Molecular Aggregation Behavior and Biological Properties of Regenerated Silk Fibroin in Na+ Solution
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摘要: 目的：丝素蛋白在特定条件下的聚集行为能够影响其动力学行为及黏弹性能，进而影响丝素蛋白材料的生物学性能，因此，本文通过系统研究丝素蛋白的自组装聚集行为，进而研究增强其力学性能及生物学性能的条件。方法：以家蚕蚕茧为原料，提取制备得到再生丝素蛋白，通过浊度实验寻找最佳组装条件；丝素蛋白溶液加入Na+后，通过流变学实验研究其对动力学行为和黏弹性能的影响；通过细胞增殖实验研究丝素蛋白的生物学性能。结果：提取的再生丝素蛋白以无规卷曲结构为主；最佳体外自组装条件：浓度为4 mg/mL的溶液在70 ℃组装6 h；丝素蛋白溶液中加入Ca2+对体外自组装起抑制作用，而加入Na+可以加快自组装速率和提高组装程度，并且随着Na+浓度的增加，丝素蛋白凝胶强度逐渐增强，凝胶网络更稳定；细胞增殖实验显示，再生丝素蛋白溶液比其自组装纤维更利于细胞生长和增殖。结论：丝素蛋白的浓度、温度、组装时间和离子都会对丝素蛋白的体外自组装聚集行为产生影响，本文初步研究丝素蛋白的自组装聚集条件和生物学性能，为提高丝素蛋白作为食品包装材料的性能提供实验依据。Abstract: Objective: The aggregation behavior of silk fibroin under specific conditions can influence its kinetic behavior and viscoelastic properties, thereby affecting biological properties of silk fibroin materials. Therefore, this study systematically investigated the self-assembly aggregation behavior of silk fibroin and explored the conditions for enhancing its mechanical performance and biological properties. Methods: Regenerated silk fibroin was extracted and prepared from domestic silkworm cocoons, and the optimal assembly conditions were determined through turbidity experiments. Rheological experiments were conducted to study the influence of Na+ on the kinetic behavior and viscoelastic properties of silk fibroin solutions. Cell proliferation experiments were carried out to investigate the biological properties of silk fibroin. Results: The extracted regenerated silk fibroin primarily exhibited a random coiled structure. The optimal in vitro self-assembly conditions involved assembly of a 4 mg/mL solution at 70 ℃ for 6 hours. The addition of Ca2+ to the silk fibroin solution inhibited in vitro self-assembly, while the addition of Na+ accelerated the assembly rate and increased the degree of assembly. Furthermore, with increasing Na+ concentration, the gel strength of silk fibroin gradually increased, leading to a more stable gel network. Cell proliferation experiments demonstrated that the solution of regenerated silk fibroin was more conducive to cell growth and proliferation than its self-assembled fibers. Conclusion: The concentration, temperature, assembly time, and ions all have an impact on the in vitro self-assembly aggregation behavior of silk fibroin. This study provides preliminary research on the self-assembly aggregation conditions and biological properties of silk fibroin, offering experimental basis for improving the performance of silk fibroin as a food packaging material.
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Keywords:
- regenerated silk fibroin /
- self assembly /
- rheology /
- viscoelasticity /
- assembly level
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丝素蛋白（SF）是一种天然蛋白质[1]，来源于家蚕蚕茧。丝素蛋白具有优异的机械强度、低免疫原性、无毒性、性能可调性和高压可灭菌性等特性[2]，已被广泛研究用于食品材料[3]及生物医学材料[4−5]等方面。SF还具有良好的可加工性[6−7]，加工方法如剪切、超声处理、渗透、自组装等。其中，自组装法最简单易操作，在近十几年，蛋白质的自组装在食品工程及包装材料领域受到越来越多的关注[8−9]。
迄今为止，人们对蛋白质的自组装也进行了大量的研究。纳米或微米级蛋白质自组装伴随着构象转变[10−12]，使其具有生物相容性，生物降解性，优异的机械强度等，应用于生物医学成像、药物传递和组织工程等领域[13−14]。然而，由于蛋白质的复杂性，蛋白质的自组装行为也较复杂[15−16]。一些外部因素包括pH[17]、温度[18]、酶动力学修饰[19]、金属离子如 Al3+、Fe3+、Cu2+和 Zn2+等也可能影响蛋白质的构象转变[20−22]，进一步影响丝素蛋白的自组装。丝素蛋白通过体外自组装成纳米纤维，进而重建天然丝的非凡特性已有很多报道[13,21]，尤其作为食品的活性包装材料和可食性膜材料，丝素蛋白的自组装可以使其达到一定强度和柔韧性，既满足食品包装的要求，也不会造成环境污染[23]。
然而，丝素蛋白通过简单水环境自组装实现性能升级仍是一个挑战[24−25]，而在其中加入对人体无害的Na+和Ca2+给自组装研究提供了新的方法，为此，本课题进行了一系列的实验，以进一步研究外界条件对丝素蛋白质组装的影响，尤其是金属离子种类和浓度的影响。这项工作可以为了解蛋白质聚集行为和性能关系提供一些线索。同时，可以通过丝素蛋白自组装以可控的方式开发出一些新的性能，为食品相关材料的研究提供理论支持。本研究首先确定丝素蛋白的最佳组装条件，进而研究加入Na+对丝素蛋白的自组装行为、黏弹性能和生物学性能的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
家蚕蚕茧 苏州浒关蚕种场；溴化锂 上海展云化工有限公司；无水碳酸钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钙 化学试剂均为国药分析纯；牛跟腱胶原蛋白（纯度≥94%） 河北考利森；丝素蛋白 湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司；小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3 北纳生物；胰蛋白酶 武汉明智生物科技有限公司；M1915透析袋 上海捷瑞生物工程有限公司。
UPH-II-5T超纯水机 成都超纯科技有限公司；UV-2000紫外分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；TGL-22MC台式高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；LGJ-10D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；S-3000N扫描电镜 日本Hitachi；GPH隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；DHR-1旋转流变仪 美国TA公司；NEXUS傅里叶红外光谱分析仪 美国Thermo Nicolet公司；DR-200Bs酶标检测仪 山东博科科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 再生丝素蛋白的制备
以家蚕蚕茧为原料制备再生丝素蛋白。制备丝素蛋白的步骤主要有：脱胶、溶丝、透析和冻干。参照文献[26]方法，称取5 g蚕茧，加入1000 mL 0.5% Na2CO3溶液中，在96 ℃煮30 min，重复煮三次得到脱胶蚕丝，然后用9.3 mol/L的LiBr溶液溶解蚕丝得到再生丝素蛋白溶液，纯水中透析（透析袋截留分子量14 kD）3 d后冻干，冻干样品放入−4 ℃冰箱保存备用。获得的再生丝素蛋白简写为RSF。
1.2.2 红外光谱
采用傅里叶红外光谱分析仪测定丝素蛋白的特征吸收峰[27]。取适量KBr粉末，再加入干燥后的样品（RSF）研磨均匀后压片（KBr与样品的质量比为100:1）。以空白溴化钾片做对照，测试范围为2000~600 cm−1，分辨率为8 cm−1，扫描次数为16次。
1.2.3 浊度测定
丝素蛋白在一定条件下可以自组装为纤维，自组装受温度、浓度、离子等条件的影响。蛋白质自组装可以通过浊度实验进行条件优化[28]。测试条件：温度（60、70、80 ℃），丝素浓度（3、4、5 mg/mL），不同离子类型（NaCl、CaCl2）、不同离子浓度（0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl）。
测定方法：时间设定为6 h，上述丝素蛋白溶液，在70 ℃下采用紫外分光光度计，在波长为290 nm测定丝素蛋白溶液的吸光值随时间的变化，并绘制浊度曲线（A-t曲线）。
1.2.4 流变学实验
通过旋转流变仪研究不同Na+浓度（0、0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl）条件下丝素蛋白的组装动力学和黏弹性能。选择平行板夹具，夹具直径为40.0 mm，测试间隙为0.6 mm。将约1.0 mL的丝素蛋白溶液（4 mg/mL）加载到经40 ℃预平衡的底板上。
1.2.4.1 70 ℃线性黏弹区测试（LVR）
将丝素蛋白样品在帕尔贴上组装7 h，再测试丝素蛋白样品的线性黏弹区，设置参数为：70 ℃，组装时间7 h，应变范围为0.1%~15%。
1.2.4.2 70 ℃振荡时间扫描（OTS）
研究丝素蛋白的自组装体系黏弹性随时间的变化，设置参数为：70 ℃，振荡时间6 h，应变1.0%（线性黏弹区内），振荡频率为1 Hz。
1.2.4.3 70 ℃振荡频率扫描（OFS）
研究丝素蛋白体系黏弹性随频率的变化，用以确定体系更类固体还是更像液体，设置参数为：70 ℃，振荡频率为0.1~15 Hz，应变1.0%（线性黏弹区内）。
1.2.5 扫描电镜
利用扫描电子显微镜（SEM）对丝素蛋白进行形貌表征。将再生丝素蛋白溶于超纯水和0.1 mol/L NaCl溶液中，配制成25 mg/mL的丝素蛋白溶液，在数显鼓风恒温干燥箱（70 ℃，8 h）中组装，然后用液氮速冻30 min后放入冷冻干燥机中干燥3 d，随后使用电子显微镜在每个样品中至少随机取5个不同部位SEM图片，在加速电压15 kV下进行观测和拍照。
1.2.6 细胞增殖实验
参照文献方法[28]，通过小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3研究丝素蛋白组装前后对细胞生长的影响。在天然高分子材料中，牛跟腱胶原蛋白具有良好的黏附、增殖等优异的生物性能，因此，本文采用牛跟腱胶原蛋白（简写为Col）组装前后作为对照。
将再生丝素蛋白配制成8 mg/mL的丝素蛋白溶液，分别取50 μL丝素蛋白溶液于96孔酶标板，并在数显鼓风恒温干燥箱（70 ℃，8 h）组装备用。用相同方法制备一组不组装的丝素蛋白样品放置冰箱冷藏（4 ℃）备用； 将牛跟腱胶原蛋白配制成8 mg/mL的胶状溶液，分别取50 μL胶原溶液于96孔酶标板，并利用隔水式恒温培养箱（36 ℃，12 h）组装备用。用相同方法制备一组不组装的胶原蛋白样品放置冰箱冷藏（4 ℃）备用。
将上述制好的样品用液氮快速冷冻30 min后放入冷冻干燥机中干燥3 d，放入冰箱冷冻室（−18 ℃）保存备用。
测定方法：用胰蛋白酶将对数生长期细胞进行消化，配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，按3000~5000细胞个数每孔接种于96孔板中，将上述96孔板置于CO2（5%）培养箱中（37 ℃下）培养24 h以贴壁。继续培养24 h后分别加入200 μL的培养基与样品（按体积比1:1）培养。每个浓度的样本设九个重复。分别选取培养1、3和5 d后的样品，向所有孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL用PBS缓冲液pH7.4配制），培养箱中孵育1~4 h。使用酶标仪测定在490 nm处的光吸收值，吸光值越大代表促细胞增殖能力越强。
1.3 数据处理
采用Origin8.5（OriginLab Crop.，Northampton，MA，USA）自带统计学软件进行数据处理及分析。数据的差异显著性（P<0.05）使用统计分析软件SPSS进行多重比较分析。所有实验重复操作3次。
2. 结果与分析
2.1 丝素蛋白的红外光谱
采用傅里叶红外光谱对丝素蛋白分子进行结构鉴定和分析。典型的丝素蛋白红外光谱特征谱带包括：无规卷曲：酰胺I带（1630~1650 cm−1）、酰胺II带（1525~1545 cm−1）、酰胺III带（1230~1270 cm−1）、酰胺V带（669 cm−1）；β-折叠：酰胺I带（1700、1625~1640 cm−1）、酰胺II带（1515~1525 cm−1）、酰胺III带（1265、1235 cm−1）、酰胺V带（700 cm−1）[27,29]。以购买丝素蛋白为对照，结果如图1所示。可以发现，两种样品的红外吸收光谱具有类似的吸收峰。再生丝素蛋白所表现出的红外特征峰为：酰胺I（C＝O伸缩振动）特征吸收峰为1630 cm−1、酰胺II（N－H变形振动）为1535 cm−1、酰胺III（N－H变角和C－H伸缩振动）为1235 cm−1、酰胺V（N－H面外变形振动）的特征谱带为 668 cm−1。购买丝素蛋白所表现出的红外特征峰为：酰胺I带特征吸收峰为1630 cm−1、酰胺II带为1540 cm−1、酰胺III带为1236 cm−1、酰胺V带的特征谱带为667 cm−1。由此表明再生丝素蛋白和市售丝素蛋白的构象均以无规卷曲结构为主。
2.2 自组装行为研究
2.2.1 温度对丝素蛋白体外自组装行为的影响
吸光度随时间的变化情况可以反映丝素蛋白体外自组装的动力学过程，且丝素蛋白溶液的吸光值越大，则丝素蛋白的体外自组装程度越高[28]。实验结果如图2所示。丝素蛋白的体外自组装与胶原蛋白类似，分别由成核期、生长期和平衡期三个阶段完成[28,30]。实验结果表明，4 mg/mL再生丝素蛋白溶液均出现了成核期、生长期和平衡期三个阶段。随着温度的升高，成核期（A）的时间逐渐缩短，80 ℃时成核期大概需要1 h，70 ℃成核期约为1.5 h，60 ℃时成核期约为3.5 h。组装生长期（B）速率也与温度密切相关，由图可知，60 ℃时生长期斜率最小，速率最慢，70 ℃时生长期斜率略高于80 ℃，生长期速率均比较快。平衡期（C）规律与生长期比较类似，60 ℃组装程度最低，70 ℃组装程度高于80 ℃。整体而言，随着温度的升高，可加快丝素蛋白体外自组装速率。但温度过高会影响丝素蛋白的体外自组装程度。因此，再生丝素蛋白的适宜组装温度为70 ℃。
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图 2 4 mg/mL丝素蛋白溶液在不同温度下的浊度曲线Figure 2. Turbidity curve of 4 mg/mL silk fibroin protein solution at different temperatures2.2.2 浓度对丝素蛋白体外自组装行为的影响
在70 ℃下，研究浓度对丝素蛋白体外自组装行为的影响，丝素蛋白浓度分别为3、4和5 mg/mL，结果如图3所示。由图可知，随着浓度的升高，成核期（A）的时间逐渐缩短，浓度为5 mg/mL时成核期缩短至1 h以内。组装生长期（B）速率也是随着浓度的增大而增大，而浓度为4、5 mg/mL的生长期斜率几乎无差别，即组装速率差别不大。并且二者到达平衡期的时间也几乎无差别，二者不同的是，随着浓度的增大，组装程度（C）也同时增加，在图中表现为浓度5 mg/mL时平衡期吸光值高于4 mg/mL的吸光值。总之，在70 ℃下，随着丝素蛋白浓度的升高，丝素蛋白体外自组装速度加快，组装时间变短，浓度高利于丝素蛋白溶液自组装。在后面的研究中选取RSF的浓度为4 mg/mL（吸光值较适中），组装温度为70 ℃。
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图 3 在70 ℃条件下不同丝素蛋白浓度的浊度曲线Figure 3. Turbidity curves of different silk fibroin protein concentrations at 70 ℃2.2.3 离子对丝素蛋白体外自组装行为的影响
采用浊度分析法研究离子对丝素蛋白自组装行为的影响。实验温度70 ℃，分别以超纯水、0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L CaCl2配制4 mg/mL丝素溶液。结果如图4所示。由图4（A）浊度曲线可知，丝素在纯水和0.1 mol/L NaCl中，随着时间的增加，丝素蛋白成核期变化基本一致，都是在很短的时间内迅速上升。进入到组装生长期，二者前期吸光值低且上升缓慢，但在0.1 mol/L NaCl 中生长期后期吸光值快速上升，斜率增加明显，说明组装速率明显增加，在4 h时基本已达平衡期，且组装程度高于纯水做溶剂。蛋白质自组装过程主要是由疏水相互作用[18]，π-π堆积[19]和/或氢键（H键）[31]作用组成，可能加入Na+后亲水性基团排列在纳米纤维表面，而疏水性块紧密堆积在核中心，因而导致丝素蛋白组装程度增加[31]。由图4（B）可以明显看出再生丝素蛋白在水中和0.1 mol/L NaCl中均可以形成稳定的凝胶。当加入0.1 mol/L CaCl2时，浊度曲线并没有表现出三个阶段，而是表现为先升再降，可能是再生丝素蛋白在生长期受到抑制作用，曲线呈现下降趋势。由图4（B）可以明显看出，溶液流动性良好，但出现很多白色絮状物，这可能是由于钙离子的加入，优先与丝素蛋白中氨基酸上的-COO−形成螯合物，该螯合物不稳定，容易聚沉，进而影响了丝素蛋白的自组装[32]。实验结果说明Na+对丝素蛋白的体外自组装起促进作用，Ca2+对丝素蛋白的体外自组装起抑制作用。
2.2.4 不同Na+浓度对丝素蛋白体外自组装行为的影响
从图4发现Na+对丝素蛋白体外自组装起促进作用。为此，进一步采用浊度分析法研究Na+浓度对丝素蛋白体外自组装的影响。Na+浓度分别选取0、0.05、0.1和0.2 mol/L NaCl，温度为70 ℃、丝素蛋白浓度为4 mg/mL，实验结果如图5所示。结果发现，随着NaCl浓度逐渐增大，成核期的时间变化不大，且与未加NaCl的RSF也几乎一致。但是在组装生长期，加了NaCl的丝素蛋白溶液几乎一致表现为吸光值上升更快，斜率大，组装速率更快（见图5中左上角的放大图），Na+浓度对组装速率影响不明显。与RSF相比，加了NaCl的丝素蛋白，不仅组装速率增大，组装程度也提高明显，0.2 mol/L NaCl达到平衡期所需时间几乎与0.1 mol/L NaCl相当，0.05 mol/L NaCl组装程度仅仅比0.1 mol/L NaCl和0.2 mol/L NaCl略低一点，说明Na+浓度对丝素蛋白体外自组装行为影响不大。
2.3 丝素蛋白的流变学性能分析
2.3.1 线性黏弹区（LVR）分析
采用旋转流变仪监测样品在线性黏弹扫描模式下的线性黏弹区，线性黏弹区（LVR）是样品发生均匀形变的区域，在该区域内凝胶样品的模量值与应变无关。样品的LVR结果（溶剂为超纯水）如图6所示，再生丝素蛋白样品在振荡应变为0.1%~3%的范围内模量不随应变增大而变化。当测试应变大于3%，样品的模量值随着应变的增加而缓慢增加，表现为溢出线性黏弹区，这种非线性流变学行为与丝素纤维的非均匀形变有关。因此，样品的LVR在0.1%~3%之间。由于其它体系的LVR与之类似，因此本图里只给出了一个典型的LVR测试结果。实验最终选择1%的应变来测定丝素蛋白样品的其它动态流变性能。
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图 6 再生丝素蛋白的线性黏弹区Figure 6. Linear viscoelastic region of regenerated silk fibroin protein2.3.2 再生丝素蛋白的黏弹性能（振荡时间扫描）
离子强度能够影响丝素蛋白的体外自组装行为[33]，为了进一步研究Na+浓度对丝素蛋白凝胶力学性质的影响，利用流变仪的振荡时间扫描模式研究不同Na+浓度（0、0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl）条件下丝素蛋白的组装动力学，结果如图7所示。由图可见，4种条件的丝素蛋白都从溶液态到凝胶态，表现出相似的组装动力学，体系模量变化具有生长期、平台期和无滞后期的特点。丝素蛋白的弹性模量G’可以表示凝胶的力学强度，G’的平衡模量值越大，则凝胶强度越高[28]。4种条件下的丝素蛋白的平衡模量值G’强度为：G’a（2175.9 Pa）<G’b（2346.27 Pa）<G’c（2544.44 Pa）<G’d（3459.12 Pa）。该结果表明，体系的离子浓度增大，则再生丝素蛋白体外自组装后的凝胶强度也增大。
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图 7 再生丝素蛋白的振荡时间扫描图注：a：H2O；b：0.05 mol/L NaCl；c：0.1 mol/L NaCl；d：0.2 mol/L NaCl；图8同。Figure 7. Spiral time scan of regenerated silk fibroin protein2.3.3 再生丝素蛋白的黏弹性能（振荡频率扫描）
采用旋转流变仪对以上四种样品进行振荡频率扫描，以进一步比较分析不同Na+离子浓度对丝素蛋白凝胶黏弹性能的影响。实验结果如图8所示，4种丝素蛋白凝胶都表现出类似的模量-频率关系。并且所有样品的弹性模量（G’）始终大于黏性模量（G”），丝素蛋白凝胶表现为弹性，且所形成的凝胶样品的弹性模量（G’）和黏性模量（G”）基本不随振荡频率的大小而变化，表明再生丝素蛋白在不同Na+浓度中所形成的凝胶网络结构稳定，行为类似固体。G’强度顺序为：G’a（2236.8 Pa）<G’b（2434.0 Pa）<G’c（2564.3 Pa）<G’d（3098.5 Pa）。由振荡频率扫描进一步证明丝素蛋白凝胶网络结构较稳定，且随着体系中Na+浓度的逐渐增大，丝素蛋白凝胶强度也逐渐增强。
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图 8 再生丝素蛋白的振荡频率扫描图Figure 8. Oscillating frequency scan of regenerated silk fibroin protein2.4 形貌分析
前述实验表明，丝素蛋白在NaCl溶液中自组装能力和凝胶强度均增强，因此，进一步采用扫描电镜观察丝素蛋白在纯水和NaCl溶液中组装后的表面形貌差异性[34]，结果如图9所示。由图可以发现，再生丝素蛋白自组装后整体呈现片状网络结构，在不同的介质中组装结构略有区别。图9a为再生丝素蛋白在纯水中组装，组装后呈现多孔片状结构，排布方向较为整齐且排列紧密，整体呈现密实片状结构，片壁较厚，孔隙大小略显不规则。图9b为再生丝素蛋白在NaCl溶液中自组装，组装后表现为明显的片状孔隙构造，其丝素片壁较薄且方向排布整齐连续，明显比图a孔隙排列整齐且孔隙大。
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图 9 再生丝素蛋白的组装SEM图注：a为纯水，b为0.1 mol/L NaCl。Figure 9. SEM image of assembled regenerated silk fibroin protein2.5 细胞增殖性能分析
采用小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3研究丝素蛋白组装前后对细胞生长的影响，并以牛跟腱胶原蛋白（Col）组装前后做对照。实验结果如图10所示。由图10可见，当培养时间为1 d时，4个样品对细胞增值能力无明显差异；当培养3 d时呈现明显差异，再生丝素蛋白和其组装纤维吸光值增加明显，其中RSF吸光度增加最多，高于胶原蛋白及组装后的胶原蛋白纤维；当培养5 d时，RSF和Assembly Col（胶原蛋白组装后）与其它样品表现出明显差异性，尤其RSF吸光值明显增加，表现出更强的促细胞增值能力。而组装后的丝素蛋白（Assembly RSF）吸光值相较于3 d几乎没变，对细胞的促生长作用并不明显。这可能是由于丝素蛋白溶液纤维粒径细且分布均一，比表面积较大，易于细胞迁移和繁殖，而组装后纤维粒径变大变长，不利于细胞附着，故组装前的丝素蛋白溶液促细胞增殖能力较组装后明显升高；而对于胶原蛋白略有不同，随着培养细胞时间的增加，组装前的胶原蛋白对细胞增殖作用不明显[35]。另外，丝素蛋白的亲水性优于胶原蛋白，使细胞粘附性能增加，因而，丝素蛋白的细胞增殖能力高于胶原蛋白[36]。
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图 10 细胞增殖性能注：图中不同字母代表有显著性差异，P<0.05，相同字母代表无显著性差异，P>0.05；黑色字体字母代表不同天数的显著性差异，红色字体字母代表同一天的显著性差异。Figure 10. Cell proliferation performance3. 结论
以家蚕蚕茧为原料提取、纯化得到再生丝素蛋白，通过浊度、流变等实验研究丝素蛋白分子的自组装聚集行为和动力学性能，通过细胞增殖实验研究生物学性能。浊度实验结果表明，高温和高浓度利于丝素蛋白自组装，但是过高的温度会使丝素蛋白的组装程度降低，最佳体外组装温度为70 ℃；加入Na+对丝素蛋白自组装有促进作用，而Ca2+则会抑制自组装；通过旋转流变实验表明，随着Na+浓度的增加，丝素蛋白凝胶强度增大，因此增加Na+浓度使丝素蛋白凝胶网络结构更稳定，黏弹性能增强；通过扫描电镜实验发现加入Na+后，丝素蛋白纤维呈多孔结构且排列更整齐。细胞实验显示丝素蛋白溶液更利于细胞增殖。综上，加入Na+后，使丝素蛋白的自组装速率和组装程度得到明显提升，且可以增强力学性能，这使丝素蛋白在可食用食品包装材料中有巨大的应用潜力。但仍然存在一些关键问题需要解决，如力学及生物学性能的调控等，今后，可进一步研究和完善丝素蛋自组装的可调控制备，使其能够满足不同食品包装和性能需求，以期实现其在食品工业中的商业化应用。
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图 2 4 mg/mL丝素蛋白溶液在不同温度下的浊度曲线
Figure 2. Turbidity curve of 4 mg/mL silk fibroin protein solution at different temperatures
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图 3 在70 ℃条件下不同丝素蛋白浓度的浊度曲线
Figure 3. Turbidity curves of different silk fibroin protein concentrations at 70 ℃
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图 6 再生丝素蛋白的线性黏弹区
Figure 6. Linear viscoelastic region of regenerated silk fibroin protein
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图 7 再生丝素蛋白的振荡时间扫描图
注：a：H2O；b：0.05 mol/L NaCl；c：0.1 mol/L NaCl；d：0.2 mol/L NaCl；图8同。
Figure 7. Spiral time scan of regenerated silk fibroin protein
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图 8 再生丝素蛋白的振荡频率扫描图
Figure 8. Oscillating frequency scan of regenerated silk fibroin protein
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图 9 再生丝素蛋白的组装SEM图
注：a为纯水，b为0.1 mol/L NaCl。
Figure 9. SEM image of assembled regenerated silk fibroin protein
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