Study on Immune Enhancement and Toxicological Evaluation of an Antioxidant Supplement
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摘要: 研究以雨生红球藻为主要原料复配富硒酵母、蜂花粉提取物和维生素E组成的抗氧化膳食补充剂的免疫作用和安全性。采用低、中、高三个剂量（0.1、0.2、0.4 g/kg bw）每天一次灌胃，连续30 d，观察对小鼠脾脏、胸腺指数、脾淋巴细胞转化活性、迟发型变态反应、抗体生成细胞水平、半数溶血值（HC50）、碳粒廓清速率、巨噬细胞的吞噬作用和自然杀伤细胞活性等指标的影响；通过Ames试验、骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验分别评估受试物的致癌潜力，以及对细胞和生殖系统的遗传毒性情况；通过30 d喂养试验考察受试物亚急性毒性。结果发现，与对照组相比，中、高剂量组OD差值分别提高了10.32%（P<0.05）和14.29%（P<0.01），说明该膳食补充剂可以促进小鼠的脾淋巴细胞增殖转化能力；高剂量组左右耳肿胀度差增加了8.02%（P<0.05），抗体积数增加了22.12%（P<0.05），说明该膳食补充剂可以显著提升迟发型变态反应能力和抗体生成细胞能力；无急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性。实验证明，雨生红球藻、富硒酵母、蜂花粉提取物和维生素E复配的抗氧化膳食补充剂食用安全，具有增强免疫力的功能。Abstract: To study the immunomodulatory effects and safety of an antioxidant supplement composed primarily of Haematococcus pluvialis, selenium-enriched yeast, bee pollen extract, and vitamin E. Three different dosages (0.1, 0.2, and 0.4 g/kg bw) were administered via gavage once daily for 30 days in mice. The impact of this antioxidant supplement was observed on various parameters, including spleen index, thymus index, splenic lymphocyte transformation activity, delayed-type hypersensitivity, antibody-producing cell levels, hemolytic complement 50 (HC50), carbon clearance rate, phagocytic activity of macrophages, and natural killer cell activity. The potential carcinogenicity of the test materials, and their genotoxic effects on cells and the reproductive system were assessed through the Ames test, bone marrow micronucleus assay, and mouse sperm abnormality test, respectively. Subacute toxicity was investigated through a 30 day feeding trial. Results showed that compared to the control group, the middle and high-dosage groups exhibited significant increase in OD difference by 10.32% (P<0.05) and 14.29% (P<0.01), respectively. It indicated that the antioxidant supplement promoted splenic lymphocyte proliferation and transformation capacity in mice. In the high-dosage group, the difference in ear swelling between the left and right ears increased by 8.02% (P<0.05), and the number of antibody volumes increased by 22.12% (P<0.05). It suggested that the antioxidant supplement significantly improved delayed-type hypersensitivity and antibody-producing cell capacity. Importantly, no acute toxicity, genotoxicity, or subacute toxicity were observed. It is demonstrated that the antioxidant supplement is safe for consumption and significantly enhances immunity.
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雨生红球藻已批准为新食品原料，其主要功效成分是虾青素（Astaxanthin），是天然虾青素最好的来源[1]。根据批准雨生红球藻新资源食品的公告规定，雨生红球藻中虾青素食用量≤12 mg/d。虾青素有多种生理功能，目前关于虾青素的抗氧化作用研究较多，是目前发现抗氧化作用最强的天然产物之一[2−3]。虾青素对机体免疫也具有调节作用，能增加血清抗体水平[4]，能增加免疫相关基因的表达水平[5]，减少肝脏脂质的氧化从而改善肝脏炎症[6]以及提升亲虾生殖能力[7−8]等。将雨生红球藻来源的虾青素复配其他原料作为膳食补充剂，完善其功能作用及其机制，对拓展雨生红球藻的应用具有重要意义。
复配抗氧化剂的抗氧化文献报道较多，但增强免疫力功能文献报道较少[9]。研究表明，雨生红球藻添加维生素E可以显著提高虾青素的稳定性[10]。但以雨生红球藻为主要原料，同时复配富硒酵母、维生素E和蜂花粉提取物等物质尚未见报道，因此其功能性和安全性有必要进一步进行研究。本研究通过小鼠的免疫功能性试验考察该复配抗氧化膳食补充剂的免疫功能，并通过急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性试验评估该抗氧化膳食补充剂的毒理安全性，为雨生红球藻相关产品开发和应用提供一定的科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雨生红球藻 昆明白鸥微藻技术有限公司；富硒酵母 安琪酵母股份有限公司；蜂花粉提取物 西安三江生物工程有限公司；维生素E 浙江新和成药业有限公司；大豆油 中粮粮油工业（九江）有限公司；蜂蜡 抚州市临川区玉茗养蜂专业合作社；Ames测试菌株 美国Moltox公司；生化试剂盒、血细胞分析试剂盒、环磷酰胺、叠氮化钠、1,8-二羟基蒽醌、2-氨基芴 武汉艾美捷科技有限公司；清洁级健康ICR小鼠、SD大鼠 广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002，实验动物合格证号：45000300000634，动物实验室使用许可证号：SCXK（桂）2016-0002。
D180二氧化碳培养箱、M1324R离心机 深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Triathler液体闪烁计数器 美国BIOSCAN公司；ZT-III型多头细胞样品收集器 上海新诺仪器设备有限公司；MD FlexStation 3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；721分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BC-30全自动血液分析仪、BS-200全自动生化分析仪 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 抗氧化膳食补充剂的制备
该抗氧化膳食补充剂以雨生红球藻来源的虾青素为主要原料，复配富硒酵母、蜂花粉提取物（油菜花粉用80%食用酒精回流提取、浓缩、干燥制得，提取率为10%）和维生素E并以大豆油为辅料混合制成，其中雨生红球藻20%，富硒酵母2.5%，蜂花粉提取物16.7%，大豆油56.8%，维生素E 0.5%，蜂蜡4%。使每100 g产品中含虾青素667 mg、硒5.83 mg、蜂花粉提取物16.7 g、维生素E 417 mg。根据中华人民共和国卫生部发布的雨生红球藻新资源食品公告（虾青素食用量≤12 mg/d）以及本研究结果，确定虾青素食用量为8 mg/d，即该抗氧化膳食补充剂食用量为1.2 g/d。
1.2.2 免疫功能试验
按成人日推荐用量的5、10、20倍分别设0.1、0.2、0.4 g/kg bw 3个剂量组和溶剂（大豆油）对照组，每小组10只ICR小鼠，雌雄各半，分别进行5次不同项目试验，每次40只。每天按10 mL/kg bw连续灌胃30 d后检测免疫指标。称量并记录小鼠体重、胸腺和脾腺重量，其中ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应（DTH）试验、血清溶血素试验、抗体生成细胞、碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）和小鼠NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶LDH测定法）：按原卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）进行。
1.2.3 急性毒性试验
急性毒性试验按原卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）进行。采用20 g/kg bw剂量，相当于成人日推荐量的1000倍，设雌雄2个试验组，每组10只ICR小鼠。将小鼠隔夜禁食16 h，不禁水。膳食补充剂样品用大豆油稀释（10 g至20 mL），搅拌均匀，经口灌胃，每天灌胃2次，2次间隔4 h，连续14 d，灌胃容量为20 mL/kg bw。观察并记录灌胃后小鼠中毒表现和死亡情况。
1.2.4 遗传毒性试验
遗传毒性试验包括Ames试验、骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，均按原卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）进行。其中骨髓细胞微核试验设3个剂量组为2.5、5.0、10.0 g/kg bw，相当于成人日推荐量125、250、500倍，另设溶剂对照组（大豆油）和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg bw），每组10只ICR小鼠，雌雄各半，均采用经口灌胃，采用30 h给样法。小鼠精子畸形试验设3个剂量组为2.5、5.0、10.0 g/kg bw，相当于成人推荐量125、250、500倍，另设溶剂对照组（大豆油）和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg bw），每组5只ICR小鼠，均为雄性，经口灌胃，连续灌胃5 d，每日一次。
1.2.5 亚急性毒性试验（30 d喂养试验）
亚急性毒性试验按原卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）进行。采用清洁级SD大鼠按受试物人日推荐量的25、50和100倍喂养30 d，设3个剂量组为0.5、1.0、2.0 g/kg bw，另设溶剂（大豆油）对照组，每组20只，雌雄各半。每只单笼独立放置，样品按5 mL/kg bw经口灌胃，每日一次，其他饮食饮水自由。每天观察并记录动物形态和称重饲料洒漏量，每周记录体重一次、食物摄入量两次。喂养30 d禁食过夜后动物称重，采血作血常规及生化指标测定，取出肝、肾、脾、睾丸称重，并对肝、肾、脾、胃肠、睾丸、卵巢作病理学检查。
1.3 数据处理
用SPSS软件进行单因素方差分析。根据方差分析结果，其中方差齐的实验数据采用LSD法进行统计分析，方差不齐的实验数据采用Tambane法进行统计分析，P<0.05表示具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 免疫功能试验
2.1.1 脏器/体重比值的测定
胸腺指数和脾指数是评估小鼠免疫器官大小的指标，能够反映出免疫器官的发育和功能状态。本膳食补充剂各剂量组胸腺指数、脾指数与对照组比较，无显著性差异（P>0.05），结果见图1。说明本品对胸腺指数和脾指数无明显影响。
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图 1 抗氧化膳食补充剂对胸腺指数、脾指数的影响Figure 1. Effects of antioxidant supplement on the thymus and spleen index2.1.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验是一种评估小鼠淋巴细胞免疫功能的方法，通过观察ConA对小鼠淋巴细胞的刺激和增殖作用，评估其细胞免疫功能。结果见图2，本品各剂量组的OD差随着剂量增加而增加，中、高剂量组小鼠淋转OD差值比对照组显著提高，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01），表明该中、高剂量能促进小鼠的淋巴细胞转化。
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2.1.3 迟发型变态反应试验
迟发型变态反应（DTH）检测是一种评估细胞免疫功能的方法，通过皮下注射抗原物质，观察小鼠是否产生皮肤变态反应，以评估其细胞免疫功能。本品高剂量组小鼠左右耳肿胀度差明显比对照组高，差异有统计学意义（P<0.05），结果见图3。表明该产品高剂量能促进小鼠的DTH，提高细胞免疫功能。
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图 3 抗氧化膳食补充剂对迟发型变态反应试验的影响Figure 3. Effects of antioxidant supplement on cellular immunity test of DNFB-induced delayed type hypersensitivity2.1.4 血清溶血素试验
血清溶血素测定用于评估小鼠对抗原物质的免疫反应。实验中通过注射抗原物质，观察小鼠是否产生溶血素，以评估其免疫反应。本品中、高剂量组小鼠溶血空斑数与对照组比较，能增加血清溶血素，但两组溶血空斑数相当，差异均无统计学意义（P>0.05），结果见图4。说明本品对体液免疫功能的血清溶血素指标无明显影响。
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图 4 抗氧化膳食补充剂对血清溶血素试验的影响Figure 4. Effects of antioxidant supplement on humoral immunity tests of serum haemolysin analysis2.1.5 抗体生成细胞检测试验
抗体生成细胞检测是一种测定小鼠免疫反应的方法，通过观察小鼠的脾细胞或骨髓细胞是否产生抗体生成细胞，以评估其免疫反应。本品高剂量组小鼠抗体积数对照组相比显著提高，差异有统计学意义（P<0.05），结果见图5。可以证明高剂量水平可有效改善小鼠抗体生成细胞功能。
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图 5 抗氧化膳食补充剂对抗体生成细胞检测试验的影响Figure 5. Effects of antioxidant supplement on humoral immunity tests of antibody-producing cell assay2.1.6 小鼠碳廓清试验
碳廓清试验是一种血清免疫学试验，用于评估小鼠非特异性免疫指标—巨噬细胞的吞噬功能。试验中将小鼠注射10 mL/kg bw的碳粉，随后观察血液中的碳粉清除率，以评估小鼠巨噬细胞的吞噬能力。本品各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），结果见图6。本研究表明本品非特异性免疫作用不明显。
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图 6 抗氧化膳食补充剂对碳廓清试验的影响Figure 6. Effects of antioxidant supplement on mononuclear-macrophages phagocytic index a of carbon clearance test2.1.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能是非特异性免疫指标。该试验通过小鼠腹腔巨噬细胞是否能够吞噬鸡红细胞以及吞噬能力大小来评估其吞噬功能。本品各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），结果见表1。表明本品非特异性免疫作用不明显。
表 1 抗氧化膳食补充剂对巨噬细胞吞噬试验的影响Table 1. Effects of antioxidant supplement on phagocytosis of peritoneal macrophages组别 动物数（只） 吞噬率（%） 转换值X P 吞噬指数 P 对照组 10 8.75±0.72 0.09±0.01 0.119±0.007 低剂量组 10 9.00±0.67 0.09±0.01 0.533 0.122±0.009 0.981 中剂量组 10 8.90±0.66 0.09±0.01 0.708 0.120±0.006 0.996 高剂量组 10 8.60±1.33 0.09±0.01 0.708 0.114±0.020 0.979 2.1.8 NK细胞活性测定
NK细胞免疫功能通过观察小鼠NK细胞对靶细胞的杀伤能力来评估其免疫反应。与对照组相比，各剂量组NK细胞活性均有提高，且低、中、高剂量组NK细胞活性依次增高，但均无显著性差异（P>0.05），结果见图7。说明本品在0.1~0.4 g/kg bw剂量范围内对NK细胞活性无明显影响。
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图 7 抗氧化膳食补充剂对NK细胞活性测定的影响Figure 7. Effects of antioxidant supplement on the NK cell activity2.2 急性毒性试验
抗氧化膳食补充剂急性毒性试验小鼠存活情况见表2。小鼠在观察期内动物活动、进食、行为等未见异常，急性毒性试验结果为最大耐受量MTD>20 g/kg bw（相当于成人日推荐量的1000倍），根据急性毒性分级属无毒级。
表 2 抗氧化膳食补充剂急性毒性试验结果Table 2. Acute toxicity test results of antioxidant supplement on mice性别 剂量（g/kg bw） 动物数（只） 初体重（g） 末体重（g） 死亡数（只） MTD（g/kg bw） 相当于人推荐量的倍数 雄 20 10 19.8±1.3 32.8±1.6 0 >20 1000 雌 20 10 19.5±1.1 26.2±1.0 0 >20 1000 2.3 遗传毒性试验
各试验使用的生物体和测量的终点是不同的，Ames试验使用细菌主要评估受试物的致癌潜力，骨髓细胞微核试验使用小鼠骨髓细胞主要评估受试物对细胞的影响，小鼠精子畸形试验使用小鼠精子主要评估受试物对生殖系统的影响。
2.3.1 Ames试验
Ames试验是一种细菌遗传毒性试验，通过观察受试物对细菌的诱变作用，评估其致癌潜力。抗氧化膳食补充剂Ames试验结果见表3和表4。从表中可以发现各浓度下，无论是否加入S9混合液，回变菌落数均未大于自发回变数的2倍，且未见剂量-反应关系。而各阳性对照组均显示强烈的诱变作用。根据Ames试验结果判断标准，本次试验测试的抗氧化膳食补充剂未见致突变作用。
表 3 抗氧化膳食补充剂第一次Ames试验结果Table 3. Ames test results of antioxidant supplement (first time)剂量（µg/皿） TA97 TA98 TA100 TA102 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 5000 115±13 121±14 31±1 32±3 132±11 139±14 267±16 276±15 1000 119±10 121±17 31±2 32±1 134±12 139±13 269±17 274±17 抗氧化膳食补充剂 200 119±15 123±14 32±1 32±2 135±10 142±14 270±15 277±16 40 120±15 122±18 32±2 32±1 137±11 145±12 270±18 273±21 8 118±19 125±12 32±2 32±2 138±11 142±14 272±17 277±17 自发回变 120±17 128±13 31±2 32±1 136±14 143±12 269±19 273±18 溶剂对照 119±12 129±10 32±2 31±1 139±10 146±12 271±17 274±19 阳性对照 （µg/皿） 2,4,7-TNFone 0.2 1166±138 1134±143 NaN3 1.5 1162±143 MMC 2.5 1181±133 2-AF 10.0 1149±82 1158±92 1210±114 1,8-二羟基蒽醌 50.0 1172±94 表 4 抗氧化膳食补充剂第二次Ames试验结果Table 4. Ames test results of antioxidant supplement (second time)剂量（µg/皿） TA97 TA98 TA100 TA102 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 5000 119±16 128±11 31±2 32±3 131±11 139±12 265±14 272±17 1000 123±11 128±14 32±1 32±1 134±11 140±12 269±14 270±17 抗氧化膳食补充剂 200 118±17 130±13 32±2 31±2 135±12 139±14 269±18 273±19 40 121±14 127±10 31±1 32±2 137±11 142±16 268±16 277±16 8 124±11 129±13 33±1 32±1 135±12 144±11 270±18 275±17 自发回变 124±13 129±10 32±3 31±2 136±11 140±13 269±17 276±12 溶剂对照 128±13 133±10 31±1 32±2 133±12 143±16 271±12 275±16 阳性对照 （µg/皿） 2,4,7-TNFone 0.2 1144±88 1155±91 NaN3 1.5 1144±129 MMC 2.5 1155±139 2-AF 10.0 1173±99 1152±117 1170±115 1,8-二羟基蔥醍 50.0 1137±87 2.3.2 骨髓细胞微核试验
骨髓细胞微核试验通过观察受试物对小鼠骨髓细胞的微核形成率，评估其对细胞的影响，检测出致畸和致癌物质。PCE/NCE是指嗜多染红细胞与正染红细胞的比值。由表5可见，该样品各剂量组PCE/NCE未少于溶剂对照组的20%，提示骨髓红细胞系统的增殖并无明显抑制，对嗜多染红细胞微核的观察无明显影响。与溶剂对照组相比，各样品剂量组微核发生率无显著性差异（P>0.05），而阳性对照组微核发生率明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），说明该样品未表现出使小鼠骨髓PCE微核率上升的致突变效应。根据该试验结果，本次试验测试的抗氧化膳食补充剂在2.5、5.0和10.0 g/kg bw剂量下未见致突变作用。
表 5 抗氧化膳食补充剂小鼠骨髓细胞微核试验结果Table 5. Results of the micronucleus test of antioxidant supplement on mouse bone marrow cells性别 剂量
（g/kg bw）动物数
（只）观察PCE数
（个）PCE/NCE 含微核PCE率 观察NCE数（个） PCE/NCE 观察PCE数（个） 含微核PCE数（个） 含微核PCE率（‰） 溶剂对照 5 1000 1010 0.99±0.04 5000 3 0.6±0.5 2.5 5 1000 1010 0.99±0.04 5000 2 0.4±0.5 雄 5.0 5 1000 1014 0.99±0.05 5000 4 0.8±0.4 10.0 5 1000 1061 0.94±0.02 5000 3 0.6±0.9 阳性对照 5 1000 1047 0.96±0.04 5000 116* 23.2±1.5* 溶剂对照 5 1000 1004 1.00±0.02 5000 4 0.8±0.4 2.5 5 1000 1006 1.00±0.05 5000 4 0.8±0.4 雌 5.0 5 1000 1027 0.97±0.03 5000 5 1.0±0.7 10.0 5 1000 1021 0.98±0.05 5000 2 0.4±0.5 阳性对照 5 1000 1037 0.96±0.02 5000 110* 22.0±2.4* 注：*表示与溶剂对照组相比，P<0.01。 2.3.3 小鼠精子畸形试验
小鼠精子畸形试验通过观察受试物对小鼠精子的形态和数量的影响，评估对雄性生育系统的毒性，尤其是精子质量的影响。由表6可见，该样品各剂量组与溶剂对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），阳性对照组与溶剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。试验组样品对小鼠精子畸形发生率未产生明显影响，表明该样品对小鼠精子不产生畸变作用。说明10.0 g/kg bw未见抗氧化膳食补充剂对小鼠精子有遗传毒性。
表 6 抗氧化膳食补充剂对小鼠精子畸形率的影响Table 6. Effect of antioxidant supplement on mouse sperm deformity组别 剂量
（g/kg bw）动物数
（只）受检精子数 畸形率
（%）试验组 2.5 5 5000 1.62±0.03 5.0 5 5000 1.78±0.19 10.0 5 5000 1.62±0.15 溶剂对照 5 5000 1.76±0.23 阳性对照 5 5000 7.48±0.33* 注：*表示与溶剂对照组相比，P<0.01。 2.4 亚急性毒性试验（30 d喂养试验）
整个试验期间，动物毛色正常，未见行为异常，无死亡发生。各剂量组（0.5、1.0、2.0 g/kg bw）动物增重与对照组经单因素方差分析比较差异无显著性（P>0.05）。试验末期血常规指标（血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞）测定结果与对照组比较，均未见异常。血液生化学检查所测各剂量组大鼠的血清指标（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、肌酊、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白）与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。各剂量组大鼠组织病理学检查结果正常，各剂量组与对照组比较未见明显生物学差异，提示试验样品对肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸无明显损伤作用。
3. 讨论与结论
雨生红球藻是我国食品级虾青素主要来源，本研究为以雨生红球藻（虾青素）为主的抗氧化膳食补充剂增强免疫力用量制定提供试验依据。根据文献报道，雨生红球藻来源的虾青素人体推荐用量为2 mg/d以上[11]，我国雨生红球藻新资源食品的公告规定虾青素食用量≤12 mg/d，二者关注点不同，但都没有准确的作用剂量。本研究表明，本品中、高剂量组明显增强小鼠脾淋巴细胞增殖能力，高剂量组明显增强DNFB诱导的小鼠迟发型变态反应和小鼠抗体生成能力，说明雨生红球藻来源的抗氧化膳食补充剂对小鼠的免疫功能有显著的提高作用。本实验表明，小鼠低、中、高三个剂量组剂量分别为0.1、0.2、0.4 g/kg bw，抗氧化膳食补充剂提高免疫功能能力随剂量增加而增强，低剂量组没有明显作用，中、高剂量组能明显提高免疫功能作用，按小鼠与人体推荐量10倍系数换算，建议成人（60 kg）食用量为每人每天8 mg。
雨生红球藻增强免疫力的机制推测可能与虾青素的抗氧化活性密切相关。单线态氧是氧分子的一种特殊存在形式，具有很强的生物活性，对动物的免疫系统有细胞毒性作用，它有助于产生导致巨噬细胞膜降解的自由基，导致吞噬效率和抗原呈递能力降低[12−13]。该自由基也会攻击T淋巴细胞和B淋巴细胞。T淋巴细胞介导细胞免疫后的激活和增殖反应是免疫应答的核心[14]，T淋巴细胞被攻击后刺激免疫反应清除抗原。B淋巴细胞受到刺激后，IgA、IgE和IgM会与抗原结合并清除自由基[15]。当这两种免疫细胞受到自由基攻击时，整个免疫系统会受到影响。研究表明，虾青素可以淬灭单线态氧，直接清除氧自由基，稳定免疫细胞膜结构，通过保护各种免疫系统的完整性增强细胞免疫力[16−17]。
毒理研究证明了雨生红球藻粉的食用安全性。陈东方等[18]分别给予1.8、3.6、7.2 g/kg bw的雨生红球藻粉，连续喂养大鼠90 d，未观察到雨生红球藻粉有明显的毒性反应。王彦武等[19]、刘颖芬等[20]采用不同剂量的雨生红球藻进行小鼠急性经口毒性试验、遗传毒性试验和大鼠30 d喂养试验，急性毒性试验结果表明受试物最大耐受量为无毒级；遗传毒性结果均为阴性；30 d喂养试验未发现受试物有损伤作用。因此，雨生红球藻单独食用安全性较高。
维生素E作为营养素补充剂，《中国居民膳食营养推荐摄入量》中成人用量为5～150 mg/d，添加了维生素E的雨生红球藻安全性较高，并具有增强免疫力作用[10]。维生素E可能通过影响免疫细胞的细胞因子、趋化因子和活性氧的水平，在机体免疫反应中发挥重要作用[21−22]。
富硒酵母能使机体的非特异性免疫、细胞免疫及体液免疫功能得到改善[23−24]，能增加肝脏抗氧化能力和改善肝损伤[25]。王玉娥等[26]研究了酵母硒对小鼠肿瘤生长和机体非特异性免疫功能的影响，证明酵母硒对荷瘤EAC小鼠NK细胞活性和碳廓清吞噬功能有增强作用。小鼠硒剂量分别为3.2和6.4 μg/kg bw·d，折合60 kg人体硒摄入量为19.2、38.4 μg/d。姜典镇等[27]按照一定的含量（硒：0.2 mg/g；维生素E：8 mg/g）按比例混合成胶体硒环状糊精包接复合物粉剂与维生素E微胶囊化粉剂，通过小鼠灌胃进行免疫功能试验。结果显示该产品对小鼠抗体生成细胞数、NK细胞活性、ConA诱导小鼠淋巴细胞转化、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力有显著作用。表明硒、维生素E对小鼠免疫功能具有调节作用。该文中剂量组42 mg/kg bw，折合60 kg人体Se 50 μg/d。本品硒用量为每人70 μg/d，高于上述用量，具有增强免疫力功能。富硒酵母属于食品营养强化剂，是通过酵母菌种发酵而成，酵母菌种可以将培养基终毒性较大的亚硒酸钠转化为有机态硒，再经分离、干燥等工艺制成富硒酵母，可以提高补硒的安全性。辛成龙[28]研究富硒酵母的急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性，表明富硒酵母为无毒级物质，未见有遗传毒性和亚急性毒性作用。
蜂花粉是指蜜蜂采蜜时带回的花粉团，为普通食品原料。人体食用蜂花粉1～2 g/d具有增强免疫力功能[29−31]。黄酮类化合物是植物抗氧化剂主要来源，具有增强免疫力功能。由于黄酮类化合物易溶于乙醇，本品采用80%食用酒精回流提取，能较好地提取出蜂花粉黄酮，为本品增强免疫力功能提供了功效成分。
本抗氧化膳食补充剂是在证明了由雨生红球藻虾青素和维生素E配方的安全性和功能性基础上[20]，添加富硒酵母和蜂花粉，增加硒和黄酮含量，这四种都是公认的抗氧化剂。根据急性毒性试验结果，表明该抗氧化膳食补充剂属于无毒级，遗传毒性试验（Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）阴性表明无遗传毒性，大鼠30 d喂养试验结果也表明食用的安全性。因此，该抗氧化膳食补充剂的用量符合安全食用剂量的要求，并具有增强免疫功能。
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图 1 抗氧化膳食补充剂对胸腺指数、脾指数的影响
Figure 1. Effects of antioxidant supplement on the thymus and spleen index
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图 3 抗氧化膳食补充剂对迟发型变态反应试验的影响
Figure 3. Effects of antioxidant supplement on cellular immunity test of DNFB-induced delayed type hypersensitivity
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图 4 抗氧化膳食补充剂对血清溶血素试验的影响
Figure 4. Effects of antioxidant supplement on humoral immunity tests of serum haemolysin analysis
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图 5 抗氧化膳食补充剂对抗体生成细胞检测试验的影响
Figure 5. Effects of antioxidant supplement on humoral immunity tests of antibody-producing cell assay
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图 6 抗氧化膳食补充剂对碳廓清试验的影响
Figure 6. Effects of antioxidant supplement on mononuclear-macrophages phagocytic index a of carbon clearance test
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图 7 抗氧化膳食补充剂对NK细胞活性测定的影响
Figure 7. Effects of antioxidant supplement on the NK cell activity
表 1 抗氧化膳食补充剂对巨噬细胞吞噬试验的影响
Table 1 Effects of antioxidant supplement on phagocytosis of peritoneal macrophages
组别 动物数（只） 吞噬率（%） 转换值X P 吞噬指数 P 对照组 10 8.75±0.72 0.09±0.01 0.119±0.007 低剂量组 10 9.00±0.67 0.09±0.01 0.533 0.122±0.009 0.981 中剂量组 10 8.90±0.66 0.09±0.01 0.708 0.120±0.006 0.996 高剂量组 10 8.60±1.33 0.09±0.01 0.708 0.114±0.020 0.979 
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表 2 抗氧化膳食补充剂急性毒性试验结果
Table 2 Acute toxicity test results of antioxidant supplement on mice
性别 剂量（g/kg bw） 动物数（只） 初体重（g） 末体重（g） 死亡数（只） MTD（g/kg bw） 相当于人推荐量的倍数 雄 20 10 19.8±1.3 32.8±1.6 0 >20 1000 雌 20 10 19.5±1.1 26.2±1.0 0 >20 1000
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表 3 抗氧化膳食补充剂第一次Ames试验结果
Table 3 Ames test results of antioxidant supplement (first time)
剂量（µg/皿） TA97 TA98 TA100 TA102 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 5000 115±13 121±14 31±1 32±3 132±11 139±14 267±16 276±15 1000 119±10 121±17 31±2 32±1 134±12 139±13 269±17 274±17 抗氧化膳食补充剂 200 119±15 123±14 32±1 32±2 135±10 142±14 270±15 277±16 40 120±15 122±18 32±2 32±1 137±11 145±12 270±18 273±21 8 118±19 125±12 32±2 32±2 138±11 142±14 272±17 277±17 自发回变 120±17 128±13 31±2 32±1 136±14 143±12 269±19 273±18 溶剂对照 119±12 129±10 32±2 31±1 139±10 146±12 271±17 274±19 阳性对照 （µg/皿） 2,4,7-TNFone 0.2 1166±138 1134±143 NaN3 1.5 1162±143 MMC 2.5 1181±133 2-AF 10.0 1149±82 1158±92 1210±114 1,8-二羟基蒽醌 50.0 1172±94
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表 4 抗氧化膳食补充剂第二次Ames试验结果
Table 4 Ames test results of antioxidant supplement (second time)
剂量（µg/皿） TA97 TA98 TA100 TA102 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 −S-9 +S-9 5000 119±16 128±11 31±2 32±3 131±11 139±12 265±14 272±17 1000 123±11 128±14 32±1 32±1 134±11 140±12 269±14 270±17 抗氧化膳食补充剂 200 118±17 130±13 32±2 31±2 135±12 139±14 269±18 273±19 40 121±14 127±10 31±1 32±2 137±11 142±16 268±16 277±16 8 124±11 129±13 33±1 32±1 135±12 144±11 270±18 275±17 自发回变 124±13 129±10 32±3 31±2 136±11 140±13 269±17 276±12 溶剂对照 128±13 133±10 31±1 32±2 133±12 143±16 271±12 275±16 阳性对照 （µg/皿） 2,4,7-TNFone 0.2 1144±88 1155±91 NaN3 1.5 1144±129 MMC 2.5 1155±139 2-AF 10.0 1173±99 1152±117 1170±115 1,8-二羟基蔥醍 50.0 1137±87
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表 5 抗氧化膳食补充剂小鼠骨髓细胞微核试验结果
Table 5 Results of the micronucleus test of antioxidant supplement on mouse bone marrow cells
性别 剂量
（g/kg bw）动物数
（只）观察PCE数
（个）PCE/NCE 含微核PCE率 观察NCE数（个） PCE/NCE 观察PCE数（个） 含微核PCE数（个） 含微核PCE率（‰） 溶剂对照 5 1000 1010 0.99±0.04 5000 3 0.6±0.5 2.5 5 1000 1010 0.99±0.04 5000 2 0.4±0.5 雄 5.0 5 1000 1014 0.99±0.05 5000 4 0.8±0.4 10.0 5 1000 1061 0.94±0.02 5000 3 0.6±0.9 阳性对照 5 1000 1047 0.96±0.04 5000 116* 23.2±1.5* 溶剂对照 5 1000 1004 1.00±0.02 5000 4 0.8±0.4 2.5 5 1000 1006 1.00±0.05 5000 4 0.8±0.4 雌 5.0 5 1000 1027 0.97±0.03 5000 5 1.0±0.7 10.0 5 1000 1021 0.98±0.05 5000 2 0.4±0.5 阳性对照 5 1000 1037 0.96±0.02 5000 110* 22.0±2.4* 注：*表示与溶剂对照组相比，P<0.01。
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表 6 抗氧化膳食补充剂对小鼠精子畸形率的影响
Table 6 Effect of antioxidant supplement on mouse sperm deformity
组别 剂量
（g/kg bw）动物数
（只）受检精子数 畸形率
（%）试验组 2.5 5 5000 1.62±0.03 5.0 5 5000 1.78±0.19 10.0 5 5000 1.62±0.15 溶剂对照 5 5000 1.76±0.23 阳性对照 5 5000 7.48±0.33* 注：*表示与溶剂对照组相比，P<0.01。
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