河套麦胚多肽的制备工艺优化及其体外降血脂活性

李雨欣; 胡芸利; 刘聪; 边瑞琴; 包小兰; 王吉力特

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023090197

河套麦胚多肽的制备工艺优化及其体外降血脂活性

李雨欣^{1, 2,},
胡芸利²,
刘聪²,
边瑞琴^{1, 2},
包小兰¹,
王吉力特^2, ,

1.
内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018
2.
河套学院农学系，内蒙古巴彦淖尔 015000

基金项目: “科技兴蒙”行动重点专项巴彦淖尔国家农业高新技术产业示范区重点项目（NMKJXM202111）；河套学院科学技术研究项目（HYZX202165）；内蒙古自治区自然科学基金资助项目（2021MS03028）；巴彦淖尔市科技计划项目（K202105）；河套特色农畜产品营养与高值化利用研究中心。

详细信息

作者简介:
李雨欣（1999−），女，硕士研究生，研究方向：食品营养与功能因子研究，E-mail：lyuxin0329@163.com

通讯作者:
王吉力特（1985−），男，博士，教授，研究方向：食品营养与功能因子研究，E-mail：wangjilite@126.com。

中图分类号: TS201.4
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出版历程
- 收稿日期: 2023-09-19
- 网络出版日期: 2024-07-04
- 刊出日期: 2024-08-29

Preparation Optimization of Hetao Wheat Germ Polypeptide and Its in Vitro Hypolipidemic Activity

LI Yuxin^{1, 2,},
HU Yunli²,
LIU Cong²,
BIAN Ruiqin^{1, 2},
BAO Xiaolan¹,
WANG Jilite^2, ,

1.
College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
2.
Department of Agriculture, Hetao College, Bayannur 015000, China

摘要

摘要: 本文以河套麦胚蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，以水解度为指标，通过单因素及正交试验优化其工艺条件，并进行体外降血脂作用研究。结果表明，在底物浓度为6.0%，温度为50 ℃、pH为10.5及加酶量为12000 U/g的条件下，麦胚蛋白的水解度达到37.18%±0.25%；麦胚多肽5 mg/mL时胆固醇胶束溶解度抑制率为27.11%±0.36%，胰脂肪酶活性抑制率为33.54%±0.57%，胆固醇酯酶活性抑制率为38.13%±0.29%；超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分占54.30%±0.32%，说明小分子量的胚芽多肽可能具有较好的降血脂作用。上述结果为进一步研究河套胚芽多肽降血脂提供了理论依据。
- 麦胚蛋白 /
- 碱性蛋白酶 /
- 多肽 /
- 降血脂 /
- 超滤分离
Abstract: In this paper, alkali protease was used to enzymatically hydrolyze wheat germ proteins grown in the Hetao region. A univariate analysis and an orthogonal experiment were conducted to optimize the enzymatically hydrolyze process conditions of wheat germ proteins, with the degree of hydrolysis taken as the indicator. Moreover, the in vitro hypolipidemic effect of wheat germ polypeptides was investigated. The results showed that the degree of hydrolysis of wheat germ proteins was 37.18%±0.25% achieved by the following conditions, substrate concentration of 6.0%, temperature at 50 ℃, pH of 10.5 and protease amount of 12000 U/g. When the concentration of wheat germ polypeptides was 5 mg/mL, the rate of inhibiting cholesterol solubilisation into micelles was 27.11%±0.36%, the pancreatic lipase activity inhibition rate was 33.54%±0.57%, and cholesterol esterase activity inhibition rate was 38.13%±0.29%. Moreover, after ultrafiltration, the relative molecule weight of polypeptides less than 1 kDa accounted for 54.30%±0.32% of all polypeptides, indicating that low-molecular-weight wheat germ polypeptides might yield superior hypolipidemic effects. The work provides a theoretical foundation for further exploring the mechanism between Hetao wheat germ polypeptides and hypolipidemic effect.
- wheat germ protein /
- alkaline protease /
- polypeptide /
- hypolipidemic /
- ultrafiltration separation

HTML全文

中国是小麦生产和加工大国，年产量高达一亿多吨，其中麦胚潜藏量达到了280万吨至420万吨，但是并没有受到足够的重视，经常被当作下脚料而丢弃^[1]。麦胚具有很高的营养价值和药用价值，被誉为“人体自然营养的宝库”^[2]。麦胚中蛋白质含量高达30%，仅次于大豆中的蛋白质含量^[3]。当前，我国在麦胚的综合利用方面尚处在一个初步开发阶段，仍有很大的改进空间^[4]。麦胚中谷胱甘肽含量非常丰富，远远超过其他谷物原料，因此，被誉为 “谷物之王”。其膳食纤维丰富，具有降低血脂和餐后血糖的功效，相较其他谷物，麦胚多肽具有很高的抗氧化性^[5]。多肽作为蛋白质的酶解产物之一，因其分子大小和结构差异，具备与蛋白质不同的功能特性。通过研究调查，多肽相较于蛋白质，具有更强的消化、吸收能力，以及较强的免疫、抗菌、降压、降脂等多种生理功能^[6]。随着人们对麦胚的重视，麦胚多肽的开发已逐渐成为我国小麦农副产品精深加工技术和新产品研发的一个重要领域。王琪^[7]研究发现，麦胚蛋白的水解产物具有自由基清除能力并且富含抗氧化活性较强的肽，可应用于天然保健食品中。

天然活性肽具有分子量小、生物活性强、副作用小等优点，其发挥的降血脂作用越来越受到人们的关注。研究表明，蛋白质通过体内胃肠道进行消化，在蛋白酶的作用下分解成小分子多肽，通过抑制胆固醇胶束的溶解和吸收，改变肠肝胆汁酸循环和提高胆固醇分解代谢以及调节脂质生成蛋白和基因表达，从而发挥作用^[8]。Marques等^[9]发现豇豆多肽能够抑制HMGCR酶活并抑制胆固醇胶束溶解实现其降血脂作用。李小凡^[10]研究表明采用碱性蛋白酶酶解制备得到的香菇柄多肽，能显著降低小鼠体重和血清总胆固醇（TC），提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。此外大豆多肽、火麻籽多肽、燕麦多肽等均被证明具有较好的降血脂作用^[11]。而近几年，对麦胚的研究多集中在麦胚蛋白的提取以及功能性质方面，有关其降血脂作用的研究未见报道。

本团队在前期研究中发现，河套小麦胚芽及胚芽蛋白通过调控胆固醇代谢相关基因，可以降低高脂模型大鼠血清TC和非高密度脂蛋白胆固醇（non-HDL-c）水平，同时能较好地抑制胆固醇胶束溶解度，发挥降血脂作用^[12]，但是其作用机制还有很多不明之处。由于碱性蛋白酶具有较强的耐碱、耐热能力以及水解蛋白质的活力^[13]。本研究采用碱性蛋白酶制备麦胚多肽，基于胆固醇胶束溶解度实验、胰脂肪酶抑制实验、胆固醇酯酶抑制实验等对麦胚多肽进行体外降血脂活性评价，通过超滤分离，进一步分析其多肽的分布。该研究结果将为河套麦胚多肽的制备及其调控脂质代谢作用提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

麦胚蛋白　实验室自制；总胆固醇（T-CHO）测试盒　南京建成生物工程研究所；碱性蛋白酶（200 U/mg）、胰脂肪酶（30000 U/g）、胆固醇酯酶（123 U/mg）、牛磺胆酸钠　上海源叶生物科技有限公司；30 kDa超滤管、10 kDa超滤管、3 kDa超滤管、1 kDa超滤管　默克密里博有限公司；4-硝基苯基丁酸酯（NPB）　西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

AUW-120D分析天平　岛津有限公司；ST3100 pH计　奥豪斯仪器有限公司；CF-16RN高速离心机　日立有限公司；MuItiskan FC型酶标仪　赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；FD-1C-50真空冷冻干燥机　北京博医康实验仪器有限公司；DH400恒温孵育器　上海坤诚科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦胚芽蛋白的制备

采用碱溶酸沉法^[14]提取麦胚蛋白，方法略有改动。称取脱脂小麦胚芽粉按料液比（1:20）与蒸馏水混合，用0.1 mol/L的NaOH调pH至10.0，50 ℃浸提90 min，4000 r/min离心20 min收集上清液，调节pH至4.4，静置离心30 min收集沉淀物，蒸馏水洗涤两次，调节pH至7.0，在−80 ℃条件下真空冷冻干燥即为小麦胚芽蛋白粗提取物。

1.2.2 酶解麦胚蛋白制备多肽单因素实验

参照吴淑娟等^[11]的方法稍作改动。取一定量的小麦胚芽蛋白粗提取物按照一定的底物浓度进行配制，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液调节pH至10.0，设定底物质量浓度5.0%，加酶量9000 U/g，温度为45.0 ℃下加碱性蛋白酶酶解，酶解液于95 ℃，灭酶10 min，冷却至室温，调节pH至7.0，离心（4500 r/min，10 min）取上清液，使用pH-stat方法测定水解度（DH），真空冷冻干燥后得到小麦胚芽多肽于避光处保存。在上述酶解基本条件下，通过变换酶解pH（9.0、9.5、10.0、10.5），加酶量（6000、9000、12000、15000 U/g），底物浓度（3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）及酶解温度（40.0、45.0、50.0、55.0 ℃），选取各因素最优水平。每个处理分别酶解180 min。

1.2.3 酶解麦胚蛋白制备多肽正交试验

在单因素实验的基础上，以酶解产物的水解度（DH，%）为评价指标，以酶解温度（A）、pH（B）、加酶量（C）、底物浓度（D）为影响因素，进行 L₉（3⁴）正交试验，每组试验平行3次，试验因素与水平如表1所示。

表 1 正交试验因素水平

Table 1. Orthogonal test factors and levels

水平	因素
水平	A酶解温度（℃）	B pH	C加酶量（U/g）	D底物浓度（%）
1	40	9.5	6000	4.0
2	45	10.0	9000	5.0
3	50	10.5	12000	6.0

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1.2.4 水解度的测定

根据 pH-stat法^[15]，计算公式见式（1）、式（2）。

$\mathrm{DH(\text{%})}=\rm\frac{h}{h_{ \mathrm{tot}}} {\times 100}$

(1)

式中：h为单位质量蛋白质被水解的肽键的量，mmol/g；h_tot为单位质量蛋白质肽键的总量，mmol/g；h_tot为8.3，mmol/g。

$\rm h=B\times N_b\times \frac{1}{\alpha}\times \frac{1}{M_p}$

(2)

式中：B为水解过程中耗碱量，mL；N_b为碱浓度，mol/L；M_p为水解液中蛋白质质量，g；1/α为校正系数。

1.2.5 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定

根据参考文献[16]的方法，稍作修改进行测定。离心管中添加20 μL 0.01 mol/L胆固醇溶液、10 μL 0.6 mol/L磷脂酰胆碱、10 μL 0.1 mol/L油酸、10 μL 0.05 mol/L单油酸甘油酯充分搅拌后，使用N₂挥发有机溶剂并添加1 mL含有6.6 mmol/L牛磺胆酸钠的15 mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.4），搅拌溶解2 min，超声波处理3 min，放置37 ℃恒温水浴锅中振荡培养24 h，使其形成胆固醇胶束溶液。分别取质量浓度为1~5 mg/mL的麦胚多肽溶液与1 mL胆固醇胶束溶液混合，于37 ℃、140 r/min振荡2 h，过0.22 μm水溶性滤膜，取上清液，采用总胆固醇测定试剂盒，在510 nm处测定吸光度值。计算公式为：

$\mathrm{胆固醇胶}\mathrm{束}\mathrm{溶}\mathrm{解}\mathrm{度}\mathrm{抑}\mathrm{制}\mathrm{率}( \text{%})=\frac{{\mathrm{A}}_{1}-{\mathrm{A}}_{2}}{{\mathrm{A}}_{1}}\times 100$

(3)

式中：A₁为原胶束胆固醇含量；A₂为样品实验管胆固醇含量。

1.2.6 胆固醇酯酶活性抑制率的测定

按照参考文献[17]的方法，稍作修改进行测定。配制0.1 mol/L NaCl溶液、0.2 mmol/L 4-硝基苯基丁酸酯（NPB）溶液（溶于乙腈）、5.16 mmol/L牛磺胆酸钠溶液、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.04）、质量浓度为1~5 mg/mL的麦胚多肽溶液（溶于乙腈）、0.72 U/mL胆固醇酯酶溶液。反应体系如表2所示。

表 2 胆固醇酯酶活性测定反应体系

Table 2. Reaction system for determination of cholesterol esterase activity

序号	项目	NaCl （mL）	NPB （mL）	磷酸缓冲液（含牛磺胆酸钠）（mL）	样品（mL）	蒸馏水（mL）	胆固醇酯酶（mL）
A	原酶液管	2.5	0.5	0.5	0	0.4	0.5
B	空白管	2.5	0.5	0.5	0	0.9	0
C	样品实验管	2.5	0.5	0.5	0.4	0	0.5
D	样品对照管	2.5	0.5	0.5	0.4	0.5	0

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加入胆固醇酯酶启动反应，25 ℃反应5 min，在405 nm处测定吸光度值，计算公式为：

${胆固醇酯酶活性抑制率}({\text{%}})=\frac{{{\mathrm{A}}}-{{\mathrm{B}}}-({{\mathrm{C}}}-{{\mathrm{D}}})}{{{\mathrm{A}}}-{{\mathrm{B}}}}\times 100$

(4)

式中：A为原酶液管吸光度值；B为空白管吸光度值；C为样品实验管吸光度值；D为样品对照管吸光度值。

1.2.7 胰脂肪酶活性抑制率的测定

根据参考文献[18]的方法，稍作修改进行测定。试剂配制：准确称取10 mg胰脂肪酶（PL），溶于10 mL Tris-HCl缓冲液，振摇，充分溶解，即得1.0 mg/mL PL溶液。准确移取8.44 μL NPB液体，加4 mL乙腈，即得浓度为12 mmol NPB溶液，作为底物。配制质量浓度为1~5 mg/mL的麦胚多肽溶液，溶于Tris-HCl缓冲液。在96孔板中加入1150 μL Tris缓冲液、200 μL PL工作液、400 μL不同质量浓度的多肽溶液，加入25 μL NPB溶液，于37 ℃、300 r/min在恒温孵育器中孵育25 min。在405 nm处测定吸光度值。计算公式为：

$\mathrm{胰}\mathrm{脂}\mathrm{肪}\mathrm{酶活性}\mathrm{抑}\mathrm{制}\mathrm{率}( \text{%})=\left(1-\frac{{\mathrm{A}}_{\mathrm{I}}-{\mathrm{A}}_{\mathrm{I}\mathrm{B}}}{{\mathrm{A}}_{\mathrm{E}}}\right)\times 100$

(5)

式中：A_I为加入样品吸光度值；A_IB为加入样品未加酶液的吸光度值；A_E为不加样品吸光度值。

1.2.8 超滤分离与多肽含量的测定

配制0.5 mg/mL的麦胚多肽溶液，在3000×g、4 ℃，离心15 min，分别用30、10、3、1 kDa的超滤膜过滤分离，收集得到分子质量>30 kDa、30~10 kDa、10~3 kDa、3~1 kDa、<1 kDa的五个不同多肽组分。

多肽含量的测定：根据参考文献[19]方法，稍作修改进行测定。准确称取100 mg邻苯二甲醛（OPA）溶于2.5 mL的甲醇中，最终浓度为40 mg/mL的OPA试剂。用50 mL 100 mmol/L四硼酸钠，20 mL 5%（v/v）十二烷基硫酸钠，27.8 mL蒸馏水，0.2 mL β-巯基乙醇，2 mL OPA溶液，制备出100 mL的新鲜混合物。将75 μL样品与3 mL混合物在室温下孵育8 min，在340 nm处测量吸光度。以L-苯丙氨酸（0~1.2 mg/mL）作为标准品，根据得到的标准曲线计算多肽含量。

1.3 数据处理

每组实验均为3组平行，所有实验数据均以均数±标准差（Mean±SD）表示。采用Excel 2016软件进行数据统计，采用SPSS 22.0软件进行显著性分析及方差分析（ANOVA），以P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2. 结果与分析

2.1 酶解麦胚蛋白单因素实验及结果分析

用碱性蛋白酶酶解麦胚蛋白，选用不同的酶解pH、加酶量、底物浓度、酶解温度进行实验，测得各种条件下的水解度见图1。

图 1 不同酶解条件对麦胚蛋白水解度的影响

注：不同的小写字母表示差异显著（P<0.05）；图2~图5同。

Figure 1. Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on the degree of hydrolysis of wheat germ proteins

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由图1A看出，随着pH的增加，麦胚蛋白的水解度呈先增后降趋势，在pH为10.0时，水解度为29.97%±0.46%，达到最大值，与其他组之间均有显著差异（P<0.05）。过高或过低的pH都会对酶的活力产生不利影响，不能使酶与底物充分结合，从而导致水解度较低^[20]。所以本实验确定pH为10.0。

由图1B可知，随着加酶量的增加，水解度先增大后逐渐降低。这是因为在底物足够的情况下，随着酶用量的增加，其与底物的结合力会得到加强，酶和底物之间的接触也会变大，因此，酶的水解度也会随之提高。随着加酶量的继续增加，底物已经被酶饱和，酶与底物之间产生竞争性抑制，能够进行有效催化作用的酶分子数量减少，从而会导致水解能力下降，水解度呈降低趋势^[21]。本实验中碱性蛋白酶的添加量为12000 U/g时麦胚蛋白的水解度最高，但是和添加量9000 U/g无显著差异（P>0.05），从能耗、成本等方面考虑，选用加酶量9000 U/g。

由图1C可知，随着底物浓度的增加，水解度逐渐下降，在大于5.0%时下降程度尤为明显（P<0.05）。当底物浓度较低时，酶与底物结合较为充分，因此水解度较高，随着底物浓度的增加，底物分散困难，较多的底物相互包埋，部分底物无法被酶催化水解，当底物浓度超过5.0%后，过高的底物浓度导致水解黏度增大，蛋白酶不能与底物充分接触，抑制水解反应^[22]，导致反应不完全，因此，在实验过程中，综合工业成本考虑，提高麦胚蛋白的浓度，可以降低能耗，提高设备的利用率，所以本实验以5.0%为最佳底物浓度。

从图1D可以看出，随着温度的升高，其水解度呈现出先增后减的趋势，在温度为45 ℃时，麦胚蛋白的水解度达到了最高值，为30.09%±0.36%，与其他组之间均有显著差异（P<0.05）。随着酶解温度的升高，会对酶的活性产生一定的影响，从而使得麦胚蛋白的水解度降低^[23]。所以选择最适温度为45 ℃。

2.2 酶解麦胚蛋白正交试验及结果分析

在上述单因素实验的基础上，选用L₉（3⁴）正交试验，由表3可知，采取极差分析方法，对各因素的R值进行了分析。各因素对水解度的影响主次顺序为：A>B>C>D，即酶解温度>pH>加酶量>底物浓度。以水解度为试验指标，根据K值的理论分析，最优组合为A₃B₃C₃D₃，即加酶量为12000 U/g，酶解温度50 ℃，pH为10.5，底物浓度6.0%，由上述正交试验得到的最适提取条件进行验证试验，麦胚蛋白水解度达37.18%±0.25%。由表4的方差分析结果可知，酶解温度、pH和加酶量对水解度的影响达到极显著水平（P<0.01），与极差分析结果一致。

表 3 麦胚蛋白酶解条件正交试验

Table 3. Orthogonal experimental of enzymatic hydrolysis conditions of wheat germ proteins

试验号	A酶解温度	B pH	C加酶量	D底物浓度	水解度（%）
1	1	1	1	1	20.41±0.03
2	1	2	2	2	20.72±0.02
3	1	3	3	3	27.68±0.12
4	2	1	2	3	20.28±0.04
5	2	2	3	1	23.12±0.21
6	2	3	1	2	23.30±0.07
7	3	1	3	2	28.53±0.15
8	3	2	1	3	29.33±0.09
9	3	3	2	1	32.85±0.18
k₁	22.94	23.07	24.35	25.46
k₂	22.23	24.39	24.62	24.18
k₃	30.24	27.94	26.44	25.76
R	8.01	4.87	2.09	1.58
因素主次顺序	A>B>C>D
最优组合	A₃B₃C₃D₃

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表 4 正交试验方差分析

Table 4. Variance analysis of orthogonal tests

变异来源	偏差平方和	自由度	均方	F值	P值
截距	17058.999	1	17058.999	12373.083	<0.0001^**
A	353.456	2	176.728	128.183	<0.0001^**
B	114.234	2	57.117	41.427	<0.0001^**
C	23.438	2	11.719	8.500	0.003^**
D	12.630	2	6.315	4.580	0.025
误差	24.817	18	1.379
总变异	17587.573	27
注：**表示差异极显著（P<0.01）。

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2.3 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定

人体内胆固醇等脂类组分是通过小肠肠液中的“膳食混合胶粒”来转运吸收的，如果破坏已形成的胶束颗粒，就会降低人体对胆固醇等脂类的吸收^[24]。如图2所示，各组胆固醇胶束溶解度抑制率之间均有显著性差异（P<0.05），麦胚多肽浓度在1~4 mg/mL时，抑制率分别为10.34%±0.59%、14.63%±0.81%、17.54%±0.94%、20.59%±0.52%，抑制率随着质量浓度的增加逐渐提高，肽浓度在5 mg/mL时，抑制率达到了27.11%±0.36%。麦胚多肽浓度越大，抑制越明显，因为在一定质量浓度范围内，相同大小的空间内多肽分子越多，与胆固醇胶束的接触机率就越大，使得更多的胆固醇胶束被破坏，抑制效果就越好。该结果可能是由于多肽分子的两亲性增强了它们与游离胆固醇胶束溶液相互作用的能力，从而降低膳食胆固醇的乳化性和溶解性^[25]。总体来说，本实验结果证实了麦胚多肽能抑制胆固醇胶束的溶解度，抑制胆固醇吸收。

图 2 不同质量浓度的麦胚多肽对胆固醇胶束溶解度抑制率的影响

Figure 2. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of cholesterol micellar solubility

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2.4 胆固醇酯酶活性抑制率的测定

食品中的胆固醇酯由于不能被肠上皮细胞直接吸收，因此需要通过肠腔内胆固醇酯酶水解胆固醇酯为游离酯肪酸和胆固醇，然后与其他物质结合形成胆固醇胶束进入小肠细胞^[26]，该酶能够水解长链脂肪酸，在水解过程中发挥着重要作用^[27]，所以抑制胆固醇酯酶活性能够预防胆固醇过多的被人体吸收，从而降低血液中胆固醇含量，起到降脂作用。如图3所示，各组胆固醇酯酶活性抑制率之间均有显著性差异（P<0.05），麦胚多肽浓度在1~4 mg/mL时，随着质量浓度的升高，抑制率也随之升高，浓度达到4 mg/mL时，抑制率为33.40%±0.59%，肽浓度增加至5 mg/mL时，抑制率为38.13%±0.29%，抑制率曲线随着抑制剂质量浓度的增大而趋于平缓状态，说明麦胚多肽对胆固醇酯酶最终总体表现为抑制作用。

图 3 不同质量浓度的麦胚多肽对胆固醇酯酶活性抑制率的影响

Figure 3. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of cholesterol esterase activity

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2.5 胰脂肪酶活性抑制率的测定

胰脂肪酶是水解膳食脂肪重要的酶，将甘油三酯最终水解为甘油单酯和脂肪酸，之后在肠道中被吸收，再在体内重新合成脂肪，这也是造成肥胖等多种疾病的一个重要原因，抑制胰脂肪酶的活性可以有效降低小肠对脂肪的吸收效率，从而达到降脂的目的。由图4所示，各组胰脂肪酶活性抑制率之间均有显著性差异（P<0.05），麦胚多肽浓度在1~4 mg/mL时，抑制率分别为9.77%±0.61%、14.37%±0.73%、17.67%±0.85%、21.52%±0.46%，抑制曲线涨幅不大，多肽浓度在5 mg/mL时，抑制率为33.54%±0.57%，与1 mg/mL浓度相比较抑制率提高了23.77%。随着浓度的增加，抑制率也明显升高，多肽在胰脂肪酶长时间消化水解之后，仍然具有对胰脂肪酶的抑制活性，且抑制率在一定范围内随着麦胚多肽浓度的增加而增大。麦胚多肽对胰脂肪酶活性有较好的抑制能力，可能通过抑制胰脂肪酶活性抑制胆固醇的消化吸收，从而降低胆固醇水平^[28]。

图 4 不同质量浓度的麦胚多肽对胰脂肪酶活性抑制率的影响

Figure 4. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of pancreatic lipase activity

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2.6 麦胚多肽超滤组分分离及多肽含量

超滤膜在外界压力作用下截留多肽溶液胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒会透过膜。如图5所示，在麦胚五种多肽组分中，>30 kDa、30~10 kDa、10~3 kDa、3~1 kDa、<1 kDa所占比例分别为4.45%±0.23%、2.49%±0.49%、2.41%±0.19%、36.36%±0.46%、54.3%±0.32%，特别是<1 kDa的组分显著高于其他组分（P<0.05）。该结果说明麦胚多肽的体外降血脂活性主要集中在相对分子质量<1 kDa的部分，可能具有较强的降血脂活性，与Isabel等^[19]研究结果一致。唐子箫等^[29]研究中通过氨基酸分析和营养评价，发现利用超滤浓缩麦胚蛋白，可以较大程度保持麦胚蛋白优异的氨基酸组成模式。国内外研究表明，多肽的降胆固醇活性与其含有的疏水区有一定的相关性，而且多肽组分中赖氨酸和精氨酸的比值低于超滤前^[30]。未来研究中应分析<1 kDa麦胚多肽的氨基酸组成、疏水性氨基酸等并进一步采用高脂模型动物实验验证其降血脂作用。

图 5 麦胚多肽超滤分离各组分的得率

Figure 5. Yield of each component in wheat germ polypeptide ultrafiltration separation

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3. 结论

本研究利用碱性蛋白酶酶解河套小麦胚芽蛋白获得多肽，采用单因素和正交试验优化了麦胚多肽的制备工艺，最佳制备工艺为：加酶量为12000 U/g，酶解温度为50 ℃，pH为10.5，底物浓度为6.0%。麦胚多肽水解度为37.18%±0.25%，在此条件下制备的麦胚多肽在实验浓度范围内胆固醇胶束溶解度抑制率最高为27.11%±0.36%，胆固醇酯酶活性抑制率最高为38.13%±0.29%，胰脂肪酶活性抑制率最高为33.54%±0.57%，麦胚多肽相对分子质量<1 kDa所占百分比最高，为54.30%±0.32%，可能具有较强的降血脂活性。综上所述，河套小麦胚芽碱性蛋白酶水解产生的小分子多肽能够抑制胆固醇酯酶活性和胰脂肪酶活性的同时，还能抑制胆固醇胶束溶解度，实现降低胆固醇作用。以上结果为下一步研究河套麦胚多肽降血脂作用提供了依据，为后续小麦副产物的有效利用与高附加值产业化提供了理论依据。

图 1 不同酶解条件对麦胚蛋白水解度的影响

注：不同的小写字母表示差异显著（P<0.05）；图2~图5同。

Figure 1. Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on the degree of hydrolysis of wheat germ proteins

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图 2 不同质量浓度的麦胚多肽对胆固醇胶束溶解度抑制率的影响

Figure 2. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of cholesterol micellar solubility

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图 3 不同质量浓度的麦胚多肽对胆固醇酯酶活性抑制率的影响

Figure 3. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of cholesterol esterase activity

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图 4 不同质量浓度的麦胚多肽对胰脂肪酶活性抑制率的影响

Figure 4. Effect of different mass concentrations of wheat germ polypeptides on the inhibition rate of pancreatic lipase activity

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图 5 麦胚多肽超滤分离各组分的得率

Figure 5. Yield of each component in wheat germ polypeptide ultrafiltration separation

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表 1 正交试验因素水平

Table 1 Orthogonal test factors and levels

水平	因素
水平	A酶解温度（℃）	B pH	C加酶量（U/g）	D底物浓度（%）
1	40	9.5	6000	4.0
2	45	10.0	9000	5.0
3	50	10.5	12000	6.0

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表 2 胆固醇酯酶活性测定反应体系

Table 2 Reaction system for determination of cholesterol esterase activity

序号	项目	NaCl （mL）	NPB （mL）	磷酸缓冲液（含牛磺胆酸钠）（mL）	样品（mL）	蒸馏水（mL）	胆固醇酯酶（mL）
A	原酶液管	2.5	0.5	0.5	0	0.4	0.5
B	空白管	2.5	0.5	0.5	0	0.9	0
C	样品实验管	2.5	0.5	0.5	0.4	0	0.5
D	样品对照管	2.5	0.5	0.5	0.4	0.5	0

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表 3 麦胚蛋白酶解条件正交试验

Table 3 Orthogonal experimental of enzymatic hydrolysis conditions of wheat germ proteins

试验号	A酶解温度	B pH	C加酶量	D底物浓度	水解度（%）
1	1	1	1	1	20.41±0.03
2	1	2	2	2	20.72±0.02
3	1	3	3	3	27.68±0.12
4	2	1	2	3	20.28±0.04
5	2	2	3	1	23.12±0.21
6	2	3	1	2	23.30±0.07
7	3	1	3	2	28.53±0.15
8	3	2	1	3	29.33±0.09
9	3	3	2	1	32.85±0.18
k₁	22.94	23.07	24.35	25.46
k₂	22.23	24.39	24.62	24.18
k₃	30.24	27.94	26.44	25.76
R	8.01	4.87	2.09	1.58
因素主次顺序	A>B>C>D
最优组合	A₃B₃C₃D₃

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表 4 正交试验方差分析

Table 4 Variance analysis of orthogonal tests

变异来源	偏差平方和	自由度	均方	F值	P值
截距	17058.999	1	17058.999	12373.083	<0.0001^**
A	353.456	2	176.728	128.183	<0.0001^**
B	114.234	2	57.117	41.427	<0.0001^**
C	23.438	2	11.719	8.500	0.003^**
D	12.630	2	6.315	4.580	0.025
误差	24.817	18	1.379
总变异	17587.573	27
注：**表示差异极显著（P<0.01）。

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施引文献(7)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 小麦胚芽蛋白的制备
1.2.2 酶解麦胚蛋白制备多肽单因素实验
1.2.3 酶解麦胚蛋白制备多肽正交试验
1.2.4 水解度的测定
1.2.5 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
1.2.6 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
1.2.7 胰脂肪酶活性抑制率的测定
1.2.8 超滤分离与多肽含量的测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 酶解麦胚蛋白单因素实验及结果分析
2.2 酶解麦胚蛋白正交试验及结果分析
2.3 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
2.4 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
2.5 胰脂肪酶活性抑制率的测定
2.6 麦胚多肽超滤组分分离及多肽含量
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 小麦胚芽蛋白的制备
1.2.2 酶解麦胚蛋白制备多肽单因素实验
1.2.3 酶解麦胚蛋白制备多肽正交试验
1.2.4 水解度的测定
1.2.5 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
1.2.6 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
1.2.7 胰脂肪酶活性抑制率的测定
1.2.8 超滤分离与多肽含量的测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 酶解麦胚蛋白单因素实验及结果分析
2.2 酶解麦胚蛋白正交试验及结果分析
2.3 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
2.4 胆固醇酯酶活性抑制率的测定
2.5 胰脂肪酶活性抑制率的测定
2.6 麦胚多肽超滤组分分离及多肽含量
3. 结论

参考文献(30)

施引文献

资源附件(1)

河套麦胚多肽的制备工艺优化及其体外降血脂活性

作者简介: 李雨欣（1999−），女，硕士研究生，研究方向：食品营养与功能因子研究，E-mail：lyuxin0329@163.com

通讯作者: 王吉力特（1985−），男，博士，教授，研究方向：食品营养与功能因子研究，E-mail：wangjilite@126.com。

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