Screening of Antidepressant Index Components and Optimization of Extraction Process of Hemerocallis citrina Baroni Based on Network Pharmacology and Fingerprint
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摘要: 目的:预测并验证黄花菜抗抑郁药效成分及作用机制,得到黄花菜干花蕾最佳提取工艺。方法:基于网络药理学筛选出黄花菜抗抑郁关键活性成分、作用靶点及关键信号通路;建立黄花菜HPLC指纹图谱,并对15批江苏宿迁产地黄花菜指纹图谱进行相似度评价,指认共有峰及其中抗抑郁活性成分,结合指纹图谱及分子对接结果确定黄花菜抗抑郁指标成分,并进行黄花菜干花蕾提取工艺正交试验优化。结果:通过拓扑分析筛选得到黄花菜中异丁香酚、芦丁、金丝桃苷等10个抗抑郁关键活性成分,通过PPI蛋白相互作用网络预测得到SRC、TP53、HSP90AA1等10个关键靶点,通过GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析,得到癌症通路、PI3K/Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路等10个关键信号通路。建立了15批黄花菜HPLC指纹图谱,匹配得15个共有峰,指认得新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素4个抗抑郁关键成分。分子对接结果表明上述成分与靶标对接结合能均小于−5 kcal/mol。以抗抑郁关键成分总黄酮、新绿原酸、芦丁转移率及出膏率为指标,优化得黄花菜干花蕾提取工艺为料液比1:10(g/mL),提取2次,提取时间1 h。该工艺下总黄酮转移率72.12%±0.61%,新绿原酸转移率68.11%±0.65%,芦丁转移率63.40%±1.59%,出膏率52.62%±0.15%。结论:本研究通过网络药理学和指纹图谱的有机结合,筛选得黄花菜中可用于提取工艺研究的抗抑郁指标成分,且优化后的黄花菜干花蕾提取工艺稳定可行,为黄花菜的抗抑郁功能食品开发提供理论依据。Abstract: Objective: To predict and validate the antidepressant pharmacodynamic components and mechanism of action of Hemerocallis citrina Baroni (H.citrina) and to determine the optimal extraction process of H.citrina. Methods: The key active ingredients, action targets and key signaling pathways of H.citrina were selected by network pharmacology. HPLC fingerprints of H.citrina were established, and similarity evaluation was conducted on 15 batches of H.citrina fingerprints from Suqian, Jiangsu Province. The common peak and the antidepressant active components in the fingerprints were identified. The key antidepressant index components of H.citrina were determined based on the results of the fingerprints and molecular docking. An orthogonal experiment was conducted to optimize the extraction process of H.citrina. Results: According to the result of topology analysis,10 key antidepressant active ingredients in H.citrina were identified, such as isoeugenol, rutin and hyperoside. The protein-protein interaction (PPI) network of H.citrina and depressive disorder targets were constructed and cluster analysis was applied, resulted to that the active ingredient targets on 10 key proteins such as SRC, TP53, HSP90AA1. Enrichment analysis of the gene ontology (GO) function and Kyoto Encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway for the key anti-inflammatory targets of H.citrina were applied and 10 key KEGG signal pathways were obtained, including the cancer pathway, PI3K/Akt signaling pathway, neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathway and so on. The HPLC fingerprints of 15 batches of H.citrina were established, and 15 common peaks were obtained. Among them, four key components of antidepressant were identified: Nechlorogenic acid, rutin, hyperoside and quercetin. Molecular docking results showed that the docking binding energies of the above components to the target were all less than −5 kcal/mol. The transfer rate of the components (total flavonoids, neochlorogenic acid and rutin) and solid yield of H. citrina were used as indicators. The extraction process of H.citrina was optimized as the ratio of material-liquid 1:10 (g/mL), the extraction process was twice, and the extraction time was 1 hour. The optimized process resulted in a transfer rate of 72.12%±0.61% for total flavonoids, 68.11%±0.65% for neochlorogenic acid, 63.40%±1.59% for rutin, and a solid yield of 52.62%±0.15%. Conclusion: Through the organic combination of network pharmacology and fingerprint, the antidepressant index components from H.citrina were screened out for extraction technology research. The optimized H.citrina extraction process of H.citrina was stable and feasible, providing a theoretical basis for the development of research on H. citrina as an antidepressant functional food.
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黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni)俗名柠檬萱草、金针菜、金针花,为百合科萱草属多年生草本宿根植物,是一种传统药食同源食物,具有2000多年的药食两用历史,其主要的食用部位是成熟花蕾,《本草纲目》中记载,黄花菜煮食“令人好欢乐,无忧”。黄花菜提取物中主要成分是黄酮类及酚类成分[1],现代药理研究表明,黄花菜具有较明确的抗抑郁作用,可以显著改善抑郁患者精神状态,且安全、无成瘾性。目前有关黄花菜抗抑郁活性的研究多以乙醇提取物为研究对象,黄花菜乙醇提取物可降低小鼠悬尾实验的不动时间,使中枢神经血清素和多巴胺增加[2],逆转脂多糖诱导的抑郁症模型小鼠抑郁样表现[3],减轻皮质酮所致大鼠脑源性神经营养因子TrkB水平的下降[4],黄花菜水、醇提取物合并给药,可改善抑郁大鼠的抑郁行为及学习记忆能力[5]。而Liu等[6]以慢性不可预知温和应激(CUMS)小鼠模型研究黄花菜提取物抗抑郁作用,发现黄花菜花蕾水提取物亦具有显著的抗抑郁作用。但黄花菜抗抑郁作用机制的研究不充分。
中药具有多成分、多靶点、调节方式多样的特点,采用西医单靶标、单成分的研究思路来研究中药,难以体现中药的系统性。网络药理学方法在强调将生物学网络与药物作用网络整合的基础上,对药物在网络中与节点或网络模块的关系进行分析探讨,由单一靶点的寻找转向综合网络分析,已成为中药活性成分筛选及作用机制研究的主要手段之一。因此,本文选择网络药理学的方法对黄花菜抗抑郁作用机制进行研究。
当前我国抑郁症人数日益增加,而目前在抗抑郁功能方面的功能食品寥寥可数。黄花菜具有良好的抗抑郁功效,及较高的食用安全性,适于抗抑郁功能食品的开发。但现有研究中黄花菜有效成分的提取主要采用乙醇提取[7−10],乙醇提取存在有机溶剂残留及提取成本高等问题,因此较少用于功能食品的开发,限制了黄花菜抗抑郁功能食品产品的开发。课题组前期对黄花菜水提和醇提工艺及其指纹图谱进行了考察,发现3批水提样品和3批醇提样品HPLC指纹图谱与对照图谱之间相似度在0.921~0.972之间,相似度均大于0.9,说明黄花菜水提取物和醇提取物的主要成分基本一致,相似性良好。因此本文中选择水提取为提取工艺,并对主要提取工艺参数进行优化。
本文基于网络药理学和HPLC指纹图谱对黄花菜抗抑郁活性成分及其抗抑郁关键信号通路进行筛选,并将主要抗抑郁活性成分和作用靶点进行分子对接验证,以筛选得到的主要活性成分为指标,通过正交试验对黄花菜干花蕾提取工艺进行优化,为开发具备抗抑郁作用的黄花菜功能食品提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄花菜干花蕾 批号:S1~S15,新鲜黄花菜花蕾在2021年5月~10月期间不同日期,于江苏省宿迁市丁嘴镇采摘,成熟度为未开放成熟花蕾,采收后按江苏省地方标准DB/T《大乌嘴黄花菜 第4部分:采收、加工、贮存技术规程》处理,得到黄花菜干花蕾,由江苏宿迁丁嘴大乌嘴金菜合作社提供,经江苏省宿迁市农业科学院周玲玲老师鉴定,均为萱草属黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni);芦丁、金丝桃苷对照品、新绿原酸对照品 HPLC级,成都普瑞法科技开发公司;槲皮素对照品 HPLC级,中国食品药品检定研究院;无水乙酸钠 AR≥99.0%,南京化学试剂有限公司;六水合氯化铝 AR≥97%,上海阿拉丁生物科技有限公司。
DW调温电热套 上海平环燃烧设备工程技术有限公司;MT-5精密天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;KQ-500E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美国安捷伦科技有限公司;UV1800PC型紫外-可见分光光度计 上海凤凰光学科仪有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄花菜活性成分收集
通过中国知网(https://www.cnki.net/)及PubMed数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/),检索并收集黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni)花蕾提取物的成分[6,11−14]。通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及化源网数据库(https://www.chemsrc.com/)收集并下载成分CAS号及Canonical SMILES号。将黄花菜成分的Canonical SMILES号输入SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)进行生物利用度和类药性分析,以GI absorption=High且Druglikness 5个指标中有3个以上为“Yes”为筛选条件,收集符合条件的黄花菜活性成分,并结合文献,得到黄花菜活性成分集。
1.2.2 黄花菜活性成分靶点预测
将黄花菜活性成分SMILES号输入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstarget prediction.ch/)[15],选择物种为智人“Homo sapiens”,对成分靶点进行预测,以Probability>0.01为筛选条件,收集预测靶点蛋白的基因Symbol。对靶点基因Symbol进行去重,得到黄花菜活性成分靶点集。
1.2.3 抑郁症相关疾病靶点预测
以“Depressive Disorder”“Depressive Disorder, Major”为关键词分别在CTD数据库(http://ctdbase.org/)[16]、GeneCards数据库(https://www.genecards.org)[17]、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search)[18]中检索并下载预测的疾病靶点信息,整合CTD数据库中有直接证据的靶点及Inference Score>100的靶点、GeneCards数据库Score前25%的靶点、DisGeNET数据库的全部靶点,对靶点基因Symbol进行去重,得到抑郁症疾病靶点集。
1.2.4 黄花菜活性成分抗抑郁作用靶点筛选
将黄花菜活性成分靶点集、抑郁症疾病靶点集上传到在线作图工具VennDetail Shiny App(http://hurlab.med.und.edu:3838/VennDetail/)制作维恩图,得到成分-疾病交集靶点,即黄花菜活性成分抗抑郁作用靶点。
1.2.5 黄花菜抗抑郁关键活性成分预测
将黄花菜活性成分及其抗抑郁靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件,构建“药物-成分-靶点”相互作用网络,将成分与靶点关系可视化,并进行拓扑学分析,根据“degree”值预测黄花菜抗抑郁关键活性成分。
1.2.6 黄花菜抗抑郁关键靶点预测
通过PPI蛋白相互作用网络预测黄花菜抗抑郁关键靶点。将黄花菜活性成分抗抑郁作用靶点导入STRING数据库(https://string-db.org),选择物种为智人“Homo sapiens”,设置minimum required interaction score 为 high confidence(0.700),将 PPI 网络信息保存为“.tsv”格式并导入Cytoscape进行拓扑结构分析,以“degree”值为指标,筛选出黄花菜抗抑郁的关键靶点。
1.2.7 GO功能与KEGG通路富集分析
将黄花菜活性成分抗抑郁作用靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/ summary.jsp),进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以P<0.05为条件,对GO分析中的生物学过程(biology process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组成(cellular component,CC),及KEGG信号通路注释结果进行显著性富集,获得靶点的GO生物功能信息及KEGG通路富集分析结果,并使用ImageGP工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/home/index/index.html)对富集分析结果进行可视化。
1.2.8 活性成分与关键靶点的分子对接验证
在PubChem数据库下载抗抑郁关键活性成分3D结构的.sdf格式文件,通过Open Babel软件转换为.mol2结构。将.mol2文件加载到AutoDockTools 1.5.6中,计算原子电荷,设置旋转键,最后保存为.pdbqt格式文件,作为对接配体。在uniport数据库(https://www.uniprot.org/)中检索核心靶点的uniport ID,输入RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/),根据蛋白的分辨率筛选适宜的蛋白结构,记录PDB ID及分子直径,下载蛋白质及其配体的结构,并将蛋白结构.pdb文件输入PyMOL 2.4.1软件中进行去水、去配体等操作,导出备用。利用AutoDock Tools 1.5.6对靶蛋白加氢、计算电荷;设置Grid Box中心坐标并定义Box大小,保存为.pdbqt格式备用。利用Autodock Vina 1.1.2进行对接,得到各成分与关键靶点蛋白的对接结合能。
1.2.9 黄花菜HPLC指纹图谱方法建立及相关性分析
1.2.9.1 指纹图谱对照品溶液制备
取新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品储备液适量,配制成混合对照品溶液。
1.2.9.2 指纹图谱供试品溶液制备
取黄花菜干花蕾,通过中药粉碎机粉碎后过80目筛,得黄花菜干花蕾粉末。取黄花菜干花蕾粉末1 g,精密称定,置于100 mL容量瓶,加入70%甲醇定容至刻度,超声处理(功率120 W,频率40 kHz)30 min,放冷,加相应溶剂补足至刻度,抽滤,精密移取滤液10 mL,浓缩至5 mL并定容,即得供试品溶液。
1.2.9.3 指纹图谱色谱条件
HPLC系统,PDA检测器,Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B);检测波长326 nm;流速1 mL/min;柱温30 ℃;进样量20 μL。梯度洗脱程序:0~8 min,8% A;8~30 min,8%~16%A;30~45 min,16%~24% A;45~60 min,24%~50% A;60~72 min,50%~95% A。
1.2.9.4 指纹图谱建立及相关性分析
按上述样品制备方法及指纹图谱色谱条件,对江苏宿迁产地15批黄花菜样品进行测定,记录色谱图。将15批黄花菜色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012)版软件,以S2样品色谱图为参照图谱,采用中位数法,时间窗宽度为 0.1 min,以出峰时间稳定且峰面积较大的芦丁(6号峰)为参照峰,经多点校正后进行色谱峰的匹配,生成对照指纹图谱及各样品指纹图谱,并进行相似度评价,得到共有峰。结合对照品,指认指纹图谱中抗抑郁活性成分色谱峰。
1.2.10 正交试验优化黄花菜提取工艺
称取黄花菜干花蕾(批号:S2)9份,切段,各50 g,精密称定,以水为溶剂,按L9(34)正交试验表分别进行热回流提取,200目滤布过滤,合并滤液即得黄花菜干花蕾提取液。以料液比、提取时间、提取次数为考察因素,以总黄酮、新绿原酸、芦丁转移率,出膏率为指标,优选黄花菜提取物提取工艺条件。提取工艺考察因素水平见表1。
表 1 提取工艺考察因素水平表Table 1. Factor levels of extraction technology水平 因素 A料液比(g/mL) B提取时间(h) C提取次数 1 1:8 0.5 1 2 1:10 1.0 2 3 1:12 1.5 3 1.2.11 抗抑郁活性成分含量测定
1.2.11.1 正交试验样品总黄酮含量测定
以芦丁为对照品,利用AlCl3-NaAc法测定正交试验提取液中总黄酮含量[19],计算总黄酮转移率,计算公式见式1。
(1) 1.2.11.2 HPLC法测定新绿原酸、芦丁含量
混合对照品溶液制备:精密称定新绿原酸对照品及芦丁对照品适量,加入60%甲醇溶解并配制成上述成分浓度分别为19.5、24.2 μg/mL的混合对照品溶液。
供试品前处理:精密移取正交试验提取液10 mL,置于100 ℃水浴上挥干溶剂,加纯水复溶后转移至10 mL容量瓶,定容至刻度。取该样品适量,13000 r/min离心10 min,过0.22 μm滤膜后待测。
色谱条件:HPLC系统,PDA检测器,色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B),流速1 mL/min,检测波长326 nm,柱温30 °C,进样体积20 μL。洗脱梯度:0~11 min,7%~8% A;11~12 min,8%~16% A;12~33 min,16% A。外标法计算提取液中新绿原酸、芦丁含量,并计算成分转移率。经方法学考察,上述含量测定方法符合药典要求。
1.2.12 出膏率测定
蒸发皿干燥至恒重,称定蒸发皿重量,精密移取提取液50 mL至蒸发皿,水浴蒸干后,105 ℃烘箱干燥至恒重,即连续两次间隔1 h的称重结果相差不超过3 mg,记录此时重量,计算出膏率。
1.2.13 最优提取工艺验证
根据优化得到的黄花菜提取工艺参数,在正交试验投料量基础上放大7倍,平行制备3份提取液,进行总黄酮、新绿原酸、芦丁转移率、出膏率的测定。
1.3 数据处理
实验数据以平均值±标准差(±s)表示,采用Excel软件进行数据处理,采用student's t test进行两组间的比较,P<0.05认为有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 黄花菜抗抑郁关键活性成分预测
通过文献检索,共收集到黄花菜中经明确鉴定结构的成分78个;经GI和Druglikness分析,并剔除无靶点成分,得到活性成分34个,组成黄花菜活性成分集。经数据库检索后去重,预测得到黄花菜活性成分作用靶点共529个,预测得到抑郁症相关疾病靶点4317个,利用VennDetail Shiny App平台将成分靶点和疾病靶点映射,得到成分-疾病交集靶点376个,结果见图1A,该交集靶点即黄花菜活性成分抗抑郁作用靶点。
黄花菜活性成分与其抗抑郁作用靶点共同构建得到“药物-成分-靶点”相互作用网络,见图1B。经“Network Analysis”分析,以节点度degree值筛选关键成分,前十位分别为异丁香酚(HC29)、金丝桃苷(HC36)、芦丁(HC33)、槲皮素(HC35)、青蒿素(HC08)、异鼠李素(HC05)、木犀草素(HC27)、桑色素(HC31)、新绿原酸(HC34)、柚皮素(HC03),degree值分别为84、79、76、76、72、71、69、69、69、66,提示上述十种成分与抗抑郁疾病靶点关联度较高,为黄花菜抗抑郁关键活性成分。
2.2 黄花菜抗抑郁关键靶点预测
将376个交集靶点导入STRING数据库,对交集靶点进行PPI网络分析。隐藏游离靶点,该网络有376个节点,包含2483条边,平均度值13.2,平均局部聚类系数为0.459,P值小于1.0×10−16。将结果导入Cytoscrape,绘制PPI网络图,见图2。对该结构进行拓扑分析,节点度值(degree)越高的靶点节点连线越多,颜色越深,证明该靶点是黄花菜抗抑郁作用的关键靶点。“degree”值前十的靶点包括SRC原癌基因(SRC)、肿瘤蛋白p53(TP53)、热休克蛋白HSP90-α(HSP90AA1)、表皮生长因子受体(EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、E1A结合蛋白p300(EP300)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1(PIK3R1)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)。以上述十个靶点为黄花菜抗抑郁关键靶点。
2.3 GO生物功能和KEGG通路富集分析
GO生物功能富集分析结果中,376个黄花菜抗抑郁靶点共涉及868个生物学过程、123个细胞组分、237个分子功能。图3A展示了上述3个项目基因数量排序的前10位。由图可知,靶点主要参与了信号传导、蛋白磷酸化、对药物的响应等生物学过程;主要定位于细胞膜、细胞质基质、细胞质等细胞组分;主要涉及蛋白结合、ATP结合、金属离子结合等分子功能。KEGG信号通路富集分析结果显示,黄花菜抗抑郁靶点共富集到183个信号通路,显著性排名前15的KEGG通路见图3B,其中主要涉及癌症通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、神经活性配体-受体相互作用信号通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)等。
2.4 黄花菜HPLC指纹图谱研究
按“1.2.9”项下供试品制备方法及色谱条件,对15批黄花菜样品进行测定,结果见图4~图5。江苏宿迁产地15批黄花菜的指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.98,相似性良好。选择黄花菜中峰面积较大且分离度较好的共有色谱峰作为共有峰,15批黄花菜的指纹图谱共匹配得到15个共有峰,共有峰占总峰面积约35.8%。参考网络药理学筛选得到的黄花菜中10个抗抑郁活性成分,通过对照品的保留时间及紫外光谱,从15个共有峰中共指认出得4个抗抑郁活性成分,分别是新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素,混合对照品色谱图见图6。
2.5 活性成分与关键靶点的分子对接验证
根据指纹图谱研究及网络药理学分析结果,可知江苏宿迁产地黄花菜中含量较高的抗抑郁关键活性成分包括新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素,以上述四种成分作为配体与黄花菜关键抗抑郁作用靶点蛋白为受体进行分子对接。从PBD数据库中获取各靶点蛋白晶体结构:SRC(PBD ID:1KSW,2.80 Å),TP53(PBD ID:6GGA,1.55 Å),HSP90AA1(PBD ID:5LRL,1.33 Å),MAPK3(PBD ID:4QTB,1.40 Å),EGFR(PBD ID:5HG8,1.42 Å),AKT1(PBD ID:3O96,2.70 Å),MAPK1(PBD ID:4FV8,2.00 Å),EP300(PBD ID:3BIY,1.70 Å),PIK3R1(PBD ID:6D87,2.70 Å),PIK3CA(PBD ID:6OAC,3.15 Å)。分子对接结果见表2,新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素与靶点的对接结合能均<−5 kcal/mol,与靶点蛋白的原配体对接结合能接近,说明上述成分与靶点蛋白能形成良好稳定的结合,且可以通过对上述靶点的调控发挥抗抑郁作用。
表 2 关键活性成分配体与靶点分子对接结果Table 2. Docking results between key active ingredients and target molecules配体 结合能(kcal/mol) SRC TP53 HSP90AA1 MAPK3 EGFR AKT1 MAPK1 EP300 PIK3R1 PIK3CA 原配体 −9.4 −6.4 −15.2 −12.6 −8.2 −14.3 −9.4 −8.2 −10.8 −8.4 新绿原酸 −8.0 −7.9 −9.2 −9.2 −7.7 −9.4 −7.8 −8.9 −7.5 −8.4 芦丁 −11.1 −9.3 −10.5 −9.9 −9.1 −10.1 −9.8 −8.3 −9.5 −9.4 金丝桃苷 −10.3 −7.6 −9.9 −9.4 −8.1 −10.6 −8.6 −7.1 −8.3 −8.7 槲皮素 −9.4 −7.6 −10.7 −9.7 −8.2 −11.0 −9.7 −8.9 −9.7 −9.2 2.6 正交试验优化黄花菜提取工艺
根据前期单因素实验结果及文献[20],选择料液比、提取时间、提取次数为考察因素,设计考察因素水平;结合网络药理学、分子对接和指纹图谱研究结果,选择总黄酮、新绿原酸、芦丁转移率,出膏率为黄花菜提取工艺的指标,进行提取工艺优化。正交试验样品选择切段的黄花菜干花蕾样品,根据课题组前期研究结果,黄花菜干花蕾粉碎成粉末再提取,过滤难度大大增加,而提取率的提高有限,对工业生产无益,而比较了黄花菜切段提取和不处理提取的情况,发现切段提取相对于不处理提取,各成分转移率显著提高,而且切段处理在工业上可行,因此选择切段处理的黄花菜进行提取。正交试验结果见表3,方差分析结果见表4。因素A为料液比,因素B为提取时间,因素C为提取次数。由直观分析结果可得,除新绿原酸外,各因素对提取率的影响为C>A>B,而对总黄酮最优提取工艺为A2B3C3,新绿原酸最优提取工艺为A3B1C3,芦丁最优提取工艺为A3B1C2,出膏率最优提取工艺为A3B3C3;料液比、提取时间对提取率影响较小,方差分析结果显示对各指标无显著影响,结合各指标最优提取工艺水平及实际生产情况,选择A2,B2为工艺参数;由方差分析结果可知,提取次数对出膏率、总黄酮、芦丁有显著影响,但各评价指标的C2和C3极差较小,对提取2次和提取3次的样品在各评价指标上取平均值,提取2次的提取率均能达到提取3次的85%,除出膏率外,成分转移率均无显著性差异。结合实际生产,选择C2为工艺参数,综上,黄花菜提取以料液比1:10 g/mL,提取时间每次1 h,提取2次为最优提取工艺参数,进行最优工艺验证实验。
表 3 提取工艺正交试验设计及直观分析结果Table 3. Orthogonal experiment design and visual analysis results of water extraction实验号 因素 转移率(%) 出膏率(%) A B C 空白 总黄酮 新绿原酸 芦丁 1 1 1 1 1 43.89 50.32 46.19 35.17 2 1 2 2 2 65.20 62.68 61.31 49.29 3 1 3 3 3 74.00 65.82 63.64 55.50 4 2 1 2 3 71.71 71.32 67.64 51.74 5 2 2 3 1 74.14 67.58 62.30 56.25 6 2 3 1 2 51.07 48.76 48.90 39.27 7 3 1 3 2 77.60 73.56 69.21 57.29 8 3 2 1 3 56.65 60.62 54.15 42.31 9 3 3 2 1 73.88 59.98 68.72 53.17 总黄酮 K1 183.09 193.20 151.61 K2 196.92 196.00 210.79 K3 194.16 198.95 225.74 R 4.61 1.92 24.71 新绿原酸 K1 178.82 195.20 159.71 K2 187.66 190.88 193.97 K3 194.16 174.57 206.97 R 5.11 6.88 15.75 芦丁 K1 171.13 183.03 149.23 K2 178.83 177.75 197.66 K3 192.07 181.25 195.14 R 6.98 1.76 16.14 出膏率 K1 139.95 144.20 116.75 K2 147.25 147.84 154.20 K3 152.77 147.94 169.03 R 4.27 1.25 17.43 表 4 提取工艺方差分析结果Table 4. Results of ANOVA with water extraction指标 因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性 总黄酮 A 104.864 2 5.087 − B 5.454 2 0.265 − C 1025.448 2 49.748 * 误差 20.61 2 1 新绿原酸 A 40.009 2 0.587 − B 78.504 2 1.151 − C 399.089 2 5.854 − 误差 68.18 2 1 芦丁 A 74.786 2 6.199 − B 4.811 2 0.399 − C 495.505 2 41.073 * 误差 12.06 2 1 出膏率 A 27.527 2 6.212 − B 3.035 2 0.685 − C 484.108 2 109.255 * 误差 4.43 2 1 注:F0.05(2,2)=19;“−”表示未检测到显著性(P>0.05),“*”表示有显著性(P<0.05)。 2.7 最优工艺验证试验
工艺验证结果如下:经三次重复试验,总黄酮、新绿原酸、芦丁转移率,出膏率分别为72.12%±0.61%(RSD值0.85%)、68.11%±0.65%(RSD值0.95%)、63.40%±1.59%(RSD值2.51%)、52.62%±0.15%(RSD值0.29%),该工艺验证条件结果与本实验中其他提取提取条件结果相比,成分转移率及出膏率较高,重复性较好,稳定可行。
3. 讨论与结论
本研究先采用网络药理学筛选出黄花菜发挥抗抑郁作用的关键活性成分、作用靶点及通路,再对宿迁产地黄花菜干花蕾进行HPLC指纹图谱建立,确认该产地黄花菜干花蕾中含量较高的抗抑郁活性成分,并通过分子对接确认了上述成分与抗抑郁靶点的结合能力,选出适合该产地黄花菜干花蕾的抗抑郁成分指标,进行黄花菜干花蕾的水提取工艺研究,得到适合该产地黄花菜抗抑郁提取物制备的提取工艺参数。
网络药理学结果表明,黄花菜提取物抗抑郁关键成分包括异丁香酚、金丝桃苷、芦丁、槲皮素、青蒿素、异鼠李素、木犀草素、桑色素、新绿原酸、柚皮素等,抗抑郁关键靶点包括SRC、TP53、HSP90AA1、EGFR、MAPK3、AKT1、MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA等。上述靶点中SRC、TP53、HSP90AA1等是影响细胞增殖、分化的重要细胞因子。丝氨酸/苏氨酸激酶AKT1是生长因子、细胞因子和其他细胞刺激下游的细胞信号传导中心节点。AKT1通过其多种底物的磷酸化与脑发育、衰老、神经退行性疾病和精神疾病相关[21],在海马的神经元可塑性中起着至关重要的作用[22−23]。此外,SRC、TP53、HSP90AA1、EGFR、AKT1、PIK3CA都是乳腺癌的靶点基因,现有研究表明黄花菜对抑郁症和乳腺癌可能有异病同治的可能性并具有共同的作用靶点[16]。结合宿迁产地黄花菜HPLC指纹图谱,指认抗抑郁成分新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素色谱峰,将该4种成分与上述10个黄花菜抗抑郁关键靶点进行分子对接,所得结合能均较低,表明能形成良好稳定的结合,进一步说明黄花菜可通过新绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素对相关抗抑郁靶点进行调控。网络药理学结果还表明黄花菜抗抑郁通路包括癌症通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、神经活性配体-受体相互作用信号通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)等。通过激活PI3-K/Akt 通路可以影响突触可塑性[24],其中SRC、EGFR、AKT等靶点都是PI3-K/Akt通路的关键靶点[25]。结合抗抑郁关键成分和靶点的网络药理学结果可知,黄花菜可能通过作用于SRC、EGFR、AKT等靶点激活PI3-K/Akt 通路发挥神经元保护作用从而实现抗抑郁疗效。
为了充分提取及认识黄花菜中有效成分,前期研究中对 HPLC 指纹图谱的供试品制备方法进行了考察,发现以 70%甲醇为溶剂时,总黄酮提取率最高,因此选择以 70%甲醇对黄花菜药材进行超声提取后进行指纹图谱测定。指纹图谱研究中发现,江苏宿迁产地的黄花菜抗抑郁活性成分中新绿原酸、芦丁含量较高,可作为黄花菜提取工艺优化的评价指标。同时黄花菜总黄酮提取物有较明确的抗抑郁作用,能显著改善抑郁模型动物的抑郁样表现。因此,为了对黄花菜提取工艺进行较为全面的评价,本文选择总黄酮、新绿原酸、芦丁为指标成分,优选其提取工艺。为准确测定成分转移率,需要先测定黄花菜干花蕾中总黄酮、新绿原酸、芦丁含量。课题组在前期研究中分别对黄花菜含量测定供试品的制备方法进行了考察,结果表明,以 70%甲醇为溶剂时,总黄酮提取率最高,而以60%甲醇为溶剂时,新绿原酸、芦丁提取率最高,因此选择分别以 70%甲醇为溶剂,对黄花菜药材粉末进行超声提取后测定其总黄酮含量,以60%甲醇为溶剂测定其新绿原酸、芦丁含量。两个方法均经方法学考察,考察结果符合药典要求。并测定了15批宿迁产地黄花菜中总黄酮、新绿原酸和芦丁的含量,分别为4.10±0.23、0.35±0.02、1.38±0.06 mg/g。黄花菜HPLC指纹图谱方法及抗抑郁活性成分含量测定方法可用于对后续黄花菜原料的质量控制及制剂工艺的评价。
由于黄花菜存在抗抑郁药效研究不充分、产业链较短、商品形式较少等问题[26],这限制了黄花菜相关产品的研发。因此,为开发具有良好抗抑郁功能的黄花菜功能食品,降低生产成本,本研究以网络药理学和指纹图谱有机结合的方法,为黄花菜抗抑郁功能食品的研制提供了合理的成分指标,同时对提取工艺进行优化,为黄花菜原料提取提供实验依据。
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表 1 提取工艺考察因素水平表
Table 1 Factor levels of extraction technology
水平 因素 A料液比(g/mL) B提取时间(h) C提取次数 1 1:8 0.5 1 2 1:10 1.0 2 3 1:12 1.5 3 表 2 关键活性成分配体与靶点分子对接结果
Table 2 Docking results between key active ingredients and target molecules
配体 结合能(kcal/mol) SRC TP53 HSP90AA1 MAPK3 EGFR AKT1 MAPK1 EP300 PIK3R1 PIK3CA 原配体 −9.4 −6.4 −15.2 −12.6 −8.2 −14.3 −9.4 −8.2 −10.8 −8.4 新绿原酸 −8.0 −7.9 −9.2 −9.2 −7.7 −9.4 −7.8 −8.9 −7.5 −8.4 芦丁 −11.1 −9.3 −10.5 −9.9 −9.1 −10.1 −9.8 −8.3 −9.5 −9.4 金丝桃苷 −10.3 −7.6 −9.9 −9.4 −8.1 −10.6 −8.6 −7.1 −8.3 −8.7 槲皮素 −9.4 −7.6 −10.7 −9.7 −8.2 −11.0 −9.7 −8.9 −9.7 −9.2 表 3 提取工艺正交试验设计及直观分析结果
Table 3 Orthogonal experiment design and visual analysis results of water extraction
实验号 因素 转移率(%) 出膏率(%) A B C 空白 总黄酮 新绿原酸 芦丁 1 1 1 1 1 43.89 50.32 46.19 35.17 2 1 2 2 2 65.20 62.68 61.31 49.29 3 1 3 3 3 74.00 65.82 63.64 55.50 4 2 1 2 3 71.71 71.32 67.64 51.74 5 2 2 3 1 74.14 67.58 62.30 56.25 6 2 3 1 2 51.07 48.76 48.90 39.27 7 3 1 3 2 77.60 73.56 69.21 57.29 8 3 2 1 3 56.65 60.62 54.15 42.31 9 3 3 2 1 73.88 59.98 68.72 53.17 总黄酮 K1 183.09 193.20 151.61 K2 196.92 196.00 210.79 K3 194.16 198.95 225.74 R 4.61 1.92 24.71 新绿原酸 K1 178.82 195.20 159.71 K2 187.66 190.88 193.97 K3 194.16 174.57 206.97 R 5.11 6.88 15.75 芦丁 K1 171.13 183.03 149.23 K2 178.83 177.75 197.66 K3 192.07 181.25 195.14 R 6.98 1.76 16.14 出膏率 K1 139.95 144.20 116.75 K2 147.25 147.84 154.20 K3 152.77 147.94 169.03 R 4.27 1.25 17.43 表 4 提取工艺方差分析结果
Table 4 Results of ANOVA with water extraction
指标 因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性 总黄酮 A 104.864 2 5.087 − B 5.454 2 0.265 − C 1025.448 2 49.748 * 误差 20.61 2 1 新绿原酸 A 40.009 2 0.587 − B 78.504 2 1.151 − C 399.089 2 5.854 − 误差 68.18 2 1 芦丁 A 74.786 2 6.199 − B 4.811 2 0.399 − C 495.505 2 41.073 * 误差 12.06 2 1 出膏率 A 27.527 2 6.212 − B 3.035 2 0.685 − C 484.108 2 109.255 * 误差 4.43 2 1 注:F0.05(2,2)=19;“−”表示未检测到显著性(P>0.05),“*”表示有显著性(P<0.05)。 -
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