发酵阶段中高温大曲的真菌群落组成进行了分析，大曲中平均相对含量>1%的门和属构成如图4所示。
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图 4 不同发酵阶段中高温大曲真菌群落组成注：（a）-门水平；（b）-属水平。Figure 4. Fungal community composition of medium-high temperature Daqu at different fermentation time由图4（a）可知，中高温大曲样品中优势真菌门主要包括子囊菌门（Ascomycota）、毛霉门（Mucoromycota）和担子菌门（Basidiomycota），三者的平均相对含量分别为88.02%、6.15%和5.28%。由图4（b）可知，中高温大曲样品中优势真菌属共有11个，分别为嗜热子囊菌属（Thermoascus，33.27%）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis，21.62%）、假丝酵母属（Candida，11.16%）、根霉属（Rhizopus，4.63%）、毛孢子菌属（Trichosporon，4.45%）、曲霉属（Aspergillus，4.11%）、嗜热真菌属（Thermomyces，3.91%）、酿酒酵母属（Saccharomyces，2.40%）、毕赤酵母属（Pichia，2.29%）、嗜热丝状真菌属（Rasamsonia，1.68%）和红曲菌属（Monascus，1.43%）。本研究进一步对不同发酵阶段中高温大曲真菌在属水平的组成进行了比较分析，结果发现中高温大曲真菌群落结构在发酵初期已经形成，即发酵成熟期的优势真菌属在潮火期也拥有较高的相对含量。然而，随着发酵的进行，部分真菌属的相对含量仍会出现比较大的波动。具体而言，发酵初期时真菌属以复膜孢酵母属为主，平均相对含量为42.49%，但是随着发酵的进行，该菌相对含量逐渐下降，发酵成熟期时，该菌相对含量降至7.85%。复膜孢酵母属是大曲发酵过程中的重要真菌属之一，为大曲发酵提供原动力，主要负责酒化和酯化[30]，亦会产生部分酶类从而影响大曲的风味物质[31]。由于发酵初期发酵室内温度和湿度适宜，氧气充足，所以给酵母菌和霉菌提供了生长繁殖的有利条件，这为中高温大曲的功能性奠定基础。随着大曲发酵的进行温度逐渐升高至顶温时，嗜热子囊菌属等对热耐受性更强的真菌大量繁殖，在后火期时平均相对含量达到50.05%，显著高于潮火期时8.55%的相对含量（P<0.01）。嗜热子囊菌属可为白酒生产提供丰富的蛋白酶和纤维素酶，从而对后续白酒生产中原料的充分利用起到积极的促进作用[32]。当中高温大曲发酵逐渐进入成熟期时，温度逐渐降低，假丝酵母属的相对含量呈现出了明显的增加趋势，嗜热子囊菌属的平均相对含量则出现小幅度下降。假丝酵母属是一类重要的酵母菌，能够在发酵过程中产生乙酸乙酯等香味物质和乙醇[18]，对提升白酒品质具有积极作用。上述结果表明，中高温大曲发酵不同阶段，大曲中的优势真菌微生物群落构成存在大幅度的波动。这提示人们在充分掌握微生物群落的特点和变化规律后，可以尝试通过合理的控制发酵过程提高中高温酒曲产品的质量和稳定性。
2.5 不同发酵阶段中高温大曲真菌群落与检测指标之间相关性分析
已有的研究结果发现酒曲理化、风味和滋味等检测指标与微生物群落结构组成之间往往存在密切的联系[33]，为了更深入地了解中高温酒曲中真菌群落结构与上述检测指标之间的潜在联系，本研究首先采用普氏分析，对不同发酵阶段中高温大曲中真菌群落结构与理化指标、风味以及滋味品质之间是否存在共同的变化趋势进行了解析，结果如图5所示。
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图 5 中高温大曲真菌属与理化指标（a）、风味指标（b）和滋味指标（c）的普氏分析注：图中字母代表不同发酵时期中高温大曲样品的编号。Figure 5. Procrustes analysis of fungal genera in medium-high-temperature Daqu with physicochemical (a), flavor (b),and taste (c) indicators由图5可知，真菌群落结构与风味指标和滋味指标均显著相关（P<0.05），其中与风味指标之间的相关性最强，但是与理化指标之间的相关性不显著（P>0.05）。表明中高温大曲中的真菌群落组成会对大曲的风味和滋味品质产生显著影响。为了揭示真菌属与各检测指标之间的详细相关关系，本研究进一步对优势真菌属与大曲风味和滋味指标之间的相关性进行了探究，结果如图6所示。
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图 6 中高温大曲优势真菌属与品质指标之间相关性网络图注：图中“—”表示正相关，“----”表示负相关；“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。Figure 6. Correlation network graph between dominant fungal genera in medium-high-temperature Daqu and quality indicators由图6可知，同一优势真菌属可影响多个指标，且同一个指标也可能被多个优势真菌属影响。其中酿酒酵母属与W3C、W5C、W2S和W2W显著正相关（P<0.05），与丰度、W5S、W6S和W1S显著负相关（P<0.05）；嗜热子囊菌属与咸味显著正相关（P<0.05），与W1W显著负相关（P<0.05）；相反，复膜孢酵母属与酸味和W1W显著正相关（P<0.05），与咸味显著负相关（P<0.05）；根霉属与涩味显著负相关（P<0.05）；毛孢子菌属与酸味和涩味显著正相关（P<0.05），与咸味和鲜味显著负相关（P<0.05）；红曲菌属则与W1W显著正相关（P<0.05）。上述结果表明，酿酒酵母与酒曲中芳香类化合物、烷烃芳香成分、乙醇的合成具有密切的关系；嗜热子囊菌属可能具有抑制有机硫化物和萜烯类化合物产生的功能；根霉属则具有抑制涩味物质形成的作用。值得注意的是，不同菌属与风味及滋味指标之间可能具有完全相反的相关关系，预示着这些菌属彼此间的功能属性可能截然相反。因此，中高温酒曲中的真菌群落组成是高品质酒曲生产需要关注的问题。
3. 结论
本研究深入分析了中高温大曲发酵过程中理化性质、风味、滋味及真菌群落结构的变化规律，探讨了中高温大曲品质指标与优势真菌属之间的相关关系。随着发酵的进行，中高温大曲中的水分、有机硫化物、萜烯类、氢氧化物含量以及涩味逐渐降低，而咸味逐渐升高。发酵特性方面，酒曲发酵力、糖化力及酯化力整体呈现出先降低后升高的变化趋势，其中发酵力在潮火期至后火期显著下降，糖化力及酯化力在后火期至成熟期显著升高。在微生物组成方面，中高温大曲的真菌群落结构在发酵初期已经形成，此时以复膜孢酵母属为主，随着发酵的进行，真菌群落多样性和复杂性逐渐降低，嗜热子囊菌属和假丝酵母属逐渐成为发酵后期的优势菌群。酒曲中的真菌属与高温大曲的风味和滋味品质之间均存在显著的相关关系，其中酿酒酵母与酒曲中芳香类化合物、烷烃芳香成分、乙醇的合成密切相关；嗜热子囊菌属可能具有抑制有机硫化物和萜烯类化合物产生的功能；根霉属则具有抑制涩味物质形成的作用。未来的研究可以进一步探究不同真菌属的代谢机制、互作关系以及其在酒曲中的竞争与协同作用，以更好地指导高品质酒曲的生产。
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图 1 不同发酵阶段中高温大曲的理化指标
注：不同小写字母表示同一指标不同发酵阶段差异显著（P<0.05）；图3同。
Figure 1. Physicochemical parameters in medium-high-temperature daqu at different fermentation times
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图 2 不同发酵阶段中高温大曲风味指标（a）和滋味指标（b）雷达图
Figure 2. Radar chart of flavor index (a) and taste index (b) of medium-high temperature Daqu at different fermentation times
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图 3 不同发酵阶段中高温大曲的α多样性指数
Figure 3. α Diversity index of medium-high temperature Daqu at different fermentation times
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图 4 不同发酵阶段中高温大曲真菌群落组成
注：（a）-门水平；（b）-属水平。
Figure 4. Fungal community composition of medium-high temperature Daqu at different fermentation time
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图 5 中高温大曲真菌属与理化指标（a）、风味指标（b）和滋味指标（c）的普氏分析
注：图中字母代表不同发酵时期中高温大曲样品的编号。
Figure 5. Procrustes analysis of fungal genera in medium-high-temperature Daqu with physicochemical (a), flavor (b),and taste (c) indicators
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