Improvement Effect of Shiitake Glycoprotein against Lead Acetate-induced Toxicity in Rats
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摘要: 目的：通过优化提取工艺获得具有促排铅功能的香菇糖蛋白，探讨其对醋酸铅诱导铅中毒大鼠的防治效果。方法：利用热水浸提去除蛋白以及层析技术获得香菇糖蛋白纯品，利用红外光谱分析、单糖组成、N端氨基酸及内部氨基酸序列分析技术鉴定了香菇糖蛋白的分子特性。将63只雄性SD大鼠随机分为9组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、香菇糖蛋白处理组（4、8、160 mg/kg）和香菇子实体处理组（4、12、36 g/kg），通过腹腔注射醋酸铅制备大鼠铅中毒模型，连续给药30 d，观察大鼠的外观表现，检测体重变化、血液和脏器中的铅含量以及生化指标。结果：提纯的香菇糖蛋白（LEPP）经过单糖组成分析发现其是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖、核糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖组成，氨基酸序列分析发现其N端序列为MPEQVVVADA，说明香菇糖蛋白具有多糖和蛋白的成分。动物实验表明，香菇糖蛋白能够促进铅中毒大鼠的体重增长，显著降低血液和肝脏中铅的含量（P<0.05），具有排除铅在肝脏中的沉积作用，显著提高血清中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性（P<0.05），降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量（P<0.05），提高机体的抗氧化能力，同时香菇糖蛋白还可以降低血液中谷草转氨酶（Glutamic Oxaloacetic Transaminase，AST）和谷丙转氨酶（Glutamic-Pyruvic Transaminase，ALT）的水平，具有保护肝脏的作用。结论：香菇糖蛋白可以排除体内的重金属铅，有效地改善大鼠的铅中毒症状。Abstract: Objective: This study was conducted to investigate the purification process aimed at obtaining a shiitake glycoprotein with lead eliminating effect, and to explore its preventive and therapeutic efficacy against lead acetate-induced lead toxicity in a rat model. Methods: The crude polysaccharide was extracted from shiitake mushrooms using a hot water extraction method, followed by further purification involving protein removal and chromatography techniques to obtain the bioactive glycoprotein. The molecular characteristics of the glycoprotein were determined through various analytical methods, including infrared spectroscopy analysis, monosaccharide composition analysis, N-terminal amino acid sequencing, and internal amino acid sequence analysis. To evaluate the bioactive potential of shiitake polysaccharide-peptide in addressing lead poisoning in rats, 63 male Sprague-Dawley rats were randomly distributed into nine groups, including a control group, a model group, a positive control group, and shiitake glycoprotein treatment groups at doses of 4, 8 and 160 mg/kg, as well as shiitake fruiting body treatment groups at doses of 4, 12 and 36 g/kg. Lead poisoning was induced in the rats via intraperitoneal injection of lead acetate. The rats were administered polysaccharide-peptide and shiitake fruiting body treatments for a duration of 30 days, with observations made regarding their physical condition. Parameters assessed included body weight, lead content in blood and various organs, as well as biochemical markers in serum. Results: The monosaccharide composition analysis showed that the purified shiitake glycoprotein (LEPP) was composed of glucose, mannose, galactose, glucuronic acid, xylose, fucose, ribose, galacturonic acid, arabinose and rhamnose. The amino acid sequence analysis showed that the N-terminal sequence was MPEQVVVADA, indicating that the shiitake glycoprotein had polysaccharide and protein components. The findings indicated that shiitake glycoprotein effectively promoted weight gain in rats afflicted with lead poisoning. It significantly reduced lead concentrations in both blood and liver, mitigated lead deposition within the liver, enhanced the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the serum, lowered the levels of malondialdehyde (MDA) （P<0.05）, and improved overall antioxidant capacity. Moreover, shiitake glycoprotein led to decreased levels of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in the blood, signifying its hepatoprotective qualities. Conclusion: In summary, shiitake glycoprotein exhibited the capability to remove the heavy metal lead from the body and ameliorate the symptoms of lead poisoning in the rat model.
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Keywords:
- shiitake /
- glycoprotein /
- lead poisoning /
- lead eliminating effect /
- hepatoprotection
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随着工业的发展，重金属造成的污染问题日趋严重，其中铅污染是最广泛的职业和环境危害之一，据统计，全球每年约有500万吨铅（Pb）排放到环境中[1−2]，它涉及到油漆、汽油添加剂、化妆品、陶瓷、玻璃、电池辐射防护材料和弹药等制造行业，铅的大量应用促使其过度排放，以不同化合物的形式随着汽车尾气、工业废料、污水等途径排出而污染空气、土壤、水体甚至是农作物，对环境造成严重且持久的影响[3−5]。生活在此环境中的人群通过饮食、呼吸和皮肤吸收水和食物、空气中的铅而处于铅长期暴露的状态。在日常生活中，人体通过皮肤、呼吸道、消化道吸收铅，其中进入呼吸道的铅约有20%～40%留在体内[6]。由于铅不能通过化学或生物修复过程降解，因此长时间的暴露会对人类健康产生极大的威胁。如铅暴露会引发一些心血管疾病，例如冠心病、高血压等[7−8]。
铅进入机体后经循环和呼吸系统作用可以分布在机体绝大部分的组织器官中，并以不溶性磷酸铅的形式沉积到骨骼、毛发、牙齿、肝脏、肾脏、脑、肌肉等软组织和血液中，直接对机体产生毒害作用，这种沉积是引起慢性铅中毒的重要途径[9]。铅一旦被人体所吸收，就会被血液所运输，通过抑制血红蛋白的合成，影响造血系统。铅在体内不仅可与谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、SOD等酶分子中-SH及其活性中心金属离子（如Zn2+，Se2+）作用，使酶活力下降，还可以产生超氧阴离子自由基和一氧化氮（NO）等活性自由基，破坏机体的抗氧化保护，进而引起DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质异常修饰等多种损伤[10−11]，铅的毒性很强，少量的铅就能引起神经系统、造血系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统等不同程度的损伤，引发一系列相关的临床病症，甚至影响生殖能力等[12]。目前，对于铅中毒的临床治疗主要采用金属螯合剂与体内的铅螯合形成水溶性物质，通过尿液排出体外。螯合药物虽有排铅的作用，但是其副作用较为显著，能够引发疲劳、乏力、食欲减退、恶心等不良反应，甚至会增加肾脏负担，严重时会造成急性肾衰竭。因此寻找安全有效，毒副作用小的天然产物替代临床药物治疗铅中毒迫在眉睫。
香菇子实体中富含多糖、蛋白、多酚、黄酮等物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化衰老、抗疲劳抑郁、抗病毒、抗辐射等作用[13−14]，是一种药食同源的食用菌。有研究表明，食用菌对环境中的重金属元素具有富集吸附的生物学特性[15]。香菇属于丝状真菌，其细胞壁的主要成分是多糖，是吸附与富集重金属的重要部位，有研究报道通过透射电镜能够观察到金属镉积累在糙皮侧耳菌丝的细胞壁上[16]，X-射线能量耗散技术观察发现真菌细胞壁存在一些结构多糖对重金属起到吸附作用[17]。同时香菇多糖中富含-COOH、-PO3H2、-NH2和-OH等主要官能团，这些官能团具有很强的重金属吸附能力，据分析香菇多糖中还含有亚铁离子，能够络合或隔离重金属[18−19]。目前对于香菇富集重金属的研究多数集中于对子实体的营养检测和菌渣富集污水中重金属能力的评价，对于其应用于体内排铅作用的研究还未见报道。
本研究通过检测生理指标以及血清和器官中铅残留来评价香菇糖蛋白的铅清除功能以及对铅中毒症状的改善作用，为香菇的药用功能开发应用以及深加工产品的研发奠定了科学基础，为治疗重金属铅中毒的药物开发提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雄性SPF级别SD大鼠 体重在250±20 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（津）2020-0008。动物每2只为一笼，在22~25 ℃的环境下，按照12 h/12 h的昼夜节律进行饲养，饮用水和食物不受限制，实验开始前在此环境下饲养动物1周，使其适应环境。本研究中所涉及的大鼠相关实验，全程均符合实验动物管理条例和动物实验管理的相关要求，并且实验获得了天津南开大学实验动物委员会的批准（NKYY-DWLL-2020-091）；香菇 北京市三宝乡合作社；铅标准品（1000 μg/mL） 北京计量科学研究院；氯化钠、硫酸、硝酸、乙酸钠、磷酸二氢钠 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、氢氧化钠、十二水和磷酸氢钠、乙酸、三氯甲烷、正丁醇 北京化工厂；无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂；重蒸酚、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒P100-1/1200-2、彩虹180广谱蛋白Marker PR 1910 北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白质定量测试盒PA10 博迈德生物技术有限公司；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）检测试剂盒 南京建成生物技术有限公司；上述试剂均为分析纯。
FR224CN分析天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；XMTD-6000智能恒温水浴锅 北京长风仪器仪表有限公司；5430R台式高速冷冻离心机 美国Eppendrof公司；FORMA-700立式超低温冰箱 北京诚茂兴业科技发展有限公司；GL-1000C高速冷冻大容器离心机 上海安亭仪器厂；BSZ-100自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；R-215 Buchi旋转蒸发仪 步琦实验室设备贸易有限公司；F08-6T大型低温真空干燥器 金西盟北京仪器有限公司；ATKA蛋白纯化系统 美国GE公司；Infinite M200酶标仪 瑞士Tecan公司。
1.2 实验方法
1.2.1 香菇活性糖蛋白的提取及纯化
香菇活性糖蛋白的提取：香菇子实体晾干后粉碎，获得香菇干粉。香菇干粉以1:35的比例加入去离子水，在85 ℃的水浴锅中水浴4 h，混合溶液以6500 r/min的转速离心30 min，收集上清液进行浓缩，浓缩后的溶液以1:4的比例加入无水乙醇，静置过夜。乙醇混合液以6500 r/min的转速离心30 min，收集沉淀烘干至溶剂挥发，获得粗提物。香菇粗提物用蒸馏水溶解，利用Seavge法去除溶液中的蛋白，反复操作，直至没有蛋白质沉淀。将除蛋白后的香菇提取物水溶液进行浓缩，冷冻干燥，即可制得香菇糖蛋白粗提物。
香菇活性糖蛋白的纯化：装填DE-52阴离子交换柱（5.0 cm×10 cm），用5倍柱体积去离子水平衡层析柱，香菇糖蛋白粗提物利用去离子水充分溶解，以6000 r/min离心20 min，取上清液进行阴离子交换层析，层析柱依次用0、50、150 mmol/L、1 mol/L NaCl溶液进行分段洗脱，利用苯酚-硫酸法和BCA法测定洗脱液中多糖和蛋白的含量，以多糖含量和洗脱体积绘制洗脱曲线，合并吸收峰的各管洗脱液，透析后浓缩进行真空冷冻干燥，得到不同的香菇糖蛋白提取组分D1~D4。分别测定D1~D4组分对铅的吸附能力，选取吸附能力强的组分进行CM-cellulose阳离子交换层析。
根据铅吸附的检测结果，筛选出组分D4进行CM-cellulose阳离子交换层析。装填CM-cellulose阳离子交换柱（3.0 cm×10 cm），用10 mmol/L pH5.6的HAc-NaAc缓冲液平衡层析柱。D4组分利用同样缓冲液溶解，离心取上清后上样，依次用10 mmol/L pH5.6的HAc-NaAc缓冲液、50 、150 mmol/L和1 mol/L NaCl溶液（用10 mmol/L缓冲液溶解）进行分段洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法测定多糖含量并绘制洗脱曲线合并吸收峰的各管洗脱液，透析后浓缩进行真空冷冻干燥，分别检测各组分对铅的吸附能力，选取吸附效果强的组分进行Superdex200凝胶柱层析。
选择对铅吸附率较高的D4C1组分进行凝胶过滤层析。预先用脱气的去离子水平衡预装柱，用脱气的去离子水溶解样品，离心取上清后上样，用脱气去离子水进行洗脱，流速为0.5 mL/min，收集洗脱液后，用苯酚-硫酸法测定每管洗脱液中多糖的含量，并检测洗脱峰对铅的吸附能力。收集有活性的组分冷冻干燥，得到香菇活性糖蛋白LEPP。
1.2.2 香菇活性糖蛋白体外吸附铅功能检测
利用铅标准品配制成10 μg/mL溶液，提取物样品与10 μg/mL铅溶液以1:1比例混合，在室温下以160 r/min充分振荡3 h，其后加入4倍体积的无水乙醇混合均匀，室温下静置1 h，然后在9000 r/min转速下离心10 min，取上清用5%的稀硝酸进行稀释，利用石墨炉法测定样品中铅的含量。检测中以去离子水代替提取物样品的处理组设置成对照组。香菇活性糖蛋白对铅的吸附率按照下面公式计算：
吸附率(%)=对照组上清液中铅的含量−实验组上清液中铅的含量对照组上清液中铅的含量×100 1.2.3 香菇糖蛋白的单糖组成及摩尔配比分析
香菇活性糖蛋白送至山东青岛科创质量检测有限公司测定单糖组成。利用多糖糖醇醋酸盐衍生物的方法对样品的单糖组成和摩尔比进行测定。以鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等单糖为标准样品进行标准曲线的制作[20−21]。
1.2.4 香菇活性糖蛋白傅里叶红外光谱分析
香菇活性糖蛋白送至山东青岛科创质量检测有限公司进行红外光谱分析[20−21]。
1.2.5 香菇活性糖蛋白内部氨基酸序列分析
利用SDS-PAGE凝胶电泳方法，将获得的糖蛋白条带切割下来，送至清华大学公共检测平台检测，将获得的数据与NCBI中真菌库进行比对[20−21]。
1.2.6 N端氨基酸序列分析
将SDS-PAGE电泳条带切割后通过Western-blot技术，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后用考马斯亮蓝R-250染色，将膜送至清华大学公共检测平台进行检测[20−21]。
1.2.7 动物建模及实验操作
将63只大鼠随机分组，设置成模型组，阳性对照组，香菇糖蛋白低、中、高剂量组，香菇子实体低、中、高剂量组和空白对照组9个组，每组7只大鼠，采用同一水平铅染毒，建立铅中毒模型：连续7 d腹腔注射Pb（Ac）2溶液（20 mg/kg体重），恢复3 d，连续30 d腹腔注射Pb（Ac）2溶液（5 mg/kg体重）。建模成功后对大鼠进行不同的给药处理，模型组在建立铅中毒模型后不进行处理；阳性对照组是建立铅中毒模型后连续30 d灌胃300 mg/kg BW EDTA-2NaCa溶液（0.8 mL/100 g体重）；香菇糖蛋白低、中、高剂量组则是建立铅中毒模型后分别连续30 d灌胃40 、80、160 mg/kg BW香菇糖蛋白溶液（0.8 mL/100 g体重）；为了评价香菇作为食物直接食用是否具有排铅的功效，本研究设计了香菇子实体处理组，并根据前期预实验设计了香菇子实体的给药剂量。香菇子实体低、中、高剂量组则是建立铅中毒模型后分别连续30 d饲喂含0.4%、1.2%、3.6%香菇子实体饲料（5 g/300 g体重）[22]。空白对照组连续7 d腹腔注射生理盐水，恢复3 d，再连续30 d腹腔注射生理盐水。实验过程中每6 d眼眶取血一次，测定血液中铅含量；实验结束后，取大鼠的血浆、肝脏、肾脏、心脏和脾后续分析。进行研磨消解，检测其铅含量，取血浆测定生化指标。
1.2.8 组织中铅含量的测定
采用湿法消化组织样品，取适量的肝脏、肾脏、心脏和脾组织，加入硝酸和浓硫酸进行消解至淡黄色溶液，利用石墨炉法[23]测定样品中铅的含量。
1.2.9 血清生化指标的测定
利用试剂盒测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）的含量。
1.3 数据处理
采用统计学软件SPSS 22.0（IBM公司）进行处理分析，多组数据比较采用方差分析，采用F检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 香菇活性糖蛋白的纯化
香菇活性糖蛋白经过热水浸提、乙醇沉淀后得到粗多糖，如图1所示，粗多糖经过DE-52阴离子交换柱层析时在1 mol/L NaCl洗脱时获得具有铅吸附功能的洗脱峰，收集浓缩后进行CM-cellulose阳离子交换层析，活性组分集中在10 mmol/L HAc-NaAc缓冲液洗脱组分，将活性洗脱液浓缩进行Superdex200凝胶过滤层析，收集洗脱峰，浓缩，冻干得到香菇活性糖蛋白提纯品LEPP。经过苯酚-硫酸法和BCA蛋白定量分析发现，LEPP是由大量多糖和少量蛋白组成的，其含量分别约为81.6%和2.3%。
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图 1 香菇糖蛋白纯化曲线注：A. DE-52阴离子交换柱层析洗脱曲线；B. CM-cellulose阳离子交换层析多糖洗脱曲线；C. FPLC凝胶过滤层析多糖洗脱曲线。Figure 1. Purification curves of shiitake glycoprotein2.2 糖蛋白单糖组成及分子量
利用多糖糖醇醋酸盐衍生法对香菇活性糖蛋白进行衍生化处理，通过气相色谱-质谱联用技术对样品中的单糖组成和含量进行测定，结果见表1所示。香菇活性糖蛋白是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖、核糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖组成，其摩尔比为10.83:0.82:0.18:2.35:0.63:70.88:6.44:2.84:0.62:1.58，其中葡萄糖含量最大，其次是甘露糖。
表 1 香菇活性糖蛋白单糖组成Table 1. Composition of active glycoprotein monosaccharides of shiitake单糖种类 含量（mg/kg） 甘露糖 1951.84 核糖 124.25 鼠李糖 30.40 葡萄糖醛酸 456.45 半乳糖醛酸 122.29 葡萄糖 12769.55 半乳糖 1160.15 木糖 426.07 阿拉伯糖 93.65 岩藻糖 258.60 2.3 香菇糖蛋白红外光谱检测分析
为初步分析香菇活性糖蛋白的结构，采用红外光谱法对LEPP进行了扫描。根据图2图谱显示，LEPP在3450和3140 cm−1处有宽幅吸收峰，是O-H和N-H伸缩振动的吸收峰[24]；2920 cm−1处的吸收峰是C-H伸缩振动吸收峰[25]；1718.36 cm−1处吸收峰是羧基形成的酯键中C=O 伸缩振动[24]；1380 cm−1处的吸收是由C-H变角振动引起的[25]，1056.53 cm−1处强吸收是C-O-C或C-O-H中的C-O键的弯曲振动峰[26]；922.34 cm−1是α-吡喃环的弯曲振动特征峰[27]；865.67、822.78 cm−1处是D-葡萄糖吡喃糖环C-O-C 的振动吸收峰，是α-糖苷键的特征吸收峰[28]；618.43 cm−1处为醇或酚O-H 键的弯曲。根据赵文竹等[29]的报道可以判断出在3450、2920、1718.36、1056.53 cm−1处的特征吸收峰的香菇活性物质中具有多糖成分，即为糖类化合物。
2.4 香菇糖蛋白N端氨基酸测序及内部氨基酸序列分析
通过Edman降解法测定香菇活性物质中N端氨基酸，其序列为MPEQVVVADA，说明LEPP具有蛋白成分。利用质谱技术测定活性物质中的内部氨基酸序列，通过NCBI数据库比对发现，42条氨基酸序列与其它来源的蛋白或多肽序列相似，其中LEPP存在6条与蛹虫草（Cordyceps militaris CM01）中甘露聚糖结合凝集素蛋白相似的序列，相似度可以达到40.82%。在分析的序列中 VAPEEHPVLLTEAPINPK、SYELPDGQVITIGNER、AVFPSIVGRPR与头孢菌（Acremonium sp.）的肌动蛋白序列相近，相似度为15.25%。
2.5 香菇糖蛋白对大鼠铅中毒的改善作用
2.5.1 香菇糖蛋白对铅中毒大鼠体重的影响
如图3所示，与空白对照组比较，染铅处理组的动物体重都显著下降（P<0.05），特别是在前9 d内，染铅处理组动物体重下降趋势尤为显著，后期动物的体重才呈现缓慢增长的趋势，且始终低于香菇及香菇糖蛋白处理组。结果表明醋酸铅会抑制动物的生长发育，与染铅处理组比较，香菇和香菇糖蛋白处理组的动物体重在第3 d开始显著上升（P<0.05），说明香菇和香菇糖蛋白能够增加铅中毒大鼠的体重增长，改善大鼠的生长发育。实验过程中，由于动物对铅毒性以及药物的耐受性存在个体差异，在实验结束前，模型组中有2只动物死亡，阳性对照组有1只动物死亡。
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图 3 香菇糖蛋白对铅中毒大鼠体重的影响Figure 3. Effects of shiitake glycoprotein on body weight in rats with lead poisoning2.5.2 香菇糖蛋白对大鼠血铅的影响
香菇及香菇糖蛋白对铅中毒大鼠血液中铅含量的影响结果见表2。本研究的建模方法可以使模型组大鼠血铅水平保持在一个高水平，与染铅处理组比较，从第12 d起，经过阳性药物EDTA、香菇糖蛋白以及香菇给药处理组的大鼠血铅含量显著降低（P<0.05），与染铅处理组比较，经阳性药物EDTA、香菇糖蛋白及香菇给药处理组处理18，24，30 d后的大鼠血铅含量都显著降低（P<0.05），说明随着给药时间的延长，阳性药物EDTA、香菇糖蛋白及香菇具有持续排铅的效果，其中香菇糖蛋白高剂量组和香菇子实体高剂量组的排铅效果与阳性药物相近。结果表明香菇糖蛋白及香菇子实体可以有效的降低血液中铅的沉积作用。
表 2 小鼠血液中的铅含量（μg/L）Table 2. Lead levels in the blood of mice (μg/L)组别 实验时间（d） 0 6 12 18 24 30 CON 37.02±0.13i 130.97±0.16i 205.06±0.18i 242.41±0.17i 318.59±0.21h 328.57±0.23i MOD 686.79±0.16d 709.39±0.26d 716.83±0.10a 729.55±0.21a 730.41±0.13a 730.21±0.15a EDTA 685.63±0.10e 677.21±0.15h 594.21±0.16h 541.44±0.23h 501.52±0.11g 479.79±0.16g LEPP-L 690.25±0.18c 712.62±0.15c 652.80±0.16c 564.23±0.23d 526.79±0.23d 510.59±0.20c LEPP-M 691.30±0.24b 721.64±0.16b 639.75±0.19d 595.80±0.16b 549.50±0.20b 497.79±0.18d LEPP-H 678.63±0.19h 692.15±0.21g 670.72±0.18b 552.73±0.23f 537.31±0.25c 482.48±0.13e LE-L 681.28±0.18f 699.38±0.21f 628.55±0.25f 575.29±0.18c 549.36±0.21b 532.69±0.26b LE-M 679.30±0.24g 703.54±0.21e 603.85±0.20g 546.80±0.16g 516.35±0.21e 486.63±0.18f LE-H 709.68±0.16a 736.47±0.27a 631.26±0.21e 554.30±0.21e 502.48±0.21f 467.24±0.18h 注：数据为平均值±标准差（n=5），不同小写字母表示经过ANOVA方差分析同列数据间有显著性差异（P<0.05）；表3~表4同。 2.5.3 香菇糖蛋白对大鼠脏器中铅含量的影响
大鼠各脏器组织经过消解后，检测其中的铅含量以此表示铅在各个器官内的沉积作用。香菇及香菇糖蛋白对铅中毒大鼠脏器内沉积铅含量的影响结果见表3。结果显示醋酸铅进入体内后不仅增加了血液中的铅含量，同时可以沉积在动物的肝脏、肾脏和脾脏中。与染铅处理组比较，经过阳性药物EDTA、香菇子实体和香菇糖蛋白处理后的大鼠肝脏中的沉积铅含量均显著下降（P<0.05），与香菇糖蛋白低剂量处理组比较，香菇糖蛋白高剂量处理组中大鼠肝脏沉积铅含量显著降低（P<0.05），说明随着浓度的增加，排铅的效果越明显，其中香菇子实体和香菇糖蛋白高剂量组的效果接近于阳性药物。但是香菇和香菇糖蛋白对肾脏、心脏和脾脏中铅沉积的清除效果并不明显。
表 3 大鼠脏器中的沉积铅含量Table 3. Lead deposition in rat organs组别 大鼠脏器铅含量（μg/g） 肝脏 肾脏 心脏 脾脏 CON 8.21±0.15i 6.71±0.13h 7.42±0.12d 14.54±0.09i MOD 86.31±0.13a 57.50±0.14c 7.62±0.17cd 98.91±0.13e EDTA 60.42±0.12h 30.81±0.13f 5.79±0.16f 181.42±0.16a LEPP-L 81.81±0.14c 41.42±0.17e 12.24±0.19a 53.41±0.16h LEPP-M 75.60±0.14d 68.23±0.18a 6.41±0.13e 99.35±0.21d LEPP-H 68.80±0.14f 63.14±0.20b 6.58±0.18e 107.82±0.11c LE-L 83.21±0.13b 26.34±0.19g 7.83±0.11c 54.22±0.17g LE-M 72.35±0.16e 47.72±0.11d 6.51±0.13e 72.62±0.16f LE-H 64.44±0.18g 57.80±0.14c 8.82±0.12b 136.32±0.17b 2.5.4 香菇糖蛋白对大鼠血清生化指标的影响
香菇和香菇糖蛋白对大鼠血清生化指标的影响见表4所示。与空白对照组比较，染铅处理组中血清ALT和AST含量显著升高（P<0.05），说明醋酸铅可以使血清中ALT和AST的水平升高，促使肝脏发生损伤；与空白对照组比较，染铅处理组SOD和CAT含量显著降低（P<0.05），染铅处理组MDA含量显著升高（P<0.05）。说明铅中毒能够降低机体的抗氧化能力，增加机体的氧化损伤。与染铅处理组比较，经阳性药物EDTA、香菇子实体和香菇糖蛋白处理后大鼠血清中ALT和AST水平显著下降（P<0.05），SOD和CAT的活性显著上升（P<0.05），MDA的含量呈现下降趋势，说明香菇糖蛋白和香菇子实体与阳性药物作用一致，能够减少肝细胞的损伤，提高机体的抗氧化能力，其中香菇糖蛋白的作用优于香菇子实体。
表 4 大鼠血清生化指标的变化Table 4. Changes of serum biochemical indexes in rats组别 生化指标 ALT（U/L） AST（U/L） SOD（U/mL） MDA（nmol/mL） CAT（U/mL） CON 36.83±3.09f 56.03±2.66g 505.56±2.11a 21.39±1.08d 7.64±0.01a MOD 79.53±3.76a 93.53±2.85a 202.53±0.51h 28.42±0.45a 3.57±0.04e EDTA 50.47±3.70de 62.37±1.25f 404.55±0.58c 26.55±0.62b 4.28±0.11d LEPP-L 58.40±1.65c 78.73±1.43c 377.35±1.48e 26.54±1.05b 4.02±0.05de LEPP-M 53.73±0.57d 69.33±1.55e 408.72±1.52f 23.64±1.07c 5.18±0.29c LEPP-H 48.87±0.86e 64.07±1.65f 455.05±1.95b 23.81±0.46c 5.92±0.69b LE-L 73.42±5.17ab 87.77±2.95ab 276.33±3.17g 29.47±0.74a 3.75±0.05e LE-M 65.79±4.95bc 82.67±3.76bc 297.83±4.25f 28.61±0.39a 4.19±0.13d LE-H 66.78±2.56b 74.98±1.36d 391.23±1.56d 26.38±0.59b 4.83±0.24c 3. 讨论
本研究采用高剂量（20 mg/kg）腹腔注射醋酸铅7 d，后期持续低剂量（5 mg/kg）注射的方式建立大鼠铅中毒的模型。在建模的过程中，大鼠在高剂量醋酸铅的作用下，与空白对照组比较，染铅处理组大鼠体重显著下降（P<0.05），为了维持体内铅含量在平稳的水平上，给予低剂量醋酸铅既可以保证大鼠的存活率又可以维持模型的稳定，说明此方法建模成功，染铅组的大鼠在受到铅刺激下，不仅体重增长缓慢，体型消瘦，同时出现精神萎靡，摄食量减少，皮毛不整的现象，表现出明显中毒的症状。与染铅处理组比较，给予香菇糖蛋白和香菇子实体治疗组中的大鼠体重显著增加（P<0.05），其摄食量高于染铅组，动物的精神状态明显得到缓解，皮毛毛躁的现象减轻，体重增长幅度高于染铅处理组，说明香菇糖蛋白和香菇子实体可以有效改善大鼠的铅中毒现象，与香菇子实体处理组比较，香菇糖蛋白处理组中的大鼠体重显著增加（P<0.05），从表观效果上分析香菇糖蛋白处理组优于香菇子实体处理组。
铅进入人体后在消化道的吸收作用下以铅离子形式进入到血液系统，多数与血红蛋白结合成非扩散铅[30−31]，铅通过抑制δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶、细胞色素P450和铁螯合酶等巯基酶活性，干扰血红素的生物合成，抑制血红蛋白的产量，同时铅以高亲和力结合在红细胞表面，使红细胞膜韧性降低，引发红细胞溶血损伤机体造血功能[32−33]。另外有研究显示，铅诱导红细胞溶血和贫血的发生与自由基生成及脂质过氧化有关，铅与蛋白质的巯基结合，能够降低过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力和谷胱甘肽（GSH）水平，显著升高红细胞中丙二醛（MDA）和过氧化氢含量[34−35]。在本研究中，与染铅组比较，香菇糖蛋白处理组大鼠血清中铅的含量显著降低（P<0.05）说明香菇糖蛋白可以降低血清中铅的残留，减少铅离子与血红蛋白的结合，与王园园等[36]报道的海带多糖对大鼠血铅的影响比较效果更加显著。与染铅处理组比较，香菇糖蛋白处理组SOD和CAT含量显著升高（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05），香菇糖蛋白最高可提高CAT和SOD活性的65.8%和124.7%，降低16.2%的MDA含量，其提高SOD活性的效果与周伯庭等[37]报道的茶多酚作用相比较高出近2倍，降低的MDA的作用也是茶多酚效果的5倍。同时香菇子实体也具有良好的排铅作用，高剂量的香菇子实体可以降低血清中铅的含量，使血清中ALT、AST含量分别降低17.2%和19.8%，分别提高了CAT和SOD活性的47%和35.2%，降低MDA含量约为7%。通过与赵翠莉等[38]报道的姬松茸多糖对铅中毒小鼠的促排铅作用进行比较，发现香菇子实体降低血清ALT的效果是姬松茸多糖的2倍。香菇子实体能够促进血液和肝脏中铅的排出，其效果与阳性药物相近，同时研究结果揭示香菇可以作为健康食品用来发挥辅助排铅功能，实验的功效剂量也可以为健康排铅提供指导基础。
铅离子随着血液循环可以沉积在脏器中，脏器中沉积的铅可引起氧化失衡和蛋白质损伤，造成脏器的功能障碍[39]。肝脏是人体内源和外源物质代谢最重要的器官，也是最先接触吸收入血液的营养物质和代谢物的脏器，因此肝脏是铅沉积（约33%）最多的软组织[40]。铅的暴露可导致肝细胞增大、炎症细胞浸润、诱导肝细胞坏死[41]。铅还会破坏细胞膜结构，引起脂质代谢紊乱，降低肝脏解毒功能[41−42]。肝脏功能发生障碍，肝脏中的AST、ALT进入血液，使血清中的相应指标升高[43]。在本研究中，与染铅处理组比较，香菇糖蛋白处理组中大鼠肝脏残留的铅含量显著降低（P<0.05），表明香菇糖蛋白能够减少铅在肝脏内的沉积作用，降低其对肝脏的毒性损伤，促进铅的排泄，同时与染铅处理组比较，香菇糖蛋白处理组中大鼠血清中ALT、AST含量显著降低（P<0.05），证明香菇糖蛋白具有保护肝脏的作用。
4. 结论
本研究通过层析纯化等技术获得了一种新型的香菇糖蛋白LEPP，该香菇糖蛋白对醋酸铅所引起的大鼠铅中毒具有改善作用，其能够促进铅中毒大鼠的生长发育，降低血液中铅含量，排除铅在肝脏中的沉积，提高机体抗氧化的能力，保护肝脏。临床上可以根据香菇糖蛋白的排铅作用进一步探讨分子作用机制，为研制开发新型、无毒、高效的药物制剂用于预防和控制铅中毒奠定理论基础。
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图 1 香菇糖蛋白纯化曲线
注：A. DE-52阴离子交换柱层析洗脱曲线；B. CM-cellulose阳离子交换层析多糖洗脱曲线；C. FPLC凝胶过滤层析多糖洗脱曲线。
Figure 1. Purification curves of shiitake glycoprotein
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图 3 香菇糖蛋白对铅中毒大鼠体重的影响
Figure 3. Effects of shiitake glycoprotein on body weight in rats with lead poisoning
表 1 香菇活性糖蛋白单糖组成
Table 1 Composition of active glycoprotein monosaccharides of shiitake
单糖种类 含量（mg/kg） 甘露糖 1951.84 核糖 124.25 鼠李糖 30.40 葡萄糖醛酸 456.45 半乳糖醛酸 122.29 葡萄糖 12769.55 半乳糖 1160.15 木糖 426.07 阿拉伯糖 93.65 岩藻糖 258.60 
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表 2 小鼠血液中的铅含量（μg/L）
Table 2 Lead levels in the blood of mice (μg/L)
组别 实验时间（d） 0 6 12 18 24 30 CON 37.02±0.13i 130.97±0.16i 205.06±0.18i 242.41±0.17i 318.59±0.21h 328.57±0.23i MOD 686.79±0.16d 709.39±0.26d 716.83±0.10a 729.55±0.21a 730.41±0.13a 730.21±0.15a EDTA 685.63±0.10e 677.21±0.15h 594.21±0.16h 541.44±0.23h 501.52±0.11g 479.79±0.16g LEPP-L 690.25±0.18c 712.62±0.15c 652.80±0.16c 564.23±0.23d 526.79±0.23d 510.59±0.20c LEPP-M 691.30±0.24b 721.64±0.16b 639.75±0.19d 595.80±0.16b 549.50±0.20b 497.79±0.18d LEPP-H 678.63±0.19h 692.15±0.21g 670.72±0.18b 552.73±0.23f 537.31±0.25c 482.48±0.13e LE-L 681.28±0.18f 699.38±0.21f 628.55±0.25f 575.29±0.18c 549.36±0.21b 532.69±0.26b LE-M 679.30±0.24g 703.54±0.21e 603.85±0.20g 546.80±0.16g 516.35±0.21e 486.63±0.18f LE-H 709.68±0.16a 736.47±0.27a 631.26±0.21e 554.30±0.21e 502.48±0.21f 467.24±0.18h 注：数据为平均值±标准差（n=5），不同小写字母表示经过ANOVA方差分析同列数据间有显著性差异（P<0.05）；表3~表4同。
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表 3 大鼠脏器中的沉积铅含量
Table 3 Lead deposition in rat organs
组别 大鼠脏器铅含量（μg/g） 肝脏 肾脏 心脏 脾脏 CON 8.21±0.15i 6.71±0.13h 7.42±0.12d 14.54±0.09i MOD 86.31±0.13a 57.50±0.14c 7.62±0.17cd 98.91±0.13e EDTA 60.42±0.12h 30.81±0.13f 5.79±0.16f 181.42±0.16a LEPP-L 81.81±0.14c 41.42±0.17e 12.24±0.19a 53.41±0.16h LEPP-M 75.60±0.14d 68.23±0.18a 6.41±0.13e 99.35±0.21d LEPP-H 68.80±0.14f 63.14±0.20b 6.58±0.18e 107.82±0.11c LE-L 83.21±0.13b 26.34±0.19g 7.83±0.11c 54.22±0.17g LE-M 72.35±0.16e 47.72±0.11d 6.51±0.13e 72.62±0.16f LE-H 64.44±0.18g 57.80±0.14c 8.82±0.12b 136.32±0.17b
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表 4 大鼠血清生化指标的变化
Table 4 Changes of serum biochemical indexes in rats
组别 生化指标 ALT（U/L） AST（U/L） SOD（U/mL） MDA（nmol/mL） CAT（U/mL） CON 36.83±3.09f 56.03±2.66g 505.56±2.11a 21.39±1.08d 7.64±0.01a MOD 79.53±3.76a 93.53±2.85a 202.53±0.51h 28.42±0.45a 3.57±0.04e EDTA 50.47±3.70de 62.37±1.25f 404.55±0.58c 26.55±0.62b 4.28±0.11d LEPP-L 58.40±1.65c 78.73±1.43c 377.35±1.48e 26.54±1.05b 4.02±0.05de LEPP-M 53.73±0.57d 69.33±1.55e 408.72±1.52f 23.64±1.07c 5.18±0.29c LEPP-H 48.87±0.86e 64.07±1.65f 455.05±1.95b 23.81±0.46c 5.92±0.69b LE-L 73.42±5.17ab 87.77±2.95ab 276.33±3.17g 29.47±0.74a 3.75±0.05e LE-M 65.79±4.95bc 82.67±3.76bc 297.83±4.25f 28.61±0.39a 4.19±0.13d LE-H 66.78±2.56b 74.98±1.36d 391.23±1.56d 26.38±0.59b 4.83±0.24c
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