Ultrasonic Assisted Ethanol Extraction of Selenium and Antioxidants from Selenium-rich Hibiscus manihot L.
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摘要: 为促进优质天然富硒植物资源的科学开发利用，本文选取富硒金花葵为研究对象，采用氢化物发生-原子荧光光谱法（Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）检测不同植物器官样品中的硒含量，超声波辅助乙醇提取金花葵花朵中的含硒有机活性组分并使用响应面法优化获得最佳提取工艺，同时对含硒提取物开展抗氧化活性研究。结果显示，金花葵各器官中硒含量从高到低依次为叶、果、花、根和茎，分别为21.99、14.29、12.93、10.90和10.23 mg/kg。响应面优化结果表明，含硒有机活性成分最佳提取参数为提取温度40 ℃、固液比1:60、提取时间40 min、超声功率350 W、乙醇浓度50%（V/V）和提取次数1次。在最佳提取参数下，硒的提取率为35.65%±0.65%。DPPH抗氧化活性测定结果显示，含硒有机活性成分的半抑制浓度（IC50）为0.048 mg/mL（硒元素浓度为0.79 μg/mL），羟基自由基清除实验显示样品浓度为8 mg/mL时达到最大清除率97%，IC50为0.56 mg/mL，还原力实验表明样品的还原能力随样品浓度的增大而增强。证明金花葵的含硒乙醇提取物具有良好的抗氧化能力。本研究可以为合理利用富硒金花葵和研发加工富硒农副作物提供一些理论依据。Abstract: To promote scientific progress and optimize the utilization of natural plant resources that rich in selenium, the study selected selenium-rich Hibiscus manihot L. as the research object, using the HG-AFS to detect the selenium content in different plant organ samples, ultrasound assisted ethanol extraction of selenium containing organic active components from sunflower flowers, and obtaining the optimal extraction process by response surface methodology. At the same time, conducting antioxidant activity research on selenium containing extracts. The results showed that the total Se concentrations in different organs of Hibiscus manihot L., from highest to lowest were found in the leaves, fruits, flowers, roots, and stems, with concentrations of 21.99, 14.29, 12.93, 10.90, and 10.23 mg/kg, respectively. The RSM optimization results indicated that the ideal conditions for the extraction parameters were as follows: Extraction temperature of 40 ℃, solid-liquid ratio of 1:60, extraction time of 40 minutes, ultrasonic power of 350 W, ethanol concentration of 50% (V/V), under one-time extraction. For the optimal conditions, the selenium extraction rate was 36.65%±0.65%. The DPPH antioxidant activity analysis showed a half-inhibitory concentration (IC50) value of 0.048 mg/mL (with a Se concentration of 0.79 μg/mL), the hydroxyl radical scavenging analysis showed that the maximum clearance rate was 97% when the extracts concentration was 8 mg/mL, and the IC50 was 0.56 mg/mL. The reducing power analysis showed that the reducing power of the extracts increases with the increase of the concentration, indicating that the extracts possess a good antioxidant capacity. The present study would provide empirical evidence to support the efficient use of selenium-rich Hibiscus manihot L. and the extraction of selenium-rich agricultural by-products.
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金花葵（Hibiscus manihot L.），别名菜芙蓉、野芙蓉等。一年生葵锦科秋葵属草本植物，形态与秋葵类似，果实可入药[1−2]，多生长于山中，易成活且在高重金属环境下仍能萌发[3]。金花葵被认为是200多种秋葵属植物中药用价值最高的一种，其花朵和果实中富含黄酮、多酚、多糖等小分子有机化合物[4]，且研究发现它对硒元素具有较强的富集能力。硒是一种人体必需的微量元素[5−6]，可通过参与合成谷胱甘肽过氧化物酶来影响人体多项生理活动和健康[7−8]。
目前植物源含硒活性成分的提取和应用是一个非常热门的研究方向，金花葵是一种高药用价值的天然富硒植物，但关于富硒金花葵中含硒活性成分提取的研究较少，因此，开展其含硒活性成分提取优化实验及抗氧化活性研究对高附加值的富硒产品开发具有重要意义。传统方法主要有碱提法、醇提法、酶提法和水提法等[9−11]，这些方法所用提取试剂简单且易于规模化应用。常用的辅助提取技术有超声微波辅助、电磁脉冲辅助和高温高压辅助等手段，其中超声辅助提取的设备易得且操作简单，适合各类样品的提取[12−13]。实验中涉及的提取条件有提取次数、提取温度、提取时间、超声功率、固液比和提取试剂浓度等[14−19]。Macias等[20]使用超声乙醇提取鼠尾草中的多酚化合物，优化得到在75%乙醇、30%振幅和10 min提取条件下，提取物中多酚组分的抗氧化活性和浓度均达到最佳水平。刘剑[1]使用热水提取金花葵籽中的硒多糖，得到最优条件为3.3 h、温度71 ℃和固液比1:31，此时硒多糖提取率最高为13.58%。本研究采用乙醇超声辅助提取的方式对富硒金花葵中的含硒活性组分进行提取，通过单因素实验和响应面试验得到最佳提取条件，并对提取物开展抗氧化活性研究，为富硒金花葵的合理开发利用提供数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
富硒金花葵样品 依托安康国硒源科技有限公司种植并采样；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH自由基试剂） 福州飞净生物科技有限公司；硒标准溶液 北京北方伟业计量研究院；乙醇 分析纯（AR），天津市天力化学试剂有限公司；硼氢化钾 分析纯（AR），天津市科密欧化学试剂有限公司；双氧水溶液（30%）、硝酸、盐酸为优级纯（GR）、水杨酸、三氯乙酸、硫酸亚铁、氯化铁、铁氰化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和氢氧化钾均为分析纯（AR） 国药集团化学试剂有限公司。
HGF-V2原子荧光光度计 北京海光仪器有限公司；KQ-100DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UV-Mini1285型紫外分光光度计 岛津（上海）实验器材有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 富硒金花葵样品前处理
在陕西安康市金花葵种植大田中随机选取五个采样点，采集盛花期、无虫害的金花葵完整植株，按照采样地点分别为JHK-1、JHK-2、JHK-3、JHK-4、JHK-5。带回实验室，按照根、茎、叶、花、果分开，经自来水清洗干净后，再用超纯水清洗3次以上，控干水分，置于干燥箱内烘干至恒重。使用高速破壁机将样品破碎，过60目筛，并于4 ℃下避光保存。
1.2.2 金花葵硒活性成分的提取方法
精确称取1.0000±0.0005 g金花葵花朵样品于100 mL离心管中，加入40 mL 50%（V:V）的乙醇水溶液，混合均匀后在250 W的超声功率下提取1 h，提取液经4000 r/min离心15 min，将上清液转移至干净的100 mL离心管中并保存于4 ℃条件下。
1.2.3 富硒金花葵各器官硒含量检测前处理
粉末样品硒含量检测方法（高温密闭消解法）：准确称取0.1000±0.0005 g样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入3 mL硝酸和1 mL双氧水，冷消1 h，然后加钢套于160 ℃烘燥箱中消解12 h以上，冷却取出后置于130 ℃电热板上，蒸发样品溶剂至近干，加入2 mL 50%（V/V）盐酸溶液于100 ℃还原30 min，再用10%盐酸溶液定容至10 mL。
1.2.4 富硒金花葵样品的含量测定
样品硒含量检测均采用氢化物发生-原子荧光光谱法（Hydride Generation Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）测试，消解方法和仪器参数修改自参考文献[21−23]。仪器参数如下：负高压240 V，灯电流30 mA，载气流量600 mL/min，屏蔽气流量400 mL/min，载流10%盐酸溶液，还原剂0.5%（M/V）氢氧化钾+1%（M/V）硼氢化钾溶液，还原剂用量为1.5 mL/次；采用峰面积法，读取时间5~25 s。
C=c×V0×DM (1) 式中：C为金花葵各器官硒的浓度，mg/kg；c为测试液硒浓度，ng/mL；V0为测试液总体积，mL；D为样品稀释倍数；M为金花葵样品称取重量，g。
1.2.5 提取液中硒含量检测方法
使用移液枪准确吸取5 mL提取液于聚四氟乙烯的消解罐中，在130 ℃电热板上蒸发至0.2 mL左右，加入3 mL浓硝酸，加盖130 ℃消解5 h，消解完成后去盖蒸至近干，后续还原步骤同1.2.3中的方法。硒提取率的计算公式如下所示：
W=c×V1×Dm (2) 式中：W为硒的提取率，%；c为使用标准曲线法计算出的硒浓度，ng/mL；V1为测试液总体积，mL；D为样品稀释倍数；m为金花葵花朵的总硒含量，μg。
1.2.6 超声波辅助乙醇提取富硒金花葵花朵中含硒活性成分的条件优化
1.2.6.1 单因素实验设计
对富硒金花葵粉末开展提取实验，分别考察了提取温度（20、30、40、50、60 ℃），固液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:60、1:80），提取时间（10、20、30、40、50、60 min），超声波功率（250、300、350、400、450、500 W），乙醇浓度（0、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），提取次数（1、2、3次）六个因素对金花葵中含硒活性成分提取率的影响。
1.2.6.2 响应面试验设计
在单因素实验结果基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计开展三因素三水平响应面优化试验，将乙醇浓度、固液比和超声功率作为优化条件，探究三个因素对其提取率的影响，其他试验条件为：提取次数1次，提取温度为40 ℃，提取时间为40 min，条件范围的选择参照单因素优化条件的最大值相邻的参数作为优化参数，选择因素和水平设计如表1所示。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Design of the response surface test factor level水平 因素 乙醇浓度（%） 固液比（g/mL） 超声功率（W） 1 80 1:80 400 0 50 1:60 350 −1 20 1:40 300 1.2.7 DPPH清除能力测定
方法参考文献[24−26]并适当修改。DPPH自由基溶液的配制：准确称取0.008 g DPPH固体于烧杯中，使用无水乙醇溶解后定容至100 mL棕色容量瓶，得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。将1.0 g富硒金花葵提取物使用50%乙醇水溶液定容至100 mL容量瓶，分别制作浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、4、8 mg/mL的溶液，维生素C的配制与金花葵提取物相同。取配好的不同梯度的两种溶液2 mL于比色管中，加入上述配好的DPPH溶液2 mL，充分混合后避光保存30 min后在517 nm处测定其吸光度，使用维生素C作为阳性对照样品进行试验。DPPH自由基清除率计算公式：
清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (3) 式中：A1为提取物溶液加入DPPH溶液后在517 nm处的吸光度；A2为提取物溶液加入2 mL无水乙醇后在517 nm处的吸光度；A0为2 mL无水乙醇加入2 mL DPPH后在517 nm下的吸光度。
提取物半抑制浓度IC50计算方式参照改良寇式法[27]，具体方式如下：
lgIC50=Xm−Ip−(3−Pm−Pn)4 (4) 式中：IC50为半抑制浓度，mg/mL；Xm为最大剂量的以10为底的对数；I为最大浓度和相临浓度的比值求以10为底的对数；P为自由基清除效率之和；Pm为数据内最大自由基清除率，mg/mL；Pn为数据内最小自由基清除率。
1.2.8 羟基自由基清除能力测定
参照刘剑[1]的方法，准确称取不同浓度的待测溶液1 mL于比色管中，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸的乙醇溶液，混合均匀后加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液水浴37 ℃反应30 min，样品在510 nm处测定吸光度。IC50的计算同DPPH自由基。
清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (5) 式中：A1为提取物溶液反应后在510 nm处的吸光度；A2为提取物溶液加入2 mL无水乙醇的吸光度；A0为加入2 mL无水乙醇的吸光度。
1.2.9 还原能力测定
参考刘剑[1]的方法，取1 mL上述不同浓度的提取物溶液于比色管中，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（K2HPO4-K2HPO4，pH=6.6），1 mL 1%（W/V）的铁氰化钾溶液，混合均匀后与水浴锅中50 ℃下反应20 min。混合物加入1 mL三氯乙酸反应一段时间后离心，取上清液2 mL加入2 mL去离子水和0.4 mL 0.1%（W/V）的铁氰化钾溶液，静置反应一段时间后在700 nm处测定吸光值。
1.3 数据处理
所有实验均做三次平行，结果使用平均值±标准差表示，分别使用SPSS 26.0和Origin 2021进行数据分析和作图，使用斯皮尔曼相关系数开展单因素分析，其中|r|越接近1，表明两组数据相关性越强，使用Design-expert 12.0进行响应面作图和方差分析，当P>0.05时认为结果不显著，P<0.05时显著，P<0.01时极显著。
2. 结果与分析
2.1 富硒金花葵各器官硒的分布
由图1可知，样品中硒元素含量累积量最大的是叶，其次是花和果实，按照硒元素平均值从高到低依次为叶、果、花、根、茎，硒元素含量分别为21.99、14.29、12.93、10.90、10.23 mg/kg。根施处理硒元素在地上部分的累积程度最高，这一实验结果与李哲[28]的研究结果一致。本研究中硒元素主要存在于叶中，可能是因为其植株较大，叶生物量较大，导致硒转运至花和果的部分较少，植株中叶的硒累积量最大。
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图 1 金花葵各器官硒含量分布图注：实线代表中位数，点划线代表均值（n=5）。Figure 1. Selenium distribution in organs of Hibiscus manihot L.2.2 提取条件优化
2.2.1 单因素实验结果
提取温度优化结果如图2A，相关分析表明，温度对提取率的影响较小（r=−0.198，P>0.05），硒提取率随温度变化呈上下波动。可能是因为温度逐渐上升时，部分乙醇分子达到饱和蒸汽压以气态分子的形式存在，这部分溶剂不能起到提取的效果，导致提取传质效率下降，使样品的提取效果变差。
固液比优化如图2B，相关分析表明，固液比对提取效果的影响极大，（r=0.940，P<0.05）硒提取率随固液比的增大逐渐增大，到达1:80的固液比时，样品中的硒元素含量略微下降，固液比过大对提取效果反而有负作用，原因可能是固液比过大时，样品的溶剂不能很好的接受超声的能量，从而导致样品的提取效果变差[29]。整体来看，样品在溶剂量不足时不能将含硒元素的物质完全提取，因此需要选用较大固液比完成实验。
提取时间优化如图2C，相关分析表明，提取时间对提取效果影响较小（r=−0.340，P>0.05），硒提取率随时间变化先上升后下降，可能的原因是样品在40 min时，分子的交换已经达到终点，溶剂继续与样品接触，样品中其他杂质成分会相继溶出，使得样品提取过程中的溶出效率变差[30]。
超声功率优化如图2D，相关分析表明，超声功率对提取效果影响较大（r=0.528，P<0.01），样品的提取效果随超声功率的改变，呈现先增大后减小的趋势，对样品的影响程度较小，可能的原因是由于超声功率的增大，样品接受能量后增大了溶出率，然而当超声能量继续增大时，样品除硒组分以外，其他杂质也相继溶出，造成提取效果的下降[31]。
乙醇浓度优化如图2E，相关分析表明，乙醇浓度的改变对提取率影响较大（r=−0.472，P<0.05），硒提取率随乙醇浓度改变呈现先增大后减小的趋势[32]，样品在40%~60%浓度下样品的提取率最高，而乙醇在100%比例时提取液中没有检测到硒元素含量，可能是因为样品乙醇占比变大时溶液的极性更接近乙醇的极性，导致提取出来的杂质变多，影响了样品的提取率。
提取次数优化如图2F所示，相关分析表明，提取次数对提取率的影响极大（r=−0.879，P<0.01），随提取次数增加硒提取率极大降低，一次提取占三次提取总硒含量的97.32%，可以认为样品在一次提取中得到了全部提取的硒，这可能得益于样品实验过程中选择较大的固液比，可以一次将硒小分子提取完成[11]。
单因素的优化结果表明，六个单因素优化结果的相关性从大到小分别是固液比、提取次数、乙醇浓度、超声功率、提取时间和提取温度（0.940>0.879>0.528>0.472>0.340>0.198），有显著影响的参数分别是固液比，提取次数，乙醇浓度和超声功率。然而样品的提取次数影响虽大，却没有优化的必要，原因是一次提取的效果基本达到最佳条件，因此最终选择固液比、乙醇浓度和超声功率作为多因素优化实验的因子。
2.2.2 响应面试验结果
响应面优化结果见表2，优化模型为二次项多项式模型，拟合方程为：
表 2 响应面试验设计与结果Table 2. Design and test results of response surface optimization实验号 固液比 乙醇浓度 超声功率 硒提取率（%） 1 −1 −1 0 14.48±0.83 2 1 −1 0 12.95±0.95 3 −1 1 0 12.21±0.35 4 1 1 0 10.65±0.46 5 −1 0 −1 25.14±0.73 6 1 0 −1 24.82±0.88 7 −1 0 1 28.04±0.94 8 1 0 1 25.22±0.86 9 0 −1 −1 15.42±0.35 10 0 1 −1 14.08±0.38 11 0 −1 1 16.04±0.69 12 0 1 1 17.16±0.73 13 0 0 0 36.23±1.35 14 0 0 0 35.91±1.67 15 0 0 0 36.75±1.49 16 0 0 0 36.62±1.33 17 0 0 0 35.99±1.89 Y=−261.80764+2.22006×A+1.71826×B+1.06945×C−0.000012×AB−0.000625×AC+0.000410×BC− 0.016997×A2−0.018810×B2−0.001479×C2
由表3可知，二次项回归模型P检验值为0.0001（P<0.05），失拟项为0.0630，表示模型有显著的统计学意义，R2的值为0.9981，Adjusted R2的值为0.9957，表明该模型拟合程度良好，该模型的变异系数为2.77%。单因素相关性分析中，固液比（A）的F检验值为11.54，P值为0.0115（P<0.05），有显著的统计学意义；乙醇浓度（B）F检验值为6.82，P值为0.0348（P<0.05），显示有显著的相关性。超声功率（C）的F检验值为14.57，P值为0.0066（P<0.05），存在明显的相关性。交互项的检验表明，三种交互项均不存在明显的相关性（P检验均大于0.05），各实验因子之间不存在互相影响。二次项分析显示，三种单因素的二次项均显著。综上，三个因素对模型均有较大影响，且影响程度从大到小依次为超声功率、固液比、乙醇浓度。
表 3 响应面回归模型方差分析Table 3. Response surface quadratic model analysis of variance方差源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 1579.75 9 175.53 417.41 <0.0001 ** A 4.85 1 4.85 11.54 0.0115 * B 2.87 1 2.87 6.82 0.0348 * C 6.13 1 6.13 14.57 0.0066 ** AB 0.0002 1 0.0002 0.0005 0.9822 AC 1.56 1 1.56 3.72 0.0952 BC 1.51 1 1.51 3.60 0.0997 A2 194.62 1 194.62 462.82 <0.0001 ** B2 1206.66 1 1206.66 2869.47 <0.0001 ** C2 57.53 1 57.53 136.80 <0.0001 ** 残差 2.94 7 0.4205 失拟项 2.39 3 0.7952 5.70 0.0630 纯误差 0.5580 4 0.1395 注：表中*表示P<0.05，表明两者之间具有显著性，**表示P<0.01，表明两者之间有极显著性，R2=0.9981；R2adj=0.9957；R2pred=0.9753；CV%=2.77。 根据模型，制作含有等高线图的三维响应曲面，结果如图3~图5所示，依照优化结果分析不同因素之间的相互作用对提取率的影响，图3显示乙醇浓度和固液比对提取效果的影响较大，但没有发现明显的交互影响，图4可得乙醇浓度对样品的影响较大，但超声功率的变化曲线较为平缓，说明乙醇浓度和超声功率交互项对提取效果影响不大，图5显示超声功率和固液比的影响均较大，但交互项影响不显著。根据响应面优化模型得到样品的最佳提取条件为固液比1:58.74，乙醇浓度49.54%、超声功率356.2 W，此时硒提取率预测值为36.38%，为方便后续的实验方案进行，将样品的优化参数取整，最终得到样品的优化方案为乙醇浓度50%、超声功率350 W、固液比1:60，提取时间40 min、提取温度40 ℃、提取次数一次。使用上述优化条件，得到提取后样品的硒得率为35.65%±0.65%，与预测值的相对标准偏差为2.0%，证明该模型可以达到优化提取的目的。
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图 3 乙醇浓度-固液比响应面分析Figure 3. Response surface analysis of solid-liquid ratio and ethanol concentration![]()
图 5 超声功率-固液比应面分析Figure 5. Response surface analysis ultrasonic power and solid-liquid ratio![]()
图 4 乙醇浓度-超声功率响应面分析Figure 4. Response surface analysis of ethanol concentration and ultrasonic power在最优条件下，选择10 g金花葵花朵样品进行提取试验，提取液使用旋转蒸发仪快速去除溶剂后经冷冻干燥机制成干样，所得提取物干粉共3.71 g。经消解处理和HG-AFS检测，本次提取产物中总硒浓度为15.68±0.47 mg/kg。
2.3 含硒乙醇提取物抗氧化活性结果分析
2.3.1 DPPH自由基清除率评价
由图6可得，样品在浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL时，DPPH自由基的清除效率随样品的浓度增大也相应增大，当样品的浓度为4 mg/mL时，样品的自由基清除效率与VC基本一致，约为97%，此时认为样品中的DPPH自由基已经完全被提取液的硒还原性组分中和。通过改良寇式计算法可得提取物的IC50为0.048 mg/mL，此时溶液中硒元素含量为0.79 μg/mL。刘剑[1]提取金花葵中的富硒多糖，得到多糖的DPPH自由基的半抑制浓度约为1.8 mg/mL，崔琦[2]提取金花葵中的黄酮组分，得到DPPH自由基的IC50为0.166 mg/mL。本研究中的DPPH自由基IC50为0.048 mg/mL，说明提取物中含硒可以增强其抗氧化能力。
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图 6 金花葵乙醇提取物的DPPH自由基抑制率Figure 6. DPPH free radical inhibition rate of ethanol extract from Hibiscus manihot L.2.3.2 羟基自由基清除力评价
从图7中可以得出，随着样品的质量浓度增大，样品的羟基自由基清除效率也逐渐增大，当提取物浓度达到8 mg/mL时样品的羟基自由基清除效率与VC的清除效率基本一致，为97.0%，IC50为0.56 mg/mL，证明提取物有较强的羟基自由基清除能力。
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图 7 金花葵乙醇提取物的羟基自由基清除能力Figure 7. Scavenging effects on ·OH of ethanol extracts from Hibiscus manihot L.2.3.3 还原力评价
金花葵乙醇提取物还原能力曲线如图8所示，由图8可知，金花葵乙醇提取物与VC的还原能力均随着浓度的增大而增强，显示出提取物较强的还原能力。
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图 8 金花葵乙醇提取物的还原能力Figure 8. Reduction ability of ethanol extracts from Hibiscus manihot L.3. 结论
本研究通过检测富硒金花葵硒含量，发现金花葵具有较强的富硒能力，硒主要集中于地上部分且叶片富硒能力最强，硒含量高达22 mg/kg，是根和茎的2倍以上。富硒金花葵花朵中含硒活性成分的提取优化结果显示，最佳提取条件为：提取温度40 ℃、固液比1:60、提取时间40 min、超声功率350 W、乙醇浓度50%，提取1次，在此条件下，金花葵花朵的硒提取率为35.65%±0.65%。含硒提取物DPPH抗氧化活性测试和羟基自由基清除效率实验和还原力实验结果证明，提取物有良好的抗氧化能力。本研究结果可以为富硒金花葵提取含硒活性成分提供数据支持，然而对硒在金花葵中的转运机制和含硒活性成分的组成及其药用价值仍需开展深入研究。
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图 1 金花葵各器官硒含量分布图
注：实线代表中位数，点划线代表均值（n=5）。
Figure 1. Selenium distribution in organs of Hibiscus manihot L.
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图 3 乙醇浓度-固液比响应面分析
Figure 3. Response surface analysis of solid-liquid ratio and ethanol concentration
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图 5 超声功率-固液比应面分析
Figure 5. Response surface analysis ultrasonic power and solid-liquid ratio
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图 4 乙醇浓度-超声功率响应面分析
Figure 4. Response surface analysis of ethanol concentration and ultrasonic power
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图 6 金花葵乙醇提取物的DPPH自由基抑制率
Figure 6. DPPH free radical inhibition rate of ethanol extract from Hibiscus manihot L.
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图 7 金花葵乙醇提取物的羟基自由基清除能力
Figure 7. Scavenging effects on ·OH of ethanol extracts from Hibiscus manihot L.
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图 8 金花葵乙醇提取物的还原能力
Figure 8. Reduction ability of ethanol extracts from Hibiscus manihot L.
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Design of the response surface test factor level
水平 因素 乙醇浓度（%） 固液比（g/mL） 超声功率（W） 1 80 1:80 400 0 50 1:60 350 −1 20 1:40 300 
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表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and test results of response surface optimization
实验号 固液比 乙醇浓度 超声功率 硒提取率（%） 1 −1 −1 0 14.48±0.83 2 1 −1 0 12.95±0.95 3 −1 1 0 12.21±0.35 4 1 1 0 10.65±0.46 5 −1 0 −1 25.14±0.73 6 1 0 −1 24.82±0.88 7 −1 0 1 28.04±0.94 8 1 0 1 25.22±0.86 9 0 −1 −1 15.42±0.35 10 0 1 −1 14.08±0.38 11 0 −1 1 16.04±0.69 12 0 1 1 17.16±0.73 13 0 0 0 36.23±1.35 14 0 0 0 35.91±1.67 15 0 0 0 36.75±1.49 16 0 0 0 36.62±1.33 17 0 0 0 35.99±1.89
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表 3 响应面回归模型方差分析
Table 3 Response surface quadratic model analysis of variance
方差源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 1579.75 9 175.53 417.41 <0.0001 ** A 4.85 1 4.85 11.54 0.0115 * B 2.87 1 2.87 6.82 0.0348 * C 6.13 1 6.13 14.57 0.0066 ** AB 0.0002 1 0.0002 0.0005 0.9822 AC 1.56 1 1.56 3.72 0.0952 BC 1.51 1 1.51 3.60 0.0997 A2 194.62 1 194.62 462.82 <0.0001 ** B2 1206.66 1 1206.66 2869.47 <0.0001 ** C2 57.53 1 57.53 136.80 <0.0001 ** 残差 2.94 7 0.4205 失拟项 2.39 3 0.7952 5.70 0.0630 纯误差 0.5580 4 0.1395 注：表中*表示P<0.05，表明两者之间具有显著性，**表示P<0.01，表明两者之间有极显著性，R2=0.9981；R2adj=0.9957；R2pred=0.9753；CV%=2.77。
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