Analysis of Polyphenol Profiles in Fractional Extracts of Passion Fruit Peels and Screening of Their Antioxidant Active Substances
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摘要: 为探究不同溶剂对百香果皮多酚的萃取效率,寻找其中抗氧化活性贡献大的特征多酚。选用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分级萃取百香果皮乙醇粗提物,采用分光光度法分别测定其总酚总黄酮含量,借助超高效液相色谱串联质谱解析各分级萃取物中酚类化合物,并结合非靶向代谢组学技术筛选差异代谢物并定量。选用DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除和Fe2+还原法分析各分级萃取物体外抗氧化活性差异,通过皮尔逊相关性分析探寻百香果皮中抗氧化活性酚类标志物。结果表明:各萃取物总酚和总黄酮含量差异显著(P<0.05),由大到小依次为乙酸乙酯部位(EE)>正丁醇部位(BE)>乙醇粗提物(CE)>水部位(WE)>石油醚部位(PE)。从CE和各分级萃取物中共鉴定出33个酚类化合物,CE、EE和BE酚类化合物种类和数量较多。主成分分析(PCA)区分了各萃取物的代谢物,正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对羟基苯甲酸、原儿茶酸、异槲皮苷和异荭草苷为差异物。EE中对羟基苯甲酸(653.44 μg/g)、异槲皮苷(2420.64 μg/g)和异荭草苷(113.23 μg/g)含量最高,CE中原儿茶酸(152.40 μg/g)含量最高。百香果皮各分级萃取物体外抗氧化活性差异显著,EE体外抗氧化能力最强,是优质的抗氧化剂开发部位。相关性分析结果显示,总酚和总黄酮是百香果皮抗氧化活性物质基础,异荭草苷和异槲皮苷是其中的抗氧化活性酚类标志物。研究结果为建立百香果皮相关抗氧化产品质量控制标准及精准开发利用百香果皮酚类化合物资源提供了基础数据。
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关键词:
- 百香果皮 /
- 分级萃取 /
- 超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS) /
- 多酚化合物 /
- 主成分分析(PCA) /
- 抗氧化
Abstract: To investigate the extraction efficiency of polyphenols from passion fruit (Passiflora edulis Sims) peel by using different solvents and to identify the characteristic polyphenols with high contribution to antioxidant activity, ethanolic crude extract (CE) was sequentially extracted with petroleum ether (PE), ethyl acetate (EE), n-butanol (BE) and water (WE). The total content of phenolics and flavonoids was then measured by using spectrophotometry. Phenolic compounds in the extracts were profiled by using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS), and differential metabolites were screened and quantified by using an untargeted metabolomics approach. Antioxidant activities in vitro were assessed through DPPH free radical scavenging, ABTS+ free radical scavenging and FRAP methods. Furthermore, the phenolic markers of antioxidant activity in the peels were explored through pearson correlation analysis. The results indicated obvious variations in the total phenolic and flavonoid content among the extracts (P<0.05), ranked in descending order as follows: EE>BE>CE>WE>PE. A total of 33 phenolic compounds were identified from both CE and each fractional extract, while CE, EE, and BE exhibited a greater variety and quantity of phenolic compounds. Principal component analysis (PCA) distinguished the metabolites of extracts, while orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) identified p-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, isoquercitrin and iso-orientin as differential compounds. EE exhibited the highest levels of p-hydroxybenzoic acid (653.44 μg/g), isoquercitrin (2420.64 μg/g) and iso-orientin (113.23 μg/g), while CE showed the highest content of proto-catechuic acid (152.40 μg/g). The in vitro antioxidant activity of passion fruit peel varied significantly among extracts, with EE showing the strongest capacity, suggesting its potential as a premium antioxidant agent. The correlation analysis revealed that the total phenols and flavonoids formed the basis of antioxidant active substances, while iso-orientin and isoquercitrin were the antioxidant active phenolic markers. The finding provided fundamental data for establishing quality control standards of antioxidant products derived from passion fruit peels, as well as for the precise development and utilization of phenolic compounds in the peels. -
当今社会面对慢性疾患和人口老龄化双重挑战,含有天然抗氧化剂的功能性食品及相关产品是人类防治慢性疾患和健康管理关口前移的重要物质[1]。百香果(Passiflora edulis Sims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora Linn.)多年生攀援藤本植物,因其独特风味和较高营养价值备受消费者喜爱,现于广西、云南、福建和四川[2]等地作为乡村振兴产业被推广种植[3]。研究表明百香果皮中富含天然多酚,种类繁多,这些多酚被证实能够有效抑制人体内的氧化应激现象[4],是开发性价比高的抗氧化功能性食品的优质绿色资源。
多酚是一类母核为C6~C3结构的天然化合物,根据取代基位置、类型和数量的不同又分为酚酸类、黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、黄烷醇类和花青素类等[5]。不同类型多酚的生物活性及其利用效率具有一定差别。因此,根据不同类型多酚在各极性溶剂中的聚合程度差异[6],对其进行分级利用,有利于多酚的高效精准开发。Fan等[7]研究发现富硒茶不同萃取部位(乙酸乙酯、正丁醇、水相)酚类化合物种类及其抗氧化和细胞保护活性具有差异,表明富硒茶不同溶剂部位有不同的利用价值。
基于超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS)的代谢组学可提供样品代谢物的大量信息,若结合模式识别方法对所得信息进行降维处理,可实现在将数据可视化的同时归纳总结各类数据,呈现多元数据的内在联系的效果。Domínguez等[8]通过建立PCA模型可视化了碱、酸和酶辅助3种提取方法下百香果皮酚类化合物差异,为后续研究者获取百香果皮目标酚类化合物而选择高效的提取方法提供了参考。
目前我国鲜见百香果皮不同溶剂部位中多酚种类差别的研究,在此本研究以百香果皮粗提物和不同极性溶剂分级萃取物为研究对象,采用UPLC-MS分析其化合物组成,并通过代谢组学技术表征百香果皮各分级萃取物代谢物差异,筛选差异代谢物并定量,选用多种抗氧化实验评价各分级萃取物的体外抗氧化能力,寻找发挥抗氧化活性的关键多酚,以期为百香果皮相关抗氧化产品的精准开发提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫皮百香果(Passiflora edulis Sims) 2021年7月6日采自四川省凉山彝族自治州德昌县;石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水甲醇、无水乙醇 分析纯,天津致远化学试剂有限公司;DPPH、ABTS、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox) 上海麦克林公司;过硫酸钾、硫酸亚铁、氯化铁、醋酸钠、盐酸 北京化工厂;2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ) 上海源叶科技有限公司;原儿茶酸、对羟基苯甲酸、异槲皮苷、异荭草苷 纯度≥98%,成都艾博克生物科技有限公司;乙腈、甲酸 色谱纯,美国Sigma公司。
KS-5200DA液晶超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;BHS-2精密数显恒温水浴锅 上海垒固仪器有限公司;R-215旋转蒸发仪 瑞士步琦公司;EnSpire 酶标仪 美国PerkinElmer公司;Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪、PLUS Xevo G2XS QTOF MS质谱仪 美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 百香果皮各分级萃取物总酚、总黄酮含量测定
1.2.1.1 样品制备
百香果皮阴干粉碎,按照液料比20:1(mL/g),用70%乙醇,超声提取30 min,抽滤回收上清液,剩余残渣重复以上步骤2次,合并上清液,旋蒸、吹干得百香果皮粗提物(CE)。超纯水溶解粗提物浸膏,经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等比依次萃取,得各极性部位萃取液和剩余水部分,旋蒸、吹干得百香果皮石油醚部位(PE)、乙酸乙酯部位(EE)、正丁醇部位(BE)和水部位(WE)浸膏。浸膏得率计算公式为:
浸膏得率(%)=浸膏质量干燥百香果果皮质量×100 1.2.1.2 总酚含量测定
参考许梦圆[9]方法,以没食子酸为标准品绘制标准曲线,得到线性回归方程:y=0.0264x+0.1741(R2=0.9990),以每克干物质中没食子酸当量(mg/g)计算总酚含量。
1.2.1.3 总黄酮含量测定
参考许梦圆[9]方法,以芦丁为标准品绘制标准曲线,得到线性回归方程:y=0.0414x+0.1094(R2=0.9990),以每克干物质中芦丁当量(mg/g)计算总黄酮含量。
1.2.2 百香果皮分级萃取物中酚类化合物UPLC-MS/MS分析
1.2.2.1 样品前处理
称取百香果皮CE、PE、EE、BE和WE浸膏各10 mg,用甲醇溶解至1 mL,3000 r/min高速离心10 min,过0.22 μm滤膜。
1.2.2.2 标准溶液制备
准确称取一定质量原儿茶酸、对羟基苯甲酸、异槲皮苷和异荭草苷,用甲醇定容。等浓度梯度稀释酚类化合物标准品溶液,以标准品浓度为横坐标,峰面积(mAU)为纵坐标,绘制各标准品标准曲线。样品特征酚类化合物含量用每克百香果皮干重中所含标准品当量表示。
1.2.2.3 色谱条件
使用配备光电二极管阵列(PDA)探测器的Acquity UPLC系统进行定性分析。色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 Column(130 Å, 1.7 µm, 2.1×100 mm);流动相:A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈;系统流速:0.4 mL/min;柱温:35 ℃;样品进样量为2 μL;紫外检测器设置为:210、280、350、520 nm;洗脱程序:0~0.5 min,1% B;0.5~25 min,1%~40% B;25~27 min,40%~100% B;27~29 min,100% B;29~31 min,1% B。
1.2.2.4 质谱条件
MS参数设置如下:在负模式下工作的电喷雾电离(ESI)源,离子源温度300 ℃,扫描范围m/z:100~1200 Da,毛细管电压为3.0 kV,锥孔电压30 V,数据采集和处理采用Massynlyx 4.2。
1.2.3 百香果皮体外抗氧化能力分析
1.2.3.1 DPPH自由基清除能力测试
参照Polatoglu等[10]的方法。用甲醇配制0.1 mmol/L 的DPPH工作液及不同浓度梯度的样品和BHT溶液。分别吸取100 μL不同浓度的样品和100 μL的DPPH工作液加入96孔板中,混匀,室温25 ℃避光反应30 min,在517 nm处测定吸光度值。以BHT为阳性对照代替样品按照以上步骤测定吸光度。DPPH自由基清除能力计算公式为:
DPPH自由基清除率(%)=[1−A1−A2A0]×100 式中:A0为空白对照(甲醇+DPPH工作液)的吸光度;A1为样品的吸光度;A2为样品空白(甲醇+样品溶液)的吸光度。
1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力测试
参考Ye等[11]方法,用甲醇配制7 mmol/L的ABTS溶液和用超纯水配制2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合,室温下避光反应 12~16 h 备用。使用前用甲醇稀释 ABTS储备液使其在波长734 nm处的吸光度为0.700±0.020。用甲醇配制0.1~0.7 mmol/L浓度梯度的Trolox标准溶液,吸取20 μL各浓度Trolox标准溶液和180 μL ABTS工作液,充分混匀后在734 nm处测定吸光度,以Trolox溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将样品代替Trolox标准溶液进行以上操作,所得吸光度值代入标准曲线,样品ABTS阳离子自由基清除能力以达到同样消除率所需Trolox质量(mmol TE/g)表示。
1.2.3.3 FRAP法抗氧化测试
参考Chen等[12]方法,分别配制0.3 mol/L的醋酸钠溶液、20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液、10 mmol/L 的TPTZ由40 mmol/L盐酸配制而成,上述溶液按照10:1:1体积比例混合,得到FRAP工作液避光备用。用甲醇配制0.05~0.80 mmol/L浓度梯度的FeSO4溶液,吸取20 μL各浓度FeSO4溶液和180 μL FRAP工作液,充分混匀后在593 nm处测定吸光度,以FeSO4溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将样品代替FeSO4溶液进行以上操作,所得吸光度值代入标准曲线,样品铁离子还原能力以Fe2+当量表示(mmol Fe2+/g)。
1.3 数据处理
将1.2所得质谱原始数据,导入代谢组学处理软件Progenesis QI,进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化处理后,输出得到保留时间、质荷比(m/z)和峰强度的数据矩阵(格式为.csv)。将数据矩阵导入SIMCA软件,进行PCA和OPLS-DA。采用Masslynx 4.2进行峰提取和化合物鉴定。使用SPSS 19.0进行单因素差异显著性分析和抗氧化实验数据处理,采用Pearson法进行相关性分析。实验重复3次,结果用平均值±标准差(¯X±SD)表示,以Origin绘图。
2. 结果与分析
2.1 百香果皮分级萃取物酚类化合物成分分析
2.1.1 浸膏得率
百香果皮乙醇粗提物经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后,得率降低,由大到小依次为 CE(18.06%)>WE(8.30%)>BE(3.70%)>EE(1.18%)>PE(0.58%),表明分级萃取对百香果皮中的化合物实现了分离。
2.1.2 总酚、总黄酮含量
结果如图1,CE中总酚含量32.61 mg/g,高于哥伦比亚紫皮百香果皮(24.96 mg/g)[13];总黄酮含量24.07 mg/g,约为广西杂交紫皮百香果(P. edulisדTai-Nong No.1”)果皮(12 mg/g)的2倍[14],说明四川产紫皮百香果皮富含多酚。
不同溶剂萃取物总酚、总黄酮含量呈现显著性差异(P<0.05),表明各溶剂对CE中的多酚化合物实现了分离。结合得率分析可知,CE得率最高,但测得总酚含量不高。EE和BE化合物得率较低,但等量浸膏中EE总酚(62.42 mg/g)和总黄酮(43.90 mg/g)含量约为CE(32.61、24.07 mg/g)的2倍,BE总酚(47.63 mg/g)和总黄酮(28.84 mg/g)含量也显著高于CE(P<0.05),说明乙酸乙酯[15]和正丁醇[16]能高效富集CE中羟基苯甲酸类(原儿茶酸)和黄酮醇类(芦丁)2种类型的多酚。WE浸膏得率仅次于CE,但总酚(11.83 mg/g)和总黄酮(10.12 mg/g)含量保留不到CE的1/2,推测WE富集了较多紫外响应差的大极性水溶性化合物。石油醚极性较小,PE总酚(1.88 mg/g)和总黄酮(1.51 mg/g)含量最低,均约为CE的6%,萃取的多酚种类与含量均较少。
2.1.3 酚类化合物鉴定
得到百香果皮粗提物和各分级萃取物总离子流图(图2),从中共鉴定出33个酚类化合物(表1),各分级萃取物多酚数量存在差别,CE、BE和EE多酚化合物数量明显较多,这是由于不同种类化合物在不同极性溶剂的溶解度有差异[7]。
表 1 百香果皮各分级萃取物多酚化合物鉴定Table 1. Identification of phenolic compounds in different fractional extracts from P. edulis peel编号 化合物名称 保留时间
(min)分子式 分子质量
[M-H]-离子碎片 各分级萃取物 CE PE EE BE WE 羟基肉桂酸类 1 肉桂酸-O-(木糖基)葡萄糖糖苷
Hexoside of cinnamic acid-O-(xylosyl)12.07 C30H46O5 485.3250 447.1747,293.0433 + - - - - 羟基苯甲酸类 2 原儿茶酸Protocatechuic acid 2.81 C7H6O4 153.0190 109.0285 + + + + + 3 对羟基苯甲酸p-Hydroxybenzoic acid 5.51 C7H6O3 137.0234 116.9280 + + + + + 4 二羟基苯甲酸己糖苷
Dihydroxybenzoic acid hexoside6.12 C13H16O9 315.0737 153.0196,109.0285 + - + + - 5 没食子酸辛酯Octyl gallate 7.23 C15H22O5 281.1397 139.0403,121.0626 - - + - - 6 原儿茶酸葡糖基戊糖苷
Protocatechuic acid glucosylpentoside8.66 C18H24O13 447.1115 315.1022,153.0196 - - + - - 7 黄没食子酸Flavogallonic acid 13.35 C21H10O13 469.0023 300.0406,299.8908,270.0546 + - - - - 8 二咖啡酰奎宁酸衍生物1
Dicaffeoylquinic acid derivative 117.72 C22H28O14 515.1376 353.1225,191.0322,179.0564 - - - + - 9 二咖啡酰奎宁酸衍生物2
Dicaffeoylquinic acid derivative 217.76 C22H28O14 515.1376 353.1182,191.0322,179.0534 - - - + - 黄烷醇及其苷类 10 表儿茶素葡萄糖苷
Epicatechin glucoside2.91 C21H24O11 451.1260 289.0880,245.0684 - - - + - 11 儿茶素葡萄糖苷Catechin glucoside 15.33 C21H24O11 451.1212 367.1499,289.8854 - - - + - 12 (表)儿茶素-(表)儿茶
(epi)Catechin-(epi)catechin13.08 C30H24O12 575.1175 375.1623,287.0490 + - + + - 黄酮醇及其苷类 13 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷
Isorhamnetin-3-O-glucoside5.65 C22H22O12 477.1040 285.0865 + - - - - 14 山奈酚-3-葡萄糖鼠李糖苷
Kaempferol-3-O-glucorhamnoside8.87 C27H29O15 593.1509 473.1103,429.0823,327.0508,309.0413,298.0498 + - + + - 15 异槲皮苷Isoquercitrin 9.86 C21H20O12 463.0865 301.0345,300.0287 + + + + + 16 山奈酚-3-O-芸香糖苷
Kaempferol-3-O-rutinoside10.58 C27H30O15 593.1509 443.0931,323.0759,285.0404 + - - + - 17 槲皮素-3-O-(6''-乙酰基)-葡萄糖苷
Quercetin-3-O-(6"-O-acetyl)-glucoside10.62 C23H22O13 505.0974 300.0248,151.0363 - - + - - 18 山奈酚-3-O-β-D-(6''-(E)-p-对香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷
Kaempferol-3-O-β-D-(6"-(E)-p-p-coumarinyl)-glucopyranoside10.65 C15H10O7 593.1509 285.0404,255.0300 - - - + - 19 紫云英苷Astragalin 11.14 C21H20O11 447.0914 285.0404,255.0300,227.0346 + + + + + 20 槲皮苷Quercitrin 13.01 C21H20O11 447.0914 301.0344,300.0251,255.0286 + - + - - 21 槲皮素-3-O-[6"-O-(3-氢氧基-
3-甲基戊二酰)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
Quercetin-3-O-[6″-O-(3-hydroxyl-3-
methylglutaryl)]-β-D-glucopyranoside15.13 C27H28O16 607.1293 505.2663,463.2547,301.2043,271.0538 + - + + - 黄酮及其苷类 22 木犀草素-3-O-乙酰基-葡萄糖苷
Luteolin-3-O-malonyl- glucoside5.01 C23H21H12 489.0978 289.0942,179.0351,133.0144,112.9860 - - - + - 23 异荭草苷Isoorientin 8.61 C21H20O11 447.0914 411.1112,357.0625,327.0508,297.0411 + - + + - 24 木犀草素-6-C-戊苷-8-C-葡萄糖苷
Luteolin-6-C-pentose-8-C-glucoside11.93 —— 579.2093 309.0733,285.0404,327.0508,357.0238,429.0823,459.1261 + - - - - 25 根皮素葡萄糖苷Phloretin glucoside 12.63 C21H24O10 435.1312 273.0766 - - + - - 26 柚皮素-O-己糖苷-O-芸香糖苷
Naringin-O-hexoside-O-rutoside18.41 C33H42O19 741.2186 307.0606,257.0797,179.0564,161.9265 + - - - - 花青素类 27 原花青素B1 Procyanidin B1 14.38 C30H26O12 577.1353 451.0981,425.0482,407.0387,289.8893,161.0476,125.1316 + - - - - 28 原花青素B2 Procyanidin B2 14.49 C30H26O12 577.1353 425.0904,245.0399,161.0505 - - + - - 29 矮牵牛配基-O-己糖苷
Petunia ligand-O-hexoside14.58 C22H17O12 472.0657 425.0529,283.0580,177.0164,164.1052,161.0216,137.0195 + - - - - 异黄酮类 30 毛蕊异黄酮Calycosin 15.78 C16H12O5 283.0598 239.1283 - - - + - 31 黄豆苷Daidzin 16.52 C21H20O9 415.1019 252.0413 + - + + - 其他 32 PhelligrinD 17.35 C22H18O7 393.0957 259.0240 - - + - - 33 PhelligrinE 15.56 C29H24O8 499.1376 393.1725,353.0242 - - + + - 注:“+”和“-”表示各分级萃取物存在或者不存在该化合物。 百香果皮粗提物和各分级萃取物中多酚种类也不同(图3),EE和BE中羟基苯甲酸类和黄酮醇类化合物占比较大,与上文总含量分析结果一致,说明中等极性溶剂乙酸乙酯和较大极性溶剂正丁醇会更多富集粗提物中以原儿茶酸为代表的羟基苯甲酸类化合物和以芦丁为代表的黄酮醇类化合物。PE和WE中酚类化合物种类较少,均只鉴定出2个羟基苯甲酸类和2个黄酮醇类化合物,可能原因是小极性溶剂石油醚更容易富集叶绿素等脂溶性成分,而经各极性溶剂萃取富集后,WE只余留了少量多酚。
2.2 百香果皮各分级萃取物化合物组成差异分析
构建无监督PCA模型对百香果皮粗提物和各分级萃取物中的化合物进行差异分析。本次分析共提取出2个包含化合物种类、数量和含量等信息的主成分,其方差解释率分别是59.98%,37.82%,累计方差解释率为97.80%,说明该模型精准性和预测能力可靠。百香果皮各部位多酚代谢物3次生物学重复数据能够较好地集中在一起,提示实验样品稳定,数据重复性好。
图4显示,百香果皮各分级萃取物数据分布于不同象限。在x轴方向上,PE、EE和BE、WE分立于x的负半轴和正半轴。y轴方向上,PE和WE分布于负半轴,与分布于正半轴的EE和BE明显区分,表明PE、EE、BE和WE中化合物种类、数量及含量存在差异。CE和BE数据点没有明显分离,说明CE和BE化合物种类数量或含量较为相似,这可能是因为乙醇和正丁醇仅相差2个碳原子,结构相似,导致了二者对百香果皮中多酚化合物的相似溶解能力。
OPLS-DA模型表现出与PCA类似的结果,PE、EE、BE和WE分别分布于第三、二、一和四象限,支持了不同极性萃取溶剂能够有效区分百香果皮中多酚化合物的结论。此外,差异代谢物是区分不同溶剂萃取的关键信息,变量重要性投影(Variable Importance in Projection,VIP)可表示不同化合物对于区分不同组分贡献大小,VIP≥1为常见的差异代谢物筛选标准。本研究共指认了4个VIP≥1的酚类代谢物(表2)作为解释百香果皮各分级萃取物差异性的代表化合物。
表 2 百香果皮的显著差异代谢物Table 2. Significantly differential metabolites of fractional extracts from P. edulis peel编号 化合物 VIP 3 对羟基苯甲酸 2.26 2 原儿茶酸 2.14 15 异槲皮苷 1.99 23 异荭草苷 1.09 2.3 百香果皮差异酚类化合物含量分析
采用外标一点法测定4个差异代谢物含量(表3)。不同溶剂萃取物中各差异物含量区分明显(P<0.05),CE、EE和BE中差异代谢物的含量普遍高于PE和WE。对羟基苯甲酸和原儿茶酸都是羟基苯甲酸类化合物,但原儿茶酸C6位置比对羟基苯甲酸多一个OH,故分子极性增加,更易溶于极性较大的乙醇。因此,原儿茶酸在CE的含量(152.40 μg/g)最高,EE(97.62 μg/g)和BE(27.97 μg/g)次之。对羟基苯甲酸则在极性适中的EE中含量(653.44 μg/g)最高,其次为CE(556.65 μg/g)和BE(344.53 μg/g)。EE中异槲皮苷(2420.64 μg/g)和异荭草苷(113.23 μg/g)含量最高,其异槲皮苷含量约为CE的3倍,高于香蕉百香果(Passiflora tripartita var. Mollissima(Kunth)L.H. Bailey)果肉的9.80 μg/g[17]。异荭草苷是西番莲属的特征酚类化合物[18],Da等[19]研究发现黄果西番莲果皮中异荭草苷含量为270~870 μg/g,紫皮百香果皮EE中异荭草苷约为CE的5倍。这可能是由于异槲皮苷和异荭草苷均为黄酮单糖苷类化合物,极性适中,更易溶于中等极性溶剂乙酸乙酯。
表 3 百香果皮各分级萃取物差异酚类化合物含量(μg/g)Table 3. Content of differential phenolic compounds in different fractional extracts from P. edulis peel (μg/g)化合物 CE PE EE BE WE 酚酸类 对羟基苯甲酸 556.65±23.03b 180.16±12.37d 653.44±56.14a 344.53±43.06c 35.37±8.67e 原儿茶酸 152.40±21.12a 8.91±1.06d 97.62±10.11b 27.97±7.69c 30.64±5.38c 黄酮醇类 异槲皮苷 744.18±31.94b 324.91±23.57d 2420.64±74.36a 475.86±42.12c <LOQ 黄酮类 异荭草苷 21.30±2.47c 0.83±0.04d 113.23±11.89a 55.74±9.27b <LOQ 注:<LOQ表示样品中该化合物含量低于定量限;同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 2.4 百香果皮各分级萃取物体外抗氧化活性分析
2.4.1 DPPH自由基清除测试结果
百香果皮各分级萃取物DPPH自由基清除能力与质量浓度呈现一定量效关系(图5)。各组分间DPPH自由基清除能力存在差异,阳性对照BHT、CE、EE和BE浓度—清除率曲线整体趋势相似,WE、PE与其他组分区分明显。CE、EE、BE和BHT的SC50值差异不显著(P>0.05),单因素方差结果(表4)与图5结果一致,提示CE、EE和BE具有和阳性对照相似的DPPH自由基清除效果。EE的DPPH自由基清除能力最强(SC50=0.02 mg/mL),约是CE的4倍。BE的SC50(0.06 mg/mL)约为CE的1.5倍,高于阳性对照BHT(SC50=0.04 mg/mL),说明乙酸乙酯和正丁醇有效富集了百香果皮粗提物中的抗氧化活性化合物。WE(SC50=0.26 mg/mL)和PE(SC50=0.30 mg/mL)自由基清除能力显著低于CE(P<0.05)。
表 4 百香果皮各分级萃取物含量及体外抗氧化活性Table 4. Content and activity of different fractional extracts from P.edulis peel部位 浸膏得率
(%)总酚
(mg/g)总黄酮
(mg/g)DPPH自由基SC50
(mg/mL)Trolox当量
(mmol TE/g)FRAP
(mmol Fe2+/g)CE 18.06±1.16a 32.61±0.34c 24.07±0.26c 0.08±0.01b 0.25±0.01c 0.21±0.01c PE 0.58±0.03e 1.88±0.26e 1.51±0.13e 0.30±0.09a 0.06±0.00e 0.10±0.01e EE 1.18±0.05d 62.42±0.31a 43.90±019a 0.02±0.02b 0.91±0.01a 0.51±0.01a BE 3.70±0.08c 47.63±0.27b 28.84±0.30b 0.06±0.02b 0.38±0.02b 0.30±0.01b WE 8.30±0.13b 11.83±0.23d 10.12±0.23d 0.26±0.06a 0.10±0.01d 0.14±0.00d BHT — — — 0.04±0.01b — — 注:—表示没有测定该化合物的含量或活性值,同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 2.4.2 ABTS+自由基清除实验结果
Trolox是水溶性维生素E衍生物,与酚类化合物结构相似,均有C6~C3以及羰基结构,被证实是最适合作为ABTS+自由基清除能力判断的标准化合物。因此,酚类化合物抗氧化能力常以 Trolox 为当量表示[20]。以 Trolox标准溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程y=−1.996x+0.7180(R2=0.9993)。
由图6可知,百香果皮粗提物和各分级萃取物均具有ABTS+自由基清除能力,但存在显著性差异(P<0.05),由强到弱分别为:EE>BE>CE>WE>PE,与DPPH自由基清除结果一致。CE的ABTS+自由基清除能力为0.249 mmol TE/g,与甜果西番莲(P. ligularis Juss)种籽有相似的ABTS+自由基清除能力(0.31~0.75 mmol TE/g)[21]。CE经分级萃取后,ABTS+自由基清除能力明显升高,EE ABTS+自由基清除能力(0.911 mmol TE/g)最强,约为CE(0.249 mmol TE/g)的4倍,其次为BE(0.379 mmol TE/g),约为CE的1.5倍。证明乙酸乙酯和正丁醇有效富集了抗氧化活性化合物。WE和PE的ABTS+自由基清除能力较差,分别仅达到EE的11%和7%。
2.4.3 FRAP实验结果
结果如图7,百香果皮各分级萃取物均具有Fe2+还原能力,但Fe2+还原能力差异明显,由高到低依次为:EE>BE>CE>WE>PE,与DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力实验结果一致。EE的Fe2+还原能力约是CE(0.212 mmol Fe2+/g)的2.5倍,为0.505 mmol Fe2+/g。BE的Fe2+还原能力(0.301 mmol Fe2+/g)也明显高于CE,约是CE的1.5倍。而WE(0.143 mmol Fe2+/g)、PE(0.1 mmol Fe2+/g)的Fe2+还原能力显著(P<0.05)低于CE,PE仅约为百香果皮CE的1/2,但高于紫皮百香果叶醇提物Fe2+还原能力(0.078 mmol Fe2+/g)[22]。FRAP基于SET机制,该机制下物质抗氧化能力取决于其电离势,酚类化合物给出电子将氧自由基转化为阴离子从而达到还原效果,不同极性萃取物的多酚化合物物质组成及含量使其电离势有所区别,并使其抗氧化能力存在差异[23]。
上述体外抗氧化能力测试结果表明CE具有良好抗氧化能力,但经过不同极性溶剂分级萃取后,各部位抗氧化能力明显不同,EE和BE体外抗氧化活性增强,PE和WE活性减弱,说明乙酸乙酯和正丁醇高效富集了CE中抗氧化活性物质。文献报道对羟基苯甲酸[24]、异槲皮苷[25]和异荭草苷[26]的抗氧化能力优秀,而EE中这3个化合物含量高。此外EE中还鉴定出原花青素B2(28)等多个特有酚类化合物,原花青素B2被报道有效消除羟自由基、超氧阴离子自由基和强有力的金属螯合能力,是目前国际上公认的天然抗氧化剂[27],由此推测这些化合物是EE高抗氧化力的原因。BE鉴定出儿茶素衍生物[28]和咖啡酸衍生物[29]等具有高抗氧化性的酚类化合物,其中毛蕊异黄酮是中草药黄芪的主要抗氧化活性成分[30],由此BE在体外抗氧化测试中表现仅次于EE的良好活性。酚类化合物种类与含量较少应该是造成PE和WE抗氧化活性较低的原因。
2.5 相关性分析
如图8所示,百香果皮总酚含量与ABTS+自由基清除能力、Fe2+还原能力呈显著相关(P<0.05),与DPPH自由基清除能力呈极显著相关(P<0.01),总黄酮含量与Fe2+还原能力呈极显著相关(P<0.01),与DPPH、ABTS+自由基清除能力呈显著相关(P<0.05),提示百香果皮总酚对其发挥抗氧化能力贡献突出,与Ghasemzadeh等[31]发现总酚含量与抗氧化活性显著相关的结果一致。
相关性分析结果表明异槲皮苷和异荭草苷为百香果皮抗氧化活性化学标志物。异槲皮苷含量与ABTS+自由基清除能力和Fe2+还原能力显著相关(P<0.05),说明异槲皮苷对百香果皮发挥抗氧化能力贡献显著。Xue等[32]发现酚类化合物糖基化对其抗氧化活性具有重要作用,异槲皮苷为C3-糖苷黄酮类化合物,而C3-糖基化有利于稳定糖苷的构象,增强自由基清除能力,这可能是异槲皮苷与百香果皮抗氧化活性显著相关的原因。异荭草苷含量与ABTS+自由基清除能力和铁离子还原能力相关系数均高达0.99,与DPPH自由基清除能力相关性也较高,提示异荭草苷也对百香果皮抗氧化活性有贡献。多羟基赋予黄酮高的抗氧化、螯合和促氧化活性[33],而且黄酮B环的邻二羟基结构会进一步提高其抗氧化能力[34],这可能是异荭草苷对百香果皮发挥抗氧化活性起突出贡献作用的原因。
3. 结论
百香果皮粗提物多酚丰富,经不同极性溶剂萃取后所得各部位的化合物和体外抗氧化活性均有差异,表明分级萃取能有效富集百香果皮各类型多酚,因此开发百香果皮抗氧化功能性产品时可进行分级提取,提高其利用效率。粗提物CE抗氧化活性弱于乙酸乙酯萃取物EE和正丁醇萃取物BE,提示粗提物中存在不发挥抗氧化活性的化合物,且也存在分子间相互拮抗作用减弱其总抗氧化活性。乙酸乙酯可有效富集以C6~C1构型为主的酚酸类化合物和黄酮醇类化合物,表现出强于百香果皮粗提物的抗氧化能力,展现了开发为百香果皮高品质抗氧化相关产品的潜力。BE差异酚类物质含量和抗氧化活性仅次于EE,其酚类物质种类与含量丰富,且次级代谢物富集得率高,也是百香果皮抗氧化活性酚类物质产品开发的高价值部位。总酚和总黄酮是百香果皮发挥抗氧化能力的重要物质基础,其中的异槲皮苷和异荭草苷是抗氧化活性化学标志物。本研究为百香果皮抗氧化产品开发质量标准建立提供了基础数据,为促进百香果产业副产物的精准高效开发,科学拓展百香果产业链提供了支持。
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表 1 百香果皮各分级萃取物多酚化合物鉴定
Table 1 Identification of phenolic compounds in different fractional extracts from P. edulis peel
编号 化合物名称 保留时间
(min)分子式 分子质量
[M-H]-离子碎片 各分级萃取物 CE PE EE BE WE 羟基肉桂酸类 1 肉桂酸-O-(木糖基)葡萄糖糖苷
Hexoside of cinnamic acid-O-(xylosyl)12.07 C30H46O5 485.3250 447.1747,293.0433 + - - - - 羟基苯甲酸类 2 原儿茶酸Protocatechuic acid 2.81 C7H6O4 153.0190 109.0285 + + + + + 3 对羟基苯甲酸p-Hydroxybenzoic acid 5.51 C7H6O3 137.0234 116.9280 + + + + + 4 二羟基苯甲酸己糖苷
Dihydroxybenzoic acid hexoside6.12 C13H16O9 315.0737 153.0196,109.0285 + - + + - 5 没食子酸辛酯Octyl gallate 7.23 C15H22O5 281.1397 139.0403,121.0626 - - + - - 6 原儿茶酸葡糖基戊糖苷
Protocatechuic acid glucosylpentoside8.66 C18H24O13 447.1115 315.1022,153.0196 - - + - - 7 黄没食子酸Flavogallonic acid 13.35 C21H10O13 469.0023 300.0406,299.8908,270.0546 + - - - - 8 二咖啡酰奎宁酸衍生物1
Dicaffeoylquinic acid derivative 117.72 C22H28O14 515.1376 353.1225,191.0322,179.0564 - - - + - 9 二咖啡酰奎宁酸衍生物2
Dicaffeoylquinic acid derivative 217.76 C22H28O14 515.1376 353.1182,191.0322,179.0534 - - - + - 黄烷醇及其苷类 10 表儿茶素葡萄糖苷
Epicatechin glucoside2.91 C21H24O11 451.1260 289.0880,245.0684 - - - + - 11 儿茶素葡萄糖苷Catechin glucoside 15.33 C21H24O11 451.1212 367.1499,289.8854 - - - + - 12 (表)儿茶素-(表)儿茶
(epi)Catechin-(epi)catechin13.08 C30H24O12 575.1175 375.1623,287.0490 + - + + - 黄酮醇及其苷类 13 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷
Isorhamnetin-3-O-glucoside5.65 C22H22O12 477.1040 285.0865 + - - - - 14 山奈酚-3-葡萄糖鼠李糖苷
Kaempferol-3-O-glucorhamnoside8.87 C27H29O15 593.1509 473.1103,429.0823,327.0508,309.0413,298.0498 + - + + - 15 异槲皮苷Isoquercitrin 9.86 C21H20O12 463.0865 301.0345,300.0287 + + + + + 16 山奈酚-3-O-芸香糖苷
Kaempferol-3-O-rutinoside10.58 C27H30O15 593.1509 443.0931,323.0759,285.0404 + - - + - 17 槲皮素-3-O-(6''-乙酰基)-葡萄糖苷
Quercetin-3-O-(6"-O-acetyl)-glucoside10.62 C23H22O13 505.0974 300.0248,151.0363 - - + - - 18 山奈酚-3-O-β-D-(6''-(E)-p-对香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷
Kaempferol-3-O-β-D-(6"-(E)-p-p-coumarinyl)-glucopyranoside10.65 C15H10O7 593.1509 285.0404,255.0300 - - - + - 19 紫云英苷Astragalin 11.14 C21H20O11 447.0914 285.0404,255.0300,227.0346 + + + + + 20 槲皮苷Quercitrin 13.01 C21H20O11 447.0914 301.0344,300.0251,255.0286 + - + - - 21 槲皮素-3-O-[6"-O-(3-氢氧基-
3-甲基戊二酰)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
Quercetin-3-O-[6″-O-(3-hydroxyl-3-
methylglutaryl)]-β-D-glucopyranoside15.13 C27H28O16 607.1293 505.2663,463.2547,301.2043,271.0538 + - + + - 黄酮及其苷类 22 木犀草素-3-O-乙酰基-葡萄糖苷
Luteolin-3-O-malonyl- glucoside5.01 C23H21H12 489.0978 289.0942,179.0351,133.0144,112.9860 - - - + - 23 异荭草苷Isoorientin 8.61 C21H20O11 447.0914 411.1112,357.0625,327.0508,297.0411 + - + + - 24 木犀草素-6-C-戊苷-8-C-葡萄糖苷
Luteolin-6-C-pentose-8-C-glucoside11.93 —— 579.2093 309.0733,285.0404,327.0508,357.0238,429.0823,459.1261 + - - - - 25 根皮素葡萄糖苷Phloretin glucoside 12.63 C21H24O10 435.1312 273.0766 - - + - - 26 柚皮素-O-己糖苷-O-芸香糖苷
Naringin-O-hexoside-O-rutoside18.41 C33H42O19 741.2186 307.0606,257.0797,179.0564,161.9265 + - - - - 花青素类 27 原花青素B1 Procyanidin B1 14.38 C30H26O12 577.1353 451.0981,425.0482,407.0387,289.8893,161.0476,125.1316 + - - - - 28 原花青素B2 Procyanidin B2 14.49 C30H26O12 577.1353 425.0904,245.0399,161.0505 - - + - - 29 矮牵牛配基-O-己糖苷
Petunia ligand-O-hexoside14.58 C22H17O12 472.0657 425.0529,283.0580,177.0164,164.1052,161.0216,137.0195 + - - - - 异黄酮类 30 毛蕊异黄酮Calycosin 15.78 C16H12O5 283.0598 239.1283 - - - + - 31 黄豆苷Daidzin 16.52 C21H20O9 415.1019 252.0413 + - + + - 其他 32 PhelligrinD 17.35 C22H18O7 393.0957 259.0240 - - + - - 33 PhelligrinE 15.56 C29H24O8 499.1376 393.1725,353.0242 - - + + - 注:“+”和“-”表示各分级萃取物存在或者不存在该化合物。 表 2 百香果皮的显著差异代谢物
Table 2 Significantly differential metabolites of fractional extracts from P. edulis peel
编号 化合物 VIP 3 对羟基苯甲酸 2.26 2 原儿茶酸 2.14 15 异槲皮苷 1.99 23 异荭草苷 1.09 表 3 百香果皮各分级萃取物差异酚类化合物含量(μg/g)
Table 3 Content of differential phenolic compounds in different fractional extracts from P. edulis peel (μg/g)
化合物 CE PE EE BE WE 酚酸类 对羟基苯甲酸 556.65±23.03b 180.16±12.37d 653.44±56.14a 344.53±43.06c 35.37±8.67e 原儿茶酸 152.40±21.12a 8.91±1.06d 97.62±10.11b 27.97±7.69c 30.64±5.38c 黄酮醇类 异槲皮苷 744.18±31.94b 324.91±23.57d 2420.64±74.36a 475.86±42.12c <LOQ 黄酮类 异荭草苷 21.30±2.47c 0.83±0.04d 113.23±11.89a 55.74±9.27b <LOQ 注:<LOQ表示样品中该化合物含量低于定量限;同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 表 4 百香果皮各分级萃取物含量及体外抗氧化活性
Table 4 Content and activity of different fractional extracts from P.edulis peel
部位 浸膏得率
(%)总酚
(mg/g)总黄酮
(mg/g)DPPH自由基SC50
(mg/mL)Trolox当量
(mmol TE/g)FRAP
(mmol Fe2+/g)CE 18.06±1.16a 32.61±0.34c 24.07±0.26c 0.08±0.01b 0.25±0.01c 0.21±0.01c PE 0.58±0.03e 1.88±0.26e 1.51±0.13e 0.30±0.09a 0.06±0.00e 0.10±0.01e EE 1.18±0.05d 62.42±0.31a 43.90±019a 0.02±0.02b 0.91±0.01a 0.51±0.01a BE 3.70±0.08c 47.63±0.27b 28.84±0.30b 0.06±0.02b 0.38±0.02b 0.30±0.01b WE 8.30±0.13b 11.83±0.23d 10.12±0.23d 0.26±0.06a 0.10±0.01d 0.14±0.00d BHT — — — 0.04±0.01b — — 注:—表示没有测定该化合物的含量或活性值,同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 -
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