Effects of Non-covalent/Covalent Interactions on Functional Properties and Stability of Gelatin-PCA Complexes
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摘要: 为探讨原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）与明胶之间的相互作用对明胶-PCA复合物功能特性和稳定性的影响，本文通过非共价和共价结合方式制备明胶-PCA复合物，采用紫外-可见光谱、荧光光谱和傅里叶红外光谱分析PCA与明胶之间的相互作用，并对复合物的抗氧化活性、抑菌活性和稳定性进行分析。结果表明，与非共价复合物相比，共价复合物具有更高的PCA结合率。PCA与明胶二者相互作用对明胶具有荧光淬灭作用，且共价作用引起的荧光淬灭程度更大。明胶-PCA复合物具有优异1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS+）自由基清除能力。与共价复合物GPCA-2相比，非共价复合物GPCA-1对DPPH和ABTS+自由基清除能力更加显著（P<0.05），其清除率分别为49.71%±2.9%和38.39%±0.57%。明胶-PCA复合物还表现出对大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的抑菌作用。与GPCA-2相比，GPCA-1的抑菌效果更加显著（P<0.05），其大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别为11.31±0.91、12.57±0.93和8.83±0.35 mm。虽然PCA与明胶之间的相互作用在一定程度上降低了PCA的抗氧化活性和抑菌活性，却能显著（P<0.05）提高PCA的光稳定性和热稳定性。明胶-PCA共价复合物在紫外光和热处理80 min后，其PCA的保留率可达到92.58%±0.62%和90.30%±0.97%。实验结果为功能型明胶-PCA复合产品的开发与利用提供理论依据。Abstract: To investigate the effect of the interaction between protocatechuic acid (PCA) and gelatin on the functional properties and stability of gelatin-PCA complexes. Gelatin-PCA complexes were prepared by non-covalent and covalent binding. Afterward, the interaction between PCA and gelatin was analyzed using UV-Vis spectroscopy, fluorescence spectroscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy. Meanwhile, an analysis was also performed on the antioxidant activity, antibacterial activity, and stability of the complexes. The findings showed a higher PCA binding rate for the covalent complexes than the non-covalent complexes. Additionally, the interaction between PCA and gelatin resulted in the fluorescence quenching of gelatin, with a higher level of fluorescence quenching observed for the covalent binding. Moreover, in addition to excellent DPPH and ABTS+ radical scavenging abilities. Compared with GPCA-2, the non-covalent complex GPCA-1 showed more significant (P<0.05) scavenging abilities against DPPH and ABTS+ free radicals, with clearance rates of 49.71%±2.9% and 38.39%±0.57%, respectively. Gelatin-PCA complexes also exhibited antibacterial activity against Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella. Moreover, the antibacterial effect of GPCA-1 was more significant (P<0.05), with inhibition zone diameters of 11.31±0.91, 12.57±0.93 and 8.83±0.35 mm for E. coli, L. monocytogenes and Salmonella, respectively. Despite reducing the antioxidant and antibacterial activities of PCA to some extent, the interaction between PCA and gelatin significantly (P<0.05) improved the photostability and thermal stability of PCA. Specifically, the retention rates of PCA in gelatin-PCA covalent complexes after 80 min of UV and heat treatment were 92.58%±0.62% and 90.30%±0.97%, respectively. In conclusion, these findings provide a theoretical basis for the development and utilization of functional gelatin-PCA complex products.
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Keywords:
- protocatechuic acid (PCA) /
- gelatin /
- interaction /
- antioxidant activity /
- antibacterial activity /
- stability
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原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA），即3,4-二羟基苯甲酸，是植物体内重要的酚酸类成分，还是果蔬中花青素和原花青素的主要代谢产物[1]。研究发现，PCA呈现出多种生物功效，包括抗菌、降糖、抗氧化和抗炎特性[2]，因此PCA作为备受瞩目的一种膳食补充剂，已被广泛应用于多种保健食品中，用来预防慢性疾病，如炎症和糖尿病[3]。但是，由于PCA的水溶性和化学稳定性差，生物利用度较低，极大限制了PCA在食品医药行业中的广泛应用。研究表明，这些限制可以通过与蛋白质相偶联或复合形式来克服[4]。
多酚类化合物与蛋白质能够以共价或非共价相互作用的方式进行结合，从而形成多酚-蛋白质复合物。蛋白与多酚之间的相互作用可能会引起蛋白质的结构、功能和营养特性的改变，这对于合理设计功能性食品，提高多酚、蛋白质的生物活性和功能特征有着非常重要的意义[5]。复合物的性质不仅取决于蛋白质和多酚的性质，还取决于成键的类型[6]。非共价相互作用通常相对较弱且可逆，涉及范德华力、氢键、疏水相互作用和静电相互作用[7]。共价相互作用通常相对较强且不可逆，可以通过碱、自由基和酶的方法形成[8]。JIA等[9]报道了乳清蛋白与表没食子儿茶素-3-没食子酸酯之间的共价相互作用改变了乳清蛋白的构象结构，改善了乳清蛋白的理化性。LIU等[10]将姜黄素和鸡蛋卵白蛋白进行非共价复合后，不仅提高了姜黄素的溶解度和光稳定性，还增强了姜黄素的抗氧化活性。FEI等[11]通过碱法制备出PCA-乳清蛋白共价配合物，提高了乳清蛋白的乳液稳定性和热稳定性，抗氧化能力随PCA浓度增加而增加。因此，利用多酚与蛋白质相互作用来改善蛋白质和多酚功能特性，扩大其应用领域是一种安全、方便和有效的策略。
明胶是一种由天然胶原蛋白部分水解而成的蛋白质生物聚合物，主要由甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸组成，具有独特的三重螺旋结构。明胶具有良好的胶凝性、溶胀性和成膜性等功能特性，同时具有来源广、价格低、良好的生物降解性和生物相容性等优点，因此可作为乳化剂、稳定剂、生物活性包装材料、发泡剂和包封剂被广泛应用于食品、材料和医药领域[12−13]。关于PCA与明胶相互作用的研究也有相应的报道。例如ZHONG等[14]通过PCA与明胶的非共价相互作用制备了一种新型PCA活性包装明胶薄膜，提高了明胶薄膜的拉伸性能和阻隔性能，赋予了薄膜抗氧化能力和抑菌能力。LIANG等[15]研究了PCA和明胶通过希夫碱反应进行共价结合制备出具有止血和抗氧化性能的复合水凝胶。然而，很少有研究系统比较明胶-PCA共价和非共价相互作用对复合物功能特性的影响。因此，本研究以PCA和明胶为研究对象，采用非共价和共价相互作用的方法制备明胶-PCA复合物，采用紫外-可见光谱、荧光光谱和傅里叶红外光谱解析明胶与PCA的相互作用，并对复合物的功能特性和稳定性进行了对比研究。本研究对改善PCA和明胶的功能特性和扩大其复合物在食品领域的应用具有一定的指导意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
原儿茶酸 纯度≥98.0%，北京索莱宝科技有限公司；明胶 生物技术级，上海麦克林生化科技有限公司；实验室中所用试剂均为分析纯；所用实验用水均为超纯水。
Waters e2695型高效液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；EQ-300VDE型双频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SynergyH4多功能酶标仪 美国BIOTEK公司；UV2700紫外-可见风光光度计 日本岛津公司；PE-Frontier红外光谱仪 美国珀金埃尔默（Perkin-Elmer）公司。
1.2 实验方法
1.2.1 明胶-PCA复合物的制备
明胶-PCA复合物的制备参考SUI等[16]方法，并略有改动。非共价复合物GPCA-1的制备：以超纯水溶解制备质量浓度10 mg/mL的明胶溶液，4 ℃下溶胀过夜。取明胶溶液与2 mmol/L PCA溶液等体积混合，并调节pH至7.0，之后采用超声波600 W处理30 min后，于室温下敞口搅拌反应24 h，即得GPCA-1；共价复合物GPCA-2的制备：以超纯水溶解制备质量浓度20 mg/mL的明胶溶液，并采用0.2 mol/L NaOH溶液将明胶溶液pH调节至9.0，4 ℃下溶胀过夜。取pH9.0明胶溶液与PCA溶液等体积混合，再次调节pH至9.0。之后采用超声波600 W处理30 min后，于室温下敞口搅拌反应24 h，即得GPCA-2。
1.2.2 PCA结合率的测定
用甲醇配制PCA，梯度浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L，利用高效液相色谱法进行含量测定。色谱条件为色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇:水（含0.1%三氟乙酸）=65:35；流速：1 mL/min；采集波长：260 nm。以PCA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制PCA的标准曲线。将明胶-PCA复合物转移至透析袋（截留分子量3500 Da）内，4 ℃下于超纯水中透析48 h，收集透析袋外的液体，定容，即为未结合的PCA。未结合的PCA采用相同的色谱条件进行分析并获得峰面积，带入标准曲线计算出未结合的PCA的浓度。
(1) 式中：C为未结合的PCA通过标准曲线计算出的PCA浓度，mmol/L；V为未结合的PCA定容后的体积，mL；C0为明胶-PCA复合物制备时PCA起始浓度，mmol/L；V0为明胶-PCA复合物体积，10 mL。
1.2.3 紫外-可见光谱分析
以超纯水为空白对照，依次移取3 mL样液（明胶、PCA、GPCA-1、GPCA-2）于比色皿样品池中。采用UV-2700分光光度计测定样品在200～800 nm范围内的紫外-可见吸收光谱，扫描速率为中速，扫描间隔为0.5 nm。
1.2.4 荧光光谱分析
取适量明胶-PCA复合物溶于pH7.0 10 mmol/L PBS中，得到明胶浓度为0.25 mg/mL的样品溶液，室温下用SynergyH4多功能酶标仪分析其内源荧光光谱。激发波长280 nm，发射波长范围300～400 nm，狭缝宽度均设置为2 nm[17]。
1.2.5 傅里叶变换红外光谱分析
将2 mg固体样品（明胶、PCA和冷冻干燥后G-PCA复合物）与0.5 g溴化钾充分混匀、研磨、压片，用傅里叶变换红外光谱仪在4000～400 cm−1范围内进行扫描。
1.2.6 抗氧化活性测定
1.2.6.1 DPPH自由基清除实验
50 μL样品加入150 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混匀，避光反应30 min后，用酶标仪测定其在517 nm处的吸光度[18]。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除实验
7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L 过硫酸钾反应生成ABTS+，室温黑暗保存12 h。用磷酸盐缓冲溶液（4 mmol/L，pH7.4）稀释ABTS+溶液，初始吸光度约为在734 nm时为0.700±0.002。取100 μL样品与20 μL稀释的ABTS+溶液混合。室温反应5 min后，测定其在734 nm处的吸光度[19]。DPPH自由基和ABTS+自由基清除率计算如式2：
(2) 式中：As为有样品时的吸光度；Ac为用蒸馏水代替样品时的吸光度。
1.2.7 抑菌活性测定
测试菌选择大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌，抑菌活性测定参照王虹懿等[20]的方法并略作修改。纸片扩散法测定抑菌透明圈直径：在无菌条件下，取0.1 mL制备好的菌悬液，在固体培养基表面涂布均匀，接着用无菌镊子夹取滤纸片贴于此固体培养基表面，然后取20 μL样品供试液均匀浸湿滤纸片，37 ℃培养8~10 h，观察并准确测量透明圈直径。同时设置明胶为对照。透明圈直径大于7 mm，判定为有抑菌效果；透明圈直径小于7 mm，判定为无抑菌效果，直径越大抑菌效果越强。
1.2.8 紫外光和热稳定性分析
紫外光稳定性实验参考ZHANG等[21]方法，并略有改动。采用功率为6 W、波长为365 nm的紫外灯柜测定PCA及其复合物的光稳定性。复合物溶液（2 mL）放置于距离紫外光源10 cm处。每隔20 min用紫外分光光度计在295 nm波长处测定样品的吸光度一次，计算PCA保留率。热稳定性实验：每个样品（2 mL）放置在10 mL透明离心管中，置于试管架上，放置于恒定水浴85 ℃中，每隔20 min用紫外分光光度计在295 nm波长处测定样品的吸光度一次，计算PCA保留率。
1.3 数据处理
每组实验平行测定重复3次；利用Minitab 17 软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05表示样本之间差异显著；采用Origin 9.1软件进行图表制作。
2. 结果与分析
2.1 PCA和明胶复合物的制备
GPCA-1和GPCA-2为明胶与PCA通过非共价相互作用和共价相互作用两种制备方式获得的两种复合物。在中性条件下（pH7.0），PCA中的酚羟基、苯环可通过疏水、氢键、范德华力等作用与蛋白上特定的氨基酸或残基发生相互作用，其中疏水作用发生在蛋白质脂肪族、芳香族氨基酸与多酚的苯环之间，氢键产生在蛋白质的羰基（蛋白质氨基酸及肽键的羰基）与多酚的羟基之间，从而形成非共价键复合物GPCA-1[22]。PCA在碱性条件下（pH9.0）的邻二酚羟基结构可以氧化生成醌类物质，与蛋白质侧链中氨基、巯基或者某些氨基酸残基等发生亲核加成反应形成稳定的有色共价复合物GPCA-2[8]。图1显示了两种复合物的PCA结合率，共价复合物GPCA-2的结合率显著（P<0.05）高于非共价复合物GPCA-1。金花等[23]也得到类似的结论，绿原酸与黑豆蛋白共价复合物绿原酸的结合率高于非共价复合物。这是由于多酚及蛋白质之间的相互作用方式不同，非共价相互作用是一种可逆作用力，它的稳定性比共价作用要差，因此通常多酚与蛋白结合共价交联比非共价结合能够获得更高的多酚结合率。
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图 1 明胶-PCA复合物的PCA结合率注：不同字母表示样本间差异显著（P<0.05）。Figure 1. PCA binding rate of gelatin-PCA complexes2.2 相互作用对明胶紫外-可见光谱的影响
酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基中的苯环是敏感的发色团，在280 nm处有紫外吸收，但因为明胶中不含有色氨酸，而苯丙氨酸的含量又比较低，因此明胶的紫外吸收特性主要是酪氨酸残基引起的[24]。PCA因为具有苯环结构在紫外区295 nm处有特征吸收峰，而在可见波长范围内无吸收。因此可以通过对比吸收峰位移以及吸光度变化判断蛋白质与多酚是否发生了相互作用。观察到与明胶、PCA相比复合物GPCA-1和GPCA-2其紫外-可见光谱都发生了显著的变化（图2）。与PCA进行对比，明胶-PCA复合物的最大吸收峰发生了红移，GPCA-1和GPCA-2分别移至310 nm和319 nm。紫外-可见光谱的改变表明明胶与PCA之间存在相互作用，且GPCA-2的作用强度高于GPCA-1。本文的结果与FANG等[25]的报道的结果一致，槲皮素与牛血清白蛋白发生非共价相互作用，最大吸收峰发生红移至377 nm（槲皮素最大吸收峰为365 nm）。除了疏水相互作用，氢键参与了PCA与明胶之间的非共价相互作用，助色基团中的孤对电子将与发色基团共轭，导致发色基团的最大吸收峰发生红移[25]。多酚在碱性条件下被氧化形成醌类化合物，并通过与蛋白质侧链助色基团-NH2、-SH生成C-N键和C-S键，因此共价作用条件下多酚与蛋白质复合物紫外-可见光谱的红移和增色效应更为明显[5]。
2.3 相互作用对明胶荧光光谱的影响
一般来说，带有苯环的氨基酸是蛋白质中固有的荧光团，包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。但因为明胶中不含有色氨酸，而苯丙氨酸的含量又比较低，因此，明胶的荧光光谱主要分析了酪氨酸残基周围环境的变化[26]。蛋白与多酚相互作用可使蛋白荧光光谱不同程度地猝灭，并有可能出现光谱的红移或蓝移现象[27]。图3为明胶和GPCA-1、GPCA-2的荧光发射光谱。明胶的荧光特性主要是由酪氨酸引起，激发波长为280 nm，发射波长300～330 nm之间，且检测到明胶发射峰为311 nm。与明胶对比，GPCA-1和GPCA-2荧光强度明显下降，说明PCA与明胶的结合过程中，发射荧光的酪氨酸残基所处的微环境发生变化，导致其内源荧光发生猝灭，且GPCA-2比GPCA-1对明胶的荧光淬灭程度更强，这是因为PCA通过共价与明胶结合比非共价具有更强的相互作用，对明胶中酪氨酸残基微环境造成的影响更大。明胶与PCA非共价和共价复合后发射峰都发生微弱红移至314 nm，表明明胶与PCA之间的相互作用会引起明胶构象发生改变，导致芳香族氨基酸残基暴露于更加极性的环境中[28]。
2.4 相互作用对明胶傅里叶红外光谱的影响
在4000~400 cm−1的FTIR光谱范围内，研究了明胶与明胶-PCA复合物的官能团和结构变化见图4。明胶的红外光谱为酰胺A带3433 cm−1（分子间氢键及N-H和O-H拉伸振动）、酰胺B带2975 cm−1（C-N拉伸振动）、酰胺I带1654 cm−1（C=O拉伸）和酰胺II带1541 cm−1（N-H弯曲与C-N拉伸耦合）[12]。对比明胶，GPCA-1的酰胺A带和酰胺B带发生11 cm−1和13 cm−1蓝移以及酰胺II带发生19 cm−1红移；GPCA-2的酰胺A带发生15 cm−1红移，酰胺B带发生15 cm−1蓝移，酰胺II带发生19 cm−1红移。明胶-PCA非共价复合物酰胺A带蓝移和谱带变宽说明明胶中含N、O的基团与PCA的羟基发生相互作用形成氢键，而氢键的形成会使伸缩振动波数向低波数移动[14,29]。明胶-PCA共价复合物酰胺A带红移和谱带变宽以及和酰胺II带红移，表明明胶中的氨基有可能参与了PCA接枝反应，形成新的C-N共价键，这与陈卫军等[30]和FEI等[11]报道的结果一致。
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图 4 明胶和明胶-PCA复合物傅里叶红外光谱图Figure 4. Fourier transform infrared spectra of gelatin and gelatin-PCA complexes2.5 PCA-明胶复合物的抗氧化活性分析
多酚已被证明是优秀的抗氧化剂，作为自由基的清除剂[21]。为了研究PCA与明胶复合以后是否会影响PCA的抗氧化活性，进行了与电子和氢原子转移相关的DPPH和ABTS+自由基清除实验，结果如图5所示。在DPPH自由基清除实验中，明胶显示出最弱的DPPH自由基清除率（6.77%±0.99%）；游离的PCA具有最高的清除能力（61.48%±3.96%）；明胶与PCA结合后也显示出优异的DPPH自由基清除能力，但不及游离PCA。ABTS+自由基清除实验结果显示，明胶自身就具有一定的ABTS+自由基清除活性（22.82%±1.05%）。与游离PCA相比，GPCA-1和GPCA-2显示出更显著的ABTS+清除活性，但其清除率小于明胶和PCA清除率之和，这与LIU等[10]的研究结果一致。姜黄素与卵清蛋白的非共价复合物的DPPH自由基清除能力小于卵清蛋白和姜黄素清除能力之和[10]。此外，观察到明胶具有6.77%±0.99%的DPPH自由基清除率和22.82%±1.05%的ABTS+自由基清除率。这主要有两个原因，明胶中的半胱氨酸和蛋氨酸具有巯基，可以通过还原作用起到抗氧化剂的作用；缺乏电子的自由基可以从芳香残基中获取质子[8,31]。
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图 5 明胶、PCA及其复合物的抗氧化活性注：不同字母表示样本间差异显著（P<0.05）。Figure 5. Antioxidant activities of gelatin, PCA andgelatin-PCA complexes多酚的抗氧化活性可能是由于酚羟基与自由基反应生成稳定的半醌类化合物，从而终止自由基链反应[32]。PCA通过非共价和共价两种相互作用均能提高明胶的抗氧化活性，这是由于PCA的酚羟基引入到明胶[33]。同时PCA与明胶之间相互作用会降低PCA的抗氧化活性。因为明胶-PCA复合物的抗氧化活性主要依赖于复合物中酚羟基的有效性，而明胶的存在对酚羟基发挥抗氧化功能有一定的掩蔽效应，共价作用比非共价作用掩蔽效应更明显。
2.6 PCA-明胶复合物的抑菌活性分析
大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌是食品中常见的致病菌，属于革兰氏阴性菌。体外抑菌实验表明GPCA-1、GPCA-2对于大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌均显示出良好的抑菌效果（抑菌圈直径7.53～13.83 mm），单独使用的PCA具有最强的抑菌活性，而单独使用的明胶不具有抑菌特性（无抑菌圈出现）（表1）[34]。对于大肠杆菌而言，PCA、GPCA-1、GPCA-2三者的抑菌性差异显著（P<0.05）；对于李斯特菌和沙门氏菌而言，PCA和GPCA-1无显著差异，与GPCA-2之间差异显著。说明PCA与明胶结合以后在一定程度上降低了PCA的抑菌功能，但非共价作用影响相对较小，共价作用对抑菌活性影响较大，与2.5结果一致。多酚与明胶复合物的抑菌特性主要依赖于多酚的有效性，PCA与明胶的相互作用阻碍了PCA的有效释放，共价结合方式由于多酚结合率高且作用力强，不利于PCA的释放，而非共价结合方式可逆且作用力较弱，PCA的释放相对容易。在ZHONG等[14]的研究中，PCA的添加可以赋予明胶薄膜的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的能力，但是明胶-PCA复合薄膜的抑菌效果不及PCA单独使用，与本研究的结果一致。研究发现，PCA可以引起革兰氏阴性菌的细胞变形和破坏，从而抑制细菌的生长[14,35]。
表 1 明胶、PCA和明胶-PCA复合物对大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的抑制作用Table 1. Antibacterial activities of gelatin, PCA andgelatin-PCA complexes2.7 PCA-明胶复合物的光和热稳定性分析
2.5和2.6结果显示了PCA及其复合物具有良好的抗氧化和抑菌特性。PCA作为生物活性成分，极易受到光和热的影响，引起多酚的降解。因此构建PCA稳定体系是保证其功能特性得以发挥的基础。PCA及其复合物在紫外光照射下的保留率结果如表2所示。紫外照射后，游离PCA随着紫外照射时间的延长，多酚保留率持续下降，在紫外照射80 min后保留率下降至74.11%±1.04%。PCA由于具有不饱和的苯环结构，在紫外光的环境胁迫下会发生降解。GPCA-1和GPCA-2则很好地防止了PCA的紫外降解，且共价结合方式可以更加有效地防止紫外降解。PCA通过与明胶的结合，包裹在明胶的疏水口袋里，有效地隔离了紫外线。此外，紫外线还可以被明胶中的芳香侧基和双键吸收，从而保护PCA免遭紫外损伤[36]。
表 2 PCA及其复合物的紫外稳定性Table 2. Photochemical stability of PCA and gelatin-PCA complexes时间（min） PCA保留率（%） PCA GPCA-1 GPCA-2 20 93.51±0.85B 93.24±0.79B 96.77±1.28A 40 85.50±2.31B 90.49±0.54A 93.63±1.06A 60 81.52±0.60C 87.32±1.42B 93.35±1.14A 80 74.11±1.04C 84.30±1.14B 92.58±0.62A 除了对紫外光敏感外，热不稳定性也是阻碍PCA实际应用的一个因素。因此，研究了PCA及其明胶复合物的热稳定性，结果如表3所示。游离的PCA显示出强烈的热不稳定性，随着85 ℃加热时间的延长，其保留率迅速下降，在80 min时保留率仅为21.04%±2.31%。然而，GPCA-1和GPCA-2因与明胶结合，多酚保留率显著（P<0.05）提高到85.23%±2.01%和90.30%±0.97%。显然，与游离PCA相比，包裹在明胶中的PCA的热稳定性大大提高，这表明PCA与明胶的相互作用使PCA的活性基团得到有效保护，免受热诱导的降解或氧化[37]。由此看出，PCA通过与明胶结合可以显著改善其光稳定性和热稳定性，通过对比两种结合方式发现，共价结合方式提高多酚光稳定性和热稳定性的效果更好，这可能是由于共价结合具有更大的多酚结合率，且作用方式更加稳定，因此具有更强的保护力。
表 3 PCA及其复合物的热稳定性Table 3. Thermal stability of PCA and gelatin-PCA complexes时间（min） PCA保留率（%） PCA GPCA-1 GPCA-2 20 81.78±1.91B 98.50±0.85A 98.87±0.43A 40 62.25±3.19B 95.93±0.51A 95.78±1.05A 60 39.77±3.45B 93.02±0.36A 93.59±3.04A 80 21.04±2.31C 85.23±2.01B 90.30±0.97A 3. 结论
明胶与PCA通过共价方式结合比非共价具有更高的PCA结合率，也显示出更强的相互作用。明胶-PCA复合物显示优异的抗氧化能力和抑菌能力，其原因主要依赖于PCA的活性。明胶与PCA的相互作用在一定程度上降低了PCA的活性，阻碍其功能特性的发挥。明胶与PCA之间的非共价相互作用主要依赖于氢键和疏水相互作用，这种作用方式作用力弱且可逆，因此对PCA活性的影响较小；而共价方式具有更高的PCA结合率和更强的结合作用力，阻碍了PCA活性基团的表达，因此在抗氧化和抑菌方面，非共价复合物显示的功能特性强于共价复合物。然而明胶-PCA共价复合物正因为具有更强和更稳定的相互作用才使得其在提高PCA稳定性方面表现更加优异。由此可知，明胶与PCA的相互作用会引起其理化性质和功能特性的改变。本研究结果可为多酚蛋白复合物作为新型功能成分开发提供参考。虽然本研究对明胶-PCA复合物部分的功能特性进行了分析，但复合物的储存稳定性、消化特性和生物利用度还需进一步研究。
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图 1 明胶-PCA复合物的PCA结合率
注：不同字母表示样本间差异显著（P<0.05）。
Figure 1. PCA binding rate of gelatin-PCA complexes
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图 4 明胶和明胶-PCA复合物傅里叶红外光谱图
Figure 4. Fourier transform infrared spectra of gelatin and gelatin-PCA complexes
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图 5 明胶、PCA及其复合物的抗氧化活性
注：不同字母表示样本间差异显著（P<0.05）。
Figure 5. Antioxidant activities of gelatin, PCA andgelatin-PCA complexes
表 1 明胶、PCA和明胶-PCA复合物对大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的抑制作用
Table 1 Antibacterial activities of gelatin, PCA andgelatin-PCA complexes
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表 2 PCA及其复合物的紫外稳定性
Table 2 Photochemical stability of PCA and gelatin-PCA complexes
时间（min） PCA保留率（%） PCA GPCA-1 GPCA-2 20 93.51±0.85B 93.24±0.79B 96.77±1.28A 40 85.50±2.31B 90.49±0.54A 93.63±1.06A 60 81.52±0.60C 87.32±1.42B 93.35±1.14A 80 74.11±1.04C 84.30±1.14B 92.58±0.62A
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表 3 PCA及其复合物的热稳定性
Table 3 Thermal stability of PCA and gelatin-PCA complexes
时间（min） PCA保留率（%） PCA GPCA-1 GPCA-2 20 81.78±1.91B 98.50±0.85A 98.87±0.43A 40 62.25±3.19B 95.93±0.51A 95.78±1.05A 60 39.77±3.45B 93.02±0.36A 93.59±3.04A 80 21.04±2.31C 85.23±2.01B 90.30±0.97A
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