Effects of Incorporation of Different Forms of Curdlan Gels on the Gelling Properties and in Vitro Digestibility of Myofibrillar Protein Gels
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摘要: 本文主要研究可得然胶以热可逆凝胶（Thermal reversible curdlan gum，TRC）和热不可逆凝胶（Thermal irreversible curdlan gum，TIRC）形态添加对肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein，MP）凝胶特性及其体外消化特性的影响。结果表明，随着TRC或TIRC浓度的增加，MP凝胶的凝胶强度和持水性显著增加（P<0.05），在添加量为0.4%时达到最大值，此结果可以通过动态流变学行为得到证实。同时，TRC或TIRC的存在促进α-螺旋转化为β-折叠，疏水相互作用和二硫键是维持共混凝胶的主要作用力。微观结构表明，TRC或TIRC添加可以促进形成致密且均匀的蛋白网状结构。然而，由于TRC或TIRC与MP之间互作方式不同，引起共混凝胶微观结构存在差异。此外，TRC或TIRC添加阻碍蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，显著降低蛋白消化率（P<0.05），尤其当添加量为0.3%（w/w）时，消化率从77.53%降低到71.66%。然而，每种添加形式对MP凝胶的体外消化率没有显著的影响（P>0.05）。因此，本研究为TRC或TIRC对MP凝胶形成和体外消化的影响提供理论依据，同时为可得然胶在肉类工业中的应用奠定技术支撑。Abstract: The effects of the addition of curdlan gel with two different forms, thermal reversible curdlan gum (TRC) and thermal irreversible curdlan gum (TIRC) on the gelling properties and in vitro digestibility of myofibrillar proteins (MP) gel were investigated. The results showed that the gel strength and water holding capacity of MP gel significantly increased with increasing TRC or TIRC concentration (P<0.05), and reached the maximum value at 0.4%, which was confirmed by dynamic rheological behavior. Meanwhile, the addition of TRC or TIRC promoted the transformation of α-helix into β-sheet, and the hydrophobic interaction and disulfide bond were the primary forces of mixed gels. The microstructures revealed that the addition of TRC or TIRC promoted the formation of the dense and uniform protein network structure. However, the modes of interactions between TRC or TIRC and MP induced the different patterns for the gel formation, resulting in the differences in the microstructure of MP gels. In addition, the addition of TRC or TIRC inhibited protein hydrolysis into small peptides and amino acids, which significantly decreased in vitro protein digestibility (P<0.05). Especially when the supplemental level was 0.3% (w/w), the digestibility was reduced from 77.53% to 71.66%. However, no significant effect on the in vitro digestibility of MP gels was observed for each addition form of curdlan (P>0.05). Therefore, this study provides a theoretical basis for the effect of TRC or TIRC on the formation and in vitro digestion of MP gel, and lays a technical support for the application of curdlan gum in meat industry.
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肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein，MP）是肌肉中主要的结构和功能成分，其凝胶特性是决定肉制品品质最重要的功能特性之一[1]。MP经过热诱导形成凝胶的过程比较复杂，需要经过蛋白质的变性、解离、聚集以及凝胶化等一系列反应[2]。影响MP凝胶特性的因素有体系的组分以及温度[3]、pH[4]以及盐离子种类和离子强度[5]等体系条件和凝胶制备方法等。近年来，研究者尝试添加外源添加物（如淀粉、膳食纤维、多糖、蛋白等）或利用新型加工技术（如超声、超高压、电子辐照等）来提高MP的凝胶特性，其中，添加多糖在实际生产中是更为安全有效的手段[6]。此外，MP只有被人体摄入并消化吸收才能为机体提供丰富的营养价值，因此研究肉蛋白消化率具有重要意义[7]。研究表明，多糖添加对肉蛋白的体外消化特性影响各不相同。Zhou等[8]发现羧甲基纤维素通过氢键、疏水性互作用等作用力与MP分子结合，掩盖胃蛋白酶与MP的结合位点，从而显著降低MP凝胶在胃消化阶段的蛋白质消化率。然而，Saengsuk等[9]发现结冷胶添加使MP分散更均匀，易于形成更小的蛋白质聚集体，在消化过程中增加MP与胃蛋白酶和胰蛋白酶的接触面积，从而促进蛋白消化。由于可得然胶凝胶独特的成胶特性，不同加热方式形成TRC和TIRC对MP凝胶消化特性的影响有待进一步探究。
可得然胶是一种由葡萄糖单体通过线性、无分枝的β-（1,3）糖苷键链接而成的多糖，能够根据不同的热处理条件形成两种类型的凝胶。将其水溶液加热至55~60 ℃然后冷却至40 ℃以下，得到热可逆凝胶（Thermal Reversible Curdlan Gum，TRC），其主要是单螺旋链通过氢键连接而成，这种凝胶极其不稳定，在40 ℃以下时，仍然可以形成游离态的分散液；当溶液继续加热到90 ℃以上时，得到热不可逆凝胶（Thermal Irreversible Curdlan Gum，TIRC），其主要是三螺旋链通过疏水相互作用形成，即使在高温条件也不会融化或者发生结晶，并随着加热时间的增加，凝胶强度会显著增加[10−11]。在前期研究发现，可得然胶以TRC和TIRC添加能够对MP的凝胶特性产生不同影响[12]，而从结构和分子力角度探究其对MP凝胶的影响机理还鲜有研究。
因此，本试验利用傅里叶红外光谱、扫描电镜、流变学检测等手段，分析TRC和TIRC对MP凝胶的凝胶强度、持水性（Water Holding Capacity，WHC）、二级结构、微观构象以及分子间作用力的影响。同时，基于蛋白结构变化与蛋白的消化特性密切相关，进一步探究TRC或TIRC添加对混合凝胶体系中MP消化特性的影响，为可得然胶在肉制品中的应用提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜的猪背部最长肌（死后24 h） 市购；可得然胶 纯度>99%，东京Dongye国际株式会社；EGTA、牛血清白蛋白 Sigma Aldrich公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 天津市巴斯夫化工有限公司；氯化镁、氯化钠 天津市津东天正精细化学试剂厂；盐酸、尼罗蓝 中国国药股份有限公司；硫酸铜、酒石酸钾钠 天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠、尿素 哈尔滨市万太生物药品公司；β-巯基乙醇 大连市宝生物科技有限公司；以上化学试剂均为分析纯。
AL-104型精密电子天平、FE20K pH计 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；QT-1旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司；JD500-2型电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；T18匀浆机 德国IKA公司；TA-XT plus型质构分析仪 英国Stable MiCro System公司；S-3400N钨灯丝扫描电子显微镜 日本日立公司；Discovery DHR-1 TA流变仪 美国TA仪器公司；马尔文激光粒度仪2000型、ZS纳米电势仪 英国马尔文公司；721型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Deltavision OMX SR超分辨率显微镜 美国通用电气公司。
1.2 实验方法
1.2.1 猪肉MP的提取
猪肉MP的提取参考Xia等[13]的方法并略作修改。首先，选取猪背最长肌，剔除脂肪和结缔组织，切成小块后放入组织捣碎机中，加入4倍体积的缓冲溶液（0.01 mol/L磷酸缓冲液、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH7.0），高速匀浆60 s，于4 ℃、3500 r/min条件下冷冻离心15 min，去除上清液收集沉淀。以上步骤重复两次。然后将4倍体积的0.1 mol/L NaCl加入沉淀中，高速匀浆60 s，于4 ℃、3500 r/min条件下冷冻离心15 min，去除上清液收集沉淀，并重复该步骤一次。再次清洗沉淀，匀浆后用四层纱布过滤两次，然后用0.1 mol/L HCl调节pH至6.0，在4 ℃、3500 r/min条件下冷冻离心15 min，最终得到沉淀即为MP，于4 ℃冷藏备用。
1.2.2 TRC和TIRC的制备
TRC制备：将可得然胶配制成5%（w/w）溶液，在55 ℃水浴条件下，不断搅拌加热15 min后停止，取出后冷却至室温，于4 ℃下放置过夜储存备用。
TIRC制备：将可得然胶配制成5%（w/w）溶液，在55 ℃水浴条件下，不断搅拌加热15 min，然后继续在90 ℃水浴条件下搅拌加热15 min，取出后冷却至室温，于4 ℃下放置过夜储存备用。
1.2.3 可得然胶-肌原纤维蛋白共混凝胶制备
将提取的MP分散于含有0.6 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）中，制备成浓度为50 mg/mL MP溶液，然后加入TRC或TIRC及含有0.6 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.0），使得最终MP浓度均为40 mg/mL，可得然胶浓度为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/w），制备均匀的共混体系。将制备好的共混体系放入80 ℃水浴锅中加热20 min，取出置于室温下冷却，于4 ℃下放置过夜，得到可得然胶-肌原纤维蛋白共混凝胶。指标测定前均需将共混凝胶在室温下平衡30 min后再进行测定。
1.2.4 WHC的测定
根据Sánchez-González等[14]的方法，将制备好的共混凝胶转移到50 mL的离心管中，在4 ℃、10000×g条件下离心15 min。将离心出来的水分倒出，称量剩余凝胶的重量。WHC计算公式如下：
WHC(%)=M2−MM1−M×100 其中：M表示离心管的质量（g）；M1表示离心前凝胶和离心管的质量（g）；M2表示离心后凝胶和离心管的质量（g）。
1.2.5 凝胶强度的测定
参考Mi等[15]的方法并略作修改。将待测样品置于载物台上，使用圆柱不锈钢探针（P/0.5），在室温下测定共混凝胶的凝胶强度。参数如下：测试前速率为5 mm/s，测试速率为1 mm/s，测试后速率为5 mm/s，下压距离50%，触发力为5 g。
1.2.6 流变学特性的测定
参考Yang等[16]的方法略作改动，取约5 g未加热处理的共混凝胶样品，均匀涂于平板的下表面（40 mm直径），驱动平板上表面缓慢下降，机器自动调节间距为1 mm，平行板外样品与空气接触处用石蜡封住以防止水分蒸发。测试参数为：频率为1 Hz，恒定应力为2%，以1 ℃/min的速率从20 ℃升温到80 ℃。测定不同样品的储能模量（G′）和损耗模量（G′′）及相位角正切（tanδ）的变化。
1.2.7 微观结构的观察
按照Hu等[17]的方法对共混凝胶样品进行微观结构的观察，进行扫描电镜观察。
1.2.8 傅里叶红外光谱扫描分析
先将共混凝胶样品冷冻干燥并通过80目筛得到冻干粉，再将1 mg样品和100 mg干燥的KBr加入玛瑙研钵并压制成片。使用傅里叶变换红外光谱仪，在4000~500 cm−1波数范围内对样品进行扫描，分辨率为4 cm−1。使用PeakFit v.4.12软件分析蛋白质二级结构的变化。
1.2.9 分子间作用力的测定
分子间作用力是根据Pham等[18]的程序并进行一些修改。称取1 g样品，分别与5 mL SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素）、SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素）、SE（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇）混合，于5000 r/min下均质1 min，4 ℃下静置反应2 h，然后，于10000×g条件下离心10 min，收集上清液，测定上清液中蛋白质含量。离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键含量分别由SB和SA溶液、SC和SB溶液、SD和SC溶液以及SE和SD溶液中蛋白质含量的差异表示。
1.2.10 体外消化
1.2.10.1 模拟体外消化过程
在体外消化分析之前，根据Jiang等[19]的方法制备模拟消化液的电解质储备溶液（（胃液（Simulated Gastric Fluid，SGF）和肠液（Simulated Intestinal Fluid，SIF））。根据Minekus等[20]的方法进行模拟体外胃和小肠的消化过程。
将MP凝胶样品绞碎，取10 mL样品与7.5 mL SGF电解质原液、1.6 mL的胃蛋白酶溶液（30000 U/mL，溶解在SGF的电解质原液中）、5 μL CaCl2（0.3 mol/L）、0.2 mL HCl（1 mol/L）以及0.695 mL蒸馏水混合，此时混合体系中含有2400 U/mL的胃蛋白酶和0.075 mmol/L的CaCl2。利用1 mol/L HCl调节混合体系的pH至3.0。最后将混合体系置于37 ℃环境中消化2 h。然后，将20 mL的上述胃消化溶液与13.5 mL SIF电解质溶液、5.0 mL的胰蛋白酶溶液（78960 U/mL，溶解在SIF溶液中）、40 μL CaCl2（0.3 mol/L）、0.15 mL NaOH（1 mol/L）和1.31 mL蒸馏水混合，混合体系中胰蛋白酶的活性为9870 U/mL。利用1 mol/L NaOH调节混合体系pH至7.0。最后将混合体系置于37 ℃环境中消化2 h。
1.2.10.2 蛋白消化率的测定
在样品中加入等体积的15%三氯乙酸（w/w）溶液，将样品置于4 ℃冰箱中保持12 h，于4 ℃ 10000×g条件下离心20 min，收集上清液。利用双缩脲法测量上清液的蛋白质含量。使用以下公式计算共混凝的蛋白消化率：
蛋白消化率(%)=上清液的蛋白含量−空白样品中上清液的蛋白含量凝胶的蛋白含量×100 1.2.10.3 消化产物粒径的测定
根据Pham等[18]的方法，使用动态光散射仪分析模拟胃肠消化后样品的粒径，使用去离子水作为分散剂，并记录体积平均值（D4,3）。测定前，将消化样品的蛋白浓度稀释到0.1 mg/mL。
1.2.10.4 MP凝胶消化产物微观结构观察
利用超高分辨率显微镜的传统的宽场成像模型和60×1.42 NA PlanApo浸油透镜对消化产物的微观结构进行观察。首先将0.5 mL消化产物添加到1.5 mL离心管中，然后添加20.0 μL 0.1%尼罗蓝。然后吸取2.0 μL染色后的样品制备观察样品。蛋白相的激发波长设置为640 nm，显示为红色。
1.3 数据处理
每个试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1（美国Analytical Software公司）软件包中Linear Models程序进行，差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）分析使用Tukey HSD程序。采用Origin 2019分析同时采用R-4.2.0软件包作图。
2. 结果与分析
2.1 TRC或TIRC添加对MP凝胶WHC和凝胶强度的影响
WHC通常用于评价MP凝胶在一定条件下结合水的能力，是评估肌肉蛋白产品的重要质量指标。如图1所示，与对照组相比，TRC或TIRC添加均能显著提高MP凝胶的WHC，且随TRC或TIRC浓度的增加而增加（P<0.05）。Gao等[21]研究发现，魔芋胶可以与MP的亲水基团结合，使得蛋白质的空间结构更加松散，暴露出更多的疏水基团，促进了疏水相互作用的形成，改善了共混凝胶的WHC。同时，对于TRC和TIRC而言，TIRC能显著提高MP凝胶的WHC（P<0.05）。
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图 1 TRC或TIRC添加量对MP凝胶持水性（A）和凝胶强度（B）的影响注：不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。Figure 1. Effects of TRC or TIRC concentration on WHC (A) and gel strength (B) of MP gels凝胶强度是评价MP凝胶品质的重要指标，可以直接反映凝胶体系中凝胶结构的稳定性。与对照组相比，TRC或TIRC添加均能显著提高共混体系的凝胶强度（P<0.05）。随着TRC或TIRC浓度的增加，共混凝胶的凝胶强度均呈现逐渐增加的趋势（P<0.05）。许多研究表明，添加亲水胶体可以产生更为致密的凝胶网络，改善凝胶的质地[17,22]。Tanyamon等[23]发现，结冷胶添加能够显著增强鱼糜凝胶的凝胶强度，可能是由于结冷胶通过静电相互作用与MP发生填料或粘合剂效应所致。另外，对于TRC或TIRC而言，TIRC对于MP凝胶的凝胶强度有显著性的影响（P<0.05）。这有可能是因为添加TIRC可以产生更为致密紧凑的三维网状结构，显著提高了混合凝胶的凝胶强度，这与WHC的结果一致。
2.2 TRC或TIRC添加对MP动态流变学特性的影响
流变学是用于确定MP凝胶化过程的物理化学特性的基本工具。通过监测热诱导凝胶化过程中共混体系的G′、G″和tanδ，分析热处理期间TRC或TIRC添加量对MP溶胶的动态粘弹性行为的变化见图2与表1所示。G′表示MP胶凝体系的弹性性质。如图2A~图2B所示，对于对照组而言，温度由20 ℃升高到42 ℃时，G′呈现缓慢增加的趋势，持续加热到50 ℃左右，出现最高的G′值，这可能是由于肌球蛋白分子头部变性展开，通过交联作用形成寡聚体，这是凝胶形成的初始阶段[24−25]。在此温度下，TRC或TIRC添加导致共混溶液G′值呈现降低的趋势，这可能是由于TRC或TIRC添加导致蛋白分子的展开和聚集能力较差。随着温度继续增加，由于肌球蛋白尾部变性，G′值呈现迅速下降的趋势，并在55~60 ℃时达到该阶段的最低值，表明临时的MP凝胶网络结构被破坏[26]。当温度继续升高直至80 ℃时，共混溶液的G′值缓慢上升，表明MP完全变性聚集并形成弹性凝胶网络结构。Tornberg[27]的研究认为，疏水相互作用在这种转变中占主导地位，将粘性溶胶转变成弹性凝胶网络。此温度下，与对照组相比，TRC或TIRC添加显著增高共混凝胶的G′值（P<0.05），并呈一定的浓度依赖性。另外，TIRC添加组的最终G′值高于TRC添加组，这表明MP-TRC凝胶的网络结构与MP-TIRC凝胶不同，TIRC的加入导致MP凝胶的刚性高于TRC。这与凝胶强度和WHC的结果是一致的。
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图 2 TRC（A、C、E）或TIRC（B、D、F）添加量对热处理过程中MP动态流变学特性的影响Figure 2. Effects of TRC (A, C, E) or TIRC (B, D, F) concentration on the dynamic rheological properties of MP during heat treatment表 1 TRC或TIRC浓度对MP动态流变学特性的影响Table 1. Effects of TRC or TIRC concentration on the dynamic rheological properties of MP样品 G′（80 ℃） G″（80 ℃） 对照 252.883±1.687h 10.452±0.137f TRC-0.1% 286.790±1.391f 12.749±0.465e TRC-0.2% 306.161±1.236d 16.979±1.023d TRC-0.3% 323.424±2.135c 19.501±1.564c TRC-0.4% 349.015±2.143b 22.609±0.984b TIRC-0.1% 261.802±1.364g 12.701±0.731e TIRC-0.2% 290.724±0.134e 17.338±1.301cd TIRC-0.3% 347.542±3.132b 19.018±2.318cd TIRC-0.4% 362.288±4.148a 29.609±0.891a 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。 G″代表MP凝胶体系的粘性性质。如图2C~图2D所示，从20 ℃升温直至80 ℃，每个样品的G″的变化与G′的趋势相似。在加热终点时，TRC或TIRC添加显著增加共混凝胶的G″值（P<0.05），并呈一定的浓度依赖性，这表明TRC或TIRC能有效增加MP的粘性行为。同时，添加TIRC处理组的G″值显著高于TRC处理组（P<0.05），这表明TRC添加可以使肌原纤维蛋白凝胶引起比TIRC更小的粘性行为。
tanδ即粘度与弹性之比。纯固体的tanδ值为零，纯液体的tanδ值为无穷大。在整个升温过程中，所有样品的G′值均大于G″值，表明共混凝胶具有类固体的力学行为。不添加TRC或TIRC的MP凝胶因其较低的tanδ值更接近于纯固体的状态，而TRC或TIRC添加显著提高共混凝胶的tanδ值（P<0.05），并呈浓度依赖关系。这可能是因为TRC或TIRC具有一定吸收水的能力，从而导致共混凝胶最终tanδ值较高。
2.3 TRC或TIRC添加对MP凝胶微观结构的影响
为了进一步观察MP凝胶的网络构象，利用扫描电镜对共混凝胶的微观结构进行观察。结果如图3所示，可以看出不同处理组之间微观结构差异较大。对照组呈现出疏松多孔的结构，形成较大且不均匀的空腔结构（如图3A中白色箭头所示）。这种疏松粗糙的结构更难锁住水分，受到外力极易被破坏，这也解释了对照组凝胶强度和WHC较低的现象。Zhuang等[28]研究表明肌原纤维蛋白凝胶网络结构中存在较多的水分通道，会对凝胶的相互作用产生负面影响。当TRC或TIRC添加后，MP凝胶呈现出孔洞较少且更为致密均匀的三维网状结构（如图3B~图3E、图3G~图3J），并随添加量的增加结构更为紧凑稳定，这可能是由于MP与TRC或TIRC之间相互作用增强，有助于蛋白之间的相互交联。Zheng等[22]发现随着κ-卡拉胶添加量的增加，南极磷虾蛋白质凝胶网络明显增强。与此同时，添加TIRC的共混凝胶较MP组凝胶孔洞较小，且随着添加量的增加，可得然胶颗粒先形成TIRC凝胶网络，再填充进肌原纤维蛋白凝胶网状结构的空隙中，使共混凝胶的结构更为致密。然而，对于添加TRC的共混凝胶，当TRC添加量为0.4%时，凝胶结构中无明显孔洞，结构均匀且网格细小，这表明添加TRC可以有效提高蛋白质之间的交联程度。这可能是由于TRC具有热可逆的还原特性，在加热过程中，TRC能够与MP发生分子间相互作用，促进共混凝胶的形成，这与Hu等[17]和Wu等[29]的研究结果是一致的。
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图 3 不同浓度TRC或TIRC对MP凝胶微观结构的影响注：A~E为放大倍数5000倍下的图像；F~J为放大倍数3000倍下的图像；A、F为未添加可得然胶的MP凝胶样品，B、G为添加0.3% TRC的共混凝胶样品，C、H为添加0.4% TRC的共混凝胶样品，D、I为添加0.3% TIRC的共混凝胶样品，E、J为添加0.4% TIRC的共混凝胶样品。Figure 3. Effects of TRC or TIRC concentrations on the microstructure of MP gels2.4 TRC或TIRC添加对MP凝胶二级结构的影响
蛋白质的二级结构主要包括α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规则卷曲[30]。由表2可知，TRC或TIRC的加入显著降低共混凝胶的α-螺旋含量，增加β-折叠含量，且呈浓度依赖性（P<0.05）。一般而言，在热诱导凝胶化过程中，β-折叠的形成与α-螺旋的解折叠同时发生，β-折叠结构有助于形成更有序和紧凑的网络[31−32]。这一结果表明，添加TRC和TIRC可以促进MP的二级结构从α-螺旋转变为β-折叠。Zhu等[33]研究发现，α-螺旋结构展开可以暴露出更多的官能团，α-螺旋含量降低表示MP分子解折叠和有序结构减少，而β-折叠含量增加表示MP聚集增强，α-螺旋含量的减少和β-折叠含量的增加均有利于MP的凝胶化。此外，与TRC相比，相同添加量的TIRC的处理组α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加（P<0.05），这可能是因为肌原纤维蛋白与TRC和TIRC相互作用有所不同。
表 2 TRC或TIRC添加量对MP凝胶二级结构组分的影响Table 2. Effects of TRC or TIRC concentration on secondary structure fractions of MP gels样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 对照 16.96±0.54a 32.69±0.06e 32.84±0.23cd 17.51±0.38bc TRC-0.1% 15.71±0.22b 33.41±0.18e 32.06±0.35d 18.82±0.29a TRC-0.2% 14.90±0.13bc 34.72±0.25d 32.94±0.94cd 17.44±0.47bc TRC-0.3% 13.66±0.56d 35.33±0.31cd 33.46±0.77bc 17.55±0.31bc TRC-0.4% 12.47±0.45e 36.85±0.64b 33.01±0.46cd 17.67±0.46bc TIRC-0.1% 15.28±0.21b 33.06±0.11e 33.32±0.33bc 18.34±0.54ab TIRC-0.2% 14.37±0.13cd 34.58±0.21d 32.75±0.52cd 18.30±0.96ab TIRC-0.3% 12.53±0.81e 36.77±0.31bc 34.05±0.64b 16.65±0.31c TIRC-0.4% 10.92±0.78f 38.74±0.45a 39.52±0.21a 10.82±0.94d 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。 2.5 TRC或TIRC添加量对MP凝胶分子间作用力的影响
蛋白质与亲水胶体之间存在一定的分子间相互作用，所涉及的作用力主要有离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键等。如图4所示，对于MP凝胶而言，疏水相互作用和二硫键是MP凝胶中最为重要的作用力。同时，随着TRC或TIRC添加量的增加，MP凝胶的离子键含量呈现先增加后降低的趋势，且在添加量为0.2%时具有最高的离子键含量（P<0.05）。对于氢键，TRC或TIRC的添加均能增加MP凝胶的氢键含量，并呈现先增加后降低的趋势，且在添加量为0.3%时具有最高的氢键含量（P<0.05）。对于疏水相互作用而言，TRC或TIRC添加均能够显著增加MP凝胶的疏水相互作用，且在添加量为0.3%时具有最大值（P<0.05）。与此同时，与TIRC相比，TRC添加可以更显著的增加疏水相互作用（P<0.05）。这可能是因为TRC具有加热可逆的还原特性，在加热过程中暴露出更多的疏水基团，促进与MP之间的相互作用。Gao等[21]研究发现，一定浓度的魔芋胶可以与MP的亲水基团结合，使得蛋白质的网状结构更为松散，暴露出更多的疏水基团，促进疏水相互作用的形成。此外，TRC或TIRC添加显著增加MP凝胶的二硫键含量（P<0.05）。这是因为在热诱导形成凝胶的过程中，蛋白分子内部的巯基暴露出来，促进了分子间二硫键的形成[34]。同时，由于TRC具有热可逆的还原特性，在热诱导过程中能够更有效的激活二硫键并诱导更多分子间二硫键的形成，促进凝胶网络结构的形成[35]。因此，TRC较TIRC添加可以更显著的增加二硫键含量。
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图 4 TRC或TIRC浓度对MP凝胶分子间作用力的影响注：不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。Figure 4. Effects of TRC or TIRC concentration on the chemical interaction of MP gels2.6 TRC或TIRC添加对MP凝胶体外消化率的影响
体外模拟消化是一种通过测定蛋白质消化率来评估生物利用度的有效方法[36]。在胃和小肠阶段的蛋白质消化率结果如图5A~图5B所示。胃（0~120 min）和小肠（120~240 min）消化过程中，随着消化时间的增加，蛋白消化率呈现显著增加的趋势（P<0.05）。这表明在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下MP逐渐水解成小分子肽或氨基酸。在胃消化阶段，与对照组相比，TRC或TIRC添加能够显著降低MP凝胶的体外消化率（P<0.05）。Hu等[37]研究发现，亲水胶体添加能够延缓大豆蛋白的消化。在胃消化终点时，随TRC或TIRC添加，蛋白消化率呈先降低后增加的趋势，在添加量为0.3%时消化率最低（P<0.05）。这可能是因为TRC或TIRC添加导致肌原纤维蛋白凝胶具有更为致密且均匀的网络结构，阻碍蛋白的消化。与此同时，在小肠消化阶段，TRC或TIRC添加能够显著降低MP体外消化率（P<0.05），这与胃相消化结果一致，且与表3中Cf值相对应。另外，经小肠消化120 min时，TRC组和TIRC组的蛋白消化率没有显著差异（P>0.05），这与胃消化的结果一致。
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图 5 TRC或TIRC添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性和体外消化特性的Spearman相关性分析Figure 5. Effects of TRC or TIRC concentration on the in vitro digestibility (A, B) and digestive kinetics (C, D) of MP gels during gastrointestinal digestion表 3 TRC或TIRC添加量对MP凝胶体外消化动力学参数的影响Table 3. Effects of TRC or TIRC concentration on kinetic parameters of in vitro digestion of MP gels样品 Cf（%） K（min） R2 对照 77.53±2.65a 0.0197±0.0045a 0.9252 TRC-0.1% 76.36±1.34ab 0.0195±0.0048a 0.9131 TRC-0.2% 75.18±3.56abc 0.0192±0.0049a 0.9058 TRC-0.3% 71.66±2.22c 0.0172±0.0045a 0.9053 TRC-0.4% 72.84±1.34bc 0.0192±0.0045a 0.9229 TIRC-0.1% 76.65±2.33ab 0.0190±0.0048a 0.9099 TIRC-0.2% 72.25±0.88c 0.0188±0.0044a 0.9211 TIRC-0.3% 71.66±1.35c 0.0170±0.0038a 0.9302 TIRC-0.4% 72.83±2.22bc 0.0169±0.0039a 0.9260 注：Cf（%）为消化240 min后的最终蛋白消化率；K（min）为消化速率常数；数值表示为从模型中估计的动力学参数的估计动力学值±标准差；同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 通常来说，亲水胶体对肌原纤维蛋白凝胶的消化动力学有显著影响。如图5C~图5D所示，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，肌原纤维蛋白的消化率随时间的增加而增加，TRC或TIRC添加显著降低蛋白消化率（P<0.05），并随添加量的增加呈现先降低后增加的趋势。与对照组相比，TRC或TIRC添加导致肌原纤维蛋白凝胶结构聚集，抑制了蛋白质的水解。同时，在TRC或TIRC的添加量为0.3%时，消化率在消化曲线的末端趋于平稳的速率更慢，这与表3中相对较低的速率常数一致，表明在该添加量下蛋白消化率达到最终平台期的速度最慢。
2.7 TRC或TIRC添加对MP凝胶消化产物粒径及微观结构的影响
表 4 TRC或TIRC添加量对MP凝胶消化产物粒径的影响Table 4. Effects of particle size (μm) of the digestion products of MP gels with TRC or TIRC concentration during gastrointestinal样品 原样 胃相 肠相 对照 56.94±2.06c 0.64±0.03d 0.35±0.01d 0.3% TRC-MP 71.06±2.41b 1.26±0.03a 1.12±0.05a 0.4% TRC-MP 75.33±4.73b 0.93±0.01c 0.76±0.04c 0.3% TIRC-MP 76.99±2.24b 1.22±0.03a 1.00±0.04b 0.4% TIRC-MP 98.49±4.40a 1.01±0.05b 0.73±0.02c 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 粒径大小可以用来表征蛋白质的水解程度[38]。如图6及表4所示，对于未消化的样品，TRC和TIRC添加组消化产物粒径显著增加（P<0.05），并呈一定的浓度依赖性。经过120 min的胃消化过程后，与对照组相比，TRC和TIRC组消化产物粒径显著增加（P<0.05），这说明TRC或TIRC添加抑制胃蛋白酶与MP分子的相互作用，降低酶对MP分子的水解程度。与胃消化阶段相比，小肠消化阶段的粒径显著减小（P<0.05），这是由于胰蛋白酶的添加，蛋白质得到进一步的水解，使蛋白质分子分解成更小的肽或氨基酸。在肠消化阶段终点，与对照组相比，TRC和TIRC组消化产物粒径显著增加（P<0.05），这与胃消化阶段的趋势是一致的。同时，TRC或TIRC添加量为0.3%时消化产物粒径最大（P<0.05），这表明在该添加量下蛋白凝胶的消化速率最低，这与测定肌原纤维蛋白凝胶的体外消化率结果一致。
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图 6 胃肠消化过程中TRC或TIRC添加量对MP凝胶消化产物微观结构及粒径（μm）的影响Figure 6. Microstructure and effects of particle size (μm) of the digestion products of MP gels with TRC or TIRC concentration during gastrointestinal显微图像可以反应MP消化前后的直径和形态，以及消化后蛋白质降解的程度[39]。在未消化的原样品的显微镜图像中观察到较多的红色蛋白颗粒，TRC或TIRC添加可以观察到更多的红色颗粒，相较于MP组存在明显差异。经过胃消化120 min后，所有处理组的蛋白颗粒均有所减小，这与胃蛋白酶水解导致蛋白颗粒降解为更小的肽有关。与MP组相比，TRC和TIRC组中红色荧光的数量和大小均有所增加。经过小肠消化120 min后，与胃消化阶段相比，各个处理组的蛋白颗粒均减小。这是由于在肠消化阶段，MP被进一步水解。与MP组相比，含有TRC或TIRC的处理组在肠消化终点蛋白颗粒较大。这可能是因为TRC或TIRC添加阻碍MP的消化。在胃消化阶段终点和小肠消化阶段终点，添加量为0.3%的TRC处理组均表现出最大的蛋白质颗粒，这说明TRC的添加量为0.3%时可以显著降低凝胶中蛋白的消化率，这与蛋白质消化率的结果一致。
2.8 相关性分析
基于斯皮尔曼（Spearman）相关性检验建立了相关矩阵，更好地说明肌原纤维蛋白凝胶特性与体外消化特性之间的关系。如图7所示，图中显示了肌原纤维蛋白凝胶特性与体外消化特性的相关性，热图中越接近蓝色表示正相关性越强，越接近红色表示负相关性越强。结果表明，MP的体外消化率与WHC、凝胶强度、G′、G″、tanδ呈负相关，且差异显著（P<0.05）；同时，蛋白消化率与α-螺旋呈显著正相关（P<0.05），与β-折叠呈显著负相关（P<0.05），并且，蛋白消化率与离子键含量呈正相关，与氢键含量（P<0.05）、疏水相互作用和二硫键含量呈负相关。TRC或TIRC添加促进α-螺旋向β-折叠转化，使分子间的疏水基团和巯基暴露出来，增强了疏水相互作用和二硫键的含量，进而显著提高了共混凝胶的WHC、凝胶强度、G′、G″、tanδ值，阻碍蛋白酶与MP分子的相互作用，显著降低共混凝胶的蛋白消化率。
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图 7 TRC或TIRC添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性和体外消化特性的Spearman相关性分析Figure 7. Spearman correlation analysis between myofibrillar proteins gels with TRC or TIRC concentration and structural and in vitro digestive properties of gels2.9 TRC或TIRC添加影响MP凝胶品质特性和消化特性的机理图
根据对MP凝胶特性和消化特性指标的分析，推测TRC或TIRC添加对肌原纤维蛋白凝胶特性和消化特性影响的相关机理。如图8所示，对照组的网状结构较为松散，随TRC或TIRC添加，共混体系中二级结构发生改变，α-螺旋含量降低导致MP分子解折叠和有序结构减少，β-折叠含量增加促进MP聚集增强。同时，分子结构的展开导致更多的官能团暴露出来，促进分子间的相互作用，有利于MP的凝胶化，有助于致密且均匀的凝胶网络结构的生成。与此同时，这种致密的凝胶网络结构中存在较少的消化酶酶切位点，阻碍MP分解成小分子肽和氨基酸，在一定程度上降低蛋白体外消化率。TRC和TIRC与MP之间存在不同的相互作用，引起共混凝胶的凝胶强度的不同变化。将TRC添加到MP溶胶中时，完全溶胀的多糖分子与MP均匀混合，并在加热过程中建立新的互穿的凝胶网络，而TIRC由于其稳定的热不可逆特性使其在加热期间充当“填料”填充在MP凝胶基质中。然而，对于TRC或TIRC添加对共混凝胶中蛋白消化率的影响，二者之间并无显著差异。
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图 8 TRC或TIRC添加影响MP凝胶品质和体外消化特性的机理图Figure 8. Mechanism diagram of the effects of TRC or TIRC concentration on the gelling properties and in vitro digestibility of MP gels3. 结论
TRC或TIRC添加能够显著改善MP凝胶的凝胶强度、持水性和流变学特性。在TRC或TIRC存在情况下，疏水相互作用和二硫键是维持MP凝胶的主要作用力，氢键和离子键的影响较小。同时，TRC或TIRC添加促进二级结构由α-螺旋向β-折叠转化，导致MP分子解折叠和有序结构减少和聚集增强，促进致密且均匀的凝胶网络结构的形成。同时，由于TRC或TIRC与MP之间复杂的分子互作阻止蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，显著降低MP凝胶的体外消化率，尤其添加浓度为0.3%（w/w）。然而，TRC或TIRC与MP之间的成胶模式不同。以TRC形式添加时，TRC颗粒由于其特殊的热可逆性在加热过程中与MP分子发生相互作用，“渗透”在MP凝胶基质中，形成更为致密稳定的互穿聚合物的凝胶网络，然而，TIRC因其稳定的热不可逆性，仅充当分散在MP凝胶基质中“填充”颗粒。因此，本研究为阐明TRC或TIRC对MP凝胶机制和体外消化率的影响提供一些重要信息，同时为可得然胶在肉类工业中的应用奠定技术支撑。未来的研究将深入解析热诱导凝胶形成过程中TRC或TIRC与MP之间的相互作用对其共混凝胶形成机制的影响。
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图 1 TRC或TIRC添加量对MP凝胶持水性（A）和凝胶强度（B）的影响
注：不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Effects of TRC or TIRC concentration on WHC (A) and gel strength (B) of MP gels
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图 2 TRC（A、C、E）或TIRC（B、D、F）添加量对热处理过程中MP动态流变学特性的影响
Figure 2. Effects of TRC (A, C, E) or TIRC (B, D, F) concentration on the dynamic rheological properties of MP during heat treatment
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图 3 不同浓度TRC或TIRC对MP凝胶微观结构的影响
注：A~E为放大倍数5000倍下的图像；F~J为放大倍数3000倍下的图像；A、F为未添加可得然胶的MP凝胶样品，B、G为添加0.3% TRC的共混凝胶样品，C、H为添加0.4% TRC的共混凝胶样品，D、I为添加0.3% TIRC的共混凝胶样品，E、J为添加0.4% TIRC的共混凝胶样品。
Figure 3. Effects of TRC or TIRC concentrations on the microstructure of MP gels
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图 4 TRC或TIRC浓度对MP凝胶分子间作用力的影响
注：不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。
Figure 4. Effects of TRC or TIRC concentration on the chemical interaction of MP gels
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图 5 TRC或TIRC添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性和体外消化特性的Spearman相关性分析
Figure 5. Effects of TRC or TIRC concentration on the in vitro digestibility (A, B) and digestive kinetics (C, D) of MP gels during gastrointestinal digestion
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图 6 胃肠消化过程中TRC或TIRC添加量对MP凝胶消化产物微观结构及粒径（μm）的影响
Figure 6. Microstructure and effects of particle size (μm) of the digestion products of MP gels with TRC or TIRC concentration during gastrointestinal
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图 7 TRC或TIRC添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性和体外消化特性的Spearman相关性分析
Figure 7. Spearman correlation analysis between myofibrillar proteins gels with TRC or TIRC concentration and structural and in vitro digestive properties of gels
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图 8 TRC或TIRC添加影响MP凝胶品质和体外消化特性的机理图
Figure 8. Mechanism diagram of the effects of TRC or TIRC concentration on the gelling properties and in vitro digestibility of MP gels
表 1 TRC或TIRC浓度对MP动态流变学特性的影响
Table 1 Effects of TRC or TIRC concentration on the dynamic rheological properties of MP
样品 G′（80 ℃） G″（80 ℃） 对照 252.883±1.687h 10.452±0.137f TRC-0.1% 286.790±1.391f 12.749±0.465e TRC-0.2% 306.161±1.236d 16.979±1.023d TRC-0.3% 323.424±2.135c 19.501±1.564c TRC-0.4% 349.015±2.143b 22.609±0.984b TIRC-0.1% 261.802±1.364g 12.701±0.731e TIRC-0.2% 290.724±0.134e 17.338±1.301cd TIRC-0.3% 347.542±3.132b 19.018±2.318cd TIRC-0.4% 362.288±4.148a 29.609±0.891a 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。 
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表 2 TRC或TIRC添加量对MP凝胶二级结构组分的影响
Table 2 Effects of TRC or TIRC concentration on secondary structure fractions of MP gels
样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 对照 16.96±0.54a 32.69±0.06e 32.84±0.23cd 17.51±0.38bc TRC-0.1% 15.71±0.22b 33.41±0.18e 32.06±0.35d 18.82±0.29a TRC-0.2% 14.90±0.13bc 34.72±0.25d 32.94±0.94cd 17.44±0.47bc TRC-0.3% 13.66±0.56d 35.33±0.31cd 33.46±0.77bc 17.55±0.31bc TRC-0.4% 12.47±0.45e 36.85±0.64b 33.01±0.46cd 17.67±0.46bc TIRC-0.1% 15.28±0.21b 33.06±0.11e 33.32±0.33bc 18.34±0.54ab TIRC-0.2% 14.37±0.13cd 34.58±0.21d 32.75±0.52cd 18.30±0.96ab TIRC-0.3% 12.53±0.81e 36.77±0.31bc 34.05±0.64b 16.65±0.31c TIRC-0.4% 10.92±0.78f 38.74±0.45a 39.52±0.21a 10.82±0.94d 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。
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表 3 TRC或TIRC添加量对MP凝胶体外消化动力学参数的影响
Table 3 Effects of TRC or TIRC concentration on kinetic parameters of in vitro digestion of MP gels
样品 Cf（%） K（min） R2 对照 77.53±2.65a 0.0197±0.0045a 0.9252 TRC-0.1% 76.36±1.34ab 0.0195±0.0048a 0.9131 TRC-0.2% 75.18±3.56abc 0.0192±0.0049a 0.9058 TRC-0.3% 71.66±2.22c 0.0172±0.0045a 0.9053 TRC-0.4% 72.84±1.34bc 0.0192±0.0045a 0.9229 TIRC-0.1% 76.65±2.33ab 0.0190±0.0048a 0.9099 TIRC-0.2% 72.25±0.88c 0.0188±0.0044a 0.9211 TIRC-0.3% 71.66±1.35c 0.0170±0.0038a 0.9302 TIRC-0.4% 72.83±2.22bc 0.0169±0.0039a 0.9260 注：Cf（%）为消化240 min后的最终蛋白消化率；K（min）为消化速率常数；数值表示为从模型中估计的动力学参数的估计动力学值±标准差；同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 4 TRC或TIRC添加量对MP凝胶消化产物粒径的影响
Table 4 Effects of particle size (μm) of the digestion products of MP gels with TRC or TIRC concentration during gastrointestinal
样品 原样 胃相 肠相 对照 56.94±2.06c 0.64±0.03d 0.35±0.01d 0.3% TRC-MP 71.06±2.41b 1.26±0.03a 1.12±0.05a 0.4% TRC-MP 75.33±4.73b 0.93±0.01c 0.76±0.04c 0.3% TIRC-MP 76.99±2.24b 1.22±0.03a 1.00±0.04b 0.4% TIRC-MP 98.49±4.40a 1.01±0.05b 0.73±0.02c 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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