Process Optimization and Physicochemical Characterization of Solid-state Fermentation of Summer-autumn Tea by Eurotium cristatum
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摘要: 为改善夏秋茶品质，采用冠突散囊菌对夏秋茶进行发酵研究。通过单因素实验，以夏秋茶茶多酚、总游离氨基酸、总黄酮、水浸出物的含量和感官评分为考察指标，选取4因素3水平进行正交试验优化发酵工艺；采用气相色谱-质谱联用（Gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对最佳工艺下发酵夏秋茶的挥发性化合物进行分析。结果表明，最佳发酵工艺为夏秋茶含水量30%、冠突散囊菌接种量15%、发酵时间9 d，发酵温度30 ℃，在此条件下加工的夏秋茶，其水浸出物含量显著提升了22.51%（P<0.05），茶多酚含量显著下降了27.71%（P<0.05），总黄酮含量显著下降了6.41%（P<0.01），游离氨基酸变化不明显，感官评分极显著提升了10.33分（P<0.01）。此外，发酵后风味化合物总量提升了296.76%，在整个发酵过程中的芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、α-松油醇、水杨酸甲酯和乙酸苯乙酯物质含量增加尤为明显，为夏秋茶带来了丰富的果香和花草香。因而经过发酵处理后，夏秋茶整体质量提高。Abstract: To improve the quality of summer-autumn tea, the fermentation of summer-autumn tea was investigated by using Eurotium cristatum. The contents of tea polyphenols, total free amino acids, total flavonoids, water leachate, and sensory scores of summer-autumn tea were used as the indicators for the one-way experiment, and four factors and three levels were selected for orthogonal experiments to optimize the fermentation process. The volatile compounds of fermented summer-autumn tea under the optimal process were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) technology. The results showed that the optimal fermentation process was 30% water content, 15% inoculum of Eurotium cristatum, fermentation time of 9 d, and fermentation temperature of 30 ℃, and the water leachate content of summer-autumn tea processed under these conditions was significantly increased by 22.51% (P<0.05), the tea polyphenol content was significantly decreased by 27.71% (P<0.05), and the total flavonoid content was significantly decreased by 6.41% (P<0.01), free amino acids did not change significantly, and the sensory score was significantly improved by 10.33 points (P<0.01). In addition, the total amount of flavor compounds was elevated by 296.76% after fermentation, and the content of linalool, linalool oxide I, α-Terpineol, methyl salicylate, and phenethyl acetate substances increased especially significantly throughout the fermentation process, which brought rich fruity and floral aroma to the summer-autumn tea. Thus, the overall quality of summer-autumn tea improved after fermentation treatment.
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中国自古以来就是产茶大国，茶叶文化充斥在人们日常生活中的方方面面。2011年以来中国茶叶的收获面积和总产量常年位于世界第一[1]，随着茶叶销售量不断增加，消费者对茶叶品质的要求也越来越高。根据茶叶的生长发育特性以及茶叶采摘的时间差异分为春茶、夏茶和秋茶[2]。其中，茶树经过一个寒冬的蛰伏，在春天旺盛生长，产出的春茶茶青叶鲜，富含多种风味物质。夏秋茶生长时间跨度长，相较于春季茶，夏秋两季气温较高，日照充足，茶树生长缓慢，导致茶叶中茶多酚含量增高[3]。按照不同季节茶叶的采摘量，春茶约占40%、夏茶和秋茶的采摘比例占60%[4]。但随着采摘成本的上升和夏秋茶市场价格的降低，其利润也随之降低，导致夏秋茶大量弃采，没有发挥其本身价值，每年经济损失达数百亿元[5]。因此，提高夏秋茶的品质对其应用价值和经济效益有着重要意义。
目前大量研究表明，茶叶中较高含量的茶多酚、生物碱、苦味氨基酸和黄酮类化合物等是造成夏秋茶具有较重苦涩味的主要原因[6−7]；其次夏秋茶的纤维含量高，叶质粗硬，炒制的茶叶色泽灰暗，外形品质不如春茶。茶叶中的氨基酸按感官可分为苦味氨基酸和甜味氨基酸，前者的降解能够有效降低茶叶的苦味；茶水浸出物是影响茶汤汤色的重要因素之一，有研究表明水浸出物的高低与茶汤的口感和香气密不可分[8−9]。因此将茶叶中的茶多酚、总黄酮、氨基酸和茶叶的水浸出物控制在一个合理的范围内对夏秋茶的品质至关重要。已有研究表明，通过接种黑茶中的优势微生物进行固态发酵能够有效降低夏秋茶中的茶多酚和黄酮类物质含量[10−11]，刘天囡[12]利用从茯砖茶中分离鉴定出冠突散囊菌发酵夏秋茶浸提液，研究表明发酵过程能够有效降低茶叶中的苦涩物质并显著增加茶叶的芳香类物质；Wang等[13]的研究发现，冠突散囊菌联合黑曲霉发酵能够显著改善夏秋茶的风味，使其产生更多的芳香类物质。但目前有关夏秋茶固态发酵大多停留在理论研究而缺乏对实际生产的工艺参数的研究，因此本研究选取冠突散囊菌对夏秋茶进行固态发酵，结合单因素实验和正交试验探究夏秋茶的最佳发酵工艺，以期提高夏秋茶的品质质量，进而提高夏秋茶的利用价值和经济效益，并为实际生产提供理论参考。
1. 材料和方法
1.1 材料与仪器
夏秋茶 由国药健康（黄山）生物科技有限公司提供；冠突散囊菌（Eurotium cristatum） 来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC；菌株编号：CICC 2099）；癸酸乙酯标准品 色谱纯，购自上海国药公司；茚三酮、茶氨酸、福林酚、甲醇、无水乙醇、没食子酸、磷酸二氢钾 均为分析纯，购自上海源叶生物有限公司；本研究中其他试剂均为分析纯试剂。
Agilent 8890-7000D气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；LT2002E电子天平 常熟天量仪器有限责任公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 夏秋茶发酵工艺
准确称量夏秋茶60 g置于发酵皿中，加入无菌水，控制夏秋茶含水量；制作冠突散囊菌孢子悬浮液，使孢子悬浮液的浓度保持在1×107 CFU/mL；吸取孢子悬浮液均匀喷洒在茶叶表面，置于培养箱中恒温发酵。发酵过程中要严格控制发酵温度，2 d进行一次翻堆，取样采用五点取样法，所有样品保存在−20 ℃备用。翻堆时需保证翻堆后茶叶分布均匀，无团块。堆渥发酵时若温度、湿度下降过快，可覆盖保鲜膜以增温保湿。所有操作都在无菌操作台内进行。
1.2.2 单因素实验设计
为研究冠突散囊菌发酵夏秋茶中水添加量、发酵时间、接种量和发酵温度等因素对发酵结果的影响，以发酵后总酚、总黄酮、总游离氨基酸含量和感官评分为指标[14]，设置水添加量（20%、30%、40%、50%、60%）、发酵时间（0、3、6、9、12 d）、接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）四个发酵因素进行单因素实验（固定因素水平为：水添加量：40%、发酵时间：9 d、接种量：15%、发酵温度：30 ℃）。单因素实验结束后，对每个因素五个水平实验结果进行分析，每个因素中取三个试验结果较好的水平进行正交试验。
1.2.3 正交试验设计
在单因素实验结果的基础上，以水添加量、发酵时间、接种量、发酵温度为实验研究因素，以发酵总评分为考察指标进行正交优化试验，以探究夏秋茶发酵的最佳工艺参数，采用加权评分法评估发酵质量，挑选出最佳发酵参数。发酵总评分计算公式为：
总分=(A/Amax)×100×0.4+(B/Bmax)×100×0.3+(C/Cmax)×100×0.2+(D/Dmax)×100×0.1 其中，A表示感官评分；B表示游离氨基酸含量；C表示水浸出物含量；D表示总黄酮含量；max表示最大值。正交试验因素水平见表1。
表 1 L9（34）正交试验设计Table 1. Design of L9 (34) orthogonal experimental水平 因素 A含水量（%） B发酵时间（d） C接种量（%） D发酵温度（℃） 1 30 6 10 25 2 40 9 15 30 3 50 12 20 35 1.2.4 发酵夏秋茶理化特性测定
水浸出物的检测方法参考余浩等[15]的研究方法并作修改：准确称取茶样3 g于烧杯中，以茶水比（1:50）于80 ℃水浴中加热1 h；过滤后静止30 min，随后4000 r/min离心10 min；准确量取茶汤上清液100 mL于干燥至恒重的蒸发皿中，于酒精灯上蒸干，随后将蒸发皿置于烘箱中，105 ℃烘干3 h，再取出蒸发皿得到水浸出物，称量至恒定。
茶叶中总酚的测定方法参考颜小捷等[16]的研究；总黄酮的测定参考王丽丽等[17]的研究；游离氨基酸的测定参考谢颖颖[18]的研究并结合GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》。总酚含量（mg/g）的标准曲线为：Y=0.0038X−0.0277，R2=0.9979；总黄酮含量（mg/g）的标准曲线为：Y=0.1629X−0.0022，R2=0.9996；总游离氨基酸含量（mg/g）的标准曲线为：Y=0.6855X−0.0153，R2=0.9987。
1.2.5 感官评定
夏秋茶的感官评定参考国标准GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》，并根据实验需求稍作修改：准确称取发酵茶样3 g置于茶杯中，加入沸水浸泡5 min，依次等速过滤出茶汤于相应的审评杯，并以香气、汤色和滋味为指标进行评定；评定小组由5名受训成员组成，审评过程中评茶员独立完成评审，根据茶汤品质进行打分（100分制）。最终评分为5名评审员总分之和除以评审人数所得的均分。评分规则见表2。
表 2 发酵夏秋茶感官评定评分标准Table 2. Scoring criteria for sensory evaluation of fermented summer and autumn tea项目 评分标准 评分（分） 评分系数 香气纯正，无杂气味，香高爽 90~99 香气 香气较高尚纯正，无杂气味 80~89 30% 尚纯 70~79 色泽均匀，红浓，明亮 90~99 汤色 色泽均匀，红浓，尚明亮 80~89 25% 色泽不均匀，红浓，尚明亮 70~79 醇厚，回味甘爽 90~99 滋味 较醇厚 80~89 45% 尚厚 70~79 1.2.6 挥发性风味物质测定
1.2.6.1 样品处理
挥发性风味物质的测定参考Chen等[19]的研究并稍作修改：称取1 g磨碎茶样放入顶空小瓶中，加入30 mL沸水和20 μL癸酸乙酯（癸酸乙酯用甲醇稀释至浓度：0.865×10−3 g/L），并在60 ℃水浴锅中平衡10 min，然后将纤维50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维探头打入顶空小瓶中，在60 ℃条件下萃取50 min，随后取出并将其插入气相色谱仪的进样口中，在250 ℃下解析5 min。
1.2.6.2 GC条件
色谱柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；载气为He（纯度99.999%），流速0.9 mL/min；升温程序：初始50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，最后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。
1.2.6.3 MS条件
质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；激活电压1.5 V；质量扫描范围40~500 m/z。
1.3 数据处理
利用SPSS（version 26.0）通过方差分析（ANOVA）对结果进行统计分析，采用邓肯检验来评估显著性水平，P<0.05。使用SIMCA14.1进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）预测变量重要性投影（VIP）分析；Origin2021绘制折线图、柱状图、饼状图和差异火山图；使用TBtools进行热图的可视化呈现。
2. 结果与分析
2.1 夏秋茶固态发酵工艺单因素实验结果
2.1.1 含水量对夏秋茶发酵品质的影响
由图1可见，随着水添加量的增加，茶多酚的含量不断下降，并在含水量为60%时达到最低，与发酵第0 d相比，下降了37.58%；水浸出物的含量呈现先升高后降低的趋势，并在含水量20%时达到最低，为36.21%，并在含水量为40%时达到最高，为39.11%；总黄酮与茶多酚的含量变化趋势类似，这也与先前的实验结果相符[20]，总黄酮含量总体上随着水添加量的增加而降低，并在含水量为40%时达到最低，为30.11 mg/g，与发酵第0 d相比降低了18.58%；游离氨基酸含量呈现先上升后下降，并于含水量50%时达到最高；含水量为50%时，茶汤明亮、茶香味明显，感官评分最高，为93分。适宜的含水量有助于各种酶活反应的进行，由茶多酚含量与水添加量呈负相关可推测，含水量增加能够促进微生物进一步降解茶多酚[21]。茶多酚、总黄酮属于天然活性物质，其含量过高会影响茶叶口感，过低又会影响茶叶抗氧化活性。计算总评分结果呈现先上升后下降的趋势，并在含水量50%时达到最高，为98.64分。综合考虑，含水量为30%、40%、50%三个水平进行后续发酵夏秋茶优化试验。
2.1.2 发酵时间对夏秋茶发酵品质的影响
由图2可见，随着发酵时间的增长，茶多酚的含量不断下降，在发酵第3~6 d下降的最快，达到9.58%，发酵第6 d开始下降速度变缓，并于第12 d达到最低点16.54%，相比较于发酵第0 d下降了26.40%；水浸出物的含量随着发酵时间呈现先升高后降低的趋势，在第9 d达到最高37.63%，相比较原料提升了17.19%；总黄酮含量总体上随着发酵时间的增加而降低，其中发酵第6 d时含量最低33.11 mg/g，与第0 d相比降低了10.46%；游离氨基酸含量呈现先上升后下降的趋势，并于发酵第9 d时达到最高5.21%；发酵第9 d时汤色红亮，口感醇厚，感官评分最高，感官评分为94.2分。结合已有研究推测发酵0~3 d，微生物主要进行繁殖活动积攒大量菌体，随后发酵3~6 d分泌大量胞外酶促进多酚等物质降解和氨基酸的生成，最终9~12 d反应趋于平缓[22]；当发酵时间过短，发酵产物发酵不完全，化合物的转化不彻底，导致发酵品质不理想；发酵时间过长则会导致发酵产物的消耗和新的不良产物的生成，同样会影响发酵品质[23]。总评分结果呈现先上升后下降的趋势，并在发酵第9 d达到最高，为99.26分。综上所述，经过对比分析，发酵第6、9、12 d三个水平进行后续发酵夏秋茶优化试验。
2.1.3 接种量对夏秋茶发酵品质的影响
由图3可见，随着接种量的增长茶多酚的含量呈下降趋势；水浸出物的含量随着接种量的增加先增高后降低，当接种量为15%时达到最高值，为38.44%；总黄酮含量总体上随着接种量的增加而降低，其在接种量为25%时含量有所回升；氨基酸含量呈现先上升后下降的趋势，并于接种量为15%达到最高，为4.51%；接种量为15%时感官评分最高，为94.15分。有研究表明，接种量决定着发酵效率，合适的接种量能够在确保最佳发酵效果的同时有效缩短发酵周期[24]，但同时也要考虑发酵底物中的营养量是否能满足菌种的生长[25]。结合不同接种量下茶多酚、水浸出物、游离氨基酸、总黄酮以及感官评分可以看出，接种量5%时发酵结束，物质含量变化不明显，且茶汤苦涩味较重；接种量25%时，茶汤颜色浑浊且滋味淡薄。总评分随着接种量增加先上升后下降，并在接种量15%时达到最高，为99.16分。综上所述，选择接种量为10%、15%、20%进行后续发酵夏秋茶优化试验。
2.1.4 发酵温度对夏秋茶发酵品质的影响
由图4可以看出，随着发酵温度的增加，茶多酚的含量呈下降趋势，在发酵温度30~35 ℃时下降的最快，下降幅度为7.6%。当发酵温度为40 ℃时，茶多酚含量最低，为14.44%，比发酵第0 d下降了30.12%；茶叶水浸出率随着发酵温度的增加而升高，并在发酵温度为40 ℃时达到最高，为39.97%；总黄酮含量随着发酵温度的增加而降低，发酵温度20 ℃时达到最高；氨基酸含量呈现先上升后变缓趋势，并于发酵35 ℃时达到最高为4.25%；发酵温度30 ℃时，汤色澄清，茶香浓厚，感官评分最高，为95.65分。发酵温度与微生物的繁殖速度和酶活反应速度密切相关[26]，适宜的温度有利于酶促化学反应以及微生物代谢，提升发酵速率的同时也能抑制有害微生物的生长[27]；发酵温度20 ℃时，菌体生长速度缓慢，多酚和总黄酮降解速度较慢，茶汤青涩味较重；发酵温度40 ℃，发酵变化过分激烈，使毛茶香低味道淡、色暗，严重损害品质。计算总评分的结果随着发酵温度的增加呈现先上升后下降的趋势，并在发酵温度30 ℃达到最高，为97.58分。综上所述，选择25、30、35 ℃进行后续发酵夏秋茶优化试验。
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图 4 发酵温度对发酵茶品质的影响Figure 4. Effects of fermentation temperature on quality of fermented tea2.2 夏秋茶发酵工艺的正交试验优化
夏秋茶发酵工艺正交试验结果如表3所示，其中A、B、C、D分别代表水添加量、冠突散囊菌接种量、发酵时间和发酵温度。从表3中可以看出，第2组A1B2C2D2得分最高，这与极差分析法得出的最佳工艺条件相同。为进一步验证正交试验结果的可靠性，进行了发酵工艺的方差检验，如表4所示，因素的重要程度为A>B>C>D。根据邓肯多重比较分析可知，A、B、C三因素中最佳水平为A1、B2、C2，因素D中三水平结果均不显著。根据前人研究表明冠突散囊菌的最佳发酵温度为30 ℃[28]，因此选择D2水平。综上所述，冠突散囊菌发酵茶的最佳工艺组合为A1B2C2D2，即夏秋茶水添加量、冠突散囊菌接种量、发酵时间、发酵温度依次为30%、15%、9 d，30 ℃。
表 3 冠突散囊菌发酵工艺正交试验结果Table 3. Results of fermentation process orthogonal tests实验号 因素 试验指标 总评分
（分）A含水量 B接种量 C发酵时间 D发酵温度 感官评分
（分）水浸出物
（%）游离氨基酸
（%）黄酮
（mg/g）茶多酚
（%）1 1 1 1 1 88.00 34.12 3.87 35.23 17.12 87.51 2 1 2 2 2 94.95 36.11 3.91 39.41 16.47 93.77 3 1 3 3 3 89.75 36.33 3.56 38.23 16.67 91.86 4 2 1 2 3 91.95 31.34 3.99 42.12 16.76 88.23 5 2 2 1 1 90.35 36.77 3.53 36.21 17.32 85.65 6 2 3 3 2 88.4.0 37.21 4.12 28.32 20.43 88.48 7 3 1 2 2 87.50 28.89 3.79 39.76 19.43 86.05 8 3 2 1 3 88.95 38.12 2.85 34.12 17.65 86.32 9 3 3 3 1 90.70 31.55 3.88 33.26 18.54 87.91 K1 269.00 262.29 263.58 261.92 K2 266.38 270.23 268.94 266.52 K3 259.32 262.19 262.19 266.27 k1 89.66 87.43 87.86 87.30 k2 88.79 90.07 89.64 88.83 k3 86.44 87.39 87.39 88.75 R 3.22 2.67 2.24 1.53 主次因素 A>B>C>D 最优组合 A1B2C2D2 表 4 发酵工艺正交试验方差分析结果Table 4. Results of analysis of variance of orthogonal tests of fermentation processes源 III类平方和 自由度 均方 F 显著性 修正模型 133.526 7 19.075 5.118 ** 截距 210526.758 1 210526.758 56485.073 ** A 50.105 2 25.053 6.722 ** B 54.306 1 54.306 14.570 ** C 27.518 1 27.518 7.383 * D 4.794 2 2.397 0.643 误差 70.815 19 3.727 总计 210731.100 27 修正后总计 204.341 26 注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。 2.3 发酵前后理化特性和挥发性化合物的变化
2.3.1 发酵夏秋茶理化特性
为进一步验证工艺优化效果，根据上述正交试验结果得到的最佳发酵工艺参数进行发酵验证实验，并将发酵后的茶叶与未发酵的夏秋茶的理化指标和感官评分进行对比。对比结果如图5所示，采用最佳发酵条件的夏秋茶发酵前后水浸出物含量显著提升了22.51%（P<0.01），茶多酚含量显著下降了27.71%（P<0.05），游离氨基酸变化不显著，只提升了0.17%，总黄酮含量下降了6.41%。由表5可知，最佳发酵条件下得到的发酵夏秋茶其在汤色、香气和滋味均得到较高评分，相比于未发酵夏秋茶其整体感官评分总分显著提升了10.33分（P<0.01）。
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图 5 夏秋茶发酵前后的理化成分注：图中*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；ns表示无显著差异。Figure 5. Physical and chemical components of raw tea and optimum technology fermented tea表 5 发酵夏秋茶的感官评价Table 5. Sensory evaluation for fermented tea人员 汤色（分） 香气（分） 滋味（分） 总评分（分） 1 94 94 95 94.45 2 92 93 96 94.10 3 91 93 94 92.95 4 94 90 94 92.80 5 92 93 96 94.10 最终得分 93.48 2.3.2 发酵夏秋茶挥发性风味物质
为进一步研究发酵前后夏秋茶风味变化情况，对发酵前后夏秋茶挥发性化合物进行检测。结果如表6所示，在发酵夏秋茶中一共检测到62种挥发性化合物，其中醇类（18种），酯类（13种），酸类（5种），酮类（6种），醛类（6种），碳氢化合物（8种）和其他化合物（6种）。发酵前后风味化合物总含量从5.24 μg/g上升到20.79 μg/g，提升了296.76%。由图6A~图6B可知，发酵前后茶叶的风味组成发生了明显变化，发酵前的风味物质主要由醇类、酸类和酯类组成，发酵后的挥发性化合物主要由酯类和醇类组成；由图6C可知，在整个发酵过程中风味物质的含量变化明显，其中主要为醇类和酯类（醇类风味化合物含量从2.60 μg/g上升到9.64 μg/g，酯类从0.17 μg/g上升到5.55 μg/g）。有研究表明，挥发性化合物中醇类的主要来源有亚油酸、氨基酸代谢、亚麻酸代谢或乳糖代谢等[29]，在夏秋茶发酵过程中芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇、萜烯醇、香叶醇、薄荷醇的含量随着发酵时间的增长而增加，其与茶叶发酵过程中独特风味的形成密切相关。芳樟醇在茶叶的风味形成中起着关键作用，其能为茶叶带来果香、花香和木香[30]；α-松油醇能为茶叶带来青香和花香；薄荷醇在黑茶风味形成过程中起着重要作用，能够为茶叶提供薄荷味；香叶醇能带来玫瑰花香和青甜气味，其在发酵夏秋茶风味物质含量中占比较大，为主要的呈香物质；脂类化合物在发酵后含量显著上升，其主要表现在发酵后水杨酸甲酯和乙酸苯乙酯含量的增加，这两种内酯多在茶叶中被检出。水杨酸甲酯一般由糖苷水解形成，具有强烈的冬青油香气，有研究表明其在茯砖茶风味的形成过程中起到重要作用[31]；乙酸苯乙酯在茶叶加工过程中由乙酸和苯乙醇反应生成，具有玫瑰、蜜样底香的花香香气[32]；苯甲酸甲酯在发酵过程中含量逐渐上升，能为茶叶提供一定的果香[33]。其次为酮类和醛类等，发酵过程中一共检测到6种酮类和6种醛类，酮类主要是由脂肪酸氧化与类胡萝卜素降解生成[34]，其中香叶基丙酮与苯乙酯、己酸己酯等物质，有助于形成茶叶的板栗香品质[35]；α-紫罗兰酮具有紫罗兰的香气，其香气阈值很低，能为茶叶中“清香”风味的呈现起重要作用[36]。醛类和酸类化合物在发酵前后大多表现为下降的趋势[37]，可能作为其他风味化合物合成的前体物质被消耗。碳氢化合物在发酵前后变化并不明显,且对茶叶的香气贡献程度较低[38]；由图6D可知，发酵前后风味化合物含量变化明显，主要表现在酯类、醛类、酸类风味物质，且变化主要分为酯类物质的上调以及醛类和酸类物质的下调。
表 6 发酵夏秋茶挥发性风味物质Table 6. Fermentation tea volatile flavor substances序号 化合物 RT（min） CAS 相对含量（μg/g） 发酵0 d 发酵9 d 醇类 1 3-己烯-1-醇 7.48 4798-44-1 − 0.17±0.11 2 苯甲醇 16.24 100-51-6 0.14±0.02 − 3 甲基苯甲醇 17.56 98-85-1 − 0.04±0.01 4 芳樟醇氧化物Ⅰ 18.03 60047-17-8 0.05±0.02 0.24±0.11 5 芳樟醇氧化物Ⅱ 18.81 34995-77-2 0.36±0.17 0.68±0.21 6 芳樟醇 19.53 78-70-6 0.09±0.03 0.76±0.31 7 脱氢芳樟醇 19.69 20053-88-7 0.10±0.04 0.41±0.22 8 苯乙醇 20.02 200-456-2 0.13±0.01 − 9 薄荷醇 23.08 2216-51-5 − 0.20±0.03 10 萜烯醇 23.17 562-74-3 0.10±0.02 0.09±0.02 11 对异丙基苯甲醇 23.56 536-60-7 0.01±0.01 0.07±0.02 12 α-松油醇 23.89 10482-56-1 0.78±0.02 4.89±0.12 13 橙花醇 25.22 106-25-2 0.12±0.04 0.49±0.24 14 L-香芹醇 25.9 99-48-9 0.24±0.04 − 15 香叶醇 26.6 106-24-1 0.21±0.01 1.10±0.03 16 丁香酚 31.93 97-53-0 0.12±0.02 0.24±0.02 17 叔丁基苯酚 37.11 732-26-3 0.12±0.01 0.17±0.06 18 柏木醇 40.36 77-53-2 0.03±0.01 0.09±0.03 酯类 19 苯甲酸甲酯 19.17 93-58-3 − 0.61±0.03 20 水杨酸甲酯 23.96 119-36-8 − 3.12±0.72 21 甲基苯甲酸甲酯 24.64 99-36-5 0.01±0.01 0.06±0.04 22 乙酸苯乙酯 26.79 103-45-7 − 0.99±0.21 23 壬酸乙酯 28.92 123-29-5 − 0.01±0.00 24 香叶酸甲酯 30.06 1189-09-9 − 0.13±0.03 25 3-4-二甲基苯甲酸甲酯 31.21 38404-42-1 − 0.51±0.02 26 （Z）-己酸-3-己烯酯 34.59 31501-11-8 0.04±0.01 0.01±0.01 27 肉豆蔻酸乙酯 45.44 124-06-1 − 0.03±0.01 28 豆蔻酸异丙酯 46.23 110-27-0 0.02±0.01 0.01±0.01 29 棕榈酸甲酯 48.76 112-39-0 − 0.03±0.01 30 棕榈酸油脂 53.58 373-49-9 0.02±0.01 − 31 领苯二甲酸二丁酯 57.74 84-74-2 0.08±0.02 0.04±0.02 酸类 32 苯甲酸 22.44 65-85-0 0.02±0.01 − 33 癸酸 32.07 334-48-5 − 0.07±0.02 34 季酮酸 44.14 4971-56-6 0.42±0.12 1.19±0.83 35 肉豆蔻酸 44.54 544-63-8 0.01±0.01 − 36 棕榈酸 57.85 57-10-3 0.72±0.23 − 酮类 37 苯乙酮 17.74 98-86-2 − 0.29±0.02 38 异佛尔酮 18.66 78-59-1 − 0.03±0.01 39 ３-甲氧基苯乙酮 29.08 586-37-8 − 0.09±0.03 40 突厥酮 32.46 57378-68-4 0.02±0.01 0.06±0.03 41 香叶基丙酮 35.07 689-67-8 − 0.02±0.01 42 α-紫罗兰酮 36.14 127-41-3 0.01±0.01 − 醛类 43 苯甲醛 12.58 100-52-7 0.14±0.03 0.15±0.08 44 苯乙醛 16.7 122-78-1 0.13±0.04 − 45 壬醛 18.75 124-19-6 0.28±0.07 0.05±0.01 46 藏花醛 24.01 116-26-7 0.17±0.02 − 47 癸醛 24.37 112-31-2 0.07±0.02 0.16±0.05 48 月桂醛 34.15 112-54-9 0.10±0.03 − 碳氢化合物 49 苯乙烯 9.1 100-42-5 0.01±0.01 − 50 月桂烯 13.99 123-35-3 − 0.15±0.04 51 对异丙基苯甲烷 15.72 99-87-6 0.02±0.01 0.04±0.01 52 β-水芹烯 15.99 555-10-2 0.04±0.01 − 53 萜品烯 17.37 586-62-9 0.03±0.01 0.06±0.01 54 十四烷 33.34 629-59-4 0.03±0.01 − 55 十五烷 36.92 629-62-9 0.01±0.01 0.01±0.01 56 植烷 53.18 638-36-8 0.01±0.01 − 其他 57 氯化苄 15.1 100-44-7 − 0.44±0.04 58 对甲苯甲醚 15.51 104-93-8 − 0.01±0.01 59 邻苯二甲醚 21.58 91-16-7 − 0.88±0.10 60 吲哚 28.66 120-72-9 0.05±0.03 0.15±0.11 61 1,2,3-三甲氧基苯 29.48 634-36-6 − 1.23±0.21 62 咖啡因 46.63 58-08-2 0.18±0.08 0.52±0.11 注：数据以¯x±s表示；−表示该挥发性化合物未检测到。 ![]()
图 6 发酵前后不同种类挥发性风味物质组成（A、B）和含量（C），挥发性风味物质聚类热图（D）注：**表示差异极显著（P<0.01）；ns表示无显著差异。Figure 6. Composition (A, B) and content (C) of different types of volatile compounds before and after fermentation, heat map of volatile compound clustering (D)为进一步研究发酵前后化合物变化情况，将发酵前后有显著差异的物质（P<0.05）和经PLS-DA分析VIP>1的风味化合物筛选为组间差异代谢物，差异挥发性化合物和发酵第0 d相比的上下调情况如图7所示。在发酵前后，共有34种差异挥发性化合物，其中有11种化合物下调，23种化合物上调；其中下调幅度较大的化合物依次为壬醛、L-香芹酸、月桂醛、藏花醛和苯甲醇；上调幅度较大的化合物依次为氯化苄、水杨酸甲酯、乙酸苯乙酯、香叶醇、邻苯二甲醚、3-己烯-1-醇、壬酸乙酯、α-松油醇、芳樟醇和薄荷醇。其中芳樟醇、α-松油醇、薄荷醇、香叶醇为关键挥发性差异化合物，因此推测夏秋茶发酵后由于芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇、水杨酸甲酯和乙酸苯乙酯等物质含量的增加使其风味得到改善，其在感官上共同作用为发酵夏秋茶带来了丰富的果香和花香[39]。
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图 7 挥发性化合物差异代谢火山图Figure 7. Volcanic map of differential metabolism of volatile compounds3. 结论
通过对发酵工艺中的水添加量、接种量、发酵时间和发酵温度进行单因素实验和正交试验，确定了最佳发酵工艺：夏秋茶水添加量30%、冠突散囊菌接种量15%、发酵时间9 d，发酵温度30 ℃。在此条件下，加工的夏秋茶相比未发酵夏秋茶的水浸出物含量显著上升了22.51%（P<0.05），茶多酚含量显著下降了27.71%（P<0.05），总黄酮含量下降了6.41%，游离氨基酸含量提升了0.17%，感官评分显著提升了10.33分（P<0.05），风味化合物总量提升了296.76%。由上可知，夏秋茶经过发酵处理，其理化指标和香气成分都得到了显著提升，品质得到极大改善。本研究通过对发酵工艺的探索，能够为实际生产提供理论依据，有助于进一步开发夏秋茶，提升经济效益。
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图 4 发酵温度对发酵茶品质的影响
Figure 4. Effects of fermentation temperature on quality of fermented tea
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图 5 夏秋茶发酵前后的理化成分
注：图中*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；ns表示无显著差异。
Figure 5. Physical and chemical components of raw tea and optimum technology fermented tea
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图 6 发酵前后不同种类挥发性风味物质组成（A、B）和含量（C），挥发性风味物质聚类热图（D）
注：**表示差异极显著（P<0.01）；ns表示无显著差异。
Figure 6. Composition (A, B) and content (C) of different types of volatile compounds before and after fermentation, heat map of volatile compound clustering (D)
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图 7 挥发性化合物差异代谢火山图
Figure 7. Volcanic map of differential metabolism of volatile compounds
表 1 L9（34）正交试验设计
Table 1 Design of L9 (34) orthogonal experimental
水平 因素 A含水量（%） B发酵时间（d） C接种量（%） D发酵温度（℃） 1 30 6 10 25 2 40 9 15 30 3 50 12 20 35 
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表 2 发酵夏秋茶感官评定评分标准
Table 2 Scoring criteria for sensory evaluation of fermented summer and autumn tea
项目 评分标准 评分（分） 评分系数 香气纯正，无杂气味，香高爽 90~99 香气 香气较高尚纯正，无杂气味 80~89 30% 尚纯 70~79 色泽均匀，红浓，明亮 90~99 汤色 色泽均匀，红浓，尚明亮 80~89 25% 色泽不均匀，红浓，尚明亮 70~79 醇厚，回味甘爽 90~99 滋味 较醇厚 80~89 45% 尚厚 70~79
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表 3 冠突散囊菌发酵工艺正交试验结果
Table 3 Results of fermentation process orthogonal tests
实验号 因素 试验指标 总评分
（分）A含水量 B接种量 C发酵时间 D发酵温度 感官评分
（分）水浸出物
（%）游离氨基酸
（%）黄酮
（mg/g）茶多酚
（%）1 1 1 1 1 88.00 34.12 3.87 35.23 17.12 87.51 2 1 2 2 2 94.95 36.11 3.91 39.41 16.47 93.77 3 1 3 3 3 89.75 36.33 3.56 38.23 16.67 91.86 4 2 1 2 3 91.95 31.34 3.99 42.12 16.76 88.23 5 2 2 1 1 90.35 36.77 3.53 36.21 17.32 85.65 6 2 3 3 2 88.4.0 37.21 4.12 28.32 20.43 88.48 7 3 1 2 2 87.50 28.89 3.79 39.76 19.43 86.05 8 3 2 1 3 88.95 38.12 2.85 34.12 17.65 86.32 9 3 3 3 1 90.70 31.55 3.88 33.26 18.54 87.91 K1 269.00 262.29 263.58 261.92 K2 266.38 270.23 268.94 266.52 K3 259.32 262.19 262.19 266.27 k1 89.66 87.43 87.86 87.30 k2 88.79 90.07 89.64 88.83 k3 86.44 87.39 87.39 88.75 R 3.22 2.67 2.24 1.53 主次因素 A>B>C>D 最优组合 A1B2C2D2
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表 4 发酵工艺正交试验方差分析结果
Table 4 Results of analysis of variance of orthogonal tests of fermentation processes
源 III类平方和 自由度 均方 F 显著性 修正模型 133.526 7 19.075 5.118 ** 截距 210526.758 1 210526.758 56485.073 ** A 50.105 2 25.053 6.722 ** B 54.306 1 54.306 14.570 ** C 27.518 1 27.518 7.383 * D 4.794 2 2.397 0.643 误差 70.815 19 3.727 总计 210731.100 27 修正后总计 204.341 26 注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。
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表 5 发酵夏秋茶的感官评价
Table 5 Sensory evaluation for fermented tea
人员 汤色（分） 香气（分） 滋味（分） 总评分（分） 1 94 94 95 94.45 2 92 93 96 94.10 3 91 93 94 92.95 4 94 90 94 92.80 5 92 93 96 94.10 最终得分 93.48
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表 6 发酵夏秋茶挥发性风味物质
Table 6 Fermentation tea volatile flavor substances
序号 化合物 RT（min） CAS 相对含量（μg/g） 发酵0 d 发酵9 d 醇类 1 3-己烯-1-醇 7.48 4798-44-1 − 0.17±0.11 2 苯甲醇 16.24 100-51-6 0.14±0.02 − 3 甲基苯甲醇 17.56 98-85-1 − 0.04±0.01 4 芳樟醇氧化物Ⅰ 18.03 60047-17-8 0.05±0.02 0.24±0.11 5 芳樟醇氧化物Ⅱ 18.81 34995-77-2 0.36±0.17 0.68±0.21 6 芳樟醇 19.53 78-70-6 0.09±0.03 0.76±0.31 7 脱氢芳樟醇 19.69 20053-88-7 0.10±0.04 0.41±0.22 8 苯乙醇 20.02 200-456-2 0.13±0.01 − 9 薄荷醇 23.08 2216-51-5 − 0.20±0.03 10 萜烯醇 23.17 562-74-3 0.10±0.02 0.09±0.02 11 对异丙基苯甲醇 23.56 536-60-7 0.01±0.01 0.07±0.02 12 α-松油醇 23.89 10482-56-1 0.78±0.02 4.89±0.12 13 橙花醇 25.22 106-25-2 0.12±0.04 0.49±0.24 14 L-香芹醇 25.9 99-48-9 0.24±0.04 − 15 香叶醇 26.6 106-24-1 0.21±0.01 1.10±0.03 16 丁香酚 31.93 97-53-0 0.12±0.02 0.24±0.02 17 叔丁基苯酚 37.11 732-26-3 0.12±0.01 0.17±0.06 18 柏木醇 40.36 77-53-2 0.03±0.01 0.09±0.03 酯类 19 苯甲酸甲酯 19.17 93-58-3 − 0.61±0.03 20 水杨酸甲酯 23.96 119-36-8 − 3.12±0.72 21 甲基苯甲酸甲酯 24.64 99-36-5 0.01±0.01 0.06±0.04 22 乙酸苯乙酯 26.79 103-45-7 − 0.99±0.21 23 壬酸乙酯 28.92 123-29-5 − 0.01±0.00 24 香叶酸甲酯 30.06 1189-09-9 − 0.13±0.03 25 3-4-二甲基苯甲酸甲酯 31.21 38404-42-1 − 0.51±0.02 26 （Z）-己酸-3-己烯酯 34.59 31501-11-8 0.04±0.01 0.01±0.01 27 肉豆蔻酸乙酯 45.44 124-06-1 − 0.03±0.01 28 豆蔻酸异丙酯 46.23 110-27-0 0.02±0.01 0.01±0.01 29 棕榈酸甲酯 48.76 112-39-0 − 0.03±0.01 30 棕榈酸油脂 53.58 373-49-9 0.02±0.01 − 31 领苯二甲酸二丁酯 57.74 84-74-2 0.08±0.02 0.04±0.02 酸类 32 苯甲酸 22.44 65-85-0 0.02±0.01 − 33 癸酸 32.07 334-48-5 − 0.07±0.02 34 季酮酸 44.14 4971-56-6 0.42±0.12 1.19±0.83 35 肉豆蔻酸 44.54 544-63-8 0.01±0.01 − 36 棕榈酸 57.85 57-10-3 0.72±0.23 − 酮类 37 苯乙酮 17.74 98-86-2 − 0.29±0.02 38 异佛尔酮 18.66 78-59-1 − 0.03±0.01 39 ３-甲氧基苯乙酮 29.08 586-37-8 − 0.09±0.03 40 突厥酮 32.46 57378-68-4 0.02±0.01 0.06±0.03 41 香叶基丙酮 35.07 689-67-8 − 0.02±0.01 42 α-紫罗兰酮 36.14 127-41-3 0.01±0.01 − 醛类 43 苯甲醛 12.58 100-52-7 0.14±0.03 0.15±0.08 44 苯乙醛 16.7 122-78-1 0.13±0.04 − 45 壬醛 18.75 124-19-6 0.28±0.07 0.05±0.01 46 藏花醛 24.01 116-26-7 0.17±0.02 − 47 癸醛 24.37 112-31-2 0.07±0.02 0.16±0.05 48 月桂醛 34.15 112-54-9 0.10±0.03 − 碳氢化合物 49 苯乙烯 9.1 100-42-5 0.01±0.01 − 50 月桂烯 13.99 123-35-3 − 0.15±0.04 51 对异丙基苯甲烷 15.72 99-87-6 0.02±0.01 0.04±0.01 52 β-水芹烯 15.99 555-10-2 0.04±0.01 − 53 萜品烯 17.37 586-62-9 0.03±0.01 0.06±0.01 54 十四烷 33.34 629-59-4 0.03±0.01 − 55 十五烷 36.92 629-62-9 0.01±0.01 0.01±0.01 56 植烷 53.18 638-36-8 0.01±0.01 − 其他 57 氯化苄 15.1 100-44-7 − 0.44±0.04 58 对甲苯甲醚 15.51 104-93-8 − 0.01±0.01 59 邻苯二甲醚 21.58 91-16-7 − 0.88±0.10 60 吲哚 28.66 120-72-9 0.05±0.03 0.15±0.11 61 1,2,3-三甲氧基苯 29.48 634-36-6 − 1.23±0.21 62 咖啡因 46.63 58-08-2 0.18±0.08 0.52±0.11 注：数据以¯x±s表示；−表示该挥发性化合物未检测到。
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