Effects of Soft-shelled Turtle Protein-derived Oligopeptides on Tubulin Polymerization-Depolymerization Regulatory Mode in Vitro
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摘要: 为探讨甲鱼蛋白源寡肽对肿瘤细胞微管蛋白活性的调控机制，本研究以前期获得的甲鱼蛋白源三条寡肽DEADLLA（D-7-A）、EAGVNDW（E-7-W）、GSISSGQV（G-8-V）为研究对象，评价其对微管蛋白聚合-解聚的影响，解析其与微管蛋白的作用模式，阐释其诱导肿瘤细胞凋亡作用的机制。结果表明，3条寡肽与长春新碱相似，均为微管蛋白聚合的抑制剂，IC50值分别为3.72、5.01、5.95 μmol/L。分子对接结果显示，D-7-A与α-微管蛋白4X1I活性中心结合位点为Ser178和Thr179；E-7-W与活性中心结合位点为Gln15、Thr225、Tyr224、Tyr210、Arg214；G-8-V与活性中心结合位点为Gln11、Ser178、Asp329，与α-微管蛋白具有较强的作用力。细胞实验结果表明，D-7-A、E-7-W、G-8-V均对A549细胞具有抑制作用，且具有剂量依赖性，其IC50值分别为2003±72、1877±102和1789±137 µmol/L。G-8-V对A549细胞的抑制效果最强，且具有诱导A549细胞凋亡的作用，并随着药物处理时间的增加，凋亡率明显提高，其作用机制是通过影响α-微管蛋白的价键，抑制微管蛋白的聚合，诱导细胞凋亡。Abstract: To examine the regulatory mechanisms of oligopeptides derived from soft-shelled turtle protein on tubulin activity in tumor cells, this study employed three specific oligopeptides D-7-A, E-7-W, and G-8-V obtained from soft-shelled turtle protein. The objective was to assess their impact on tubulin polymerization and depolymerization, investigate their interaction with tubulin, and elucidate the mechanisms induce apoptosis in tumor cells. The results showed that the three oligopeptides exhibited similarities to vincristine and acted as inhibitors of tubulin polymerization, their respective IC50 values was 3.72, 5.01, and 5.95 µmol/L. Furthermore, the molecular docking analysis revealed that D-7-A interacted with the active center of α-tubulin 4X1I, specifically binding to Ser178 and Thr179. The active center of E-7-W was found to be bound by Gln15, Thr225, Tyr224, Tyr210 and Arg214. Similarly, G-8-V was observed to bind to Gln11, Ser178 and Asp329 at the active center, exerting a significant impact on α-tubulin. The results of cell experiments showed that D-7-A, E-7-W and G-8-V had dose-dependent inhibitory effects on A549 cells, with IC50 values of 2003±72, 1877±102 and 1789±137 μmol/L, respectively. The G-8-V exhibited the most potent inhibitory effect on A549 cells, leading to the induction of apoptosis. Moreover, the apoptosis rate demonstrated a significant increase with prolonged drug treatment time. The underlying mechanism of action involved the inhibition of tubulin polymerization and the induction of apoptosis by perturbing the valence bond of α-tubulin.
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微管是真核细胞中重要的结构组分，由α和β微管蛋白异二聚体装配成长管状纤维结构[1]。作为细胞结构的组成部分，微管参与多种细胞器的组成；作为细胞内转运装置，微管在囊泡和线粒体在细胞内转运中也发挥着重要作用；在细胞有丝分裂期，微管蛋白起着决定性的作用[2]。迄今为止，已发现了很多化合物能与微管蛋白结合[3−5]，其中靶向紫杉醇位点、长春碱位点和秋水仙碱位点抑制剂被报道的较多[6−8]，结合于紫杉醇位点的化合物，能够促进微管蛋白聚合为微管，并抑制已形成的微管解聚，而结合于后两个位点的抑制剂则正好相反，其促进微管的解聚并抑制聚合[9−10]。微管蛋白是抗肿瘤活性物的重要作用靶点，对微管蛋白的作用是靶向性筛选抗肿瘤活性物的重要模型之一。
抗肿瘤小分子多肽具有分子量小、低毒性、高活性、易吸收、易于穿透肿瘤细胞、不易产生耐药性等特点[11]，是筛选天然抗肿瘤活性资源的宝库。1976年Pettit首次从海兔中发现环肽类抗肿瘤活性成分，其后从海兔中分离出一系列含量很低的小分子肽Dolastatin 1~18，其中Dolastatin 10和15能够抑制微管聚合并促进其解聚，干扰肿瘤细胞的有丝分裂，对多种癌细胞有诱导凋亡作用[12]。目前，研究人员从藻类、鱼类、贝类中也发现了系列高活性的抗肿瘤肽[13−14]。甲鱼又称鳖，在动物性食品中，蛋白含量居于前位，可以作为制备高品质活性肽的优质原料[11]。已有研究表明，甲鱼蛋白肽抗氧化[15−16]、抗衰老[17]、抗肿瘤[18−19]、免疫调节[20]等多种生物活性。课题组前期研究对甲鱼中性蛋白酶解肽进行了纯化，并对具有较高抗肿瘤活性的甲鱼蛋白肽组分进行了watersQ-tof MS/MS分析，由PLGS3.02蛋白分析软件进行肽序列结构鉴定，以NCBI所报道的甲鱼蛋白序列构建的88M的蛋白库为搜索蛋白，并获得活性较好的甲鱼蛋白源寡肽序列，分别命名为D-7-A、E-7-W、G-8-V[19]。
然而，甲鱼蛋白源寡肽D-7-A、E-7-W、G-8-V的抑制肿瘤增殖的活性机理尚未深入研究。本研究通过评价D-7-A、E-7-W、G-8-V对微管蛋白聚合-解聚的影响，分析其与微管蛋白的互作模式，探究G-8-V对A549细胞的诱导凋亡作用，以阐释甲鱼蛋白源寡肽的抗肿瘤活性机理。研究结果为深度开发甲鱼蛋白资源，拓展其活性作用提供数据支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
DEADLLA、EAGVNDW、GSISSGQV 固相合成，纯度>98%，吉尔生物科技有限公司，结构见图1；猪脑 市售；长春新碱 标准品，纯度≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司；A549细胞 海星生物科技有限公司；RPMI-1640 培养液 兰州百灵生物技术有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、青链霉素混合液（100X）、三磷酸鸟苷（GTP）、分离胶、浓缩胶、福林酚 北京索莱宝科技有限公司；标准牛血清蛋白（BSA）、二甲基亚砜（DMSO） Sigma公司；CCK-8 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Beyotime、4-吗啉乙磺酸（MES）聚合缓冲液 北京沃凯生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。
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图 1 D-7-A、E-7-W、G-8-V的结构注：（a）为D-7-A；（b）为E-7-W；（c）为G-8-V。Figure 1. Structures of D-7-A, E-7-W, and G-8-VMultiskan FC 荧光酶标仪、351 CO2培养箱 赛默飞世尔仪器有限公司；BS-210s电子天平 德国Sartorus公司；XW-80A漩涡混匀机 上海精科实业有限公司；TDL-5-A 低速台式离心机 ANKE公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；HYG-B全温度摇瓶柜 太仓市实验设备厂；ZHJH超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 猪脑微管蛋白的制备
参照Landino等[4]提取猪脑微管蛋白的方法。猪脑置于冰上去除脑膜、大血管并剪碎，用预冷的MES缓冲液（MES 0.1 mol/L，EGTA 0.1 mmol/L，ATP 1.0 mmol/L，MgCl2 0.1mol/L，用NaOH调pH6.5）清洗2次，掏碎后制成匀浆。将脑组织匀浆在4 ℃、10000 r/min条件下离心1 h，取上清液，加入等体积的MES聚合缓冲液，置于37 ℃水浴中保温30 min，摇动数次，在26 ℃、10000 r/min条件下离心1 h，弃上清，用约1/10匀浆体积的预冷MES缓冲液将沉淀物分散，置于冰水浴中30 min，沉淀物基本溶解，再离心收集沉淀，并用少量预冷的MES缓冲液在冰水浴中溶解，得到微管蛋白溶液。
1.2.2 微管蛋白含量的测定
BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）法进行测定。
1.2.3 微管蛋白的鉴定
采用SDS-PAGE凝胶电泳[21]，制胶选用12%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳开始时开启120 V的直流电压，观察显色条带跑到分离胶后切换成80 V的电压，继续电泳，直到显色条带到达胶块的底端后停止进行电泳。考马斯亮蓝R-250染液进行染色并观察。
1.2.4 微管蛋白聚合-解聚体系的建立
微管蛋白溶液置于4 ℃的冰浴中低温保存30 min，取190 μL的微管蛋白于预冷的比色皿中，加入GTP母液混合均匀，将最后的浓度配为1 mmol/L，每隔3 min测一次吸光度值A350，并绘制聚合曲线。曲线随着反应的时间上升随后趋于平衡（约20 min），将比色皿放入准备好的冰水浴中，每3 min测定一次吸光度值A350，曲线随着反应时间从最高平台期逐渐下降并趋于最低平衡，解聚反应基本趋于完成。
1.2.5 甲鱼蛋白源寡肽对微管蛋白聚合-解聚的影响
在上述微管蛋白聚合-解聚的反应体系中，实验组加入不同浓度的5 μL D-7-A、E-7-W、G-8-V，使其终浓度分别为0.25，0.5，1，2，4，6 μmol/L，按1.2.4的测定方法记录A350的变化。
1.2.6 分子对接
用MOE分子模拟软件的Alpha Site Finder模块，基于已经报道的微管蛋白晶体结构（PDB code：4X1I和3JAL），通过去除α-微管蛋白和β-微管蛋白晶体上的结合化合物以及水分子，分子加氢及能量最小化等预处理采用Site Finder模块搜索该蛋白的活性位点，并将所得活性位点进行Surface and Maps处理，获得该蛋白受体分子的活性位点区域，以此区域为靶标区域。对本研究分离纯化获得的新型α-微管蛋白和β-微管蛋白抑制肽与靶标区域的结合模式进行分析研究。然后通过DOCK模块，将 D-7-A、E-7-W、G-8-V与α-微管蛋白和β-微管蛋白活性位点进行对接。对接方法设置采用Triangle Matcher，重新打分和再优化方法采用London dG和GridMin，最优的30个构象进行最优排列。探究D-7-A、E-7-W、G-8-V分子分别与α-微管蛋白和β-微管蛋白的结合模式。
1.2.7 细胞活性的测定
采用CCK-8法检测细胞活性，A549细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释制备浓度为1×105个/mL的细胞悬液；每孔100 μL接种于96孔板，置37 ℃、5％ CO2饱和湿度的孵箱内培养24 h，待细胞贴壁后弃培养液，分别加入100 μL不同浓度的D-7-A、E-7-W、G-8-V（25，50，100，500，1000，1500，2000 μmoL/L）。同时设立空白组（只加培养液）和对照组（只加细胞和培养液），每组设3个平行孔，继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。计算细胞增殖抑制率及半数抑制浓度（IC50）[9,19]。
抑制率(%)=OD(对照组−空白组)−OD(实验组−空白组)OD(对照组−空白组)×100 1.2.8 流式细胞检测细胞凋亡
取对数生长期的A549细胞以1×105个/mL接种于6孔培养板，置 37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱内培养24 h；细胞贴壁后，加入1000 μmoL/L的G-8-V，同时设对照组（只加细胞和培养液），置37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱内分别处理24 h和48 h；收集细胞；PBS洗涤细胞；加入Binding Buffer 和FITC标记的Annexin V（20 µg/mL）10 µL，室温下避光孵育30 min；离心收集细胞，用1×Binding Buffer 将细胞再次重悬，再加入碘化丙啶（PI）（50 µg/mL）5 µL；于室温下在黑暗中孵育15 min，充分混合后，1 h内流式细胞仪上检测细胞凋亡[22]。WinMDI 29.0 软件分析细胞凋亡。结果判断：正常的活细胞不被Annexin V-FITC和PI染色（第三象限）；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，PI染色呈阴性（第四象限）；凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色（第一象限）；坏死细胞不能被Annexin V-FITC染色，只能被PI染色（第二象限）。
1.3 数据处理
用Design-Expert 8.06 软件进行中心点试验设计和数据分析，用Excel软件作图。以平均数±标准差表示（¯X±SD），用SPSS16.0 统计软件分析。单因素方差分析检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 微管蛋白的鉴定
按BCA法[22]测定微管蛋白的含量，浓度为1.7 mg/mL，经SDS-PAGE电泳显示（图2）蛋白样品的相对分子质量为55 kDa左右，与文献所报道一致[21]，此条带为微管蛋白。
2.2 D-7-A、E-7-W、G-8-V对微管蛋白聚合-解聚的影响
微管蛋白在37 ℃条件下聚合（0～10 min），在4 ℃条件下解聚（40～60 min），平台期反应了微管蛋白在聚合条件下聚合-解聚之间的动态平衡（图3），在体外通过对温度的控制模拟微管蛋白的正常聚合-解聚平衡。
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图 3 图3 寡肽对微管蛋白聚合-解聚的影响Figure 3. Effects of oligopeptide on tubulin polymerization-depolymerization长春新碱为微管蛋白抑制剂[23]，因此，本研究以长春新碱为阳性对照，在蛋白聚合-解聚体系中加入终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、6 μmol/L的长春新碱。结果如图3a所示，在37 ℃恒温过程中，长春新碱能够抑制微管蛋白聚合，且具有剂量依赖性。从图3b~图3d中可以看出，在37 ℃聚合条件下，实验浓度范围内D-7-A、E-7-W、G-8-V对微管蛋白聚合的抑制率均随着处理浓度的增加而增加，其IC50值分别为3.72、5.01、5.95 μmol/L。3条寡肽均为微管蛋白聚合的抑制剂，且与长春新碱相似，能够结合于微管蛋白端部，从而抑制微管蛋白聚合[24]。
2.3 D-7-A、E-7-W、G-8-V与微管蛋白的互作机制
微管蛋白是球形分子，有两种类型：α-微管蛋白（α-tubulin）和β-微管蛋白（β-tubulin），这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。α亚基由450个氨基酸组成，β亚基是由455个氨基酸组成，它们的分子量约55 kDa。
本实验基于已经报道的微管蛋白晶体结构（PDB code：1SA0），对α-微管蛋白和β-微管蛋白活性位点进行搜索。4X1I 和3JAL为多种微管蛋白抑制剂与微管蛋白受体的共晶结构代表[25]。为进一步探究D-7-A、E-7-W、G-8-V与微管蛋白的互作模式，分别对D-7-A、E-7-W、G-8-V与微管蛋白的活性位点进行对接。
2.3.1 D-7-A、E-7-W、G-8-V与α-微管蛋白的结合模式
D-7-A与α-微管蛋白活性中心4X1I对接结果显示，D-7-A与4X1I活性中心存在两个作用力，一个是侧链与D-7-A的侧链供体作用力，一个是骨架受体作用力。这两个作用力作用于同一位点，一个是活性中心的Ser178残基，另一个是活性中心的Thr179氨基酸残基。从相互作用图（图4）可见，D-7-A在α-微管蛋白中未发现明显的位点排斥及残基酸化作用等，保证了D-7-A在活性口袋中的稳定。
E-7-W与α-微管蛋白活性中心4X1I对接结果显示，E-7-W与4X1I活性中心存在6个作用力，与活性中心发生交互作用的氨基酸位点分别是：Gln15、Thr225、Tyr224、Tyr210、Arg214。从图5中可见，部分氨基酸残基并未完全进入到活性中心，E-7-W对4X1I活性的抑制作用可能只是部分肽段残基在起作用，但是否单纯以发生交互作用的肽段与活性中心结合，还是其他残基也起到了辅助作用，还有待于进一步研究。
G-8-V与α-微管蛋白活性中心4X1I对接结果显示，G-8-V与4X1I活性中心存在4个作用力，与活性中心发生交互作用的氨基酸位点分别是：Gln11、Ser178、Asp329。从图6中可见，部分氨基酸残基完全进入到活性中心，G-8-V对4X1I活性的抑制作用因较多的作用力结合，且作用力发生在G-8-V的首尾两端，保证了活性肽在活性位点的平衡。奥司他汀是抗肿瘤天然产物达司他汀10的合成类似物，是超强细胞毒性微管抑制剂，临床上用作抗体-药物偶联物的有效载荷。Andreas等[23]介绍了几种新的N-端修饰的奥斯他汀类似物的设计和合成，并创新性地获得了新的先导化合物PF-06380101，该化合物对肿瘤细胞的增殖有良好的抑制能力。该研究认为所有奥斯他汀类似化合物与微管蛋白的关键交互作用主要是发生在Asp-β179和Phe-α351，α2亚基的Asn-α329位点。对比本研究的3条寡肽与活性口袋的对接结果发现，本研究的3条寡肽与Andreas等[23]获得的PF-06380101化合物活性机制不同，作用于受体的氨基酸残基位点没有相似性，可能属于新的微管蛋白抑制剂位点。
2.3.2 D-7-A、E-7-W、G-8-V与β-微管蛋白的结合模式
D-7-A与β-微管蛋白活性位点3JAL对接结果显示（图7），D-7-A与3JAL活性中心存在3个氢键作用力。D-7-A与β-微管蛋白活性中心的Glu297、Arg121和Asn300残基以氢键结合，起到了侧链供体的作用。
E-7-W与β-微管蛋白活性位点3JAL对接结果显示（图8），E-7-W与3JAL活性中心Tyr161残基以氢键结合，Tyr161提供了氢键侧链，起到了侧链受体的作用。
G-8-V与3JAL对接结果显示（图9），二者不存在作用力，说明二者无相互作用，既该活性肽对β-微管蛋白无抑制活性。结果显示，D-7-A、E-7-W、G-8-V与对β-微管蛋白相互以氢键相互作用，或无作用力量。
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图 9 GSISSGQV与β-微管蛋白3JAL活性位点结合的空间构象Figure 9. Binding of GSISSGQV to the active site of β-tubulin由于 D-7-A、E-7-W、G-8-V与α-微管蛋白具有较强的相互作用，与β-微管蛋白作用较弱。已有报道微管蛋白是抗肿瘤活性物的重要作用靶点[26]，因此进一步研究三条寡肽的抗肿瘤作用。
2.4 甲鱼蛋白源寡肽对A549细胞的影响
2.4.1 D-7-A、E-7-W、G-8-V对A549细胞活性的影响
影响微管蛋白的聚合，干扰微管微丝的形成可影响与凋亡相关的信号传导通路，引起细胞凋亡[25]。本实验首先评价了不同浓度的D-7-A、E-7-W、G-8-V对A549细胞的影响。实验结果显示（图10），D-7-A、E-7-W、G-8-V均对A549细胞具有一定的抑制作用，均具有剂量依赖性，其IC50值分别为2003±72、1877±102、1789±137 µmol/L，G-8-V对A549细胞的抑制效果最强，因此进一步评价其对A549细胞的诱导凋亡作用。
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图 10 甲鱼蛋白源寡肽对A549的活性影响注：不同字母代表差异显著（P<0.05）。Figure 10. Effects of peptides on the proliferation of A549 cells2.4.2 G-8-V对A549的诱导凋亡作用
Annexin V-PI双染法检测肿瘤细胞凋亡，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来[26−27]。由于G-8-V对A549细胞的抑制效果最强，因此采用Annexin V-PI双染法检测G-8-V对A549细胞凋亡诱导作用。
如图11所示，对照组95%以上为正常细胞，早期凋亡率为2.93%±0.23%，晚期凋亡率为1.07%±0.15%，坏死率为0.60%±0.10%。与对照组相比，用1000 µmol/L的G-8-V分别处理肺癌A549细胞24 h和48 h后，各处理组细胞早期凋亡率均显著增加（P<0.05），且随着时间的增加而增加。药物处理24 h组，细胞早期凋亡率为5.33%±0.32%，细胞晚期凋亡率为6.67%±0.59%，细胞坏死率为0.90%±0.20%；药物处理48 h时，细胞早期凋亡率为11.33±1.00%，晚期凋亡率为12.77%±0.40%，细胞坏死率为1.43%±0.23%。与对照组相比，随着处理时间的增加，细胞的凋亡率也在增加，说明GSISSGQV会对人肺癌A549细胞凋亡产生显著影响（P<0.05）。
3. 结论
三条寡肽D-7-A、E-7-W、G-8-V均对微管蛋白的聚合具有抑制作用，为微管蛋白聚合抑制剂，与长春新碱相似。分子对接结果发现D-7-A与α-微管蛋白活性中心4X1I存在2个作用力，2个结合位点Ser178和Thr179；E-7-W与α-微管蛋白活性中心存在6个作用力，5个结合位点Gln15、Thr225、Tyr224、Tyr210、Arg214；G-8-V与α-微管蛋白活性中心4X1I存在4个作用力，3个结合位点Gln11、Ser178、Asp329，说明D-7-A、E-7-W、G-8-V对α-微管蛋白的抑制作用较强，而与β-微管蛋白的作用力较弱。
细胞实验结果表明，D-7-A、E-7-W、G-8-V对A549细胞有较好的抑制效果，G-8-V的效果最好，且能够诱导A549细胞凋亡，具有时间依赖性。本研究为深度开发甲鱼蛋白资源，探究其活性作用机理提供数据支持。
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图 1 D-7-A、E-7-W、G-8-V的结构
注：（a）为D-7-A；（b）为E-7-W；（c）为G-8-V。
Figure 1. Structures of D-7-A, E-7-W, and G-8-V
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图 3 图3 寡肽对微管蛋白聚合-解聚的影响
Figure 3. Effects of oligopeptide on tubulin polymerization-depolymerization
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图 9 GSISSGQV与β-微管蛋白3JAL活性位点结合的空间构象
Figure 9. Binding of GSISSGQV to the active site of β-tubulin
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图 10 甲鱼蛋白源寡肽对A549的活性影响
注：不同字母代表差异显著（P<0.05）。
Figure 10. Effects of peptides on the proliferation of A549 cells
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