The Relative Molecular Mass, Monosaccharide Composition and Antioxidant Activity of Ziziphus jujuba FleshPolysaccharide at Different Stages
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摘要: 为了探究不同生长时期酸枣果肉中多糖含量、相对分子质量、单糖组成及抗氧化活性变化规律,以野生型和种植型酸枣为研究对象,分别采用苯酚-硫酸比色法、高效凝胶色谱法、高效离子色谱法和DPPH自由基清除实验研究其不同生长时期的果肉多糖含量、相对分子质量、单糖组成和自由基清除能力。研究发现野生型和种植型的酸枣果肉中多糖含量均表现出先下降后上升的趋势;两种类型的酸枣果肉多糖的相对分子质量均随着酸枣的发育逐渐降低;两种类型酸枣果实发育前期果肉多糖中单糖鼠李糖含量最高可达46.14 mg/g,半乳糖次之可达33.10 mg/g;果实发育后期,两种类型的酸枣果肉多糖中单糖含量最高的为阿拉伯糖可达60.30 mg/g,半乳糖醛酸次之可达45.02 mg/g;两种类型酸枣果肉多糖的DPPH自由基清除能力变化趋势与其果肉中多糖含量变化趋势基本相同;种植型酸枣与野生型酸枣在多糖含量、多糖相对分子质量、单糖组成和自由基清除能力方面均表现为相同的趋势,且均属于还原糖积累类型果实。研究结果为酸枣果肉资源进一步开发与利用提供参考。Abstract: For the purpose of exploring the polysaccharide content, relative molecular mass, monosaccharide composition, as well as antioxidant activity in Ziziphus jujuba flesh polysaccharide (ZJFP) at distinct growth stages. The content, relative molecular weight, monosaccharide composition and free radical scavenging ability of ZJFP in wild-type and plant-type at different growth stages were studied by phenol-sulfuric acid assay, high performance gel chromatography, high performance ion chromatography, and DPPH free radical scavenging experiment. Moreover, the results determined that the polysaccharide content of ZJFP in both wild and plant types demonstrated a trend of first decreasing and consequently rising. Furthermore, the relative molecular mass of the two types of ZJFP gradually decreased with the development of the Ziziphus jujuba. During the initial stage of fruit development, the ZJFP exhibited the highest content of rhamnose, reaching 46.14 mg/g, followed by galactose up to 33.10 mg/g. Whereas, in the later stage of fruit development, the highest monosaccharide content in the two types of ZJFP was arabinose up to 60.30 mg/g, preceded by galacturonic acid up to 45.02 mg/g. Additionally, the trend of DPPH free radical scavenging capacity of ZJFP of the two types was identical to the trend of polysaccharide content in Ziziphus jujuba flesh. Plant-type and wild-type Ziziphus jujuba illustrated the identical trend regarding polysaccharide content, the relative molecular weight of polysaccharides, monosaccharide composition, as well as free radical scavenging ability, and both were of the type of fruit that reduces sugar accumulation. The research serve as a valuable reference for the future development and utilization of Ziziphus jujuba flesh resources.
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酸枣(Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu. ex H.F. Chou)为鼠李科枣属落叶小乔木,其种子酸枣仁具有养心补肝,宁心安神等功效,是中医药临床治疗失眠的首选品,酸枣果肉为酸枣仁生产过程中的副产品。酸枣果肉含有多种化学成分[1],如多糖、有机酸、多酚、甾醇、黄酮以及多种微量元素和大量维生素等,具有抗氧化、免疫调节、抗癌和保肝活性[2−5]。据报道约每30 kg酸枣鲜果仅可产出酸枣仁药材1 kg[6],仅少量酸枣果肉作食品应用,如酸枣汁、酸枣糕、酸枣面等[7−9]。每年有大量的酸枣果肉作为废弃组织被丢弃,造成极大的资源浪费,导致酸枣的资源利用率低下。
近年来,随着人们对健康生活的向往以及养生观念的提高,多糖的保健作用引起人们的广泛关注,研究发现很多植物多糖具有抗菌、抗氧化和保肝等多种生物活性[10−12]。随着对植物多糖的研究逐步深入,发现在器官水平、细胞水平到分子水平,均有不同程度的免疫调节作用[13];同时发现多种植物多糖具有抗氧化活性[14−16],目前已有80多种植物多糖被成功提取并有望广泛地应用于医药和保健食品的研究和开发中[17]。植物多糖的结构是影响其生物活性的关键因素,确定多糖的一级结构能够清楚地了解其生物活性及其机制[18]。
虽然现今药食同源类中药多糖在功能性保健食品方面应用较少,但以药食同源类中药多糖为天然原料研发功能性保健食品具有巨大潜力[19]。酸枣果肉中含有丰富的多糖,有研究报道酸枣果肉中多糖有增强小鼠的肌力、记忆力、食欲等作用[20−21]。有研究表明植物多糖的生物活性和营养价值与其生长过程中的含量、相对分子质量及单糖组成密切相关[22−23]。目前,对酸枣果肉中多糖相关研究大多针对其提取方式和生物活性[24−25],而有关生长过程中酸枣果肉中多糖含量、相对分子质量、单糖组成等初级结构及抗氧化活性变化规律尚未见报道,本研究通过对不同时期野生型和种植型酸枣果肉多糖(Ziziphus jujuba flesh polysaccharide,ZJFP)进行多糖含量、抗氧化能力、相对分子质量和单糖组成进行研究分析,探究酸枣果肉中多糖含量及其单糖组成变化、抗氧化活性在不同生长时期的变化规律,以期为进一步研究酸枣果肉多糖结构与其功能活性的关系和抗氧化功能食品的开发奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
酸枣样品 采自陕西咸阳淳化县北仲山酸枣种植基地(N34°45'36'',E108°30'6''),经陕西省中药资源产业化省部共建协同创新中心宋忠兴主任药师鉴定为鼠李科枣属植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou的果实,本次研究选取基地外野生和基地内种植的不同生长时期的酸枣,共采摘五次共十批样品,分别为7月7日、8月7日、9月7日、9月25日、10月7日采摘的鲜果;三氟乙酸、葡萄糖对照品、岩藻糖对照品、鼠李糖对照品、阿拉伯糖对照品、半乳糖对照品、木糖对照品、甘露糖对照品、核糖对照品、葡萄糖醛酸对照品 Sigma公司;甘露糖醛酸对照品 南通飞宇生物科技有限公司;普鲁兰DXT3K、普鲁兰DXT21K、普鲁兰DXT130K、普鲁兰DXT600K、普鲁兰DXT820K、普鲁兰DXT3755K、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、半乳糖醛酸对照品、古罗糖醛酸对照品 上海源叶生物科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯;水 为纯化水。
ICS5000离子色谱、Thermo Multiskan GO多功能酶标仪、Forma 88000超低温冰箱、Reacti-thermo氮气吹扫仪、U3000凝胶色谱 美国Thermo公司;OPTILAB T-rex示差检测器 美国Wyatt公司;UV-2600紫外可见分光光度计 日本岛津公司;Sartorius CPA225D十万分之一电子分析天平 德国赛多利斯公司;SRA12N60冷冻干燥机 上海舍岩仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 酸枣果肉粗多糖提取
酸枣样品自然阴干,除去果核,得到酸枣果肉。然后精密称取干燥至恒重的酸枣果肉细粉0.25 g,置圆底烧瓶中,加入80%乙醇150 mL,加热回流1 h,趁热过滤,留残渣,残渣用80%热乙醇洗涤3次,每次10 mL,将残渣及滤纸置于烧瓶中,加入150 mL水,加热回流1 h,趁热过滤,留滤液,残渣及烧瓶用热水洗涤4次,每次10 mL,合并滤液及洗液,浓缩,−80 ℃冰箱预冻12 h,于冷冻干燥机−60 ℃条件下干燥24 h,得酸枣果肉粗多糖[26]。
1.2.2 总多糖含量测定
参照查娜等[27]酸枣果肉多糖含量测定方法,配制质量浓度为0.1 mg/mL的无水葡萄糖对照品溶液,使用苯酚-硫酸法进行显色,在490 nm波长处测定吸光度,得到标准曲线为y=0.0167x−0.0015(R2=0.9991)。x为葡萄糖质量浓度,y为吸光度。
1.2.3 ZJFP相对分子质量分布测定
1.2.3.1 多糖对照品溶液配制
取不同规格的普鲁兰多糖适量[26],精密称定,用0.1 mol/L NaNO3水溶液(含0.02% NaN3,w/w)溶解,配成平均相对分子质量(Mw)为6.10×105 Da的对照品溶液(A),Mw分别为2.10×104、3.75×106 Da的对照品混合溶液(B)和Mw为3.65×103、1.31×104、8.21×105 Da的对照品混合溶液(C),定容至浓度为1.0 mg/mL。
1.2.3.2 高效凝胶色谱分析
称取适量“1.2.1”项下多糖溶解在0.1 mol/L NaNO3水溶液(含0.02% NaN3,w/w)中,配制终浓度为1.0 mg/mL的多糖溶液,并通过孔径为0.45 μm的过滤器过滤后上机检测[28]。采用凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-803 HQ,300 mm×8 mm)串联。柱温45 ℃,进样量100 μL,流动相A(0.02% NaN3,0.1 mol/L NaNO3),流速0.5 mL/min,洗脱梯度为等度,洗脱时间为100 min。
将多糖对照品溶液进行分析,以时间为横坐标,示差信号值为纵坐标。以l g(Vh)流体力学体积为纵坐标(y),洗脱体积Vel为横坐标(x),得线性回归方程为y=−0.8158x+15.233(R2=0.9946),计算ZJFP的Mw。
1.2.4 ZJFP中的单糖组成种类及含量测定
1.2.4.1 ZJFP完全酸水解物的制备
取干净的色谱瓶,称取适量多糖样品,加入1 mL 2.0 mol/L三氟乙酸溶液,121 ℃加热2 h[29]。通氮气,吹干。加入甲醇清洗,再吹干,重复甲醇清洗2~3次。加入水溶解,转入色谱瓶中待测。
1.2.4.2 单糖对照品溶液配制
准确称取所需标准品后,加水配成10 mg/mL标准溶液母液单标,然后取适量标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为60、50、40 μg/mL的标准品混标,根据需要将其稀释1.25、1.66、2.5、5、10、50、100倍。
1.2.4.3 离子色谱分析条件
根据文献[30],采用Dionex™ CarboPac™ PA20(150 mm×3.0 mm,10 μm)液相色谱柱;进样量为5 μL。流动相A(H2O),流动相B(0.1 mol/L NaOH),流动相C(0.1 mol/L NaOH,0.2 mol/L NaAc),流速0.5 mL/min;柱温为30 ℃;洗脱梯度:0 min A相/B相/C相(95:5:0,V/V/V),26 min A相/B相/C相(85:5:10,V/V/V),42 min A相/B相/C相(85:5:10,V/V/V),42.1 min A相/B相/C相(60:0:40,V/V/V),52 min A相/B相/C相(60:40:0,V/V/V),52.1 min A相/B相/C相(95:5:0,V/V/V),60 min A相/B相/C相(95:5:0,V/V/V)。
1.2.5 不同生长时期ZJFP的DPPH自由基清除能力测定
取不同时期ZJFP干品,配制成质量浓度为1.0 mg/mL的多糖溶液。取多糖2.0 mL,加入2.0 mL浓度为0.02 mol/mL的现配DPPH乙醇溶液,混合均匀,于37 ℃下避光反应30 min,测定517 nm处吸光度[31]。VC作阳性对照。按公式计算DPPH自由基清除能力。以乙醇代替DPPH溶液为对照组A0,水替代样品作空白组AP,多糖样品组为AS。
WDPPH(%)=[1−(AS−A0)/AP]×100 1.3 数据处理
所有样品进行3次测定,显著性差异采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析,Origin 2019b对数据进行绘图分析,色谱数据利用软件Chromeleon处理。
2. 结果与分析
2.1 不同时期酸枣果肉中多糖含量
对采集的酸枣果肉进行多糖含量测定,结果见图1。野生型ZJFP的含量为44.01±2.18~66.05±0.98 mg/g;种植型ZJFP含量为41.08±2.27~59.66±2.97 mg/g,酸枣果肉中多糖含量与生长期密切相关,生长前期酸枣膨大消耗多糖,中期果实大小稳定后多糖开始积累。野生型ZJFP在7月7日至8月7日之间含量显著下降(P<0.05),在8月7日至10月7日之间进行积累;种植型ZJFP在7月7日至9月7日之间含量显著下降(P<0.05),在9月7日至10月7日之间进行积累。
图 1 不同时期和种植方式ZJFP含量注:不同大小写字母表示差异显著(P<0.05);图6同。Figure 1. ZJFP content in different stages and different planting methods2.2 ZJFP相对分子质量分布
将多糖对照品溶液进行分析,以时间为横坐标,示差信号值为纵坐标,结果见图2。将ZJFP溶液在1.2.3项色谱条件下进行分析,根据保留时间可以将ZJFP分为P1、P2、P3、P4四个组分,其中P1、P2峰面积较大,保留时间较长,平均Mw分别为5.23×106、10.03×104 Da;P3、P4峰面积较小,保留时间较短,平均Mw分别为2.03×102、0.39×102 Da,见图3。
随着酸枣果实的生长,野生型ZJFP的P1、P4两个组分含量逐步降低,P3组分先降低后稳定,P2组分占比逐渐增大;种植型ZJFP的P1和P4两个组分的含量逐步降低,P3组分含量先升高后降低、P2组分含量逐步升高。随着酸枣的成熟,果肉多糖中相对分子量较大的P1组分逐渐消耗,P2组分占比增大的相对分子质量发生变化,种植型ZJFP相对分子质量为4.46×105~5.84×106 Da,野生型ZJFP相对分子质量为6.90×105~6.12×106 Da,见表1。
表 1 不同时期ZJFP相对分子质量Table 1. Relative molecular weight of ZJFP in different stages采样时间 Mw(kDa) 种植 野生 7月7 3048.17 4392.49 8月7 5844.23 6116.64 9月7 1181.74 1132.58 9月25 1265.06 919.66 10月7 445.71 690.09 2.3 ZJFP中的单糖组成及含量分析
将“1.2.4”下制备的多糖酸水溶液采用离子色谱系统进行分析,通过对比标准单糖图谱可知,两种类型ZJFP酸水解液均有9种单糖共有峰,按保留时间依次鉴定为岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸,见图4。酸枣果肉多糖的单糖组成数据处理时,采用外标法定量,测定不同浓度标品制定标准曲线,线性关系信息见表2。
表 2 各单糖标曲信息Table 2. Standard curve information of each monosaccharide标样名称 保留时间(min) 斜率 拟合度 岩藻糖 4.5503 0.5244 0.9921 阿拉伯糖 9.6170 0.609 0.9921 鼠李糖 9.9337 0.3754 0.9953 半乳糖 11.9253 0.9019 0.9923 葡萄糖 14.0087 1.0758 0.9914 木糖 16.5753 0.9556 0.991 甘露糖 17.8587 0.6859 0.9969 果糖 19.9420 0.2992 0.9937 核糖 21.4337 0.718 0.9978 半乳糖醛酸 34.4670 0.3962 0.994 古罗糖醛酸 35.0337 0.4635 0.992 葡萄糖醛酸 37.0920 0.7971 0.9951 甘露糖醛酸 39.4670 0.3032 0.9922 根据所得标准曲线,计算样品中岩藻糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸的含量。种植型ZJFP中9种单糖平均含量分别是0.93、0.94、35.09、36.68、25.25、29.86、5.36、4.25、23.41 mg/g,野生型ZJFP中9种单糖平均含量分别是1.06、1.06、36.72、43.73、29.27、23.57、5.90、3.66、33.86 mg/g。从图5中可以看出,两种类型ZJFP中9种单糖平均含量最高的是鼠李糖,其次是阿拉伯糖,其中岩藻糖与葡萄糖醛酸含量基本相同,所占比例仅0.4%。两种类型酸枣在发育过程中阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、岩藻糖和葡萄糖醛酸五种单糖在多糖中占比增大,鼠李糖、半乳糖、木糖和甘露糖在多糖中占比减少。野生型ZJFP中半乳糖醛酸占比高达25.00%、葡萄糖醛酸占比也可到1.08%;种植型ZJFP中半乳糖醛酸占比则为16.26%,葡萄糖醛酸占比为0.64%。种植型酸枣相对与野生型酸枣其ZJFP中葡萄糖占比较大,可达22.51%,野生型仅为14.10%。
2.4 不同生长时期ZJFP的DPPH自由基清除能力测定
从图6中可以看出,ZJFP浓度为1.0 mg/mL时,野生型ZJFP的DPPH自由基清除率为41.80%~65.36%,在7月7日至8月7日显著下降(P<0.05),从65.36%降至41.80%,8月7日至9月7日之间显著上升(P<0.05),自41.80%升至52.46%,9月7日至10月7日,清除能力无显著变化(P>0.05);种植型ZJFP的DPPH自由基清除率在47.40%~60.25%,于7月7日至8月7日之间显著下降(P<0.05),自60.25%降至47.40%,8月7日至10月7日间,清除能力无显著变化(P>0.05)。对不同时期ZJFP含量与DPPH自由基清除能力进行相关性分析,结果发现不同时期ZJFP含量与其DPPH自由基清除能力显著相关(P<0.01),见表3。
表 3 ZJFP含量和DPPH自由基清除率相关性Table 3. Correlation between ZJFP content and DPPH radical scavenging rate名称 种植型ZJFP 野生型ZJFP 清除率 0.766** 0.896** 注:**代表在0.01水平上显著相关。 3. 讨论与结论
本研究对不同时期酸枣的果肉多糖进行含量测定发现,发育过程中果肉多糖含量呈现出先下降后上升的趋势,且发育后期多糖含量低于发育初期。有研究表明酸枣果实总糖量显著低于一些枣类,同时有机酸含量显著高于枣果实[32],这可能是酸枣独特风味的原因。通过对酸枣果肉多糖进行相对分子量测定发现,酸枣果肉多糖可以分为P1(5.23×106 Da)、P2(10.03×104 Da)、P3(2.03×102 Da)和P4(0.39×102 Da)四个组分,P2组分含量相对较高。单糖组成测定结果表明两种类型酸枣果肉多糖均由岩藻糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸9种单糖组成,与种植型相比野生型酸枣果肉多糖中葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸所占比例相对较高,成熟期酸枣中还原糖类成分,如阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的含量较果实发育初期均出现了明显增长,表明酸枣属于还原糖积累类型果实[33]。DPPH自由基清除能力测定结果显示,当ZJFP浓度1.0 mg/mL时,野生型ZJFP平均清除率可达56.23%,种植型ZJFP平均可达51.22%高于相同浓度的板枣多糖[34]、骏枣多糖[35]的清除率,表明两种类型酸枣果肉多糖具有较强的DPPH自由基清除能力。上述研究结果可为酸枣果肉多糖的开发和应用提供参考,同时影响抗氧化能力强弱的因素和多糖代谢的机制仍需进一步探究。
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图 1 不同时期和种植方式ZJFP含量
注:不同大小写字母表示差异显著(P<0.05);图6同。
Figure 1. ZJFP content in different stages and different planting methods
表 1 不同时期ZJFP相对分子质量
Table 1 Relative molecular weight of ZJFP in different stages
采样时间 Mw(kDa) 种植 野生 7月7 3048.17 4392.49 8月7 5844.23 6116.64 9月7 1181.74 1132.58 9月25 1265.06 919.66 10月7 445.71 690.09 表 2 各单糖标曲信息
Table 2 Standard curve information of each monosaccharide
标样名称 保留时间(min) 斜率 拟合度 岩藻糖 4.5503 0.5244 0.9921 阿拉伯糖 9.6170 0.609 0.9921 鼠李糖 9.9337 0.3754 0.9953 半乳糖 11.9253 0.9019 0.9923 葡萄糖 14.0087 1.0758 0.9914 木糖 16.5753 0.9556 0.991 甘露糖 17.8587 0.6859 0.9969 果糖 19.9420 0.2992 0.9937 核糖 21.4337 0.718 0.9978 半乳糖醛酸 34.4670 0.3962 0.994 古罗糖醛酸 35.0337 0.4635 0.992 葡萄糖醛酸 37.0920 0.7971 0.9951 甘露糖醛酸 39.4670 0.3032 0.9922 表 3 ZJFP含量和DPPH自由基清除率相关性
Table 3 Correlation between ZJFP content and DPPH radical scavenging rate
名称 种植型ZJFP 野生型ZJFP 清除率 0.766** 0.896** 注:**代表在0.01水平上显著相关。 -
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