Effect of Ultrasonic Modification on the Interaction between Blueberry Pectin and Cyanidin-3-O-Glucoside
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摘要: 本文以不同超声处理（688、1376、2063 W/cm2，10、20、30 min）对蓝莓中水溶性果胶、螯合性果胶、碳酸钠可溶性果胶进行超声改性，并探讨改性果胶结构与果胶-矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）相互作用的关系。实验结果表明，超声改性使果胶与C3G之间的相互作用增强。超声功率2063 W/cm2处理10 min后，与未经超声改性相比，三种果胶均表现出与C3G的最大结合量（提高到约2~6倍），但长时间超声（20~30 min）不利于改性果胶与C3G的相互作用。经超声改性后，果胶-C3G复合物的粒径变小，Zeta电位增加，物理稳定性提高。在三种不同的果胶样品中，超声处理引起了果胶分子量的降低和甲基酯化，促进了支链结构的降解，提高了游离羧基的数量，并增加了结构网络空隙，超声处理对果胶结构特性的改变促进了果胶与C3G之间的相互作用。
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关键词:
- 蓝莓果胶组分 /
- 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 /
- 相互作用 /
- 超声改性
Abstract: This study involved the ultrasonic modification of water-soluble pectin, chelator-soluble pectin, and sodium carbonate-soluble pectin in blueberries using different ultrasonic treatments (688, 1376, 2063 W/cm2, 10, 20, 30 min). The research explored the relationship between the modified pectin structure and the interaction between pectin and cyanidin-3-O-glucoside (C3G). The results showed that ultrasonic modification resulted in enhanced interaction between pectin and C3G. After the ultrasonic treatment of 2063 W/cm2 for 10 min, all three pectins showed the maximum binding capacity with C3G, which was about 2~6 times higher than that without the ultrasonic modification. Whereas, prolonged ultrasonic time (20~30 min) was unfavorable for the interaction between modified pectin and C3G. After ultrasonic modification, the particle size of the pectin-C3G complexes became smaller, the Zeta potential was increased, and the physical stability was thus improved. In three different pectin samples, ultrasonic treatment induced a reduction in molecular weight and methyl esterification of the pectin, facilitated the degradation of the branched structures, promoted the number of free carboxyl groups, and increased the presence of structural network voids. The alteration of the structural properties of pectin by ultrasonic treatment facilitated the interactions between pectin and C3G. -
花色苷是蓝莓中的重要活性物质，主要由矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）、锦葵色素-3-葡萄糖苷和飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷组成。花色苷是一类黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和调节脂肪代谢等多种生物活性[1]。然而，花色苷稳定性较差，在环境中极易受到pH、光照、温度等因素影响而发生降解，显著影响其开发利用[2]。花色苷与果胶多糖、蛋白、多酚等食物组分相互作用，可以调节其稳定性并改善它的功能特性[3]。果胶是植物细胞壁的主要成分，与花色苷相互作用形成了具有果胶和花色苷功能的复合物。这不仅增强了花色苷的功能特性，还降低了其在环境中的损失，因此近年来备受研究关注[4]。例如，柑橘、苹果和甜菜果胶可以显著提高饮料中黑加仑花色苷的颜色稳定性[5]，而蓝莓果胶则可以改善花色苷的体外胃肠道稳定性，形成的复合物具有更高的抗氧化活性[6]。
果胶的分子结构是影响其与花色苷互作的重要因素之一。对果胶进行改性，可以显著影响花色苷-果胶复合物的结构和功能。果胶作为多种单糖及其衍生物构成的复杂大分子，主要由α-1,4-糖苷键连接的D-半乳糖醛酸（GalA）残基直链组成，包含高半乳糖醛酸（HG）、鼠李半乳糖醛酸-I（RG-I）和鼠李半乳糖醛酸-II（RG-II）三个结构域[7]。通过化学、生物和物理等方式改性果胶，可得到具有独特理化性质和生物活性的果胶衍生物。超声波（ultrasonic，US）处理是用于改变果胶多糖结构及其功能的直接有效的方法之一[8−10]。据报道，与天然果胶相比，US处理的果胶具有更好的生物活性[11]，更有利于生物体的吸收，这可能与果胶结构和链构象的变化有关[12−13]。此外，已有研究证实US改性后促进了果胶与白藜芦醇结合并提高了复合物生物活性[14]，但US修饰果胶结构对果胶和花色苷相互作用的影响尚不清楚。
本研究从蓝莓中提取水溶性果胶（water-soluble pectin，WSP）、螯合性果胶（chelator-soluble pectin，CSP）、碳酸钠碱溶性果胶（sodium carbonate-soluble pectin，NSP），对其进行US改性。以蓝莓中主要的花色苷单体C3G 为对象，研究US改性果胶与C3G的相互作用，明确US处理对果胶结构特性以及果胶结构特性变化对果胶与C3G相互作用的影响，揭示US修饰果胶-C3G相互作用的影响因素。研究结果将为提高含花色苷果汁制品食品性能、开发新食品配料提供参考，为扩大花色苷应用领域开辟新途径。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜蓝莓（秘鲁蓝莓） 购于南京市孝陵卫集贸市场；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（纯度>98%） 武汉中标科技有限公司；D-半乳糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-岩藻糖、半乳糖醛酸 标准品，上海源叶生物科技有限公司；1,2-环己二胺四乙酸（CDTA） 麦克林公司；甲醇、乙醇、丙酮、冰醋酸等分析纯化学试剂 国药集团化学试剂有限公司。
1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；NICOMP Z3000纳米粒度电位仪 美国PSS粒度仪公司；PHS-5 pH计 上海康仪仪器有限公司；Elx-800酶标仪 美国Bio-Tek公司；H1-16KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；EVO-LS10 扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司股份公司；探头US波处理器 宁波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet iS50型傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 不同果胶组分的提取
三种果胶组分的提取参考Lin等[15]所描述的方法略作修改。新鲜蓝莓洗净，搅拌机打碎后滤汁，沉淀使用冷冻干燥机干燥后研磨成粉过筛100目保存。将25 g冻干蓝莓粉在70 ℃下与250 mL 95%乙醇混合2 h。混合物在4 ℃下6000 r/min离心20 min，并抽滤获得沉淀。沉淀中加入30 mL 95%乙醇洗涤，离心并过滤4次，再用30 mL丙酮进行最终洗涤，离心过滤后为醇不溶性固体（AIS）。AIS室温干燥过夜，参照Koh等[16]的研究略作修改进行分馏。0.5 g AIS等分试样室温下溶解于50 mL 50 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH5.2）中，24 h后将混合物离心过滤以获得水溶性果胶（WSP）上清液。剩余沉淀溶解在50 mL 50 mmol/L CDTA，50 mmol/L乙酸钠（pH5.2）中24 h，离心过滤获得螯合性果胶（CSP）上清液。最后在剩余沉淀中加入50 mL 50 mmol/L碳酸钠，20 mmol/L硼氢化钠室温储存24 h，离心过滤以获得碱溶性果胶（NSP）上清液，所提果胶样品均储存在4 ℃下以备实验。
1.2.2 果胶US改性
对分离获得的WSP、CSP、NSP三种果胶样品进行US处理，以获得US改性果胶（USWSP、USCSP和USNSP）。探头US波处理器的最大功率为900 W，探头微尖的直径为5 mm。将果胶样品置于锥形烧瓶中。在不同振幅（15%、30%和45%）下US处理10、20和30 min（2 s开和3 s关）。在US处理过程中，使用冰水浴将溶液保持在40 ℃以下。根据以下公式计算US波功率强度[17]：
I=Pπr2 式中：I是超声强度（W/cm2）；P为输入功率（W）；r是超声探头的半径（cm）。总功率（900 W）的15%、30%和45%，这对应于688、1376和2064 W/cm 2。
使用冰醋酸将NSP和USNSP上清液pH调节至中性，并用去离子水对WSP、CSP和NSP以及USWSP、USCSP和USNSP溶液进行透析，以除去提取缓冲液中的盐残留物。透析袋的截留分子量为6~8 kDa。透析后将上清液冷冻干燥并储存在4 ℃备用。
1.2.3 果胶/改性果胶与C3G结合能力测定
1.2.3.1 C3G含量测定
参考Lin等[15]的方法并略作修改。分别将WSP/CSP/NSP与US改性果胶USWSP/USCSP/USNSP溶解在25 mmol/L乙酸盐缓冲液（pH4.0）中，浓度调整至0.5 mg/ mL，静置过夜使其充分水解。用25 mmol/L乙酸缓冲液（pH4.0）将C3G单体溶解至0.5 mg/mL。然后，将1 mL 0.5 mg/mL果胶和1 mL 0.5 mg/mL C3G溶液混合，保存在深色小瓶中，4 ℃下孵育18 h。将无果胶对照等体积的25 mmol/L乙酸缓冲液（pH4.0）与0.5 mg/mL C3G混合。18 h后，将混合物等分试样转移到离心过滤器中，并在8000 r/min、4 ℃下离心20 min分离游离和结合C3G。将C3G上清液滴加至已用25 mmol/L氯化钾（pH1.0）或400 mmol/L乙酸钠（pH4.5）缓冲溶液预先加入的96微孔板中，平衡90 min。使用酶标仪在520 nm和750 nm处获取吸光度读数。计算pH1.0和pH4.5之间的吸光度差。C3G含量按以下公式计算：
游离C3G含量(mg/L)=A×Mw×DF×1000ε×L 式中：A表示吸光度值；Mw表示矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；DF表示稀释因子；ε表示矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔消光系数，26900 L/mol·cm；L表示比色皿光范围为1 cm。
1.2.3.2 果胶/US改性果胶-C3G结合量的计算方法
果胶/改性果胶和C3G的结合能力参考Lin等[15]和Koh等[6]报道的方法测定，略有修改。结合C3G含量Cb（mg/L）是通过将对照组滤液中游离C3G浓度Ci（mg/L）与实验组滤液中的游离C3G浓度Cj（mg/L）的差值计算，最后结合C3G的量以μg/mg果胶表示。公式如下：
Cb(mg/L)=Ci−Cj 1.2.4 果胶-C3G复合物结构表征
将1.2.1获得的三种果胶组分、1.2.2获得的US改性果胶和1.2.3获得的果胶-C3G复合物采用真空冷冻干燥设备冻干成固体粉末。在此阶段之后，样品粉末已准备好进行进一步测定。
1.2.4.1 Zeta电位和粒径测定
果胶和果胶-C3G复合物的Zeta电位和平均粒径参考Tan等[18]所描述的方法。测量温度为25 ℃，溶液折射率固定为1.33。每个样品一式三份测量。
1.2.4.2 扫描电子显微镜
参照Tan等[18]的方法，使用扫描电子显微镜（SEM）观察果胶/US改性果胶和果胶-C3G复合物的微观结构。加速电压为2~5 kV，用铂喷雾处理样品固体粉末并在100和1000放大倍率下拍照。
1.2.5 果胶理化特性测定
1.2.5.1 果胶分子量测定
使用高效液相色谱仪分析测定果胶的分子量[19]。取3 mg果胶样品溶于1 mL流动相中，过0.45 μm水膜待测。色谱条件：流动相为含0.1 mol/L Na2SO4的PBS（0.01 mol/L pH6.8）缓冲溶液，凝胶柱为tsl-gelG3000SWXL，流速为0.4 mL/min，示差检测器（RID），柱温35 ℃。根据普鲁兰多糖分子量标准品（P-5、P-10、P-20、P-50、P-100、P-200）绘制标准曲线（y=−13271x+337375，x为出峰时间，R2为0.9991）计算果胶分子量。
1.2.5.2 果胶单糖组成分析
单糖组成测定方法参考Xing等[20]1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生法并略作修改。将100 μL果胶溶液（5 mg/mL）加入到100 μL 4.0 mol/L三氟乙酸中密封，120 ℃水解2 h。水解液冷却后加入200 µL甲醇用氮气吹干，重复3次后用100 μL去离子水溶解残渣。并加入100 μL NaOH溶液（0.6 mol/L）与残渣充分混合，取100 μL的混合物加入100 μL PMP甲醇溶液（0.5 mol/L）在70 ℃水浴孵育100 min进行衍生化反应。衍生后的溶液加入50 μL 0.3 mol/L HCl中和并用氮气吹干，随后加入1 mL去离子水溶解残余物并加入1 mL氯仿充分混匀萃取后静置，弃氯仿层，重复三次除去过量的PMP。经0.45 μm有机相滤膜过滤后进行色谱分析。色谱条件：色谱柱为Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为35 ℃，流动相为乙腈与0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.7）按照体积比17:83的混合液，流速为1 mL/min，检测波长为245 nm，进样量为20 µL。各类单糖标准曲线如表1所示。
表 1 单糖组分标准曲线Table 1. Standard curve of monosaccharide components单糖种类 标准曲线 甘露糖 y=11191x−105.67（R2=0.9936） 鼠李糖 y=9411.7x+39.099（R2=0.9975） 半乳糖醛酸 y=3442.7x+359.93（R2=0.9983） 葡萄糖 y=11049x+67.721（R2=0.9987） 半乳糖 y=9130.1x+10.84（R2=0.9990） 木糖 y=1976.5x−1670.5（R2=0.9995） 阿拉伯糖 y=15042x−89.025（R2=0.9992） 岩藻糖 y=41585x−42049（R2=0.9994） 1.2.5.3 傅里叶红外光谱分析
使用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱仪测量样品粉末。红外光谱记录在4000~500 cm−1的范围内，平均扫描32次。酯化度（DE）是根据先前报道的方法从FT-IR光谱中确定的[21]。DE是根据1700~1750 cm−1区域的峰面积和1600~1630 cm−1峰面积之比计算，公式如下：
DE(%)=(A1740A1740+A1620)×100 式中：A1740表示1740波数处的峰面积；A1620表示1620波数处的峰面积。
1.3 数据处理
统计分析是使用Origin 2021进行的。使用方差分析（ANOVA）分析所有实验结果的均值，并使用软件SPSS 25.0在P<0.05的统计显著性水平下进行比较。除非特别说明，否则所有实验均以样品一式三份进行，并报告平均值±标准偏差。
2. 结果与分析
2.1 不同US条件改性对果胶与C3G相互作用的影响
由表2可知，未经US改性的三种果胶中，WSP与C3G的结合量最低，NSP与C3G的结合量最高，三种果胶表现出的不同结合能力，推测与其结构的差异有关。Lin等[15]在研究不同pH条件下三种果胶组分和花色苷的相互作用时也有相似结论，即NSP更易与C3G结合。在较低的US强度下（688 W/cm2和1376 W/cm2），US处理时间从10 min延长到30 min，WSP和C3G的结合量整体呈现上升趋势，NSP与C3G的结合量表现为降低趋势，而CSP与C3G的结合则表现出先降低后增加的趋势。但在高强度2064 W/cm2超声处理后，随着处理时间的延长，三种果胶与C3G的结合均下降。进一步比较超声强度对果胶与C3G结合的影响，在相同US处理时间（10 min和20 min）下，随着US强度的增强，三种果胶与C3G的结合量显著增加（P<0.05）。US功率为2064 W/cm2 处理10 min时，三种果胶最大结合量分别为70.15±1.42、119.43±2.56、133.81±3.54 μg/mg果胶，与未改性相比，提高到约2~6倍。但US处理时间过长（>20 min）会减弱果胶-C3G的结合。这些结果表明在适宜的US条件下，改性果胶易与C3G相互作用形成复合物，这可能是因为US处理对果胶的结构改变促进了其与C3G的结合。不同US条件下，WSP/CSP/NSP三种果胶与C3G结合表现出不同的变化规律，这可能是因为三种果胶本身具有不同的键合状态和微观结构[21]，经US改性后果胶理化结构进一步发生改变，导致与C3G结合效果也呈现较大差异。
表 2 不同US参数下果胶-C3G结合量Table 2. Amount of pectin-C3G binding under different ultrasonic parameters果胶组分 超声强度（W/cm2） C3G结合量（μg/mg果胶） 0 min 10 min 20 min 30 min WSP 0 10.85±1.69B − − − 688 − 16.50±1.40Bb 15.00±0.47Cb 35.07±0.44Ba 1376 − 18.50±2.49Bb 31.47±1.8Bab 46.68±1.42Aa 2064 − 70.15±1.42Aa 49.93±0.98Aab 28.40±1.08Bb CSP 0 67.45±2.55A − − − 688 − 81.00±2.01ABb 80.13±2.37Bb 116.94±3.48Aa 1376 − 86.31±3.11ABa 64.27±2.12Cb 73.67±2.40ABab 2064 − 119.43±2.56Aa 97.75±1.67Aab 70.23±1.88ABb NSP 0 68.59±1.41A − − − 688 − 82.64±2.13Ba 62.67±1.65Bab 78.13±2.47Aa 1376 − 92.64±1.65ABa 65.15±0.47Bab 61.62±1.78Bb 2064 − 133.81±3.54Aa 80.35±5.24Aa 65.76±4.58Bb 注：同一行的不同小写字母表示显著差异（P<0.05）；同列中样品组内不同大写字母表示显著差异（P<0.05）。 2.2 果胶/US改性果胶-C3G复合物结构特性
2.2.1 果胶/US改性果胶-C3G复合物的粒径和电位
如表3所示，在pH4.0条件下，WSP/CSP/NSP均带负电荷，Zeta电位值分别为−5.65±0.30、−8.03±0.18和−22.76±0.61 mV。US处理后，三种果胶Zeta电位绝对值增大。结合表2中三种果胶与C3G的结合量分析可推测，果胶所携带的负电荷数是影响C3G结合的因素之一。这是因为NSP携带更多的负电荷，与C3G混合后表现出更高的果胶-C3G结合量，且经US改性后，具有更高负电荷的USWSP/USCSP/USNSP与C3G的结合量增加。除此之外，US处理后果胶-C3G复合物的绝对电位值增加，表明US改性可形成物理稳定性更高的果胶-C3G复合物。Zeta电位结果表明US可以增加果胶的电荷密度并形成更多的离子键。因此，US促进更高负电荷果胶与C3G芳香环骨架正电荷之间的静电相互作用，使它们形成更加有序的结构。
表 3 果胶/US改性果胶-C3G复合物的粒径和电位Table 3. Particle size and potential of pectin/US modified pectin-C3G complexes样品 粒径（nm） 电位（mV） WSP 2317.16±21.99B −5.65±0.30b USWSP 1634.06±94.25D −10.63±0.22d WSP-C3G 2589.93±74.68A −5.05±0.34a USWSP-C3G 2006.80±44.30C −6.98±0.16c CSP 1573.65±14.64A −8.03±0.18b USCSP 978.56±85.19C −11.05±0.66d CSP-C3G 1663.17±37.23A −6.22±0.56a USCSP-C3G 1409.47±68.22B −9.69±0.41c NSP 748.46±11.31A −22.76±0.61b USNSP 526.20±19.54C −36.95±0.91d NSP-C3G 778.95±49.37A −16.73±0.39a USNSP-C3G 661.67±37.61B −27.28±0.46c 注：同一列下的不同字母表示显著差异（P<0.05）；US条件为2064 W/cm2，10 min。 果胶-C3G复合物粒径如表3所示。未经US处理时，WSP/CSP/NSP的粒径分别为2317.16±21.99、1573.65±14.64和748.46±11.31 nm，表明NSP溶液体系的稳定性最高，WSP稳定性最低。果胶-C3G复合物粒径均高于果胶分子，表明果胶与C3G通过疏水和氢键等相互作用力形成的复合物彼此交联形成了粒径更大的复合物[22]。US处理后，果胶与C3G复合物粒径减小，可能是因为US波切割果胶侧链降低果胶空间尺寸，从而有效减小粒径。
2.2.2 果胶/US改性果胶-C3G复合物微观结构
利用扫描电镜分析了果胶/US改性（2064 W/cm2，10 min）果胶和NSP/USNSP-C3G复合物的微观结构，如图1所示。在100倍放大倍数下，不同果胶之间的微观形态差异较大，WSP呈现出致密、片状卷曲样结构，局部出现枝状结构。CSP呈现出不规则碎叶片状，而NSP与CSP结构相似，但叶片较大且表现出线状网络结构。经US处理后，三种果胶结构均向不规则形状转变，网络空隙增大，NSP结构受US影响最大，大片叶状结构变为细小片状或颗粒状。这可能是因为US处理产生的声空化作用使果胶链间的糖苷键断裂。
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图 1 果胶/ US改性（2064 W/cm2，10 min）果胶和NSP/ USNSP-C3G复合物的SEM图像Figure 1. SEM image of pectin/US modified (2064 W/cm2, 10 min) pectin and NSP/USNSP-C3G complexes以NSP果胶为例，观察了1000倍数下NSP-C3G复合物以及USNSP-C3G复合物的微观结构。放大后在果胶基质表面出现不规整球状凸起，有文献表明其为果胶包埋状态的C3G形式[23−24]。由图1可知USNSP-C3G比NSP-C3G复合物结合C3G更多，这与表2中US处理后促进果胶与C3G结合结果相符合。因此可知， C3G能与果胶分子结合，US处理降低了果胶分子链的空间位阻，暴露出更多结合位点，促成C3G与改性果胶结合。
2.3 果胶组分的结构特性
为了进一步了解C3G对不同果胶组分选择性结合的机制以及US处理如何促进果胶-C3G的相互作用，测定了US改性前后WSP/CSP/NSP的分子量、单糖组成以及甲酯化等指标。
2.3.1 US处理对果胶分子量的影响
如图2所示，US处理后WSP、CSP和NSP的均重分子量（Mw）均发生不同程度的下降。这是由于超声波空化效应生成的空化气泡快速破裂释放大量能量，产生局部高温高压引起聚合物的降解和断裂[25]。US处理起始阶段，空化效应引起果胶迅速降解，果胶Mw降低，随着US时间的延长，果胶中大分子聚集物变少，降解速度缓慢，Mw下降量减少。
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图 2 不同US时间和US功率处理后 WSP（A）、 CSP（B）和 NSP（C）的重均分子量Figure 2. Weight-average molecular weight of three pectin components after different ultrasonic time and ultrasonic power treatment WSP (A), CSP (B) and NSP (C)进一步研究US强度对果胶Mw的影响。如图2所示，10 min处理条件下，与未处理果胶相比，688 W/cm2 US处理使WSP/CSP/NSP的Mw分别降解6.80%、5.43%、5.87%，当US强度增加至2064 W/cm2后分别下降13.41%、13.85%、9.89%。这表明果胶链在高强度US下降解明显。US强度的增加将产生更高的空化能量并增加空化气泡的数量，从而具有更强的结构破坏作用，以提高果胶Mw的降解速率和程度。US处理可破坏果胶分子结构中的范德华力、氢键和疏水相互作用力等[26]，这种破坏最终导致果胶大分子延伸链结构断裂，从而形成更小的片段。结合表2可知，随着US改性后果胶Mw下降，改性果胶-C3G结合量主要呈现出先增加后减小的趋势，这可能是因为果胶大分子断裂成小片段增加结合位点，从而促进结合，但果胶分子进一步的减小会导致果胶的完整性丧失反而不利于结合。
2.3.2 US处理对果胶单糖组分的影响
果胶单糖组成直接影响果胶的结构和功能特性。研究分析了US处理对WSP、CSP和NSP三种果胶单糖组成的影响，如表4所示。半乳糖醛酸（GalA）是WSP、CSP中的主要单糖，分别占37.70%、56.11%，半乳糖（Gal）是NSP中占比最高的单糖（47.73%），其次是GalA（22.37%）和阿拉伯糖（Ara）（21.56%）。与CSP和NSP级分相比，在WSP检出的木糖（Xyl）和葡萄糖（Glc）可能来源于纤维素以及可溶性非果胶多糖[21]。有研究表明，丰富的中性糖含量可能导致果胶链结合位点数减少，阻碍与花色苷的结合[27−29]。
表 4 US处理对果胶单糖组分的影响Table 4. Effect of US on pectin monosaccharide components单糖（mol/%） WSP USWSP CSP USCSP NSP USNSP Man 3.39±0.25a 2.22±0.16b 1.43±0.11cd 1.11±0.10d 2.26±0.16b 1.77±0.11c Rha 4.54±0.55a 4.27±0.45a 2.37±0.09c 1.83±0.27c 3.61±0.30b 3.45±0.14b GalA 37.70±2.49d 49.95±1.04c 56.11±1.57b 67.04±1.49a 22.37±0.76e 39.83±1.47c Glc 4.22±0.33a 2.84±0.21b − − 1.58±0.08c 1.27±0.10c Gal 21.15±0.79c 14.66±0.41d 17.59±0.69d 11.48±0.87e 47.73±1.57a 35.41±0.52b Xyl 2.94±0.73a 1.85±0.77b − − − − Ara 23.45±1.21a 20.06±0.92b 21.43±1.68b 17.27±0.57c 21.56±1.70b 16.22±0.94c Fru 2.96±0.15b 3.71±0.24a 1.07±0.01d 1.23±0.11d 1.21±0.09d 1.61±0.21c GalA/（Rha+Ara+Gal+Fru+Xyl ） 0.68±0.04e 1.12±0.02c 1.32±0.01b 2.11±0.07a 0.30±0.01f 0.71±0.07d Rha/GalA 0.12±0.03a 0.08±0.01b 0.04±0.00c 0.03±0.00c 0.16±0.01a 0.09±0.01b （Ara + Gal）/Rha 9.82±0.80c 8.13±0.89c 16.43±0.35b 15.82±1.52b 19.03±1.53a 14.97±0.19b 注：同一行下的不同字母表示显著差异（P<0.05）；US-WSP/CSP/NSP为2064 W/cm2，10 min改性果胶；Man，甘露糖；Rha，鼠李糖；GalA，半乳糖醛酸；Glc，葡萄糖；Gal，半乳糖；Xyl，木糖；Ara，阿拉伯糖；Fuc，岩藻糖；−表示未检测到；GalA/（Rha+Ara+Gal+Fru+Xyl）表示果胶的线性和侧链的程度；Rha/GalA表示RG-I在果胶中的占比；（Ara+Gal）/Rha表示连接到RG-I骨架的侧链的平均长度。 US处理后，三种果胶组分的单糖类型均保持不变，但摩尔比（mol/%）略有不同。高度分支化的RG-I 结构域主要由鼠李糖（Rha）、Gal和Ara构成，US处理后这三种单糖的摩尔比不同程度降低，表明US处理可以降解果胶侧链。 Rha具有增强果胶链刚性的作用[30]，US处理降低Rha含量，减小了果胶链刚性强度，增加了果胶链的灵活性。三种果胶GalA摩尔百分比均显著增加（P<0.05），可能是由于US使果胶侧链断裂，导致GalA在主链中富集。通过GalA/（Rha+Ara+Gal+Fru+Xyl）的摩尔比计算得出果胶线性和侧链分支程度，由表4可知，WSP（0.68±0.04）和CSP（1.32±0.01）的线性程度较高，US处理后三种果胶的比值增大，表明US处理使果胶更加线性化。Rha/GalA表示RG-I在果胶中的占比，WSP和CSP的线性虽然都较高，但CSP的RG-I占比最低（0.04±0.00），支化结构较少，结合表2中两者在pH4.0下与C3G的结合力差约十倍。这表明C3G更倾向于与线性果胶结合，而丰富的侧链结构会限制结合。US处理后CSP的Rha/GalA比值变化不显著（P>0.05），表明US处理仅降解RG-I侧链而对HG主链影响较小。（Ara+Gal）/Rha表示侧链长度，相较于WSP和CSP，NSP虽然表现出低线性（0.30±0.01）和RG-I（0.16±0.01）的高占比，但在pH4.0条件下C3G结合量最高。这是可能是因为NSP具有最高的（Ara+Gal）/Rha比值（19.03±1.53）以及较低的Rha（3.61±0.30）摩尔比，表明其RG-I结构丰富，长链的RG-I结构更加柔软，有研究表明柔性侧链通常有助于酚类交联[31]。US处理后果胶（Ara+Gal）/Rha比值降低，其中NSP改性果胶降低比例最高，与未US相比，降低21.3%，这些结果表明US处理使果胶的分支程度下降，进一步证实了US处理可以降解果胶侧链。
对比表2果胶-C3G结合量的结果分析，US处理通过降低果胶侧链刚性强度以及果胶分支程度来影响果胶-C3G的相互作用。US改性后，果胶中性糖侧链被裂解，果胶刚性半柔性链被转化为柔性链，果胶链表现出更好的灵活性和较低的分支程度，暴露出更多的亲水和疏水口袋，减少了C3G和果胶分子之间的空间位阻、增加结合位点数，利于与C3G的结合。
2.3.3 不同US处理对三种果胶组分官能团的影响
分析了US处理对三种果胶FT-IR光谱的影响。图3A为未经US处理三种果胶的FT-IR光谱，如图所示，3280 cm−1吸收峰表示果胶分子中半乳糖醛酸分子内和分子间O-H拉伸振动。2927 cm−1左右出现的特征峰是由CH2组中的C-H弯曲振动引起。1700~1760 cm−1和1600~1630 cm−1处的特征峰分别归因于甲酯化羧基和离子羧基的C=O键的特征拉伸振动（COO−）[32]。三个果胶组分在1400 cm−1的特征峰表示为C-H弯曲振动，1013~1230 cm−1出现的特征峰由C-O拉伸振动和O-H弯曲引起，表明存在吡喃环结构。930 cm−1和832 cm−1则是D-吡喃葡萄糖基团和GalA的特征吸收峰[14]，峰强度可以反映GalA含量变化。
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图 3 果胶/US改性（10 min）果胶的FT-IR光谱Figure 3. FT-IR spectrum of pectin/ultrasonic modified pectin (10 min)US处理后，三种果胶光谱中特征峰的位置和幅度发生了不同程度的变化，但特征峰数量保持不变，表明US处理可能导致果胶分子链结构的打开和重排，而果胶的主要化学结构和组成物质得以保留。随着US强度的增加，1740 cm−1处的特征峰基本不变，而1612 cm−1的峰强度增加，表明US处理使果胶体系中游离GalA含量增加，这可以释放出更多的游离羧基。由表2可知，随着US强度的增加，果胶-C3G结合量呈现显著增加的趋势（P<0.05），结合FT-IR图谱结果表明US改性促进果胶释放出的游离羧基与C3G发生氢键和静电相互作用。
2.3.4 不同US处理对果胶/US改性果胶甲酯化程度的影响
进一步分析了果胶的甲酯化程度（图4），计算1740 cm−1（COO-R）峰面积与1620 cm−1（COO-）峰面积总和之比的平均值作为甲酯化程度（DE）[33]。由图3可知，随着US强度的增加，1612 cm−1处峰面积变大，表明DE逐渐降低。未经US处理时，WSP和CSP的DE值分别为34.0%和21.8%，US功率2064 W/cm2处理10 min后，WSP和CSP的DE值分别降低了9.7%和4.6%，而NSP的DE未检测到。DE的这种降低趋势可能是US的空化效应导致羧基的C=O键断裂[30,34]，这与果胶-C3G复合物粒径电位结果相符。DE大小依次为WSP>USWSP>CSP>USCSP>NSP>USNSP，结合表2可知，三种改性果胶结合C3G含量依次为USWSP<USCSP<USNSP，这些数据进一步表明US处理破坏了果胶结构，增加了表面积，从而在其表面上暴露了更多的游离COO-等带电基团。因此，携带更多负电荷（游离羧基）的果胶更有可能与携带正电荷（黄素阳离子）的C3G通过静电相互作用结合[35]，使US改性果胶结合C3G能力大于原始果胶。
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图 4 果胶/US改性果胶的甲酯化程度Figure 4. Degree of methyl esterification of pectin/US modified pectin3. 结论
探讨US处理对蓝莓中3种果胶组分性质的变化及其与C3G相互作用的影响。三种果胶组分与C3G表现出显著不同的结合能力，NSP最高，WPS最低；US改性果胶-C3G复合物Zeta电位值增大、粒径减小，表明US可以增强果胶C3G复合物的稳定性。US处理通过对果胶组分理化性质、微观结构的修饰促进与C3G的结合，且高功率US改性利于果胶与C3G的相互作用，但长时间US（20~30 min）不利于两者相互作用。这表现在US处理后果胶侧链和晶体结构破坏，使分支程度和甲酯化程度显著降低，游离羧基含量增加并暴露出更多的亲水和疏水口袋，这些因素的协同作用下促进C3G和果胶分子之间的氢键相互作用和静电相互作用。可见，US改性处理可作为一种调控果胶和C3G相互作用的有效手段。
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图 1 果胶/ US改性（2064 W/cm2，10 min）果胶和NSP/ USNSP-C3G复合物的SEM图像
Figure 1. SEM image of pectin/US modified (2064 W/cm2, 10 min) pectin and NSP/USNSP-C3G complexes
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图 2 不同US时间和US功率处理后 WSP（A）、 CSP（B）和 NSP（C）的重均分子量
Figure 2. Weight-average molecular weight of three pectin components after different ultrasonic time and ultrasonic power treatment WSP (A), CSP (B) and NSP (C)
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图 3 果胶/US改性（10 min）果胶的FT-IR光谱
Figure 3. FT-IR spectrum of pectin/ultrasonic modified pectin (10 min)
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图 4 果胶/US改性果胶的甲酯化程度
Figure 4. Degree of methyl esterification of pectin/US modified pectin
表 1 单糖组分标准曲线
Table 1 Standard curve of monosaccharide components
单糖种类 标准曲线 甘露糖 y=11191x−105.67（R2=0.9936） 鼠李糖 y=9411.7x+39.099（R2=0.9975） 半乳糖醛酸 y=3442.7x+359.93（R2=0.9983） 葡萄糖 y=11049x+67.721（R2=0.9987） 半乳糖 y=9130.1x+10.84（R2=0.9990） 木糖 y=1976.5x−1670.5（R2=0.9995） 阿拉伯糖 y=15042x−89.025（R2=0.9992） 岩藻糖 y=41585x−42049（R2=0.9994） 
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表 2 不同US参数下果胶-C3G结合量
Table 2 Amount of pectin-C3G binding under different ultrasonic parameters
果胶组分 超声强度（W/cm2） C3G结合量（μg/mg果胶） 0 min 10 min 20 min 30 min WSP 0 10.85±1.69B − − − 688 − 16.50±1.40Bb 15.00±0.47Cb 35.07±0.44Ba 1376 − 18.50±2.49Bb 31.47±1.8Bab 46.68±1.42Aa 2064 − 70.15±1.42Aa 49.93±0.98Aab 28.40±1.08Bb CSP 0 67.45±2.55A − − − 688 − 81.00±2.01ABb 80.13±2.37Bb 116.94±3.48Aa 1376 − 86.31±3.11ABa 64.27±2.12Cb 73.67±2.40ABab 2064 − 119.43±2.56Aa 97.75±1.67Aab 70.23±1.88ABb NSP 0 68.59±1.41A − − − 688 − 82.64±2.13Ba 62.67±1.65Bab 78.13±2.47Aa 1376 − 92.64±1.65ABa 65.15±0.47Bab 61.62±1.78Bb 2064 − 133.81±3.54Aa 80.35±5.24Aa 65.76±4.58Bb 注：同一行的不同小写字母表示显著差异（P<0.05）；同列中样品组内不同大写字母表示显著差异（P<0.05）。
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表 3 果胶/US改性果胶-C3G复合物的粒径和电位
Table 3 Particle size and potential of pectin/US modified pectin-C3G complexes
样品 粒径（nm） 电位（mV） WSP 2317.16±21.99B −5.65±0.30b USWSP 1634.06±94.25D −10.63±0.22d WSP-C3G 2589.93±74.68A −5.05±0.34a USWSP-C3G 2006.80±44.30C −6.98±0.16c CSP 1573.65±14.64A −8.03±0.18b USCSP 978.56±85.19C −11.05±0.66d CSP-C3G 1663.17±37.23A −6.22±0.56a USCSP-C3G 1409.47±68.22B −9.69±0.41c NSP 748.46±11.31A −22.76±0.61b USNSP 526.20±19.54C −36.95±0.91d NSP-C3G 778.95±49.37A −16.73±0.39a USNSP-C3G 661.67±37.61B −27.28±0.46c 注：同一列下的不同字母表示显著差异（P<0.05）；US条件为2064 W/cm2，10 min。
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表 4 US处理对果胶单糖组分的影响
Table 4 Effect of US on pectin monosaccharide components
单糖（mol/%） WSP USWSP CSP USCSP NSP USNSP Man 3.39±0.25a 2.22±0.16b 1.43±0.11cd 1.11±0.10d 2.26±0.16b 1.77±0.11c Rha 4.54±0.55a 4.27±0.45a 2.37±0.09c 1.83±0.27c 3.61±0.30b 3.45±0.14b GalA 37.70±2.49d 49.95±1.04c 56.11±1.57b 67.04±1.49a 22.37±0.76e 39.83±1.47c Glc 4.22±0.33a 2.84±0.21b − − 1.58±0.08c 1.27±0.10c Gal 21.15±0.79c 14.66±0.41d 17.59±0.69d 11.48±0.87e 47.73±1.57a 35.41±0.52b Xyl 2.94±0.73a 1.85±0.77b − − − − Ara 23.45±1.21a 20.06±0.92b 21.43±1.68b 17.27±0.57c 21.56±1.70b 16.22±0.94c Fru 2.96±0.15b 3.71±0.24a 1.07±0.01d 1.23±0.11d 1.21±0.09d 1.61±0.21c GalA/（Rha+Ara+Gal+Fru+Xyl ） 0.68±0.04e 1.12±0.02c 1.32±0.01b 2.11±0.07a 0.30±0.01f 0.71±0.07d Rha/GalA 0.12±0.03a 0.08±0.01b 0.04±0.00c 0.03±0.00c 0.16±0.01a 0.09±0.01b （Ara + Gal）/Rha 9.82±0.80c 8.13±0.89c 16.43±0.35b 15.82±1.52b 19.03±1.53a 14.97±0.19b 注：同一行下的不同字母表示显著差异（P<0.05）；US-WSP/CSP/NSP为2064 W/cm2，10 min改性果胶；Man，甘露糖；Rha，鼠李糖；GalA，半乳糖醛酸；Glc，葡萄糖；Gal，半乳糖；Xyl，木糖；Ara，阿拉伯糖；Fuc，岩藻糖；−表示未检测到；GalA/（Rha+Ara+Gal+Fru+Xyl）表示果胶的线性和侧链的程度；Rha/GalA表示RG-I在果胶中的占比；（Ara+Gal）/Rha表示连接到RG-I骨架的侧链的平均长度。
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