Formulation Optimization and Storage Characteristics of Huangcai Instant Meatballs
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摘要: 为获得黄菜即食肉丸最优配方并对其贮藏特性进行研究，以感官评分为考察指标，利用Plackett-Burman试验筛选出了对黄菜即食肉丸感官评分影响显著的3个因素，并通过最陡爬坡试验和Box-Behnken试验，优化了黄菜即食肉丸配方；对比了黄菜即食肉丸与普通肉丸以及两种不同包装下（玻璃瓶、脱氧剂＋PET易拉罐封装）黄菜即食肉丸37 ℃贮藏过程中色差、质构、菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、过氧化值、硫代巴比妥酸值等指标的变化。结果表明：黄菜即食肉丸最佳配方为肉:黄菜比为1:1、鸡蛋添加量9%、食盐添加量0.9%。在该配方下制得的黄菜肉丸清香柔和，富有弹性，形状饱满，色泽诱人，感官评分为23.58分。在贮藏过程研究中，黄菜肉丸较普通肉丸pH显著降低（P<0.05），抑制了菌落总数（P<0.05），大肠菌群和致病菌的生长；脱氧剂＋PET易拉罐封装更好的保持了黄菜肉丸的色泽，显著延缓了菌落总数的上升（P<0.05），延长了产品贮藏期，抑制了大肠菌群以及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。本研究对黄菜即食肉丸配方开发及其在不同包装下贮藏特性的研究具有一定参考意义。Abstract: In order to determine the best recipe for Huangcai instant meatballs to research the characteristics of their preservation, the Plackett-Burman test was used to eliminate the three variables that significantly impacted the sensory score of Huangcai instant meatballs. The steepest climb test and Box-Behnken test were then used to optimize the Huangcai instant meatball recipe. The changes in color, texture, total colony count, coliforms, Staphylococcus aureus, Salmonella, peroxide value, and thiobarbituric acid value were compared with those of regular meatballs and two different packages (glass bottle, deoxidizer+PET can package) stored at 37 ℃. The meat-Huangcai ratio of 1:1 with the inclusion of 9% egg and 0.9% salt was the best combination for the primary influencing factors in the formulation of Huangcai instant meatballs, according to the results. The meatballs made using this recipe had an organoleptic score of 23.58 points and were aromatic, soft, elastic, full in shape, and visually appealing in color. In comparison to regular meatballs, the Huangcai instant meatballs in the storage process had a considerably lower pH (P<0.05) and reduced the growth of Escherichia coli and harmful bacteria (P<0.05). Deoxidizer+PET could encapsulate yellow vegetable meatballs more effectively, prolong the product's storage period, prevent the growth and reproduction of pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus, and significantly delaying the rise in colony count (P<0.05). For the development of the recipe for Huangcai instant meatballs and its preservation properties under various packages, the current study has certain reference relevance.
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根用芥菜别名大头菜，芥菜疙瘩，为山西中部地区广泛栽培的芥菜品种之一。为了更好的进行贮藏，民间将其自然发酵，发酵产物颜色逐渐转黄，故称黄菜[1]。黄菜口感酸爽，解腻开胃，但是关于黄菜相关产品的开发研究较少。肉丸在我国是一种家庭传统小吃，因其丰富的营养以及良好的感官品质受到了消费者青睐，然而随着生活方式的改变，传统肉丸面临着方便性不足，产品配方单一，脂质含量过高，贮藏困难等问题。针对这些问题的相关研究成为了肉丸产品的重要研究方向。
传统肉丸多添加盐、水、淀粉以及香辛料等辅料，而Hsu等[2]研究发现肉丸中添加一定量食盐可促进蛋白凝胶结构形成并提高肉丸产率。冯爽等[3−4]对黑豆豆腐肉丸的配方进行了优化并确定了微波复热能更好的保证产品的感官品质及质构特性。传统肉丸中的动物脂肪赋予了肉丸独特良好的风味，但是研究表明动物脂肪长期摄入过量会引发心脏病、肥胖症以及高血脂等富贵病[5]。然而直接减少脂肪含量会影响肉制品风味口感等感官品质，所以在保持良好感官品质的同时降低脂肪含量成为了配方创新的热点。张光耀等[6]用经乙醇和芦丁稳定后的乳清分离蛋白-大豆油预乳化液代替肉丸中脂肪以期降低肉丸中动物脂肪含量，结果表明替代比例25%时产品蒸煮损失、色差、质构、气味、TBARs值最为接近对照。
传统肉丸含水量较高导致其容易发生腐败变质[7]，设法延长肉丸贮藏期成为了热门方向。刘树萍等[8]采用北五味子提取物与壳聚糖复合制膜并将其用于肉丸保鲜，在（4±1） ℃下有效延长肉丸的货架期达到15 d。张蓓等[9]研究了不同食用菌对牦牛肉丸贮藏品质的影响，结果表明，香菇对牦牛肉丸贮藏中质构特性、流变特性、乳化特性、保水性等品质均有积极作用。FALOWO等[10]通过添加肉豆蔻提取物延缓了肉丸脂肪和蛋白质的氧化。但关于利用包装方式来延缓肉丸腐败变质的相关研究较少。
目前市场上最常见的肉丸包装方式分为真空包装和非真空包装，真空包装适用于以潮汕牛肉丸为代表的内里质密的肉丸，此类肉丸有一定的耐压性不易变形，真空包装配合复合包装材料可以延长其保质期。非真空包装适用于全程冷链物流的预制肉丸，这种为市场上最为常见。也存在极少数添加防腐剂以及油炸配合一定程度的烘干工艺所制成的含水量较低的肉丸，这种肉丸因高温杀菌与含水量较低的特性可以在非真空的包装下可常温贮藏一段时间。PET材料有着优良的阻隔性，配合脱氧剂可以降低产品环境中氧气含量从而延缓肉丸腐败变质，总体成本可控，用于包装油炸肉丸有着一定的市场可行性。
本研究旨在优化黄菜肉丸配方并对黄菜肉丸贮藏过程中品质的变化进行研究，同时考察PET易拉罐+脱氧剂与普通玻璃瓶两种不同包装对黄菜肉丸贮藏过程中各项指标的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
芥菜 本市农贸市场，要求新鲜，外观完好且无损伤；铁系脱氧剂 杭州鲜代感网络科技有限公司；PET易拉罐塑料易拉罐 河南凯丰包装制品有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司。
LRH-250CL超低温冰箱 上海一恒科学仪器有限公司；ST3100试验室pH计、AR224CN电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；DL-CJ-1N超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；LS-S0HD压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；VORTEX-5旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；YS3060智能分光测色仪 深圳市三恩时科技有限公司；TMS-Pro质构仪 Food Technology Corporation公司；LD-SY12食用油品质测试仪 山东莱恩德智能科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄菜即食肉丸制作工艺流程
黄菜制备→原料肉预处理→切块→调制→斩拌→炸制（170~180 ℃，5 min）→常温冷却→包装贮藏。
1.2.2 普通肉丸制作工艺流程
原料肉预处理→切块→调制→斩拌→炸制（170~180 ℃，5 min）→冷却→包装贮藏。
1.2.3 操作要点
1.2.3.1 黄菜制备
将新鲜叶茎分离后清洗沥干，将芥菜块茎和叶子切碎后按照块茎与叶子重量比3:1压入泡菜缸中加水后放置于食品加工实验室中室温条件下进行自然发酵15 d后pH为3.47，取黄菜进行肉丸制备。
1.2.3.2 肉丸基本配方
肉馅肥瘦比1:3，鸡精0.2%，香油1 mL/100 g，花椒粉0.1%，大料粉0.1%，生姜粉0.1%（按实际生产惯例所有配料以肉和黄菜的总重量为基准进行添加）。
1.2.3.3 原料肉预处理
选择新鲜猪后腿肉，剔除筋膜、骨骼后清洗干净并切成1 cm3左右小块于4 ℃冷藏备用。
1.2.3.4 调制与斩拌
将处理好的猪后腿肉按照肥瘦比1:3与提前沥水的黄菜按比例放入斩拌机，同时加入花椒粉，大料粉，生姜粉，鸡精，香油制作黄菜肉丸。普通肉丸不加入黄菜，其余原料与黄菜肉丸添加一致。
1.2.3.5 炸制
将肉馅制成直径约2 cm的肉丸后放入温度为170~180 ℃的热油中炸制大约5 min后捞出沥油。
1.2.3.6 冷却、包装
将肉丸放于消毒后的工作台上进行冷却，玻璃瓶包装，将沥油冷却后的肉丸放入玻璃瓶（200 mL）内，拧紧瓶盖。脱氧剂＋PET易拉罐（200 mL）包装，将冷却后肉丸放于PET易拉罐并放入脱氧剂后用PET易拉罐台式封口机进行密封。
1.2.4 Plackett-Burman试验
运用Design-Expert（Version 12）软件进行PB试验设计，根据前期预试验确定各因素水平，对影响黄菜肉丸感官评分的7个因素进行显著性试验。各影响因素水平见表1。
表 1 Plackett-Burman试验因素水平设计Table 1. Plackett-Burman test factor level design变量 因素 低水平（−1） 高水平（1） X1 肉:黄菜 1:1 1:0.5 X2 淀粉添加量（%） 7 14 X4 鸡蛋添加量（%） 5 10 X5 葱添加量（%） 2.5 5 X7 料酒添加量（%） 1 2 X8 小苏打添加量（%） 0.025 0.05 X10 食盐添加量（%） 0.5 1 X3、X6、X9、X11 虚拟变量 −1 1 1.2.5 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验结果，以效应的正负为爬坡方向，以感官评分为响应值，每个处理重复３次，寻找最佳响应区域。
1.2.6 Box-Behnken试验
在Plackett-Burman和爬坡试验基础上，采用Design-Expert（Version 12）中的Box-Behnken设计试验组合，分别选取对感官评分Y影响显著的肉与黄菜比例、鸡蛋添加量、食盐添加量进行响应曲面优化试验，因素水平如表2。
表 2 Box-Behnken试验因素与水平Table 2. Factors and levels of Box-Behnken design因素 水平 −1 0 1 A肉:黄菜 0.6:1 0.9:1 1.2:1 B鸡蛋添加量（%） 6 9 12 C食盐添加量（%） 0.6 0.9 1.2 1.2.7 贮藏试验
普通肉丸放于玻璃瓶中贮藏作为对照组M，按配方优化后黄菜肉丸放于玻璃瓶作为处理组HM。按优化后黄菜肉丸配方制作并放置脱氧剂密封于PET易拉罐塑料易拉罐作为处理组HM+PET易拉罐。将处理组与对照组均放置于37 ℃进行贮藏，每隔3 d取样一次。
1.2.8 感官评分
由经过专业培训的人员组作为感官评价小组对黄菜肉丸的色泽形状、弹性、滋气味、口感、组织状态进行综合评价，感官评定标准见表3。
表 3 黄菜肉丸感官评分标准Table 3. Sensory scoring standard of huangcaiinstant meatballs项目 性状描述 分数（分） 色泽形状
（5分）形状饱满，色泽诱人且均匀 5~4 形状饱满，色泽正常或形状稍有塌陷但色泽诱人 3~2 形状稍有塌陷，色泽一般 1 弹性
（5分）按压富有弹性，迅速恢复原状 5~4 按压弹性一般，较快恢复原状 3~2 按压弹性差，很难恢复原状 1 滋气味
（5分）清香柔和，具有猪肉的鲜味和黄菜的清香味 5~4 较清香，猪肉和黄菜味不足或过于浓烈 3~2 味道不好，无猪肉和黄菜味，甚至有异常味道 1 口感
（5分）表皮清脆，内里爽口细腻 5~4 表皮爽脆性一般，内里较细腻 3~2 口感不爽脆，难以下咽 1 组织状态
（5分）切面均一，布满均匀细小气孔 5~4 切面较均一，略有一些较大气孔 3~2 切面不均一，有特大气孔 1 1.2.9 相关参数分析
色差采用YS3060色差仪进行测量，Uv状态关闭，SCE测量模式，D65光源，采用CIE Lab颜色空间，观察者角度为10°，测量口径为4 mm；使用TMS-Pro质构仪进行TPA测试，力量感应元量程100 N，探头回升高度20 mm，挤压距离8 mm，检测速度100 mm/min，起始力0.4 N，两次压缩间隔时间1 s，测试后速度190 mm/min；pH参照文献[11]，菌落总数参照文献[12]，大肠菌群参照文献[13]，金黄色葡萄球菌参照杜雅正等[14]，沙门氏菌参考陈露露等[15]快速检测片法；过氧化值：样品混匀粉碎后，取5 g样品，放入50 mL烧杯中，加入10~20 mL石油醚（通风橱）浸泡后过滤取滤液并于50 ℃水浴除去石油醚，使用食用油品质测试仪检测；硫代巴比妥酸值参照文献[16]进行测量。
1.3 数据处理
采用Design-Expert（Version 12）软件进行响应面优化分析，OriginPro 2021进行统计分析，数据以平均数±标准差的形式表示。得到的数据使用IBM SPSS Statistics（version 26）进行ANOVA方差分析和邓肯多重数据分析，在P<0.05的条件下进行差异显著性分析。利用OriginPro 2021作图。
2. 结果与分析
2.1 黄菜即食肉丸配方优化的Plackett-Burman试验
从表4~表5可以看出，试验模型P<0.01，表示模型极显著。以感官评分Y为响应值，得到回归方程Y=15.04+1.60X1+0.4042X2−1.25X4+0.2858X5+0.4042X7+0.0175X8+0.9208X10，R2为0.9731表明模型拟合良好，因素X1（肉:黄菜）、X4（鸡蛋添加量）与X10（食盐添加量）对感官评分极显著（P<0.01）。其中肉:黄菜和食盐添加量对感官评分的影响为正效应，鸡蛋添加量对感官评分的影响为负效应，以此3个因素进行之后最陡爬坡试验。其余不显著因素，均为正效应，故在后续爬坡试验中均取高水平值。
表 4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4. Plackett-Burman test design and results实验号 X1 X2 X4 X5 X7 X8 X10 感官评分（分） 1 1 −1 1 −1 1 1 −1 14.12 2 1 1 −1 −1 −1 1 −1 16.23 3 1 1 −1 −1 1 −1 1 19.34 4 −1 1 −1 1 1 −1 −1 14.57 5 −1 1 1 1 1 1 −1 12.65 6 −1 −1 1 −1 1 −1 1 12.34 7 1 1 1 1 −1 −1 1 16.74 8 1 −1 1 1 −1 −1 −1 13.78 9 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 13.36 10 −1 1 1 −1 −1 1 1 13.13 11 −1 −1 −1 1 −1 1 1 14.57 12 1 −1 −1 1 1 1 1 19.64 表 5 试验因子的显著性分析Table 5. Significance analysis of variables因素 F值 P值 显著性 X1 69.11 0.0011 ** X2 4.4 0.104 X4 41.77 0.003 ** X5 2.2 0.2123 X7 4.4 0.104 X8 0.0082 0.932 X10 22.82 0.0088 ** 模型 9.22 0.0054 ** 注：*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异高度显著（P<0.01）；***代表差异极显著（P<0.001），下同。 2.2 最陡爬坡试验
最陡爬坡试验结果见表6，随着因素肉:黄菜、鸡蛋添加量、食盐添加量的变化，感官评分先升高后降低，在第3次试验时达到最大值，为22.99，因此选择肉:黄菜为1:0.9，鸡蛋添加量9%，食盐添加量0.9%作中心点，进行响应面优化。
表 6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6. Design and results of the steepest ascent experiment实验号 肉:黄菜 鸡蛋添加量（%） 食盐添加量（%） 感官评分（分） 1 1:1.5 15 0.3 17.45 2 1:1.2 12 0.6 20.97 3 1:0.9 9 0.9 22.99 4 1:0.6 6 1.2 17.69 5 1:0.3 3 1.5 16.98 2.3 Box-Behnken试验
2.3.1 响应面优化试验结果
响应面优化试验结果见表7，利用Design-Expert软件对响应曲面所得数据进行二次回归方程分析，得到回归方程：Y=23.57+0.98A+0.2413B+0.2712C+0.4AB−0.275AC−0.0175BC−1.53A2−1.89B2-2.23C2，该模型方差分析见表8。P（模型）<0.001，回归方程模型极显著，P（失拟项）=0.4129失拟项不显著，回归方程拟合程度良好，校正决定系数R2adj=0.9802，表明试验设计误差较小且具有可靠性，适合实际情况，可用于对感官评分的分析和预测。同时方差分析结果中P值及F值表明，因素A、B、C对感官评分的影响显著（P<0.05）且选定范围内对响应值的影响顺序为A（肉:黄菜）>C（食盐添加量）>B（鸡蛋添加量）。交互项AB对黄菜肉丸感官影响显著（P<0.05），二次项A2、B2、C2对黄菜肉丸感官影响极显著（P<0.001）。由F值可知，一级交互作用大小排序为：AB>AC>BC。
表 7 响应面试验设计与结果Table 7. Design and results of response surface experiment实验号 A B C 感官评分（分） 1 −1 0 1 19.26 2 0 −1 −1 19.03 3 1 −1 0 20.26 4 0 0 0 23.90 5 0 1 −1 19.23 6 −1 1 0 19.23 7 −1 −1 0 19.23 8 0 0 0 23.78 9 0 0 0 23.28 10 1 1 0 21.86 11 −1 0 −1 18.26 12 1 0 1 20.80 13 0 0 0 23.39 14 0 −1 1 19.70 15 0 0 0 23.48 16 0 1 1 19.83 17 1 0 −1 20.90 表 8 回归模型方差分析Table 8. Regression simulation analysis of variance项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 60.73 9 6.75 89.12 <0.0001 *** A 7.68 1 7.68 101.47 <0.0001 *** B 0.4656 1 0.4656 6.15 0.0422 * C 0.5886 1 0.5886 7.77 0.027 * AB 0.64 1 0.64 8.45 0.0227 * AC 0.3025 1 0.3025 3.99 0.0858 BC 0.0012 1 0.0012 0.0162 0.9024 A2 9.88 1 9.88 130.47 <0.0001 *** B2 15.03 1 15.03 198.47 <0.0001 *** C2 20.92 1 20.92 276.34 <0.0001 *** 残差 0.53 7 0.0757 失拟项 0.2525 3 0.0842 1.21 0.4129 误差 0.2775 4 0.0694 总误差 61.26 16 R2 0.9913 R2adj 0.9802 2.3.2 各因素对感官评分的交互作用
为了研究各变量间的关系，根据回归方程的结果，使用响应面软件进行了可视化分析，绘制响应曲面图，响应面坡面越陡峭，两个因素的交互作用对感官评分影响越显著，反之则说明两因素交互作用对响应值的影响越小。由图1可以看出，因素B（鸡蛋添加量）与因素C（食盐添加量）投影的等高线较圆说明BC交互作用弱。同时从响应面的最高点和等高线可以看出感官评分在所选范围内存在极值。这与以上方差分析表中数据相符。
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图 1 两两因素交互作用对综合评分影响的响应面Figure 1. Response surface of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score2.3.3 最佳配方优化及验证
根据响应面曲线回归模型预测的最佳配方为肉:黄菜=0.999、鸡蛋添加量9.295%、食盐添加量0.912%。根据试验操作便利性和实际操作可行性的原则，调整修正后参数为肉:黄菜比为1:1、鸡蛋添加量9%、食盐添加量0.9%，在此最佳配比条件下进行验证试验，平行3次，得到感官评分平均值23.58±0.51与同模型预测值的相对误差<5%，所制作的酸菜肉丸清香柔和，具有猪肉的鲜味和黄菜的清香味，富有弹性，形状饱满，色泽诱人。表明此系列参数准确可靠，试验模型具有一定的实际参考价值。
2.4 肉丸贮藏过程中品质的变化
2.4.1 肉丸贮藏过程中色差的变化
颜色是影响肉制品消费可接受度的重要指标，直观反映产品的品质好坏[17]。由图2可知，两种肉丸（M和HM）在贮藏期间，明度指数L*均呈现上升趋势。可能是贮藏期间水分由肉丸内部迁移到肉丸表面导致肉丸表面折光率变化。第0 d时，黄菜肉丸HM的a*大于（P<0.05）普通肉丸M，b*小于（P<0.05）普通肉丸M，说明添加黄菜使得肉丸红绿度偏红，黄蓝度偏蓝。普通肉丸M在0~6 d，a*显著降低（P<0.05），颜色偏绿，之后a*升高色泽偏红，b*随着贮藏时间的延长而降低表现为偏蓝缺黄。黄菜肉丸HM在贮藏期间（0~15 d）a*显著降低（P<0.05），b*上升表现为红绿度偏绿，黄蓝度偏黄缺蓝。
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两种不同包装的黄菜肉丸（HM与HM+PET），在贮藏期间L*均升高、a*均降低、b*均升高，变化趋势相同，HM+PET在0~15 d时第15 d所测红绿度与第0 d之差为−3.35，第15 d所测黄蓝度与第0 d之差为2.22；普通包装HM的第15 d所测红绿度与第0 d之差为−4.59，第15 d所测黄蓝度与第0 d之差为4.41，说明脱氧剂+PET易拉罐包装减缓了a*的降低与b*的升高从而在贮藏期间更好的保持了产品的色泽。可能是加入脱氧剂后PET易拉罐封装所造成的缺氧环境抑制了脂肪氧化以及微生物的生长繁殖等需氧活动从而减缓了颜色变化。
2.4.2 肉丸贮藏过程中质构特性的变化
由图3可知，第0 d时，黄菜肉丸的硬度、弹性、咀嚼性均显著小于普通肉丸（P<0.05），这可能是因为黄菜的加入使得黄菜肉丸水分含量增加，蛋白含量降低，以及黄菜的酸性促使蛋白质变性对其交联产生了影响[18]。贮藏期间M和HM两种肉丸的硬度和咀嚼性均先上升后下降（P<0.05）。前期（0~6 d）上升可能与水分的迁移和流失有关，后期（9~12 d）硬度降低可能由于微生物的分解蛋白质，导致蛋白组织结构遭到破坏。在第0~6 d黄菜肉丸弹性显著上升后期逐渐降低（P<0.05）。在贮藏前期，脱氧剂+PET易拉罐的包装方式显著延缓了肉丸硬度、弹性、咀嚼性的变化（P<0.05）。
2.4.3 肉丸贮藏过程中pH的变化
pH是用来判断食品好坏程度的一个关键因素，由图4可知，第0 d黄菜肉丸的pH为5.25显著低于普通肉丸6.17（P<0.05），黄菜的添加使得该产品属中酸性食品。在贮藏期间黄菜肉丸pH小于普通肉丸（P<0.05）且两种肉丸pH均为先上升后下降。pH的增大可能是腐败微生物增加以及内源酶活性变化导致了产品中蛋白质的分解与一些碱性物质的产生[19]。从第3 d起，2组不同包装的黄菜肉丸pH差异显著（P<0.05）。脱氧剂+PET易拉罐封装pH变化幅度更小，主要是由于脱氧剂+PET易拉罐塑料易拉罐密封使得其中微生物数量减少，贮藏过程中发生的需氧劣变减缓。
2.5 肉丸贮藏过程中微生物的变化
2.5.1 肉丸贮藏过程中菌落总数的变化
菌落总数常用来衡量肉制品卫生状况（发酵食品除外），可以直观反映食品受微生物污染的程度。如图5所示，两种肉丸的菌落总数在贮藏期间呈上升趋势，黄菜肉丸上升速率比普通肉丸慢。在相同贮藏时间内（0 d除外），黄菜的添加显著减少了菌落总数（P<0.05）。主要是因为黄菜的加入使得食品pH降低到5.25达到了中酸性食品行列，大多腐败微生物酶系在pH=5.5左右会受到抑制。按照GB 4789.2-2022中关于肉丸菌落总数的规定，黄菜肉丸在第9 d取样时失去食用价值，普通肉丸则为6 d。在相同贮藏期间（3~15 d），脱氧剂＋PET易拉罐封装相比与玻璃瓶包装显著减少了黄菜肉丸的菌落总数（P<0.05），因为脱氧剂以及密封PET易拉罐包装使得黄菜肉丸与外界环境隔绝的同时内部氧气含量降低明显，低氧的环境不利于腐败微生物的生长，较低的pH配合170~180 ℃的高温烹饪以及较低的氧气含量符合了德国肉类专家Leistner博士[20]所提出的栅栏因子理论，这些栅栏因子间的互作效应直接影响了微生物的内平衡，使得采用脱氧剂+PET易拉罐封装的黄菜即食肉丸失去食用价值的时间延长到第15 d。
2.5.2 肉丸贮藏过程中大肠菌群的变化
大肠杆菌主要来源于人畜的粪便，是评价食品卫生状况的重要标准之一。我国对于熟肉制品中大肠菌群的要求载于GB 2726-2016[21]。由表9可知，两种肉丸在贮藏期间，大肠菌群数呈上升趋势，且普通肉丸上升更快。黄菜肉丸比普通肉丸首次检出时间推迟了6 d，普通肉丸在第9 d大肠菌群数为123（CFU/g）超出了标准限定值，黄菜肉丸超过限定值则为第15 d。两种不同包装方式下，脱氧剂+PET易拉罐封装的黄菜肉丸在贮藏期间（0~15 d）并未有大肠菌群的检出，这说明脱氧剂+PET易拉罐封装在密封的同时降低氧气含量可以明显抑制大肠菌群的增值。
表 9 肉丸贮藏过程大肠菌群的变化Table 9. Changes in coliform bacteria during storage of meatballs贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 33 <10 <10 9 123 <10 <10 12 380 23 <10 15 633 203 <10 2.5.3 肉丸贮藏过程中致病微生物的变化
肉丸中致病菌应符合GB 29921-2021[22]的要求。金黄色葡萄球菌是熟肉制品中常见的一种致病菌，也是熟肉制品引起食物中毒的主要污染菌[23]，其所产肠毒素在较高温度与较低pH下仍有活性[24]。从表10中可以看出，普通肉丸在第6 d已有金黄色葡萄球菌检出，而黄菜肉丸则在第9 d检出，且脱氧剂+PET易拉罐的包装在贮藏15 d内并没有金黄色葡萄球菌检出。普通肉丸在第12 d取样检测中金黄色葡萄球菌超出标准限定值。
表 10 肉丸贮藏过程金黄色葡萄球菌的变化Table 10. Changes of Staphylococcus aureus during storage of meatballs贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 70 <10 <10 9 346 13 <10 12 1643 160 <10 15 15133 585 <10 沙门氏菌种类繁多，是引起感染性腹泻和食物中毒的重要病原菌。表11可看出，沙门氏菌检出在普通肉丸和黄菜肉丸贮藏中的第15 d，在脱氧剂+PET易拉罐包装中并未检出。对比金黄色葡萄球菌，沙门氏菌检出时间较晚，这与栗云鹏等[25]关于猪肉冷藏中两菌的检出顺序相一致。在第15 d取样时普通肉丸和黄菜肉丸有沙门氏菌检出，超出标准限定值，而脱氧剂+PET易拉罐包装的黄菜肉丸则在贮藏期内并未检出。
表 11 肉丸贮藏过程沙门氏菌的变化Table 11. Changes in Salmonella during storage of meatballs贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 <10 <10 <10 9 <10 <10 <10 12 <10 <10 <10 15 90 80 <10 2.6 肉丸贮藏过程中POV和TBARs的变化
2.6.1 肉丸贮藏过程中过氧化值（POV）的变化
POV作为脂质氧化的初级代谢产物[26]，可以评估食品中油脂初始氧化程度[27]，POV越高表明脂质氧化中间产物积累越多[28]。如图6，在相同贮藏时间下黄菜肉丸POV均显著高于普通肉丸（P<0.05）这可能是黄菜的加入使得黄菜肉丸的含水量远高于普通肉丸，过高的水分导致油炸食品与煎炸油发生强烈的变质反应，且会导致不良异味的产生[29]。此外，炸制过程中水分的蒸发会造成压差导致黄菜肉丸吸收了更多的煎炸油，这都可能造成黄菜肉丸的POV值升高。在第3 d时，两种不同包装的POV出现显著差异（P<0.05）。采用脱氧剂＋PET易拉罐封装最终含量显著低于玻璃瓶包装（P<0.05），说明添加除氧剂的PET易拉罐包装能够防止贮藏过程中脂肪氧化，可能是因添加除氧剂导致了贮藏环境中氧气含量有所降低一定程度上延缓了脂质氧化过程。
2.6.2 肉丸贮藏过程中硫代巴比妥酸值（TBARs）的变化
TBARs值反应了不饱和脂肪酸氧化终产物丙二醛的含量[30]。TBARs值是反映脂肪氧化衍生物的重要指标[31]。如图7，第0 d时，两种肉丸TBARs值并未有显著差异（P<0.05），从第3 d起，黄菜肉丸TBARs值显著高于普通肉丸（P<0.05），这是因为黄菜肉丸中有着大量的脂肪初级产物的积累，随着贮藏时间的延长，这些初级氧化产物进一步氧化为终产物，同时黄菜肉丸较高的水分含量也进一步加速了脂肪的氧化。在贮藏期间脱氧剂＋PET易拉罐封装显著地减缓了TBARs的上升（P<0.05），可能是该包装方式下，较低的氧气含量延缓了脂肪的氧化速度。
3. 结论
在Plackett-Burman试验结合爬坡试验基础上利用Box-Behnken设计对黄菜即食肉丸配方进行优化，得到最佳配方为肉:黄菜=1，鸡蛋添加量9%，食盐添加量0.9%，添加黄菜一定程度上降低了pH，抑制了菌落总数，大肠菌群和致病菌的生长（P<0.05）。脱氧剂+PET易拉罐封装HM+PET在贮藏期间更好的保持了产品的色泽，显著延缓了菌落总数的上升（P<0.05），延长了产品贮藏期（P<0.05），抑制了大肠菌群以及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。
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图 1 两两因素交互作用对综合评分影响的响应面
Figure 1. Response surface of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score
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表 1 Plackett-Burman试验因素水平设计
Table 1 Plackett-Burman test factor level design
变量 因素 低水平（−1） 高水平（1） X1 肉:黄菜 1:1 1:0.5 X2 淀粉添加量（%） 7 14 X4 鸡蛋添加量（%） 5 10 X5 葱添加量（%） 2.5 5 X7 料酒添加量（%） 1 2 X8 小苏打添加量（%） 0.025 0.05 X10 食盐添加量（%） 0.5 1 X3、X6、X9、X11 虚拟变量 −1 1 
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表 2 Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design
因素 水平 −1 0 1 A肉:黄菜 0.6:1 0.9:1 1.2:1 B鸡蛋添加量（%） 6 9 12 C食盐添加量（%） 0.6 0.9 1.2
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表 3 黄菜肉丸感官评分标准
Table 3 Sensory scoring standard of huangcaiinstant meatballs
项目 性状描述 分数（分） 色泽形状
（5分）形状饱满，色泽诱人且均匀 5~4 形状饱满，色泽正常或形状稍有塌陷但色泽诱人 3~2 形状稍有塌陷，色泽一般 1 弹性
（5分）按压富有弹性，迅速恢复原状 5~4 按压弹性一般，较快恢复原状 3~2 按压弹性差，很难恢复原状 1 滋气味
（5分）清香柔和，具有猪肉的鲜味和黄菜的清香味 5~4 较清香，猪肉和黄菜味不足或过于浓烈 3~2 味道不好，无猪肉和黄菜味，甚至有异常味道 1 口感
（5分）表皮清脆，内里爽口细腻 5~4 表皮爽脆性一般，内里较细腻 3~2 口感不爽脆，难以下咽 1 组织状态
（5分）切面均一，布满均匀细小气孔 5~4 切面较均一，略有一些较大气孔 3~2 切面不均一，有特大气孔 1
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表 4 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 4 Plackett-Burman test design and results
实验号 X1 X2 X4 X5 X7 X8 X10 感官评分（分） 1 1 −1 1 −1 1 1 −1 14.12 2 1 1 −1 −1 −1 1 −1 16.23 3 1 1 −1 −1 1 −1 1 19.34 4 −1 1 −1 1 1 −1 −1 14.57 5 −1 1 1 1 1 1 −1 12.65 6 −1 −1 1 −1 1 −1 1 12.34 7 1 1 1 1 −1 −1 1 16.74 8 1 −1 1 1 −1 −1 −1 13.78 9 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 13.36 10 −1 1 1 −1 −1 1 1 13.13 11 −1 −1 −1 1 −1 1 1 14.57 12 1 −1 −1 1 1 1 1 19.64
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表 5 试验因子的显著性分析
Table 5 Significance analysis of variables
因素 F值 P值 显著性 X1 69.11 0.0011 ** X2 4.4 0.104 X4 41.77 0.003 ** X5 2.2 0.2123 X7 4.4 0.104 X8 0.0082 0.932 X10 22.82 0.0088 ** 模型 9.22 0.0054 ** 注：*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异高度显著（P<0.01）；***代表差异极显著（P<0.001），下同。
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表 6 最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Design and results of the steepest ascent experiment
实验号 肉:黄菜 鸡蛋添加量（%） 食盐添加量（%） 感官评分（分） 1 1:1.5 15 0.3 17.45 2 1:1.2 12 0.6 20.97 3 1:0.9 9 0.9 22.99 4 1:0.6 6 1.2 17.69 5 1:0.3 3 1.5 16.98
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表 7 响应面试验设计与结果
Table 7 Design and results of response surface experiment
实验号 A B C 感官评分（分） 1 −1 0 1 19.26 2 0 −1 −1 19.03 3 1 −1 0 20.26 4 0 0 0 23.90 5 0 1 −1 19.23 6 −1 1 0 19.23 7 −1 −1 0 19.23 8 0 0 0 23.78 9 0 0 0 23.28 10 1 1 0 21.86 11 −1 0 −1 18.26 12 1 0 1 20.80 13 0 0 0 23.39 14 0 −1 1 19.70 15 0 0 0 23.48 16 0 1 1 19.83 17 1 0 −1 20.90
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表 8 回归模型方差分析
Table 8 Regression simulation analysis of variance
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 60.73 9 6.75 89.12 <0.0001 *** A 7.68 1 7.68 101.47 <0.0001 *** B 0.4656 1 0.4656 6.15 0.0422 * C 0.5886 1 0.5886 7.77 0.027 * AB 0.64 1 0.64 8.45 0.0227 * AC 0.3025 1 0.3025 3.99 0.0858 BC 0.0012 1 0.0012 0.0162 0.9024 A2 9.88 1 9.88 130.47 <0.0001 *** B2 15.03 1 15.03 198.47 <0.0001 *** C2 20.92 1 20.92 276.34 <0.0001 *** 残差 0.53 7 0.0757 失拟项 0.2525 3 0.0842 1.21 0.4129 误差 0.2775 4 0.0694 总误差 61.26 16 R2 0.9913 R2adj 0.9802
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表 9 肉丸贮藏过程大肠菌群的变化
Table 9 Changes in coliform bacteria during storage of meatballs
贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 33 <10 <10 9 123 <10 <10 12 380 23 <10 15 633 203 <10
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表 10 肉丸贮藏过程金黄色葡萄球菌的变化
Table 10 Changes of Staphylococcus aureus during storage of meatballs
贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 70 <10 <10 9 346 13 <10 12 1643 160 <10 15 15133 585 <10
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表 11 肉丸贮藏过程沙门氏菌的变化
Table 11 Changes in Salmonella during storage of meatballs
贮藏时间（d） M HM HM+PET易拉罐 0 <10 <10 <10 3 <10 <10 <10 6 <10 <10 <10 9 <10 <10 <10 12 <10 <10 <10 15 90 80 <10
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