Effects of Streptococcus thermophilus on the Fermentation Quality of Liquid Black Garlic
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摘要: 目的：以新鲜大蒜为原料制备液态黑蒜，研究嗜热链球菌对液态黑蒜品质的影响。方法：新鲜大蒜于180 ℃高温下进行蒜氨酸酶灭活，而后破碎加入嗜热链球菌，以未添加嗜热链球菌的灭酶破碎大蒜（空白）为参照，研究嗜热链球菌比例、不同蒜氨酸酶灭活时间及二者共存时间对制备液态黑蒜品质的影响。结果：大蒜高温以灭活蒜氨酸酶的时间最优为9 min，加入嗜热链球菌比例最佳为5%，嗜热链球菌与灭酶破碎大蒜共存时间最优为32 h，80 ℃恒温恒湿发酵箱中发酵所需时间为15 d，各品质指标达到黑蒜发酵标准，相比于空白，此时液态黑蒜总酚含量是其2倍、总酸含量是其1.9倍、还原糖含量是其1.3倍、DPPH·清除率和·OH清除率分别是其1.5倍和1.46倍。结论：嗜热链球菌可促进黑蒜发酵，提升黑蒜品质指标，缩短发酵时间，具有较大应用前景。Abstract: Objective: Liquid black garlic was prepared from fresh garlic and the effect of Streptococcus thermophilus on the quality of liquid black garlic was studied. Methods: Fresh garlic was inactivated with alliinase at 180 ℃, then broken and added with Streptococcus thermophilus. Using the inactivated garlic without Streptococcus thermophilus (blank) as reference, the effects of Streptococcus thermophilus ratio, different alliinase inactivation time and their coexistence time on the quality of liquid black garlic were studied. Results: The optimal time for inactivating allinase in garlic at high temperature was 9 min, the optimal proportion of Streptococcus thermophilus was 5%, the optimal coexistence time of Streptococcus thermophilus and inactivated crushed garlic was 32 h, and the fermentation time required in a constant temperature and humidity fermentation tank at 80 ℃ was 15 d. All quality indexes reached the fermentation standard of black garlic. Compared with blank black garlic, the total phenol content of liquid black garlic was 2 times, the total acid content was 1.9 times, the reducing sugar content was 1.3 times, the DPPH· clearance and ·OH clearance were 1.5 times and 1.46 times, respectively. Conclusion: Streptococcus thermophilus can promote the fermentation of black garlic, improve its quality indicators, shorten fermentation time and have great application prospects.
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黑蒜是在高温高湿的环境下由新鲜大蒜加工制作而成的一种无辛辣刺激感、颜色呈黑色、口味酸甜的一类大蒜深加工食品，蛋白质、糖类、维生素等含量至少是大蒜含量的两倍以上[1]，具有抗氧化、调节血糖、血压、抗癌防癌、增加免疫力等功效[2−3]。黑蒜加工工艺分为固态和液态发酵[4]。相对于固态黑蒜，液态黑蒜发酵时间更短且没有硫化物等臭味物质散出，蒜臭味大大降低，且液态加工方式有助于提高黑蒜营养价值和生物功能性[5]。但目前液态黑蒜研究仍比较少，且存在加工时间长、工艺繁琐，成本高等缺点[6−9]。
近年来，越来越多的研究者利用微生物发酵改善黑蒜品质。Si等[10]利用保加利亚乳杆菌发酵制备固体黑蒜，结果表明发酵后固体黑蒜的抗氧化性显著提高，且此黑蒜具有良好的预防妊娠糖尿病的功效。Ma等[8]利用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等发酵黑蒜提取液，发现能够有效改善黑蒜提取液的感官评价，提升黑蒜提取液总黄酮、总酚含量等指标。Ro等[9]研究发现从臭豆腐中分离的三种乳酸菌可以改变黑蒜提取液中S-烯丙基半胱氨酸的含量，提升对小鼠的润肠通便作用，说明乳酸菌对黑蒜的发酵品质有着重要的影响。由于新鲜大蒜在破碎后，蒜氨酸酶可促使蒜氨酸转化为对乳酸菌具有杀灭作用的大蒜素，所以无法直接利用乳酸菌发酵制备液态黑蒜。而Kim等[11]研究证明，通过一定高温热处理可使蒜氨酸酶失活，进而使破碎大蒜与微生物共存。故本研究方案为首先将新鲜大蒜于高温下进行蒜氨酸酶灭活，而后破碎加入嗜热链球菌，让二者共存一定时间后制备液态黑蒜，考察加入的嗜热链球菌比例及共存时间对液态黑蒜品质的影响，研究其最佳制备条件。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜大蒜 江苏省徐州市邳州市；嗜热链球菌 食品级，陕西荣林生物科技有限公司；蔗糖 分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；福林酚（1 mol/L） 飞净生物科技有限公司；亚硝酸钠 分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；亚铁氰化钾 分析纯， 天津市风船化学试剂科技有限公司；硫酸锌、无水亚硫酸钠、氢氧化钠、无水碳酸钠、没食子酸 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸 分析纯，天津市光复精细化工研究所；甲醛（30%） 西陇科学股份有限公司；苯酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 分析纯，郑州派尼化学试剂厂；酒石酸钾钠、邻菲啰啉 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；30%过氧化氢、无水乙醇、硫酸亚铁 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；MRS琼脂 分析纯，杭州百思生物技术有限公司。
JA2003A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；TDL-50B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；DZKW-S-4电热恒温水浴锅、100-1AS电热鼓风干燥箱、FL-2可调式封闭电炉 北京市永光明医疗仪器有限公司；UV-2800紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；DZF-6050A恒温发酵箱 北京中兴伟业仪器有限公司；85-2恒温磁力搅拌器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗仪器 昆山市超声仪器有限公司；PHS-3 pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；JZ-300色差仪 深圳市金准仪器设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。
1.2 实验方法
1.2.1 液体发酵黑蒜工艺流程
参考贾庆超等[12]黑蒜加工工艺流程，如下：
选取新鲜无破损、无变质大蒜→去皮→清洗→去根蒂→180 ℃灭活蒜氨酸酶→蒜瓣破碎→装罐→加水→加辅料（嗜热链球菌），共存→80 ℃恒温发酵→成品→品质指标测定[13]。
操作要点：选取新鲜无破损、无变质的大蒜，进行去皮，清洗，去除根蒂，在高温180 ℃下灭活蒜氨酸酶，分别处理8、9、10 min，处理之后用破壁机进行破碎，破碎粒度为4 mm，并进行装罐，设置大蒜与蒸馏水的料液比为4:1，将嗜热链球菌原料质量比例的4%、5%和6%[14]，在室温下分别共存16、24、32 h，与破碎粒度为4 mm、料液比为4:1且未添加嗜热链球菌的灭酶大蒜（空白组）于80 ℃恒温恒湿发酵箱中进行发酵。每2 d取一定量的发酵黑蒜，分别测定黑蒜中还原糖含量、总酚、总酸含量、褐变程度、氨基酸态氮和抗氧化活性等指标，从而探究嗜热链球菌比例对液态黑蒜发酵品质的影响。
1.2.2 大蒜中蒜氨酸酶灭活时间的研究
将处理好的新鲜大蒜在高热鼓风干燥箱中180 ℃下分别处理8、9、10 min，破碎至4 mm蒜粒，准确称取1.00 g嗜热链球菌粉末，用蒸馏水稀释倍数为10−5、10−6的菌液，将灭酶和未灭酶破碎后的大蒜与配制的灭菌过的MRS培养基一同置入培养皿中，等待凝固，凝固后吸取1 mL稀释过后的嗜热链球菌液加入培养皿中，转动培养皿待菌液吸收后将其倒置，放入恒温发酵箱中37 ℃共存16、24、32 h，后观察不同热处理时间、不同共存时间下菌落总数。通过菌落总数分析其微生物生长状况，从而得到灭活蒜氨酸酶最优时间。
1.2.3 液态发酵黑蒜品质指标的测定方法
1.2.3.1 褐变程度的测定
根据Li等[15]方法，使用色差计测量色度。在色差计中，样品的颜色由三个维度L*、a*和b*表示。L*（反射率）值衡量产品对光的反射，范围从完美白色的100到黑色的0。红色/绿色和黄色/蓝色分别由a*和b*值表示。色差计在测量前使用白色和黑色标准进行校准。褐变程度以ΔE表示。
ΔE=[(L∗−L0)2+(a∗−a0)2+(b∗−b0)2]1/2 式中：L*、a*、b*分别为色差计的测定值；L0、a0、b0分别为未进行任何处理的大蒜的测定值。
1.2.3.2 还原糖含量的测定
根据彦繁鹤等[16]3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）测定液态发酵黑蒜中还原糖含量。葡萄糖标准曲线方程为y=1.021x+0.0022，R2=0.9998。
准确称取黑蒜样品5.000 g，放入研钵中迅速研磨至无肉眼可见颗粒状，精准移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，静置30 min，在离心机中3800 r/min离心10 min。准确吸取上清液1.00 mL于10 mL具塞试管中，加水补足至2.00 mL，加入1.50 mL DNS试剂，在水浴锅100 ℃沸水中水浴5 min，取出冷却至室温，立即加水定容至刻度线，在540 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线，计算液态发酵黑蒜中还原糖的含量。
1.2.3.3 总酸的测定
参考于蒙娜[7]的研究，使用直接滴定法测定液态发酵黑蒜中总酸含量。
准确称取黑蒜样品质量m为5.000 g，放入研钵中迅速研磨至无肉眼可见颗粒状，精准移入100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，充分混匀制备成100 mL样品稀释液V0，静置30 min，于3800 r/min下离心10 min。准确吸取上清液V2为20.00 mL于烧杯中，加入60.00 mL去离子水，搅拌均匀，用浓度C为0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2，记录氢氧化钠消耗体积V1。而后用20.00 mL水来替代20.00 mL样液，作为空白试验，记录氢氧化钠所消耗体积V，计算液态发酵黑蒜中总酸含量。
总酸含量(%)=C×(V1−V)×K×V0m×V2×100 式中K：0.06，即1 mmol氢氧化钠相当于乙酸的质量（g）。
1.2.3.4 氨基酸态氮的测定
参考GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》[17]测定液态发酵黑蒜中氨基酸态氮含量。
准确称取黑蒜样品质量m为5.000 g，于研钵中迅速研磨至无肉眼可见颗粒状，精准移至100 mL容量瓶中，静置30 min。准确吸取上清液V3为20.00 mL于烧杯中，加入60.00 mL去离子水，搅拌均匀，用浓度C为0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH为8.2，再加入10.00 mL 40%甲醛溶液，混匀，用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH为9.2，记录氢氧化钠标准溶液消耗体积V1。同时取80.00 mL水，做空白试验，记录滴加氢氧化钠标准溶液所消耗体积V2。计算公式如下：
氨基酸态氮(以氮计%)=(V1−V2)×C×0.014×100m×V3×0.01 式中：0.01表示1 mL浓度为1.000 mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量（g）。
1.2.3.5 总酚的测定
根据福林酚法[18]测定液态发酵黑蒜中含有的总酚含量。没食子酸标准曲线方程为y=125.82x+0.0288，R2=0.9972。
而后准确称取黑蒜样品1.000 g于50 mL容量瓶中，加入25.00 mL 70%乙醇溶液，超声浸提30 min，过滤至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，准确吸取2.00 mL于10 mL具塞试管中，用70%乙醇定容，准确吸取1.00 mL置于10 mL具塞试管中，加6.00 mL蒸馏水和0.50 mL福林酚试剂，摇匀，1 min后，加入1.50 mL 20%碳酸钠溶液，充分混匀、定容，75 ℃下水浴10 min，冷却至室温，于760 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线，计算液态发酵黑蒜中总酚含量。
1.2.3.6 抗氧化活性的测定
准确称取黑蒜样品5.000 g于250 mL锥形瓶中，加入50.00 mL 50%乙醇溶液，超声浸提30 min，先于3800 r/min离心20 min，再取上清液4000 r/min离心20 min，取上清液备用[19]。
a.DPPH·清除率的测定：参考赵晓娟等[19]测定方法：准确称取19.72 mg DPPH，用无水乙醇溶解，定容至250 mL容量瓶中，得到浓度为0.2 mmol/L溶液。准确吸取DPPH和黑蒜样液各2.00 mL，混合均匀避光放置30 min，以无水乙醇为参照，于517 nm波长处测定吸光度A1；测定无水乙醇与DPPH·溶液各2.00 mL混合后吸光度A2；测定黑蒜样液与无水乙醇各2.00 mL混合后吸光度A3。计算清除率：
DPPH⋅清除率(\%)=(1−A1−A3A2)×100 b.·OH清除率的测定：参考赵晓娟[20]测定方法：准确吸取0.05 mol/L磷酸缓冲溶液1.00 mL于10 mL比色管中，加入0.50 mL邻二氮菲溶液，充分混匀，再加0.50 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，立即混匀，再加入0.50 mL黑蒜样品溶液，充分混匀后，加入0.50 mL 0.1% H2O2溶液，用蒸馏水定容至刻度，37 ℃下水浴1 h，于536 nm波长处测吸光度A1。同时用蒸馏水代替上述样液，测定吸光度A，用蒸馏水代替上述样液和H2O2溶液，测定吸光度A0。计算清除率：
⋅OH清除率(%)=A1−AA0−A×100 1.3 数据处理
实验重复三次。SPSS 21.0用于数据方差分析及误差值的结果计算，P<0.05表示具有显著性差异。Origin 2018用于黑蒜品质指标图的绘制。结果使用平均值±标准差的形式表示。
2. 结果与分析
2.1 灭活时间对嗜热链球菌的影响
由表1可知，培养16 h时，灭活时间为8 min无菌落产生，灭活时间为9 min和10 min有少量菌落产生；培养24 h时，灭活时间为9 min和10 min菌落产生较多，而灭活时间为8 min有少量菌落产生；培养32 h时，灭活时间为8 min显著低于9 min与10 min的菌落总数（P<0.05），而灭活时间9 min与10 min差异不显著（P>0.05），由此可推断，灭活时间9 min和10 min的灭活效果优于8 min。而以未灭酶破碎新鲜大蒜做培养基时，共存时间为16、24、32 h时，均无菌落产生。所以本研究在高温180 ℃下分别将大蒜灭活蒜氨酸酶9 min，10 min后，将其破碎后添加嗜热链球菌比例为4%、5%、6%，并在室温下分别共存16、24、32 h，与未添加嗜热链球菌灭酶破碎预处理（以下简称空白）的大蒜一同放入80 ℃[12]恒温恒湿发酵箱中进行恒温发酵，并测定发酵过程中产生的理化指标，从而研究嗜热链球菌与大蒜在室温下共存时间对发酵产生的影响。
表 1 热处理时间及共存时间对菌落总数菌落总数的影响Table 1. Effect of heat treatment time and co-existence time on the total colony number of bacterial colonies指标 蒜氨基酸酶灭活时间（min） 16（h） 24（h） 32（h） 8 9 10 8 9 10 8 9 10 菌落总数
（CFU/mL）无 （2.02±0.1）×
102 a（2.03±0.2）×
102 a（5.05±0.2）×
102 b（2.27±0.1）×
103 c（1.96±0.2）×
103 d（3.86±0.2）×
105 e（1.47±0.2）×
106 f（1.36±0.2）×
106 f注：表中字母代表显著差异性（P<0.05）。 2.2 褐变程度
∆E的数据代表着发酵黑蒜颜色的深浅，∆E的数据越大，就代表发酵黑蒜颜色越深，同时也代表着发酵产品的成色越好[21]，类黑精含量也越大[22]。参考于蒙娜[7]在黑蒜液态发酵工艺的研究，在80 ℃条件下恒温发酵，褐变度达到60时，认为黑蒜发酵已成熟。
2.2.1 灭活9 min时菌比例对褐变程度的影响
由图1可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜褐变程度均呈先上升后趋于平缓趋势。由图1a可知，共存16 h，褐变程度上升趋势为5%>6%>4%>空白，当发酵至12 d时，5%嗜热链球菌比例黑蒜褐变值为60.64，即黑蒜发酵基本趋于平缓且成熟，4%、6%嗜热链球菌比例黑蒜在第18 d时，褐变值分别为64.1和63.32，才达到此种状态。由图1b可知，共存24 h，褐变程度上升趋势为4%>6%>5%>空白，当发酵至15 d时，三种比例褐变值分别为63.8、62.71和61.67，此时发酵基本趋于平缓且成熟。由图1c可知，共存32 h，褐变程度上升趋势为5%>6%>4%>空白。当发酵至12 d时，5%嗜热链球菌比例黑蒜褐变值为62.38，此时发酵基本趋于平缓且成熟，当发酵至15 d时，4%、6%嗜热链球菌比例黑蒜褐变值分别为63.66、62.78，此时才基本趋于平缓且成熟。由此可知，灭活蒜氨酸酶9 min时，嗜热链球菌比例为5%、共存32 h（设为T1），褐变程度较好，且此时发酵时间大于12 d时，褐变程度均大于嗜热链球菌为4%和6%黑蒜褐变程度，且差异显著（P<0.05）。
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2.2.2 灭活10 min时菌比例对褐变程度的影响
由图2可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜褐变程度均呈先上升后趋于平缓的趋势。由图2a可知，共存16 h，褐变程度总体上升趋势为4%>5%>6%>空白，5%和6%嗜热链球菌比例黑蒜发酵至15 d时，褐变值分别为66.98、62.07，黑蒜发酵趋于平缓且成熟。嗜热链球菌比例为4%黑蒜发酵至第18 d时，褐变值为61.37，发酵成熟，但由于此时黑蒜褐变程度较大，因此在15~18 d内，此比例黑蒜发酵速率明显较快；由图2b可知，共存24 h，褐变程度上升趋势为4%>5%>6%>空白，当发酵至15 d时，4%、5%嗜热链球菌比例黑蒜褐变值分别为61.7、60.51，黑蒜发酵趋于平缓且成熟，而嗜热链球菌比例为6%，黑蒜在发酵第18 d时，褐变值为61.2，才达到此种状态；由图2c可知，室温下共存32 h，褐变程度上升趋势4%>6%>5%>空白，当发酵至12 d时，4%嗜热链球菌比例黑蒜褐变值为61.28，黑蒜发酵趋于平缓且成熟，5%和6%嗜热链球菌比例黑蒜在发酵第15 d时，褐变值分别60.14、61.56，才发酵成熟。综上所述，灭活蒜氨酸酶10 min，加入嗜热链球菌比例4%，室温下共存32 h时（设为T2），褐变程度更好，均大于嗜热链球菌比例为5%和6%的黑蒜褐变程度，且除了第18 d以外，其余均与二者褐变程度差异显著（P<0.05）。
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图 2 灭活10 min时嗜热链球菌比例对褐变程度的影响Figure 2. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on browning degree after 10 minutes of inactivation综上所述，由图1c和图2c可知，褐变程度上升趋势为T1>T2>空白，且当发酵至12 d时，均发酵成熟，T1为此时较优条件。丘苑新等[23]在黑蒜变温发酵发酵工艺研究中得出，发酵至30 d时，黑蒜在制备过程中具备深黑色外观，达成品的标准；陈玲[24]在冷冻和美拉德反应对黑蒜的影响研究中，发酵至20 d时，黑蒜发酵成熟。由此可知，加入嗜热链球菌进行预处理的黑蒜的∆E数值比未添加的大蒜褐变程度要好，有利于黑蒜发酵。
2.3 还原糖含量
在黑蒜发酵过程中，还原糖含量主要取决于两点，一是大蒜中的多糖被降解生成还原糖，二是美拉德反应消耗还原糖[22]。还原糖含量在发酵过程中不但会影响黑蒜发酵的速率，而且较高含量的还原糖既有利于类黑精的形成，还赋予黑蒜软糯酸甜的口感[25]。参考GB/T 42205-2022《黑蒜质量通则》，当还原糖含量（%）≥35时，黑蒜品质达到特级标准[26]。
2.3.1 灭活9 min时菌比例对还原糖含量的影响
由图3可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间黑蒜还原糖含量呈现不断上升趋势。由图3a可知，共存16 h，还原糖含量上升趋势为5%>6%>4%>空白。当还原糖达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数分别为15、12、15 d，还原糖含量分别为36.9、35.46、39.94 g/100 g，发酵至27 d时，5%嗜热链球菌比例的黑蒜还原糖含量最高，为53.27 g/kg；由图3b可知，共存24 h，还原糖含量上升趋势为4%>6%>5%>空白。当还原糖含量达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数均为15 d，还原糖含量分别为40.86、36.96、39.36 g/100 g，发酵至27 d时，4%嗜热链球菌比例黑蒜还原糖含量最高，为53.54 g/100 g；由图3c可知，共存32 h，还原糖含量上升趋势为5%>6%>4%>空白。当还原糖含量达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜所需发酵天数分别为15、12、15 d。还原糖含量分别为40.56、39.36、38.94 g/100 g，发酵至27 d时，5%嗜热链球菌比例黑蒜还原糖含量最高，为55.94 g/100 g。综上所述，嗜热链球菌可使黑蒜发酵时间缩短。当添加嗜热链球菌比例为5%、共存时间为32 h、高温灭活蒜氨酸酶9 min（设为T3），发酵时间最短，还原糖含量较高，且当发酵时间大于12 d时，均显著大于相同条件下4%和6%还原糖含量（P<0.05）。
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图 3 灭活9 min时嗜热链球菌比例对还原糖含量的影响Figure 3. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on reducing sugar content after 9 minutes of inactivation2.3.2 灭活10 min时菌比例对还原糖含量的影响
由图4可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜还原糖含量呈现先上升后趋于平缓趋势。由图4a可知，共存16 h，还原糖含量的上升趋势为6%>4%>5%>空白。当还原糖达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数均为15 d，还原糖含量分别为38.66、37.18、39.12 g/100 g。发酵至27 d时，6%嗜热链球菌比例的黑蒜还原糖含量最高为53.1 g/100 g；由图4b可知，共存24 h，还原糖含量上升趋势为4%>5%>6%>空白。当还原糖达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数均为15 d，还原糖含量分别为39.46、40.72、40.02 g/100 g。发酵至27 d时，4%嗜热链球菌比例的黑蒜还原糖含量达到最高为53.54 g/100 g；由图4c可知，共存32 h，还原糖含量上升趋势为6%>5%>4%>空白，当还原糖达到特级标准时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数均为12 d，还原糖含量分别为37.46、35.06、38.64 g/100 g。发酵至27 d时，6%嗜热链球菌比例的黑蒜还原糖含量最高为54.43 g/100 g。综上所述，当嗜热链球菌比例为6%、共存时间为32 h、灭活10 min时（设为T4），还原糖含量较高，且当发酵时间达到12 d时，均大于4%和5%嗜热链球菌比例的黑蒜还原糖含量，除了第18 d以外，均差异显著（P<0.05）。
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图 4 灭活10 min时嗜热链球菌比例对还原糖含量的影响Figure 4. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on reducing sugar content after 10 minutes of inactivation综上所述，由图3c和图4c可知，还原糖含量上升趋势为T3>T4>空白，当还原糖含量达到特级标准时，二者各发酵所需天数均为12 d，还原糖含量分别为39.36、38.64 g/100 g，所以T3为此时较优条件。李超峰等[27]采用糖化变温处理工艺，得到还原糖含量最高为32.14 g/100 g；在卢福芝等[28]的黑蒜发酵过程中还原糖和可溶性糖含量变化的研究中，还原糖含量最高为49.36 g/100 g，均低于本试验还原糖含量。因此，本试验方案能更好地促使还原糖释放出来，缩短发酵时间。
2.4 总酸含量
研究表明，总酸是黑蒜风味产生的第一重要因素[29−31]。参考于蒙娜感官评定[7]，当总酸含量为15~30 g/kg时，黑蒜有些许酸味；当总酸含量在30~40 g/kg时，黑蒜酸味适中，口感良好；当总酸含量超过40 g/kg时，酸度过高，影响黑蒜口感。
2.4.1 灭活9 min时菌比例对总酸含量的影响
由图5可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜总酸含量呈现上升趋势。由图5a可知，共存16 h，总酸含量上升趋势为5%>6%>4%>空白，当总酸含量达35 g/kg时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜发酵所需天数分别21、18、18 d，总酸含量分别为39.9、38.88、36.75 g/kg。由图5b可知，共存24 h，总酸含量上升趋势为4%>5%>6%>空白，当总酸含量达35 g/kg时， 4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜发酵所需天数分别为18、18、24 d，总酸含量分别为39.62、35.81、37.05 g/kg。由图5c可知，共存32 h，总酸含量上升趋势为5%>6%>4%>空白，当总酸含量达35 g/kg时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需天数分别为21、15、15 d，总酸含量分别为39.77、37.26、35.19 g/kg。综上所述，灭活蒜氨酸酶9 min，嗜热链球菌比例为5%，共存时间为32 h（设为T5），总酸含量上升趋势更快，且显著大于此条件下嗜热链球菌为4%、6%的黑蒜总酸含量（P<0.05），黑蒜口感酸度适中、发酵天数更短。
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图 5 灭活9 min时嗜热链球菌比例对总酸含量的影响Figure 5. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on total acid after 9 minutes of inactivation2.4.2 灭活10 min时菌比例对总酸含量的影响
由图6可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜总酸含量呈现上升趋势。由图6a可知，共存16 h，嗜热链球菌比例为4%、5%、6%的黑蒜总酸含量上升趋势为5%>4%>6%>空白，当总酸含量达35 g/kg时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需天数均为24 d，总酸含量分别为36.34、39.08、36.06 g/kg。由图6b可知，共存24 h，总酸含量上升趋势为5%>4%>6%>空白，当总酸含量达35 g/kg时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数分别为18、18、21 d，总酸含量分别为36.52、40.27、39.12 g/kg。由图6c可知，共存32 h，总酸含量上升趋势为6%>4%>5%>空白，当总酸含量达35 g/kg时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜各发酵所需天数分别为18、24、18 d，总酸含量分别为35.94、38.76、38.44 g/kg。所以，当灭活蒜氨酸酶10 min，嗜热链球菌比例为5%且共存时间为24 h时（设为T6），显著大于相同条件下4%、6%比例的总酸含量（P<0.05），黑蒜总酸上升速率更快，更利于黑蒜发酵。
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图 6 灭活10 min时嗜热链球菌比例对总酸含量的影响Figure 6. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on total acid after 10 minutes of inactivation综上所述，由图5c和图6b可知，总酸含量上升基本趋势为T5>T6>空白，当总酸含量达35 g/kg时，二者各发酵所需天数分别为15、18 d，总酸含量分别为37.26、40.27 g/kg。说明加入嗜热链球菌促进发酵，缩短发酵时间。在房磊[32]加工湿度对黑蒜品质影响的研究中，20 d时总酸含量达标准。而本试验在15 d时即达标准，说明嗜热链球菌黑蒜发酵效果良好。在T5条件下，发酵黑蒜总酸含量所需发酵天数短，为此时较优条件。
2.5 氨基酸态氮含量
氨基酸态氮是美拉德反应产生的重要底物，其含量会直接影响黑蒜品质，主要取决于两个因素：美拉德反应消耗；大蒜在加工过程中蛋白质分解[12]。参考贾庆超等[25]蒸汽预处理对黑蒜品质的影响研究中，当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，达到发酵标准。
2.5.1 灭活9 min时菌比例对氨基酸态氮含量的影响
由图7可知，随着发酵时间不断增加，不同共存时间氨基酸态氮含量呈先上升后下降趋势。由图7a可知，共存16 h，嗜热链球菌比例为4%、5%、6%发酵黑蒜氨基酸态氮含量上升趋势为4%>6%>5%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间分别为6、8、6 d，氨基酸态氮含量分别为5.98、5.28、5.45 g/100 g；由图7b可知，共存24 h，氨基酸态氮含量上升趋势为5%>6%>4%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间均为6 d，氨基酸态氮含量分别为5.25、5.56、5.36 g/100 g；由图7c可知，共存32 h，氨基酸态氮含量上升趋势为5%>6%>4%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，嗜热链球菌比例为4%、5%、6%的黑蒜所需发酵时间分别为8、6、8 d，氨基酸态氮含量分别为5.18、5.49、5.26 g/100 g。综上所述，当灭活蒜氨酸酶9 min，嗜热链球菌比例为4%，共存时间为16 h（设为T7），氨基酸态氮达发酵标准所需天时最短为6 d，且发酵时间大于6 d时，显著大于相同条件下5%、6%的氨基酸态氮含量（P<0.05）。
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图 7 灭活9 min时嗜热链球菌比例对氨基酸态氮的影响Figure 7. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on amino acid nitrogen after 9 minutes of inactivation2.5.2 灭活10 min时菌比例对氨基酸态氮含量的影响
由图8可知，随着发酵时间不断增加，不同共存时间发酵黑蒜氨基酸态氮含量呈先上升后下降趋势。由8a可知，共存16 h，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜氨基酸态氮含量的上升趋势为6%>4%>5%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间分别为6、8、6 d，氨基酸态氮含量分别为5.32、5.56、5.89 g/100 g。由图8b可知，共存24 h，氨基酸态氮含量上升趋势为6%>4%>5%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例分黑蒜所需发酵时间分别为8、8、6 d，氨基酸态氮含量分别为5.48、5.26、5.36 g/100 g；由图8c可知，共存32 h，氨基酸态氮含量上升趋势为4%>5%>6%>空白。当氨基酸态氮含量（g/100 g）≥5时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间分别为6、8、8 d，氨基酸态氮含量分别为5.39、5.36、5.17 g/100 g。综上所述，灭活蒜氨酸酶10 min，嗜热链球菌比例为6%，共存时间为16 h（设为T8）为较优条件，且显著大于相同条件下比例为5%的氨基酸态氮含量（P<0.05），除了第15 d外，均大于相同条件下比例为4%的氨基酸态氮含量。
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图 8 灭活10 min时嗜热链球菌比例对氨基酸态氮的影响Figure 8. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on amino acid nitrogen after 10 minutes of inactivation综上所述，由图7a和图8a可知，发酵黑蒜的氨基酸态氮含量上升趋势为T7>T8>空白，在T7条件下，在18 d时氨基酸态氮含量达到最高值为9.17 g/100 g，且在第6 d时含量为5.98 g/100 g，达到发酵标准，比T8发酵第6 d时高0.9 g/100 g。所以T7为此时较优条件。而赵雪晴等[33]在不同预处理对黑蒜品质影响研究中，经过高温处理的大蒜，氨基酸态氮含量在16 d发酵完成；唐仕荣等[34]在发酵黑蒜功能物质与抗氧化活性变化中，70 ℃环境下25 d时发酵完成，因此，高温灭活蒜氨酸酶且加入嗜热链球菌对于液态黑蒜发酵有促进作用，能较好缩短发酵时间。
2.6 总酚含量
黑蒜发酵过程中酚类物质是用来检验黑蒜抗氧化能力的一项重要指标之一，发酵后的黑蒜中多酚含量要比新鲜大蒜高出约5倍左右[35−36]。参考贾庆超等[25]蒸汽预处理对黑蒜品质的影响研究，当总酚含量（mg/g）≥8时，达到发酵标准。
2.6.1 灭活9 min时菌比例对总酚含量的影响
由图9可知，随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜总酚含量呈现先上升后平缓趋势。由图9a可知，共存16 h，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜总酚含量上升趋势为4%>5%>6%>空白，当含量达到8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜所需发酵时间分别为15、15、18 d，总酚含量分别为8.94、8.32、8.42 mg/g；由图9b可知，共存24 h，总酚含量上升趋势为4%>5%>6%>空白，当含量达到8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间分别为15、18、18 d，总酚含量分别为8.12、8.43、8.22 mg/g；由图9c可知，共存32 h，总酚含量上升趋势为5%>6%>4%>空白，当含量达到8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵时间分别为18、12、15 d，总酚含量分别为8.45、8.98、8.27 mg/g。综上所述，当灭活蒜氨酸酶9 min，嗜热链球菌比例为5%，共存时间为32 h（设为T9），是较优条件，且发酵时间达到12 d时，显著大于相同条件下比例为4%、6%黑蒜的总酚含量（P<0.05），达到发酵标准所需时间最短。
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图 9 灭活9 min时嗜热链球菌比例对总酚的影响Figure 9. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on totalphenols after 9 minutes of inactivation2.6.2 灭活10 min时菌比例对总酚含量的影响
由图10可知， 随着发酵时间的增加，不同共存时间发酵黑蒜总酚含量呈现先上升后平缓趋势。由图10a可知，共存16 h，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜总酚含量总体上升趋势为4%>5%>6%>空白，当总酚含量达8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜所需发酵天数分别为15、18、18 d，总酚含量分别为8.38、8.36、8.52 mg/g；由图10b可知，共存24 h，总酚含量上升趋势为6%>5%>4%>空白，当总酚含量达8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜所需发酵天数分别为21、18、15 d，总酚含量分别为8.48、8.3、8.11 mg/g；由图10c可知，共存32 h，总酚含量上升趋势为6%>5%>4%>空白，当总酚含量达8 mg/g时，4%、5%、6%嗜热链球菌比例的黑蒜所需发酵天数分别为18、18、15 d，总酚含量分别为8.58、8.89、8.87 mg/g。综上所述，灭活蒜氨酸酶10 min，嗜热链球菌比例为6%，室温下共存32 h（设为T10），为较优条件，发酵时间大于15 d时，显著大于嗜热链球菌为4%、5%比例黑蒜的总酚含量（P<0.05）。
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图 10 灭活10 min时嗜热链球菌比例对总酚的影响Figure 10. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on totalphenols after 10 minutes of inactivation综上所述，由图9c和图10c可知，当总酚含量达8 mg/g时，T9和T10条件下所需发酵时间分别为12、15 d，总酚含量分别为8.98、8.87 mg/g，且T9条件下发酵至27 d时，总酚含量最高，达13.09 mg/g，所以T9为此时较优条件。唐仕荣等[34]在发酵大蒜功能物质与抗氧化活性变化研究中，固态发酵黑蒜总酚含量在发酵30 d达最大值，仅为3.3 mg/g左右；吴清梅等[37]在不同加工工艺对黑蒜产品品质的研究中，黑蒜发酵产生总酚最高值为7.91±0.17 mg/g，而本试验研究所得总酚含量最高为13.09 mg/g，且12 d发酵已达到标准。
2.7 DPPH·清除能力
2.7.1 灭活9 min时菌比例对DPPH·清除率的影响
由图11可知，随着发酵时间增长，不同共存时间下的发酵黑蒜DPPH·清除率呈现逐渐上升后平缓趋势。由图11a可知，共存16 h，4%、5%、6%嗜热链球菌比例黑蒜DPPH·清除率上升趋势为6%>5%>4%空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为6%时发酵黑蒜DPPH·清除率最高，为82.84%；由图11b可知，共存24 h，DPPH·清除率上升趋势为6%>4%>5%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为6%发酵黑蒜DPPH·清除率最高，为83.35%；由图11c可知，共存32 h，DPPH·清除率上升趋势为5%>4%>6%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为5%的黑蒜DPPH·清除率最高，为86.95%。综上所述，当灭活蒜氨酸酶9 min，嗜热链球菌比例为5%且共存时间为32 h时（设为T11），是较优条件，当发酵时间大于8 d时，显著大于相同条件下嗜热链球菌为4%、6%两种比例黑蒜的DPPH·清除率（P<0.05）。
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图 11 灭活9 min时嗜热链球菌比例对DPPH·清除率的影响Figure 11. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on DPPH· clearance rate after 9 minutes of inactivation2.7.2 灭活10 min时菌比例对DPPH·清除率的影响
由图12可知，随着发酵时间的增长，不同共存时间下发酵黑蒜的DPPH·清除率呈先上升后平缓趋势。由图12a可知，共存16 h，嗜热链球菌比例为4%、5%、6%的黑蒜DPPH·清除率上升趋势为6%>5%>4%>空白，当发酵至27 d时，6%嗜热链球菌比例的黑蒜DPPH·清除率最高，为81.86%；由图12b可知，共存24 h，DPPH·清除率上升趋势为5%>6%>4%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为5%的黑蒜DPPH·清除率最高，为84.07%；由图12c可知，共存32 h，DPPH·清除率上升趋势为5%>4%>6%>空白，且当发酵至27 d时，5%嗜热链球菌比例的黑蒜DPPH·清除率最高，为82.74%。综上所述，当灭活蒜氨酸酶10 min、嗜热链球菌比例为5%、室温下共存24 h时（设为T12），为较优条件，且发酵时间大于10 d时，显著大于相同条件下嗜热链球菌比例为4%、6%黑蒜的DPPH·清除率（P<0.05）。
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图 12 灭活10 min时嗜热链球菌比例对DPPH·清除率的影响Figure 12. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on DPPH· clearance rate after 10 minutes of inactivation综上所述，由图11c和图12b可知，发酵黑蒜的DPPH·清除率上升趋势为T11>T12>空白，在T11条件下，当发酵至27 d时，DPPH·清除率最高值为86.96%，更利于黑蒜发酵。而王玉荣等[38]在黑蒜简易制备研究中，得到的DPPH·的清除率最大为85.3%；李宁阳[39]在黑蒜品质形成规律及抗氧化性研究中，DPPH·的清除率最大不超过80%，因此，T11为此时较优条件。
2.8 ·OH清除能力
2.8.1 灭活9 min时菌比例对·OH清除率的影响
由图13可知，随着发酵时间的增长，不同共存时间下发酵黑蒜的·OH清除率呈现先上升后平缓趋势。由图13a可知，共存16 h，·OH清除率上升趋势为5%>6%>4%>空白，且当发酵至27d时，嗜热链球菌比例为5%黑蒜·OH清除率最高，为77.72%；由图13b可知，共存24 h，·OH清除率上升趋势为4%>6%>5%>空白，且当发酵至27d时，嗜热链球菌比例为4%黑蒜·OH清除率最高，为80.24%；由图13c可知，共存32 h，·OH清除率上升趋势为5%>6%>4%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例5%发酵黑蒜·OH清除率最高，为85.2%。综上所述，灭活蒜氨酸酶时间9 min，嗜热链球菌比例5%，室温下共存时间32 h（设为T13）为此时较优条件，当发酵时间大于8 d时，显著大于嗜热链球菌比例为4%、6%两种条件下黑蒜的·OH清除率（P<0.05）。
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图 13 灭活9 min时嗜热链球菌比例对·OH清除率的影响Figure 13. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on ·OH clearance rate after 9 minutes of inactivation2.8.2 灭活10min时菌比例对·OH清除率的影响
由图14可知，随着发酵时间的增长，不同共存时间下发酵黑蒜的·OH清除率呈先上升后平缓趋势。由图14a可知，共存16 h，·OH清除率上升趋势为6%>4%>5%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为6%黑蒜·OH清除率最高，为83.5%；由图14b可知，共存24 h，·OH清除率上升趋势为4%>5%>6%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例4%黑蒜·OH清除率最高，为80.21%；由图14c可知，共存32 h，·OH清除率上升趋势为4%>6%>5%>空白，且当发酵至27 d时，嗜热链球菌比例为4%黑蒜·OH清除率最高，为73.05%。综上所述，灭活10 min，嗜热链球菌比例为6%，室温下共存16 h时，是较优条件（设为T14），当发酵时间大于10 d时，显著大于相同条件下嗜热链球菌比例为4%、6%两种·OH清除率（P<0.05）。
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图 14 灭活10 min时嗜热链球菌比例对·OH清除率的影响Figure 14. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on ·OH clearance rate after 10 minutes of inactivation综上所述，由图13c和图14a可知，发酵黑蒜的·OH清除率上升趋势为T13>T14>空白，在T13条件下，当发酵至27d时，·OH清除率最高值为85.2%，为此时较优条件。与王玉荣等[38]在黑蒜制备的研究中得到的清除率的最高值为85.3%几乎相同，但本研究加入嗜热链球菌后的大蒜发酵后清除率比空白上升了45%，说明嗜热链球菌的对黑蒜品质的改进有巨大作用；牛娜娜等[40]利用微生物、冷冻和高温高压3种工艺对黑蒜功能性成分、抗氧化活性影响研究中，黑蒜的·OH清除率最高达到55.72%，比本试验研究的最高值低约30%。由此可得，灭活蒜氨酸酶并加入嗜热链球菌的大蒜在发酵过程中·OH自由基的清除率更好。
3. 结 论
本研究以新鲜大蒜为原料，采用高温灭酶促使嗜热链球菌可以与破碎大蒜共存的方法制备液态黑蒜，该试验方案操作简单，且高温灭活蒜氨酸酶后加入嗜热链球菌的液态发酵黑蒜的各项理化指标均优于未添加嗜热链球菌的大蒜。综合分析文中较优条件T1、T3、T5、T7、T9、T11和T13，得到大蒜高温灭活蒜氨酸酶时间最优为9 min，加入嗜热链球菌比例最佳为5%，共存时间最优为32 h，80 ℃恒温恒湿发酵箱中发酵所需时间为15 d，各品质指标均达到黑蒜发酵标准，相比于未添加嗜热链球菌的液态黑蒜总酚含量是其2倍，总酸含量是其1.9倍，还原糖含量是其1.3倍，DPPH·清除率和·OH清除率分别是其1.5倍和1.46倍，在发酵时间和各物质含量测定值方面优于传统的固态黑蒜，得到的液态发酵黑蒜的各项指标更好，品质更佳。表明嗜热链球菌可促进黑蒜发酵，提升黑蒜品质指标，缩短发酵时间，具有较大应用前景。
本研究采用9 min和10 min两种灭酶时间，二者的本质区别是灭酶的程度不同，从研究结果来看，在相同的条件下，两种灭酶时间制备的液态发酵黑蒜的品质有所不同，经查阅文献，目前国内外尚无相关研究，所以下一步的研究重点是探讨不同的灭酶时间下发酵液态黑蒜品质不同的原因，为嗜热链球菌制备液态黑蒜提供更加扎实的理论依据。
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图 2 灭活10 min时嗜热链球菌比例对褐变程度的影响
Figure 2. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on browning degree after 10 minutes of inactivation
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图 3 灭活9 min时嗜热链球菌比例对还原糖含量的影响
Figure 3. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on reducing sugar content after 9 minutes of inactivation
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图 4 灭活10 min时嗜热链球菌比例对还原糖含量的影响
Figure 4. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on reducing sugar content after 10 minutes of inactivation
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图 5 灭活9 min时嗜热链球菌比例对总酸含量的影响
Figure 5. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on total acid after 9 minutes of inactivation
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图 6 灭活10 min时嗜热链球菌比例对总酸含量的影响
Figure 6. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on total acid after 10 minutes of inactivation
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图 7 灭活9 min时嗜热链球菌比例对氨基酸态氮的影响
Figure 7. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on amino acid nitrogen after 9 minutes of inactivation
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图 8 灭活10 min时嗜热链球菌比例对氨基酸态氮的影响
Figure 8. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on amino acid nitrogen after 10 minutes of inactivation
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图 9 灭活9 min时嗜热链球菌比例对总酚的影响
Figure 9. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on totalphenols after 9 minutes of inactivation
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图 10 灭活10 min时嗜热链球菌比例对总酚的影响
Figure 10. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on totalphenols after 10 minutes of inactivation
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图 11 灭活9 min时嗜热链球菌比例对DPPH·清除率的影响
Figure 11. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on DPPH· clearance rate after 9 minutes of inactivation
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图 12 灭活10 min时嗜热链球菌比例对DPPH·清除率的影响
Figure 12. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on DPPH· clearance rate after 10 minutes of inactivation
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图 13 灭活9 min时嗜热链球菌比例对·OH清除率的影响
Figure 13. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on ·OH clearance rate after 9 minutes of inactivation
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图 14 灭活10 min时嗜热链球菌比例对·OH清除率的影响
Figure 14. Effects of Streptococcus thermophilus ratio on ·OH clearance rate after 10 minutes of inactivation
表 1 热处理时间及共存时间对菌落总数菌落总数的影响
Table 1 Effect of heat treatment time and co-existence time on the total colony number of bacterial colonies
指标 蒜氨基酸酶灭活时间（min） 16（h） 24（h） 32（h） 8 9 10 8 9 10 8 9 10 菌落总数
（CFU/mL）无 （2.02±0.1）×
102 a（2.03±0.2）×
102 a（5.05±0.2）×
102 b（2.27±0.1）×
103 c（1.96±0.2）×
103 d（3.86±0.2）×
105 e（1.47±0.2）×
106 f（1.36±0.2）×
106 f注：表中字母代表显著差异性（P<0.05）。 
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