Preparation of Selenium-enriched Morchella Polysaccharide and Its Antitumor Activity in Vitro
-
摘要: 本研究旨在优化提取和纯化富硒羊肚菌多糖（Se-MPS），并评估其抗肿瘤活性及其机制。采用单因素和响应面优化法，对富硒羊肚菌粗多糖的提取工艺进行优化。通过柱层析法对粗多糖进行纯化，并对其化学组成进行分析。使用HepG2细胞进行CCK-8试验、集落形成试验、划痕试验和Transwell试验来评价Se-MPS的抗肿瘤活性。采用RT-qPCR法、Western blot法和免疫荧光法评价Se-MPS的潜在抗肿瘤机制。单因素和响应面试验结果显示，富硒羊肚菌粗多糖提取的最佳工艺参数为：提取时间2.5 h、液料比45:1（mL/g）、提取温度82 ℃，得率为7.95%。纯化后，Se-MPS的总糖含量达到95.86%，硒含量高达76.07±0.32 mg/g。此外，Se-MPS显著降低了HepG2细胞的集落形成效率、细胞迁移率和侵袭细胞数目（P<0.05）。同时，Se-MPS抑制了PI3K/Akt通路传导，下调了葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）的mRNA表达，并降低了细胞的葡萄糖摄取量。研究结果表明，通过对提取时间、液料比及提取温度的优化，可改善富硒羊肚菌粗多糖得率。此外，通过调控PI3K/Akt通路，富硒羊肚菌多糖可发挥出较强的抗肿瘤活性。这项研究为富硒羊肚菌多糖的抗肿瘤活性提供了证据，并为相关功能性食品的开发提供了参考。Abstract: This study aimed to optimize the extraction and purification processes for selenium-enriched Morchella esculenta (L.) Pers. (also known as Morchella) polysaccharides (Se-MPS) and to evaluate their anti-tumor activities and mechanisms. The extraction process was optimized using single-factor and response surface methodology. The crude polysaccharides were purified through column chromatography and their chemical composition was analyzed. The anti-tumor activity of Se-MPS was evaluated using HepG2 cells through a series of assays, including CCK-8, colony formation, scratching, and Transwell assays. The potential anti-tumor mechanisms of Se-MPS were assessed using RT-qPCR, Western blot, and immunofluorescence methods. Experimental results from single-factor and response surface methodology revealed that the optimal extraction conditions for selenium-enriched Morchella crude polysaccharides were: An extraction time of 2.5 h, a liquid-to-material ratio of 45:1 (mL/g), and an extraction temperature of 82 ℃, yielding a crude polysaccharides yield of 7.95%. After purification, the total sugar content of Se-MPS reached 95.86%, with a selenium concentration of 76.07±0.32 mg/g. Furthermore, Se-MPS significantly reduced colony formation efficiency, cell migration rate, and the number of invasive cells in HepG2 cells (P<0.05). Meanwhile, Se-MPS inhibited the PI3K/Akt signaling pathway, down-regulated mRNA expression of glucose transporter 2 (GLUT2), and reduced glucose uptake in cells. The results indicated that optimizing extraction time, liquid-to-material ratio, and extraction temperature could improve the yield of selenium-enriched Morchella crude polysaccharides. Additionally, Se-MPS exhibited strong anti-tumor activity by regulating the PI3K/Akt pathway. This study provides evidence of the anti-tumor activities of Se-MPS and offers insights for the development of related functional foods.
-
羊肚菌（Morchella esculenta（L.）Pers.）属于子囊菌亚门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科和羊肚菌属，以其独特的口感和良好的保健功效而闻名[1−3]。作为一种珍贵的食药两用蘑菇，其在全球范围内备受推崇。多项研究表明，羊肚菌的保健功效与其富含多种有益健康的成分有关，包括多糖、氨基酸、脂质、维生素、甾醇、有机酸等，这些成分已被广泛应用于植物药物和营养保健品的开发[4]。在这些活性成分中，羊肚菌多糖因具有良好的抗肿瘤、抗菌、增强免疫等多种作用而受到许多研究者的关注[2]，研究显示羊肚菌多糖能有效激活免疫系统，这提示其可能具有潜在的抗肿瘤活性[5]。羊肚菌的许多保健功效和生物活性都归功于其含有的多糖。因此，羊肚菌多糖具有重要的研究和经济价值。
据报道，多糖与某些微量元素结合可增强其生物活性，例如硒元素[6]。硒（Se）是人体必需的微量矿物质元素之一，对维持免疫系统健康和保护细胞免受氧化应激具有关键作用[7]。硒可增强免疫系统的功能，提高对病毒和细菌的抵抗力，从而降低感染风险[7]。此外，硒还可抑制氧化应激、减少细胞损伤[7]。研究显示，硒对某些癌症具有显著的抵抗效果，可抑制肿瘤细胞的增长和扩散，减少癌症的发病率[8]。硒以多种形式存在，如硒酸、亚硒酸盐或元素硒，它可在生物体内与多糖、多肽或蛋白质结合转化为有机硒[9]。硒与多糖的结合不仅可以优化二者作为营养补充剂的生理和保健功效，还可以降低硒和多糖在食品加工应用中的内在局限性，如低溶解度和低生物利用度[10]。然而，富硒羊肚菌多糖的生物活性的研究报道较少，特别是其抗肿瘤活性的研究鲜有报道，进一步研究富硒羊肚菌多糖的抗肿瘤活性有助于揭示其生物活性和潜在的健康益处。
本文在单因素实验的基础上采用响应面法优化了富硒羊肚菌粗多糖的提取工艺。此外，研究了柱层析法制备的纯化羊肚菌硒多糖（Se-MPS）的化学组成，并采用CCK-8试验、集落形成试验、划痕试验和Transwell试验评估了Se-MPS的抗肿瘤效果。同时，采用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光法初步探究了Se-MPS的潜在抗肿瘤机制。这些研究为富硒羊肚菌多糖的高效制备及其在功能性食品中的应用提供重要的科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
富硒羊肚菌子实体 湖北省恩施土家族苗族自治州来凤县，纯水洗净，烘干、粉碎后过80目筛存储；DEAE Sepharose FF琼脂糖凝胶 Pharmacia公司；3500 Da透析袋 上海高信化玻仪器有限公司；苯酚、浓硫酸、间羟基联苯 上海国药集团化学试剂有限公司；HepG2肝癌细胞 中国科学院上海细胞库；考马斯亮蓝G-250 上海源叶生物科技有限公司；牛血清白蛋白、胎牛血清、DMEM培养基 HyClone公司；0.1%结晶紫溶液 Sigma公司；葡萄糖氧化酶试剂盒 Applygen Technologies公司；一抗与二抗 Abcam公司；葡萄糖转运蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）mRNA表达正向引物AACTGCCCACAATCTCATACTCA和反向引物TGATTCTTCCAAGTGTGTCCCC 生工生物工程（上海）股份有限公司；TRIzol试剂、Servicebio®RT First Strand cDNA合成试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix、DAPI 武汉塞维尔有限公司。
UV-5100紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；RE-3000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LABCONCO冷冻干燥机 赛默飞世尔科技有限公司；CO-150二氧化碳培养箱 New Brunswick SCIENTIFIC公司；CKX41倒置显微镜 日本Olympus公司；MLS-3750灭菌锅 日本Sanyo公司；定量图像分析仪 上海天能科技有限公司；AMR-100酶标仪 杭州奥盛仪器有限公司；StepOne实时荧光定量PCR仪 Applied Biosystems公司。
1.2 实验方法
1.2.1 富硒羊肚菌粗多糖提取
将羊肚菌子实体在40 ℃条件下烘干4 h后粉碎过80目筛。将1.0 g羊肚菌粉按30:1（mL/g）液料比与去离子水混合并置于60 ℃恒温水浴中提取2.5 h，之后离心10 min（4000 r/min）收集上清液，重复提取两次。合并收集的上清液并用旋转蒸发仪浓缩，然后加入3倍体积的95%乙醇，4 ℃静置过夜。离心10 min后（4000×g），将沉淀冷冻干燥，得到粗多糖。
$$ \mathrm{粗}\mathrm{多}\mathrm{糖}\mathrm{得}\mathrm{率}(\text{%})=\frac{\mathrm{冻}\mathrm{干}\mathrm{粗}\mathrm{多}\mathrm{糖}\mathrm{重}\mathrm{量}(\mathrm{g})}{\mathrm{原}\mathrm{料}\mathrm{重}\mathrm{量}(\mathrm{g})}\times 100 $$ 1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 提取时间对粗多糖得率的影响
称取1.0 g干燥的富硒羊肚菌子实体粉末，固定液料比30:1（mL/g）、提取温度60 ℃，选取提取时间1.5、2、2.5、3、3.5 h，按照1.2.1提取流程进行实验，并称重以测定粗多糖的得率。
1.2.2.2 液料比对粗多糖得率的影响
称取1.0 g干燥的富硒羊肚菌子实体粉末，提取温度60 ℃，提取时间2.5 h，选取液料比20:1、30:1、40:1、50:1、60:1（mL/g），按照1.2.1提取流程进行实验，并称重以测定粗多糖的得率。
1.2.2.3 提取温度对粗多糖得率的影响
称取1.0 g干燥的富硒羊肚菌子实体粉末，提取时间2.5 h，液料比为30:1（mL/g），选取提取温度 50、60、70、80、90 ℃，按照1.2.1提取流程进行实验，并称重以测定粗多糖的得率。
1.2.3 响应面优化试验
在单因素实验结果的基础上，结合Box-Behnken试验设计原理，对提取时间（A）、液料比（B）、提取温度（C）按照三因素三水平进行编码，试验设计中的水平及编码见表1。最后以粗多糖得率为响应值，利用软件 Design Expert 8对试验数据进行分析。
表 1 响应面试验因素与水平Table 1. Experimental factors and levels of response surface test水平 因素 A提取时间（h） B液料比（mL/g） C提取温度（℃） −1 2.0 30:1 70 0 2.5 40:1 80 1 3.0 50:1 90 1.2.4 富硒羊肚菌粗多糖纯化
采用Qian等[4]的方法纯化富硒羊肚菌多糖。将粗多糖（40 mg/mL）溶于0.02 mol/L磷酸盐缓冲液中并经0.45 μm滤膜过滤，然后经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱（2.6 cm×50 cm）洗脱。洗脱液为0.5 mol/L NaCl溶液，流速为1 mL/min，同时用苯酚-硫酸法监测洗脱过程。收集洗脱液，用截留10 kDa的透析袋透析36 h，冷冻干燥得到纯化多糖Se-MPS。
$$ \mathrm{纯}\mathrm{化}\mathrm{多}\mathrm{糖}\mathrm{得}\mathrm{率}(\text{%})=\frac{\mathrm{冻}\mathrm{干}\mathrm{纯}\mathrm{化}\mathrm{多}\mathrm{糖}\mathrm{重}\mathrm{量}(\mathrm{g})}{\mathrm{上}\mathrm{样}\mathrm{重}\mathrm{量}(\mathrm{g})}\times 100 $$ 1.2.5 纯化Se-MPS的化学组成分析
参照国家标准GB 5009.93-2010，采用原子荧光光谱法测定硒含量。
采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[11]：取6支25 mL刻度试管，配制20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖溶液并各取2 mL，按顺序向试管内加入1.0 mL 90 g/L苯酚溶液并混匀，之后在5~20 s内加入5 mL浓硫酸并在室温下反应30 min。以空白为参比，在波长485 nm处测定混合反应液吸光度值。以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。将配制好的多糖溶液按照同样方法测定吸光度值，代入标准曲线计算总糖含量。
采用间羟基苯基法测定糖醛酸含量[4]：配制10、20、40、60、80、100 μg/mL的半乳糖醛酸标准品溶液。取1.0 mL并与5.0 mL四硼酸钠-硫酸溶液（0.478 g四硼酸钠溶于100 mL浓硫酸）混合后沸水浴5 min，之后采用冰水浴降至室温。向体系中加入100 μL间羟基联苯混匀并静置5 min，之后于520 nm处测定吸光度值。以糖醛酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。将配制好的多糖溶液按照相同方法测定吸光度值，代入标准曲线计算糖醛酸含量。
采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[12]：配制10、20、40、60、80、100 mg/L蛋白质标准溶液，各取20 μL分别加入到 96孔板中，向其中加入200 μL 1×G250 溶液并于室温孵育3~5 min，之后于595 nm波长下测定各孔的吸光值。以蛋白质标准溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将配制好的多糖溶液按照相同方法测定吸光度值，代入标准曲线计算蛋白质含量。
1.2.6 纯化Se-MPS的抗肿瘤活性
1.2.6.1 细胞培养
HepG2细胞在37 ℃，5% CO2和95%湿度的环境中培养，并在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素双抗混合液的DMEM培养基中孵育处理。
1.2.6.2 细胞活力评价
收集处于对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，以每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，加入不同浓度的样品（0、25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL）100 μL。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于37 ℃恒温培养箱中反应1 h后取出，置于酶标仪中于450 nm处测定吸光度值。
1.2.6.3 细胞集落形成试验评价HepG2细胞增殖能力
将实验分为四组，依次为对照组（无任何样品添加）、低剂量Se-MPS组（200 μg/mL）、中剂量Se-MPS组（400 μg/mL）、高剂量Se-MPS组（800 μg/mL）。将各组细胞以104个/mL密度接种于6孔板中，每孔细胞数为200。每3 d更换一次DMEM培养基，连续培养2周后终止培养。向每孔加入500 μL 14%多聚甲醛，洗涤细胞三次并于室温固定30 min。随后，采用500 μL 0.1%结晶紫溶液洗涤细胞并染色，然后在室温下孵育15 min。染色后，用双蒸水洗涤细胞，计算形成的克隆细胞的数目。按下列公式计算细胞克隆形成效率：
$$ \mathrm{克}\mathrm{隆}\mathrm{形}\mathrm{成}\mathrm{效}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{克}\mathrm{隆}\mathrm{数}\mathrm{平}\mathrm{均}\mathrm{值}}{\mathrm{铺}\mathrm{板}\mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{总}\mathrm{数} }$$ 1.2.6.4 细胞划痕试验评价HepG2细胞的迁移能力
收集对数生长期的细胞并接种于6孔板中，每孔保持约5×104个细胞。细胞完全覆盖后，沿中线刮去约2 mm的划痕。然后洗涤细胞3次，对照组加入不含胎牛血清的DMEM培养基，低、中、高剂量多糖组分别加入含200、400、800 μg/mL Se-MPS的无胎牛血清DMEM培养基。培养36 h后，通过Image J软件计算细胞迁移率。
$$ 细胞迁移率({\text{%}})=\frac{0\;\mathrm{h}\mathrm{划}\mathrm{痕}\mathrm{宽}\mathrm{度}-36\;{\rm h}\mathrm{划}\mathrm{痕}\mathrm{宽}\mathrm{度}}{0\;\mathrm{h}\mathrm{划}\mathrm{痕}\mathrm{宽}\mathrm{度}}\times 100 $$ 1.2.6.5 Transwell试验评价HepG2细胞的侵袭能力
收集对数生长期的细胞并在Transwell室中测定细胞侵袭力。将对照组细胞接种于不含胎牛血清的DMEM培养基中（105个/mL），而低、中、高剂量多糖组分别接种于含200、400、800 μg/mL Se-MPS的无胎牛血清DMEM培养基中（105个/mL），所有组细胞均接种于上室，下室覆盖DMEM完全培养基。在37 ℃温育24 h后，除去残留在膜上表面的细胞，并用无水甲醇固定30 min。细胞膜用0.5%结晶紫染色，并于显微镜下计数浸润细胞数，每孔随机选择5个视野进行拍照并进行细胞计数。在侵入测定过程中，上室用Matrigel预涂。
1.2.6.6 葡萄糖消耗量测定
依据朱将雄[11]之前报道的方法对细胞进行处理，略有改动。将细胞（105个/mL）接种于含DMEM培养基的96孔板中并培养24 h。实验分为四组：对照组（无样品添加），低、中、高剂量Se-MPS组（分别为200、400、800 μg/mL）。之后，低、中、高剂量组分别用相应浓度的Se-MPS处理36 h，而模型组用生理盐水替代。孵育结束后，收集无细胞上清液并使用GOD-POD法测定葡萄糖含量。之后，根据初始和最终细胞培养上清液中的葡萄糖含量之差计算葡萄糖消耗量。
1.2.6.7 GLUT2基因表达测定
收集对数生长期的细胞并依据1.2.6.6中的步骤对细胞进行分组及样品处理，之后使用TRIzol试剂提取细胞的总RNA。采用Servicebio®RT First Strand cDNA合成试剂盒将RNA反转录成cDNA，逆转录程序设置为25 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 s。随后使用2×SYBR Green qPCR Master Mix检测GLUT2基因的表达水平，实时定量PCR的扩增条件设置为95 ℃预变性10 min，然后以95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s实施30个循环，并在72 ℃下延伸30 s。以GAPDH基因为内参基因，采用2−ΔΔCt法计算GLUT2基因的相对mRNA表达水平。
1.2.6.8 Western blot法评价PI3K p85、p-Akt及Akt蛋白表达
收集对数生长期的细胞并依据1.2.6.6中的步骤对细胞进行分组及样品处理。之后，收集细胞并用RIPA裂解缓冲液裂解。收集的蛋白通过SDS-PAGE电泳初步分离并转移到PVD膜上，并用5%的脱脂牛奶封闭1 h。弃去剩余液体后，将膜与稀释的一抗（1:500~1:1000）在4 ℃下孵育过夜，使用的一抗包括ati-PI3K p85、anti-pAkt及anti-Akt。清洗3次后，将其与相应的二抗（HRP标记山羊抗大鼠IgG）在室温下孵育30 min，并使用ECL显色溶液进行显色。使用定量图像分析仪测定蛋白质条带的密度，并将β-肌动蛋白（β-actin）作为内参蛋白[10]。
1.2.6.9 免疫荧光法评价PI3K p85和pAkt蛋白表达
收集对数生长期的细胞并依据1.2.6.6中的步骤对细胞进行分组及样品处理。采用0.1 mol/L PBS溶解的含4%多聚甲醛的混合液预混合细胞1 h。冲洗后，采用1% Triton X-100在室温下渗透细胞（20 min）。清洗细胞3次，之后采用10%血清封闭细胞1 h，并与相应的一抗混合孵育过夜（4 ℃）。之后，洗涤细胞并用相应的荧光标记二抗孵育。滴加DAPI避光孵育5 min后清洗4次。封片后，在荧光显微镜下观察结果。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次，利用软件 Design Expert 8对响应面试验数据进行分析。所有统计分析均由GraphPad Prism 9.0完成，P<0.05被视为具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
如图1A所示，随着提取时间从1.5 h延长到2.5 h，粗多糖的得率显著升高（P<0.05），并在2.5 h时达到最大值6.41%，继续延长提取时间并未使得粗多糖得率有所提升。过长的提取时间易使得非多糖类水溶性成分溶出从而导致与多糖竞争而降低得率，因此选定2.5 h为最佳提取时间进行后续响应面优化试验。在液料比为20:1~40:1（mL/g）之间（图1B），随着液料比的增加，粗多糖的得率显著提高（P<0.05），这可能是因为在较低液料比时，溶液量较少限制了多糖的溶出。然而，当液料比超过40:1（mL/g）时，粗多糖得率变化不再显著（P>0.05）。考虑到增加液料比会在过滤和浓缩等后续步骤中增加多糖的损失，选择液料比为40:1（mL/g）为最佳结果进行后续的响应面优化试验。在提取温度为50~80 ℃的范围内（图1C），随着温度的升高，粗多糖的得率明显增加。当提取温度超过80 ℃后，粗多糖得率的变化趋于平缓且无显著性差异（P>0.05），此时多糖的溶出已达到饱和。长时间的过高温度提取可能会破坏多糖的结构，因此选择80 ℃为最佳提取温度进行后续的响应面优化试验。
![]()
图 1 提取时间（A）、液料比（B）和提取温度（C）对富硒羊肚菌粗多糖得率的影响注：不同字母表示组间具有显著差异（P<0.05）。Figure 1. Effects of extraction time (A), liquid-to-material ratio (B), and extraction temperature (C) on the yield of selenium-enriched Morchella crude polysaccharides2.2 响应面优化试验
在热水浸提富硒羊肚菌多糖的过程中，以粗多糖得率（Y）作为响应值，提取时间（A）、液料比（B）、提取温度（C）为影响因素设计试验，结果见表2。将表2数据进行二次回归分析，拟合回归方程为Y=2.48+2.98A+0.57B+0.05C+0.35AB+3.15AC+0.27BC‒3.28A2‒0.90B2‒9.5C2。
表 2 响应面试验设计Table 2. Design of response surface test试验号 A提取时间 B液料比 C提取温度 得率（%） 1 ‒1 ‒1 0 5.69 2 1 ‒1 0 6.8 3 ‒1 1 0 5.44 4 1 1 0 7.74 5 ‒1 0 ‒1 5.65 6 1 0 ‒1 4.61 7 ‒1 0 1 4.37 8 1 0 1 6.88 9 0 ‒1 ‒1 5.77 10 0 1 ‒1 5.98 11 0 ‒1 1 5.1 12 0 1 1 6.34 13 0 0 0 7.98 14 0 0 0 7.65 15 0 0 0 7.92 16 0 0 0 7.44 17 0 0 0 7.82 借助 Design-Expert 8.0 软件，对响应面试验结果进行了详细分析。通过对表2中的数据进行回归拟合和方差分析，具体结果整理于表3中。如表3所示，模型的差异极显著（P<0.01）而失拟项不显著（P>0.05），这表明模型的拟合效果良好且试验设计可靠。多元相关系数R2为0.9593，显示模型与实际实验数据之间的拟合度良好。同时，模型校正系数R2Adj为0.9069，表明模型能够准确地分析和预测富硒羊肚菌粗多糖得率。此外，从表3的F值可知影响粗多糖得率的主要因素为提取时间>液料比>提取温度。响应面和等高线图（见图2）展示了两个变量之间的交互作用。图2B和2E揭示了提取时间和提取温度之间的最为显著的相互作用，其次是提取时间和液料比的关系（图2A和2D），而液料比与提取温度之间的交互作用则相对较弱（图2C和2F）。
表 3 响应面回归模型方差分析Table 3. Variance analysis for response surface regression models方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 22.28 9 2.48 18.32 0.0005 ** A 2.98 1 2.98 22.03 0.0022 ** B 0.57 1 0.57 4.24 0.0786 ns C 0.06 1 0.06 0.43 0.5340 ns AB 0.35 1 0.35 2.62 0.1496 ns AC 3.15 1 3.15 23.31 0.0019 ** BC 0.27 1 0.27 1.96 0.2040 ns A2 3.28 1 3.28 24.25 0.0017 ** B2 0.90 1 0.90 6.66 0.0365 * C2 9.50 1 9.50 70.31 0.0001 ** 残差 0.95 7 0.14 失拟项 0.75 3 0.25 5.23 0.0719 ns 误差 0.19 4 0.05 总离差 23.22 16 注：*差异显著（0.01<P<0.05）；**差异极显著（P<0.01）；ns代表无显著性差异。 ![]()
图 2 提取时间、液料比和提取温度对富硒羊肚菌粗多糖得率影响的响应面图和等高线图Figure 2. Response surface and contour plots of the effect of extraction time, liquid-to-material ratio and extraction temperature on the yield of selenium-enriched Morchella crude polysaccharides根据回归模型的确定，得出了富硒羊肚菌粗多糖的最优提取工艺参数为提取时间2.74 h、液料比45.48:1（mL/g）、提取温度82.75 ℃，此时预测得率为 8.00%。结合实际操作，将提取时间调整至2.5 h，液料比为45:1（mL/g），提取温度为82 ℃，此时预测得率为7.98%。通过验证实验（n=3），实际得率为7.95%±0.18%，从而验证了模型的可靠性。
2.3 纯化Se-MPS的化学组成分析
由表4可知，富硒羊肚菌子实体的硒含量为0.48 mg/kg，其硒含量符合国家行业标准中的判定值0.10~5.00 mg/kg（GH/T 1135-2017富硒农产品）。纯化后的Se-MPS得率为9.98%±0.22%，与吴孔阳等[13]报道的利用类似的方法纯化羊肚菌多糖所得到的得率接近。此外，Se-MPS中的硒含量76.07±0.32 mg/kg，显著高于富硒羊肚菌子实体和粗多糖中的硒含量（分别为0.48±0.02和12.34±0.09 mg/kg，P<0.05），这表明经过纯化后的Se-MPS中的硒含量显著富集，与多糖相结合可能是富硒羊肚菌中硒的主要存在形式[6]。Se-MPS中的总糖含量为95.86%±0.22%，与纯化前的总糖含量相比（68.49%±0.18%），纯化后的总糖含量显著提高（P<0.05）。同时，在粗多糖和纯化后的多糖中均检测到少量糖醛酸的存在，这表明制备的Se-MPS可能是一种酸性多糖[14]。然而，经过纯化后的Se-MPS中仍含有少量的蛋白质，推测这些成分可能为与硒多糖结合的结合组分[15]。
表 4 富硒羊肚菌子实体、粗多糖、纯化多糖的化学组成Table 4. Chemical composition of selenium-enriched Morchella fruiting bodies, crude polysaccharides and purified polysaccharides样品 硒（mg/kg） 总糖（%） 蛋白质（%） 糖醛酸（%） 得率（%） 富硒羊肚菌子实体 0.48±0.02c 9.83±0.47c 24.34±0.35a 0.02±0.00c − 粗多糖 12.34±0.09b 68.49±0.18b 11.36±0.27b 0.17±0.01b 7.95±0.18b 纯化Se-MPS 76.07±0.32a 95.86±0.22a 0.32±0.02c 0.37±0.01a 9.98±0.22a 注：同列不同字母表示具有显著差异（0.01<P<0.05）。 2.4 富硒羊肚菌多糖纯化组分的抗肿瘤活性
2.4.1 富硒羊肚菌多糖抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭
细胞活力实验（图3A）表明纯化Se-MPS浓度在25~800 μg/mL 范围内对细胞增殖均具有抑制作用，且在800 μg/mL时抑制效果最佳。如图3B所示，纯化Se-MPS的低、中、高剂量组的集落形成效率显著低于对照组（P<0.05），且其作用效果也呈剂量依赖性。这一结果表明富硒羊肚菌纯化多糖可有效诱导HepG2细胞发生凋亡。同样地，在图3C和图3D中也可观察到，不同剂量下的纯化多糖剂量依赖性地抑制了HepG2细胞的迁移和侵袭。研究证实，富硒平菇多糖可降低人肺癌细胞系A549、人卵巢癌细胞系SKOV3、人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞活力，诱导细胞凋亡并抑制A549细胞的转移[16]。此外，硒与多糖的复合能够显著增强多糖的抗肿瘤效应[6]。以富硒灵芝菌丝体所得的含硒多糖（SeGLP-2B-1）为例，其抑制六种人类癌细胞系增殖的效果较一般多糖 GLP-2B-1 高出10倍[17]。本文的结果表明Se-MPS可呈剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，表明硒元素与羊肚菌多糖的结合可发挥潜在的抗肿瘤功效，也进一步验证了富硒可食用菌活性多糖在抗肿瘤活性方面的显著效应。
![]()
图 3 不同浓度Se-MPS处理后HepG2细胞的细胞存活率（A）、集落形成（B）、细胞迁移（C）和细胞侵袭（D）情况注：*表示具有显著差异（0.01<P<0.05），**、***、****均表示具有极显著差异但程度不同（0.001<P<0.01，0.0001<P<0.001，P<0.0001），ns表示无显著性差异；图4~图6同。Figure 3. Cell survival rate (A), colony formation (B), cell migration (C), and cell invasion (D) of HepG2 cells after treatment with different concentrations of Se-MPS2.4.2 富硒羊肚菌多糖抑制肝癌细胞的糖消耗及GLUT2基因表达
葡萄糖代谢在癌症的发生和发展中发挥着关键作用，而细胞膜上的葡萄糖转运体（GLUT）介导的葡萄糖运输是癌细胞获取葡萄糖的主要机制之一[18]。如图4A所示，Se-MPS以剂量依赖的方式抑制了HepG2细胞对葡萄糖的摄取。进一步的研究显示Se-MPS显著抑制了HepG2细胞中GLUT2基因的表达（P<0.05）（图4B）。GLUT2是肝细胞膜上的跨膜载体蛋白，同时也是肝细胞中最丰富的葡萄糖转运蛋白，负责将血液中的葡萄糖跨越质膜转运到肝细胞内[19]。其表达是葡萄糖敏感基因的生理控制所必需，在肝脏中的失活会导致肝脏中的葡萄糖代谢紊乱，肝细胞摄取葡萄糖受损。之前的研究明确了早期的葡萄糖代谢抑制与后续的癌细胞增殖抑制之间存在紧密的联系，这表明阻断癌细胞的葡萄糖代谢可能是一种潜在的抗癌策略[18]。据报道，下调GLUT2的蛋白表达可减少胰腺肿瘤细胞的葡萄糖摄取，从而减少肿瘤细胞的增殖和运动[20]。这些研究表明，抑制GLUT2表达可减少肿瘤细胞的葡萄糖摄取，从而降低肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭。结合当前的研究结果，推测Se-MPS抑制HepG2细胞的恶性增殖、迁移和侵袭可能与抑制GLUT2基因的表达有关。
![]()
图 4 不同浓度Se-MPS处理对细胞葡萄糖消耗量（A）和细胞内GLUT2 mRNA表达水平（B）的影响Figure 4. Effect of different concentrations of Se-MPS treatment on cellular glucose consumption (A) and intracellular GLUT2 mRNA expression levels (B)2.4.3 富硒羊肚菌多糖抑制肝癌细胞中PI3K/Akt通路表达
为了深入探究Se-MPS对GLUT2基因表达的调控机制，采用了Western blot法和免疫荧光法来检测PI3K p85和pAkt的表达情况，相关结果见图5和图6。与对照组相比，观察到Se-MPS可显著抑制PI3K p85和pAkt的表达（P<0.05）。癌症的肿瘤发生过程通常涉及PI3K/Akt信号传导，该通路的激活可阻止细胞凋亡并促进肿瘤细胞的细胞周期进展[21]。据报道，PI3K/Akt信号通路对于肝癌细胞的增殖、侵袭以及抑制细胞凋亡均具有促进作用，抑制PI3K/Akt信号传导可抑制肝癌细胞的侵袭性行为[22]。同时，PI3K/Akt信号传导与肝癌细胞的葡萄糖吸收密切相关，进而影响了肝癌细胞的增殖[22]。PI3K/Akt通路的激活可上调GLUT2的表达，从而增强肝癌细胞的血管生成、转移和侵袭[23]。研究显示二氢青蒿素可通过下调非小细胞肺腺癌细胞中PI3K/Akt通路表达来抑制GLUT2的表达，以此来抑制细胞活力和克隆形成能力并诱导细胞凋亡，同时降低细胞对葡萄糖的摄取，具有时间和剂量依赖效应[24]。因此，Se-MPS可能通过调控PI3K/Akt通路，抑制肿瘤细胞中的GLUT2表达以调节肿瘤细胞的葡萄糖摄取，从而调控肝癌细胞的恶性增殖和侵袭。
![]()
图 5 Western blot实验评价Se-MPS对HepG2细胞中PI3K p85、pAkt和Akt蛋白表达的影响注：PI3K p85：磷脂酰肌醇激酶；pAkt：磷酸化蛋白激酶B；Akt：蛋白激酶B；图6同。Figure 5. Western blot assay to evaluate the effect of Se-MPS on the expression of PI3K p85, pAkt and Akt proteins in HepG2 cells![]()
图 6 免疫荧光实验评价Se-MPS对HepG2细胞中PI3K p85和pAkt蛋白表达的影响Figure 6. Immunofluorescence assay to evaluate the effect of Se-MPS on the expression of PI3K p85 and pAkt proteins in HepG2 cells3. 结论
本研究通过单因素和响应面试验，成功优化了富硒羊肚菌粗多糖的提取工艺，最佳工艺参数为：提取时间2.5 h、液料比45:1（mL/g）、提取温度82 ℃，其粗多糖得率可达7.95%。纯化后的富硒羊肚菌多糖表现出显著的抗肿瘤活性，通过调控PI3K/Akt通路，下调GLUT2基因表达，进而降低了细胞的葡萄糖摄取量，可显著降低HepG2细胞的集落形成效率、细胞迁移率和侵袭细胞数目（P<0.05）。综上所述，富硒羊肚菌多糖具有显著的抗肿瘤功效，有望成为一种天然的功能性食品，用于肿瘤的预防和干预。未来的研究应继续深入探讨富硒羊肚菌多糖的抗肿瘤机制，以为其在食疗中的应用提供更为科学的依据。
-
![]()
图 1 提取时间（A）、液料比（B）和提取温度（C）对富硒羊肚菌粗多糖得率的影响
注：不同字母表示组间具有显著差异（P<0.05）。
Figure 1. Effects of extraction time (A), liquid-to-material ratio (B), and extraction temperature (C) on the yield of selenium-enriched Morchella crude polysaccharides
![]()
图 2 提取时间、液料比和提取温度对富硒羊肚菌粗多糖得率影响的响应面图和等高线图
Figure 2. Response surface and contour plots of the effect of extraction time, liquid-to-material ratio and extraction temperature on the yield of selenium-enriched Morchella crude polysaccharides
![]()
图 3 不同浓度Se-MPS处理后HepG2细胞的细胞存活率（A）、集落形成（B）、细胞迁移（C）和细胞侵袭（D）情况
注：*表示具有显著差异（0.01<P<0.05），**、***、****均表示具有极显著差异但程度不同（0.001<P<0.01，0.0001<P<0.001，P<0.0001），ns表示无显著性差异；图4~图6同。
Figure 3. Cell survival rate (A), colony formation (B), cell migration (C), and cell invasion (D) of HepG2 cells after treatment with different concentrations of Se-MPS
![]()
图 4 不同浓度Se-MPS处理对细胞葡萄糖消耗量（A）和细胞内GLUT2 mRNA表达水平（B）的影响
Figure 4. Effect of different concentrations of Se-MPS treatment on cellular glucose consumption (A) and intracellular GLUT2 mRNA expression levels (B)
![]()
图 5 Western blot实验评价Se-MPS对HepG2细胞中PI3K p85、pAkt和Akt蛋白表达的影响
注：PI3K p85：磷脂酰肌醇激酶；pAkt：磷酸化蛋白激酶B；Akt：蛋白激酶B；图6同。
Figure 5. Western blot assay to evaluate the effect of Se-MPS on the expression of PI3K p85, pAkt and Akt proteins in HepG2 cells
![]()
图 6 免疫荧光实验评价Se-MPS对HepG2细胞中PI3K p85和pAkt蛋白表达的影响
Figure 6. Immunofluorescence assay to evaluate the effect of Se-MPS on the expression of PI3K p85 and pAkt proteins in HepG2 cells
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Experimental factors and levels of response surface test
水平 因素 A提取时间（h） B液料比（mL/g） C提取温度（℃） −1 2.0 30:1 70 0 2.5 40:1 80 1 3.0 50:1 90 
下载: 导出CSV
表 2 响应面试验设计
Table 2 Design of response surface test
试验号 A提取时间 B液料比 C提取温度 得率（%） 1 ‒1 ‒1 0 5.69 2 1 ‒1 0 6.8 3 ‒1 1 0 5.44 4 1 1 0 7.74 5 ‒1 0 ‒1 5.65 6 1 0 ‒1 4.61 7 ‒1 0 1 4.37 8 1 0 1 6.88 9 0 ‒1 ‒1 5.77 10 0 1 ‒1 5.98 11 0 ‒1 1 5.1 12 0 1 1 6.34 13 0 0 0 7.98 14 0 0 0 7.65 15 0 0 0 7.92 16 0 0 0 7.44 17 0 0 0 7.82
下载: 导出CSV
表 3 响应面回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis for response surface regression models
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 22.28 9 2.48 18.32 0.0005 ** A 2.98 1 2.98 22.03 0.0022 ** B 0.57 1 0.57 4.24 0.0786 ns C 0.06 1 0.06 0.43 0.5340 ns AB 0.35 1 0.35 2.62 0.1496 ns AC 3.15 1 3.15 23.31 0.0019 ** BC 0.27 1 0.27 1.96 0.2040 ns A2 3.28 1 3.28 24.25 0.0017 ** B2 0.90 1 0.90 6.66 0.0365 * C2 9.50 1 9.50 70.31 0.0001 ** 残差 0.95 7 0.14 失拟项 0.75 3 0.25 5.23 0.0719 ns 误差 0.19 4 0.05 总离差 23.22 16 注：*差异显著（0.01<P<0.05）；**差异极显著（P<0.01）；ns代表无显著性差异。
下载: 导出CSV
表 4 富硒羊肚菌子实体、粗多糖、纯化多糖的化学组成
Table 4 Chemical composition of selenium-enriched Morchella fruiting bodies, crude polysaccharides and purified polysaccharides
样品 硒（mg/kg） 总糖（%） 蛋白质（%） 糖醛酸（%） 得率（%） 富硒羊肚菌子实体 0.48±0.02c 9.83±0.47c 24.34±0.35a 0.02±0.00c − 粗多糖 12.34±0.09b 68.49±0.18b 11.36±0.27b 0.17±0.01b 7.95±0.18b 纯化Se-MPS 76.07±0.32a 95.86±0.22a 0.32±0.02c 0.37±0.01a 9.98±0.22a 注：同列不同字母表示具有显著差异（0.01<P<0.05）。
下载: 导出CSV
-
[1] SUN Y, HE H, WANG Q, et al. A review of development and utilization for edible fungal polysaccharides:Extraction, chemical characteristics, and bioactivities[J]. Polymers,2022,14(20):4454. doi: 10.3390/polym14204454
[2] TIETEL Z, MASAPHY S. True morels (Morchella)-nutritional and phytochemical composition, health benefits and flavor:A review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2018,58(11):1888−1901. doi: 10.1080/10408398.2017.1285269
[3] 林晓民, 李振岐, 侯军, 等. 中国菌物[M]. 北京:中国农业出版社, 2007. [LIN X M, LI Z Q, HOU J, et al. Chinese mycology[M]. Beijing:China Agriculture Press, 2007.] LIN X M, LI Z Q, HOU J, et al. Chinese mycology[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2007.
[4] QIAN L J, DU M X, YANG X Y, et al. Microanalysis characterization and immunomodulatory effect for selenium-enriched polysaccharide from Morchella esculenta (L.) Pers[J]. Molecules,2023,28(7):2885. doi: 10.3390/molecules28072885
[5] HUO W, QI P, CUI L, et al. Polysaccharide from wild morels alters the spatial structure of gut microbiota and the production of short-chain fatty acids in mice[J]. Bioscience of Microbiota, Food and Health,2020,39(4):219−226. doi: 10.12938/bmfh.2020-018
[6] CHENG L, WANG Y, HE X, et al. Preparation, structural characterization and bioactivities of Se-containing polysaccharide:A review[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2018,120:82−92. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.07.106
[7] ZHU J X, CHEN Z Y, CHEN L, et al. Comparison and structural characterization of polysaccharides from natural and artificial se-enriched green tea[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,130:388−398. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.02.102
[8] ZHANG, S J, SONG Z T, SHI L J, et al. A dandelion polysaccharide and its selenium nanoparticles:Structure features and evaluation of anti-tumor activity in zebrafish models[J]. Carbohydrate Polymers,2021,270:118365. doi: 10.1016/j.carbpol.2021.118365
[9] ZHU J X, DU M K, WU M R, et al. Preparation, physicochemical characterization and identification of two novel mixed ace-inhibiting peptides from two distinct tea alkali-soluble protein[J]. European Food Research and Technology,2020,246(7):1483−1494. doi: 10.1007/s00217-020-03505-z
[10] ZHU J X, YU C, HAN Z, et al. Comparative analysis of existence form for selenium and structural characteristics in artificial selenium-enriched and synthetic selenized green tea polysaccharides[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2020,154:1408−1418. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.11.022
[11] 朱将雄. 不同中国黑茶降血糖活性比较及其降血糖机理探究[D]. 上海:上海师范大学, 2020. [ZHU J X. Comparison of hypoglycemic activities of different Chinese dark teas and exploration of hypoglycemic mechanisms[D]. Shanghai:Shanghai Normal University, 2020.] ZHU J X. Comparison of hypoglycemic activities of different Chinese dark teas and exploration of hypoglycemic mechanisms[D]. Shanghai: Shanghai Normal University, 2020.
[12] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry,1976,72:248−254. doi: 10.1016/0003-2697(76)90527-3
[13] 吴孔阳, 原瑞材, 杨同香, 等. 响应面法优化羊肚菌多糖提取工艺研究[J]. 洛阳师范学院学报,2021,40(2):19−23. [WU K Y, YUAN R C, YANG T X, et al. Optimization of extraction technology of Morchella esculenta polysaccharides by response surface methodology[J]. Journal of Luoyang Normal University,2021,40(2):19−23.] doi: 10.3969/j.issn.1009-4970.2021.02.006 WU K Y, YUAN R C, YANG T X, et al. Optimization of extraction technology of Morchella esculenta polysaccharides by response surface methodology[J]. Journal of Luoyang Normal University, 2021, 40（2）: 19−23. doi: 10.3969/j.issn.1009-4970.2021.02.006
[14] WANG Q, YANG X Y, ZHU C W, et al. Valorization of polysaccharides from Benincasa hispida:Physicochemical, moisturizing, and antioxidant skincare properties[J]. Frontiers in Pharmacology,2022,13:912382. doi: 10.3389/fphar.2022.912382
[15] ZHU J X, ZHOU H, ZHANG J Y, et al. Valorization of polysaccharides obtained from dark tea:Preparation, physicochemical, antioxidant, and hypoglycemic properties[J]. Foods,2021,10(10):2276. doi: 10.3390/foods10102276
[16] ZHANG Z M, ZHANG Y S, LIU H, et al. A water-soluble selenium-enriched polysaccharide produced by Pleurotus ostreatus:Purification, characterization, antioxidant and antitumor activities in vitro[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2021,168:356−370. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.12.070
[17] SHANG D J, ZHANG J N, WEN L, et al. Preparation, characterization, and antiproliferative activities of the Se-containing polysaccharide SeGLP-2B-1 from Se-enriched Ganoderma lucidum[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(17):7737−7742. doi: 10.1021/jf9019344
[18] GHEZZI C, PEREZ S, RYAN K, et al. Early reduction of glucose consumption is a biomarker of kinase inhibitor efficacy which can be reversed with glut1 overexpression in lung cancer cells[J]. Molecular Imaging and Biology,2023,25(3):541−553. doi: 10.1007/s11307-022-01782-6
[19] LIN S T, TU S H, YANG P S, et al. Apple polyphenol phloretin inhibits colorectal cancer cell growth via inhibition of the type 2 glucose transporter and activation of p53-mediated signaling[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(36):6826−6837. doi: 10.1021/acs.jafc.6b02861
[20] WANG F, QI X M, WERTZ R, et al. p38γ MAPK is essential for aerobic glycolysis and pancreatic tumorigenesis[J]. Cancer Research,2020,80(16):3251−3264. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-19-3281
[21] WANG W L, SHEN C, ZHAO Y Z, et al. Identification and validation of potential novel biomarkers to predict distant metastasis in differentiated thyroid cancer[J]. Annals of Translational Medicine,2021,9(13):1053. doi: 10.21037/atm-21-383
[22] PASKEH M D A, GHADYANI F, HASHEMI M, et al. Biological impact and therapeutic perspective of targeting PI3K/Akt signaling in hepatocellular carcinoma:Promises and challenges[J]. Pharmacological Research,2023,187:106553. doi: 10.1016/j.phrs.2022.106553
[23] UMAPATHY D, KARTHIKEYAN M C, PONNUCHAMY K, et al. The absence of cellular glucose triggers oncogene AEG-1 that instigates VEGFC in HCC:A possible genetic root cause of angiogenesis[J]. Gene,2022,826:146446. doi: 10.1016/j.gene.2022.146446
[24] 闵发胜, 杨建洪, 黄建军, 等. DHA通过抑制PI3K通路和GLUT2表达而诱导NSCLC细胞毒性[J]. 中国病理生理杂志,2015,31(11):1961−1969. [MIN F S, YANG J H, HUANG J J, et al. DHA induced cytotoxicity in NSCLC cells via inhibiting PI3K pathway activation and GLUT2 expression[J]. Chinese Journal of Pathophysiology,2015,31(11):1961−1969.] MIN F S, YANG J H, HUANG J J, et al. DHA induced cytotoxicity in NSCLC cells via inhibiting PI3K pathway activation and GLUT2 expression[J]. Chinese Journal of Pathophysiology, 2015, 31（11）: 1961−1969.
下载:
计量
- 文章访问数: 0
- HTML全文浏览量: 0
- PDF下载量: 0
