Effect of Low Temperature Impregnation Process on the Quality of Orah Fruit Wine
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摘要: 为探究不同低温浸渍温度与浸渍时间对沃柑果酒品质的影响。以广西武鸣沃柑为原料，分别采用不同低温浸渍时间、浸渍温度对沃柑果醪进行预处理，酒精发酵结束后，对沃柑果酒基础理化、总酚含量、黄酮含量、DPPH自由基清除率、色度、香气成分及感官评价进行分析。结果表明，与未经浸渍的沃柑酒样相比，低温浸渍处理组酒样残糖量显著升高（P<0.05），酒精度降低；多酚含量提高0.03~0.59 g/L，黄酮含量升高0.01~0.30 g/L，DPPH自由基清除率提升8.21%~22.79%，色度差在0.41~21.67之间；香气物质分析表明，冷浸渍酒样香气物质种类多，含量高，感官特性好。综上，4 ℃浸渍24 h工艺沃柑果酒品质最好，与未经浸渍酒样相比，总酚、黄酮含量分别提升38.31%和24.39%，DPPH自由基清除率达到83.33％，感官评分为86.64分。该研究结果为提高沃柑果酒的品质提供了新的理论依据。Abstract: In order to study the effect of different low temperature impregnation temperature and impregnation time on the quality of orah fruit wine. This study took Guangxi Wuming orah as raw material, and pretreated orah fruit mash at different low temperature and time, respectively. After alcohol fermentation, the basic physicochemistry, total phenol content, flavonoid content, DPPH free radical clearance rate, chroma, aroma components and sensory evaluation were analyzed. The results showed that compared with the unimpregnated orah fruit wine sample, the residual sugar content of the low temperature impregnated wine sample was significantly increased, while the alcohol content was decreased. On the contrary, total phenol content increased by 0.03~0.59 g/L, flavonoid content increased by 0.01~0.30 g/L, DPPH free radical clearance increased by 8.21%~22.79%, and chroma difference ranged from 0.41 to 21.67. The analysis of aroma substances showed that cold impregnated wine samples had many kinds of aroma substances, high content and good sensory properties. The overall results showed that the quality of the orah fruit wine was the best when impregnated at 4 ℃ for 24 h. Compared with the unimpregnated wine, the contents of total phenol and flavonoid content were increased by 38.31% and 24.39%, respectively. The DPPH free radical scavenging rate reached 83.33%, and the sensory score was 86.64. The results would provide a new theoretical basis for improving the quality of citrus wine.
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Keywords:
- low temperature impregnation /
- citrus fruit wine /
- total phenols /
- color /
- aroma substances
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沃柑是一种晚熟型杂交柑橘，是芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物品种，其外观呈橙黄色，果实肉质鲜美，是我国南方地区的特产，因其富含多糖、矿物质、蛋白质、有机酸、酚酸、类胡萝卜素、维生素（尤其是维生素C）、黄酮类化合物等活性物质[1]，以及具有预防心血管疾病和癌症、抗菌、抗炎、增强人体免疫力的作用深受消费者青睐[2]。与此同时，沃柑具有糖度高、酸度低、色泽鲜艳、多酚含量高的特点[3−4]，是果酒酿造的优质原料。因此，对沃柑果酒的前处理方式进行探究，不仅可以提高沃柑果酒的品质，提升产品附加值，还能促进沃柑产业的健康良性发展。
果酒的前处理方式主要分为热浸渍、冷浸渍以及酶处理、超声、微波等辅助技术[5]。然而，热浸渍、酶处理等技术，会造成果酒中花色苷等活性物质不同程度的降解、营养成分不同程度的破坏，并且存在操作复杂、成本高昂等问题[6−7]。而冷浸渍技术（Cold Maceration，CM）是最近几年研究较多的发酵前浸渍技术，该工艺技术有利于水溶性化合物在水性介质中的选择性扩散，在葡萄酒的生产中已有应用，可增加葡萄中多糖、多酚等活性物质的释放和溶解[8]。Naviglio等[9]研究了不同浸渍温度对霞多丽葡萄的品质影响，结果发现总酚类化合物的浓度随着低温浸渍温度降低而增加，其中4 ℃浸渍酒样总酚含量高达440.4 mg/L；也有学者发现，冷浸渍时间在提高葡萄酒酚类化合物浓度的同时，也增强了抗氧化活性[10]；Alti-Palacios等[11]发现冷浸渍技术显著提高酯类、醇类化合物的浓度，对葡萄酒的芳香品质和复杂性有积极影响；在色泽方面，李斌斌等[12]发现冷浸渍处理能更好地改善干红葡萄酒的色泽，且不影响葡萄酒整体质量。综上所述，冷浸渍技术具有提升果酒品质的良好潜力，但至今未应用到沃柑果酒的开发中。
基于此，本研究通过对比未经浸渍酿造方式与不同温度、时间低温浸渍技术酿造沃柑果酒后其总酚、总黄酮、DPPH自由基清除率、色度、感官评价与香气成分等指标，探究低温浸渍对沃柑果酒的品质特性的影响，以期为冷浸渍工艺在沃柑果酒的酿造生产中提供一定的理论依据和技术参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沃柑 产自广西武鸣，购自农贸市场，挑选无腐烂、无损伤、成熟度一致，果径在65~70 mm的大小均匀的果实，糖度为15°Brix；安琪活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；果胶酶（5000 U/g） 东恒华道生物科技有限公司；焦亚硫酸钾 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2-辛醇 色谱纯，上海麦克林生化技有限公司；芸香叶苷、没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、福林酚、硝酸铝、亚硝酸钠、3,5-二硝基水杨酸 分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
WS114手持糖度计 上海谱振生物科技有限公司；MJWJE2802D榨汁机 美的集团股份有限公司；UV-1100分光光度计 上海美普达仪器有限公司；7890A-5975B气相色谱-质谱联用仪 Agilent Technologies公司；TD-4M离心机 山东博科仪器有限公司；UitraScan VIS台式色差仪 HunterLab有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沃柑果酒的酿造
选择新鲜、成熟的沃柑，去皮、榨汁，调节果醪初始糖度为15°Brix，初始pH为5.0，加入果胶酶100 mg/L、焦亚硫酸钾100 mg/L[7]。试验共分为10组（每组3个平行），低温浸渍处理组于4、9、14 ℃分别放置12、24和36 h[13]，对照组（CK组）不进行低温浸渍处理。浸渍结束后，酵母活化以1 g/L干酵母计算，加10倍量的5%的糖水，在35~40 ℃活化30 min，待低温浸渍处理组温度恢复室温后，接入活化好的酿酒酵母，置于25 ℃恒温箱，启动酒精发酵，酒精发酵结束后过滤，加入焦亚硫酸钾100 mg/L，于4 ℃下澄清。
1.2.2 基础理化指标的测定
总酸、酒精度的测定参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]进行检测；pH采用pH计测定；可溶性固形物采用手持式糖度计测定；总残糖的测定参照刘俊丽等[15]的DNS法，以葡萄糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.1554x−0.1716（R2=0.9991）。
1.2.3 总酚含量的测定
总酚含量的测定参照Cai等[16]Folin-Ciocalteu 比色法，吸取0.1 mL酒样，结果以没食子酸计，以没食子酸标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=4.1714x+0.0027（R2=0.9993）。
1.2.4 黄酮含量的测定
黄酮参照李斌斌等[12]的方法测定，吸取0.1 mL酒样，结果以芦丁计，以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=6.0536x+0.0061（R2=0.9992）。
1.2.5 DPPH自由基清除率测定
参考马懿等[7]的方法，用无水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，将2 mL酒样加入到2 mL DPPH溶液中混匀，室温避光反应30 min后，在波长517 nm处测定吸光度，记为Ａi；同时以等量磷酸缓冲溶液（PBS，pH7）作空白对照试验，记为Ａc。每个样重复测定3次，根据下式计算清除率。
DPPH自由基清除率(%)=(1−AiAc)×100 式中：Ai表示样品加入DPPH室温避光反应30 min后在波长517 nm处的吸光度；Ac表示加入等量磷酸缓冲溶液室温避光反应30 min后在波长517 nm处的吸光度。
1.2.6 色差的测定
色度情况参照Barros等[17]的方法，采用色差仪对样品进行检测，以蒸馏水标零后，以CK组为标品，分别测定每个酒样的L*、a*、b*值，其中，dE*值根据下式进行计算。
dE*=√(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2 式中：L*表示亮度；a*表示红度值；b*表示黄度值；dE*表示总色差值。
1.2.7 感官品评
参考Hu等[18]的方法进行感官评价（表1），感官评价小组由10名学生（5名女性和5名男性，年龄20~30岁）组成，在感官评价之前，由三名国家级品酒员对小组成员进行专业培训，培训标准参考《国标感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优选评价员》[19]。
表 1 沃柑果酒感官品评评分标准Table 1. Standard for sensory evaluation of orah fruit wine项目 分值 评分标准 外观（35） 20~35 澄清透明、有光泽 10~20 澄清透明、色泽不足 1~10 浑浊、无光泽 香气（30） 20~30 香气纯正、浓郁优雅 10~20 果香不足、但尚且和谐 1~10 果香不良、或有异味 口感（35） 20~35 酒体饱满、舒心爽口、酸甜度适中、余味悠长 10~20 舒心爽口、略酸或略甜 1~10 酸涩、平淡、有异味 1.2.8 挥发性香气成分的测定
香气成分的测定参照朱艳霞等[13]顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（Headspace Solid-Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）的方法并做适当修改。
HS-SPME：将8 mL酒样装入15 mL顶空瓶中，并加入1 g NaCl，加入内标2-辛醇（0.1643 μg/μL）50 µL；酒样在45 ℃条件下预热10 min后，将老化后的微萃取头插入顶空瓶中，同时推出纤维头（距离液面1.5 cm），于顶空位置吸附35 min，吸附后，收回纤维头并迅速送至GC送样口，在250 ℃热解析3 min。
GC条件：DB-WAX毛线管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；采用不分流进样模式；程序升温：初始温度40 ℃，保留5 min，以2 ℃/min升温至60 ℃，以5 ℃/min升温至180 ℃，保留5 min，以10 ℃/min 升温至230 ℃，保留10 min；载气为高纯氦气，恒定流速1.2 mL/min。
MS条件：电子轰击电离源（EI），离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，采集模式为全扫描，MS四极杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min。
挥发性物质定性定量：色谱峰对应的质谱通过与NIST/Wiley Database进行检索比对，保留匹配度大于80%的鉴定结果。通过内标物（2-辛醇）的峰面积和沃柑果酒中各组分的峰面积比值，计算各个组分的质量浓度。
挥发性风味物质质量浓度（μg/L）=各成分峰面积×内标物质量浓度/内标物峰面积
1.3 数据处理
所有实验重复操作3次。DPS数据处理系统V6.55用于数据的显著性分析和多重比较（Duncan法），数据处理后用平均值±标准差的方式表示，Origin 2023用于主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）及图的绘制。
2. 结果与分析
2.1 不同低温浸渍处理对沃柑果酒基础理化指标的影响
不同低温浸渍处理对沃柑果酒理化指标的影响如表2所示。低温浸渍处理酒样总糖含量均显著高于CK组酒样总糖含量（P<0.05），与此同时，除4 ℃浸渍12 h处理组与CK组的酒精度无显著差异外，其它处理组酒精度都显著低于CK组（P<0.05）。总酸与pH数据表明，低温浸渍处理组酒样pH在4.19~4.24之间，总酸在10.28~11.61 g/L之间，低温浸渍处理组酒样总酸含量、pH与对照组酒样无显著区别（P>0.05），低温浸渍温度为9 ℃的酒样，其总酸含量随低温浸渍时间的延长呈增加趋势，可能是因为浸渍时间增加导致沃柑内部的成分相互发生反应，代谢产物柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和草酸等有机酸增加[20]；与此同时，不同浸渍温度酒样之间则无显著的变化规律，说明低温浸渍处理温度对酒的酸度影响不大；此外，低温浸渍处理各酒样中可溶固形物含量在8.27~8.83 g/L之间，4 ℃浸渍12 h处理组可溶性固形物含量显著高于其它处理组（P<0.05），为8.83±0.17 g/L，说明该条件对可溶性固形物有积极影响。
表 2 不同低温浸渍处理对沃柑果酒基础理化指标的影响Table 2. Effects of different low temperature impregnation treatments on the basic physicochemical indexes of orah fruit wine温度 时间 总酸（g/L） 总糖（g/L） pH 可溶性固形物（°Brix） 酒精度（%vol） CK − 10.96±0.22ab 1.74±0.33d 4.23±0.01a 8.33±0.29bc 15.17±0.12a 4 ℃ 12h 11.61±0.50a 2.85±0.23ab 4.19±0.02a 8.83±0.17a 14.87±0.19ab 24 h 11.29±0.50a 2.21±0.23c 4.20±0.03a 8.40±0.16abc 14.17±0.24c 36 h 11.61±0.47a 2.55±0.32bc 4.18±0.02a 8.43±0.21abc 14.27±0.18c 9 ℃ 12 h 10.35±0.19b 2.69±0.18abc 4.20±0.06a 8.80±0.22ab 14.10±0.08c 24 h 10.92±0.58ab 2.50±0.35bc 4.20±0.05a 8.57±0.17abc 14.47±0.45bc 36 h 11.33±0.26a 2.99±0.15ab 4.21±0.04a 8.33±0.12bc 14.30±0.19c 14 ℃ 12 h 11.08±0.18ab 3.05±0.24ab 4.22±0.02a 8.73±0.21abc 14.50±0.36bc 24 h 11.55±0.34a 3.26±0.30a 4.22±0.03a 8.53±0.26abc 14.00±0.14c 36 h 10.28±0.10b 2.71±0.32abc 4.24±0.03a 8.27±0.12c 14.17±0.11c 注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05，表3~表5同。 2.2 不同低温浸渍处理对沃柑果酒总酚含量的影响
多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的植物次生代谢物，主要存在于植物的皮、根、叶、果中，有超氧化物歧化酶活性，能有效清除自由基，调节细胞氧化还原电位，帮助人体抵抗自由基的伤害，其作为果酒中最为丰富的化合物，对沃柑果酒的色泽、口感、抗氧化性等有较大影响[21]。研究发现不同低温浸渍处理对沃柑果酒的多酚含量会有一定的影响，如图1所示。
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根据图1结果分析可知，9 ℃浸渍12 h和14 ℃浸渍36 h的沃柑果酒酒样中的总酚含量与CK组无显著性差异（P>0.05），其它处理组的多酚含量都显著高于CK组（P<0.05），说明适当的低温浸渍有利于水果中多酚物质的溶出；另一方面，低温下多酚氧化酶的活性受到抑制，尽量多的保留了多酚物质[17]。其中，当浸渍温度为4 ℃时，浸渍时间为12、24、36 h组别都显著高于相同浸渍时间的其它组别（P<0.05），相对于CK组分别提高了13.64%、38.31%、13.64%，4 ℃浸渍24 h的沃柑果酒多酚含量达到了2.13 g/L，显著高于其它处理组（P<0.05），该处理对于提高沃柑果酒的多酚含量有明显的效果。
2.3 不同低温浸渍处理对沃柑果酒黄酮含量的影响
黄酮类化合物是一种多酚类物质，属于生理活性物质，具有抗自由基、抗氧化和抑菌等作用[1]，大量存在于沃柑中，主要参与形成果酒的颜色、口感、风味等，试验对不同低温浸渍处理的沃柑果酒的黄酮含量进行了考察，得到了如图2所示的结果。
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图 2 不同低温浸渍处理沃柑果酒的黄酮含量Figure 2. Flavonoid contents of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments图2结果表明，不同的低温浸渍时间与温度处理对沃柑果酒的黄酮含量有一定的积极影响，当浸渍时间为12 h时，4和9 ℃浸渍处理黄酮含量无明显提升（P>0.05），但随着浸渍温度的升高，14 ℃浸渍处理组的黄酮含量有一定的升高，高于4 ℃组0.07 g/L。在浸渍温度为9 ℃时，随着浸渍时间的延长，黄酮含量也呈现递增的趋势，36 h浸渍处理时最高，与12 h相比提升了15.32%。总体来看，与CK（1.23 g/L）对比，4 ℃浸渍24、36 h，9 ℃浸渍36 h，14 ℃浸渍12、24、36 h处理组的黄酮含量都得到了显著提升（P<0.05），其中4 ℃浸渍24 h的沃柑果酒黄酮含量显著高于其它处理组（P<0.05），与CK相比提高了0.4 g/L，原因可能是适当的低温浸渍处理可以破坏沃柑果肉的细胞组织，改变细胞质膜的透性，使更多的黄酮溶出[22]。
2.4 不同低温浸渍处理对沃柑果酒DPPH自由基清除率的影响
沃柑果酒的抗氧化作用主要体现在富含多酚类物质，这些物质可以清除体内自由基、螯合金属离子、激活其它抗氧化剂、抑制细胞内氧化酶活性[21]，从而达到了抗氧化的目的，如图3所示，从DPPH自由基清除率的强弱来看，CK组清除率最低，为60.54%，而低温浸渍处理的各酒样清除率在68.75%~83.33%范围内。从不同低温浸渍处理的沃柑果酒清除DPPH自由基效果可看出，4 ℃浸渍24 h的酒样显著高于其它酒样（P<0.05），DPPH自由基清除率达到了83.33%，DPPH自由基清除能力最强，这可能与它具有最高的多酚含量、黄酮含量有关；其次，9 ℃浸渍36 h处理组DPPH自由基清除能力仅次于4 ℃浸渍24 h处理组，清除率为78.75%，显著高于其它组别（P<0.05），相比于CK组，以上两者分别提高了37.64%和30.08%。总体来说，低温浸渍对DPPH自由基清除效果较好，这与Alencar等[10]研究结果一致。
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图 3 不同低温浸渍处理沃柑果酒的DPPH自由基清除率Figure 3. DPPH free radical clearance rate of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments2.5 不同低温浸渍处理对沃柑果酒色泽的影响
色泽是沃柑果酒重要的感官特征之一，直接影响消费者的视觉感受，对不同低温浸渍处理的沃柑果酒色泽指标进行研究，得到了表3所示的结果。
表 3 不同低温浸渍处理沃柑果酒的色泽指标Table 3. Color indexes of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments温度 浸渍时间 色泽指标 L* a* b* dE* CK 0 59.61±0.16b 1.52±0.05h 36.76±0.15c - 4 ℃ 12 h 51.23±0.09d 3.57±0.02b 37.10±0.08b 8.63±0.08f 24 h 38.54±0.09i 4.47±0.01a 32.63±0.09g 21.67±0.11a 36 h 41.66±0.07h 3.08±0.01c 32.82±0.06g 18.44±0.08b 9 ℃ 12 h 59.65±0.25b 1.80±0.02f 37.06±0.20b 0.41±0.18i 24 h 57.63±0.13c 1.68±0.01g 36.31±0.14d 2.03±0.14g 36 h 43.13±0.02g 2.27±0.03d 31.34±0.04h 17.37±0.03c 14 ℃ 12 h 50.73±0.11e 2.11±0.05e 34.07±0.14e 9.30±0.15e 24 h 48.62±0.02f 2.07±0.03e 33.26±0.01f 11.55±0.02d 36 h 60.22±0.11a 1.43±0.02i 38.03±0.08a 1.41±0.11h L*值反映的是沃柑果酒色泽的深浅，值越大色泽越浅，由表3数据分析可知，L*值在4、14 ℃中会随浸渍时间的延长呈现出先下降再上升的趋势，而在温度9 ℃下随浸渍时间延长沃柑果酒的颜色则加深，其中4 ℃浸渍24 h的L*值最小，14 ℃浸渍36 h的L*值最大，除14 ℃浸渍36 h处理组外，CK组的L*值显著高于其它处理组（P<0.05），说明经低温浸渍处理后发酵的果酒颜色更深。
a*值与酒体的红色程度相关，沃柑果酒的a*越大，表明红色调越强；14 ℃浸渍36 h的酒样a*值低于CK酒样中的a*值，除此之外，所有低温浸渍处理组的a*显著高于CK组（P<0.05），4 ℃浸渍24 h的酒样a*值最高，其次是4 ℃浸渍12 h与36 h，与CK组相比分别增加了194.08%、134.87%、102.63%，说明低温浸渍处理过的酒样色调更红，这是因为低温浸渍使细胞壁刚性结构丧失和增强了细胞壁的通透性，沃柑中更多的花色苷被浸提出来[23]。
沃柑果酒中的黄色调由b*表示，14 ℃浸渍36 h的b*值显著高于其它酒样（P<0.05），4和9 ℃浸渍12 h的酒样b*值显著高于CK酒样（P<0.05），表明在上述低温浸渍处理条件下沃柑果酒黄色度较深，沃柑果酒的黄色度是由类黄酮等物质产生的，这可能是因为适宜的低温浸渍可以加速呈黄色调的多酚类物质溶入果酒中；另一方面酒样的褐变也会引起酒体颜色的变黄。研究表明，沃柑中呈黄色调的酚类物质浸入酒体后，会与花色苷相作用形成辅色效应，增强沃柑果酒色泽[24]，从而导致低温浸渍后酒体的黄色调高于未经浸渍的酒体。
dE*表示色差值，指与CK的总体色泽的差距大小，值越大差距越大。9 ℃浸渍12 h时dE*<1，表明该处理组的酒样与CK组相比其色差肉眼较难以分辨；此外，沃柑果酒4 ℃浸渍24 h后相比于对照组差距最大（P<0.05），说明该浸渍条件对色度影响最大。已有研究表明，冷浸渍技术对色泽具有积极作用，可增加果酒的颜色强度和稳定性，并且与多酚类化合物呈正相关[6]。
2.6 感官品评结果
本实验组织了10位具有一定专业技术知识、接受过专业训练，且身体健康、感觉器官灵敏的同学，建立的沃柑果酒感官评定小组，对果酒的各个项目（色泽、香气、口感）进行感官评分，沃柑果酒的感官评分如表4所示。
表 4 不同低温浸渍处理沃柑果酒的感官评分Table 4. Sensory evaluation of different low temperature impregnation treatments for orah fruit wine温度 浸渍时间 色泽（35分） 香气（30分） 口感（35分） 总分（100分） CK − 29.89±2.35a 20.03±2.06b 25.59±2.30cd 75.48±2.36c 4 ℃ 12 h 26.03±1.69a 26.34±2.38a 29.52±3.06abc 81.83±3.25ab 24 h 27.49±2.31a 27.20±2.15a 31.93±1.63a 86.64±2.31a 36 h 26.11±3.67a 25.65±3.01a 27.03±2.59bcd 78.83±2.56bc 9 ℃ 12 h 29.23±2.09a 25.13±1.98a 30.71±2.23ab 85.04±2.31a 24 h 27.04±3.01a 23.82±1.56ab 29.29±1.99abc 80.09±1.98bc 36 h 24.82±2.55a 27.03±3.67a 26.01±2.35cd 77.75±3.25bc 14 ℃ 12 h 26.02±3.07a 27.00±2.30a 23.52±2.41d 76.54±2.31c 24 h 26.52±3.09a 26.10±2.53a 23.91±1.66d 76.51±3.21c 36 h 28.61±2.11a 24.11±2.31ab 25.20±3.01cd 77.88±3.11bc 通过感官品评结果（表4）可以看出，未经浸渍工艺酿造的果酒澄清透明，但香气不足，可能是因为多酚类物质过多氧化，未浸提至酒样中[22]。对比不同酒样处理方式，低温浸渍的酒爽口绵长，橘子味香气怡人，而未经浸渍工艺酿造的果酒香味不协调，缺少了酒本身的香气与口感，得分较低，与最高得分组相差11.1分。不同低温浸渍处理的沃柑果酒在外观、香气和口感上并无明显差异，但在口感上，4 ℃浸渍24 h的果酒醇厚绵净、韵味悠长，总分达到了86.64分。
2.7 不同低温浸渍处理对沃柑果酒香气成分的影响
根据多酚类物质含量、感官评价和抗氧化性指标综合考虑，试验选用4 ℃低温浸渍处理的酒样组与CK组酒样进行香气成分比较。根据表5可知，4组样品共检测出22种香气成分，分别是醇类、酯类、酸类、酚类等，其中醇类和酯类物质是沃柑果酒中的主要挥发性风味物质，并且与黄六斌等[25]柑橘类果酒中香气成分的含量相似。
表 5 不同低温浸渍处理沃柑果酒的香气成分含量Table 5. Contents of aroma components in orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments类别 序号 化合物名称 质量浓度（μg/L） CK 4 ℃浸渍12 h 4 ℃浸渍24 h 4 ℃浸渍36 h 醇类 A1 苯乙醇 1130.03±22.82c 1695.55±68.65b 1904.20±23.26a 1081.76±22.13c A2 2,3-丁二醇 155.15±3.33d 316.99±5.13b 186.46±6.79c 620.94±15.75a A3 异戊醇 5545.82±12.64a − 738.69±26.07b 759.80±30.92b A4 （2R,3R）-（-）-2,3-丁二醇 869.55±2.94a − 529.28±8.23b − A5 二甲基硅烷二醇 − 260.52±16.77a 235.68±4.01a − A6 异丁醇 − − 2375.85±2.38 − 酯类 B1 十六酸乙酯 254.25±3.73d 475.09±7.33c 513.20±4.81b 797.83±7.70a B2 癸酸乙酯 433.79±4.36d 560.06±7.82c 672.75±20.63b 845.21±18.78a B3 月桂酸乙酯 180.64±8.58c 328.27±22.33b 354.01±20.34b 527.69±14.84a B4 十一酸乙酯 − − − 51.26±2.63 B5 己二酸二（2-乙基己）酯 1466.93±25.81c 550.81±15.39d 6155.90±18.29a 1711.87±12.70b B6 亚油酸乙酯 − − − 179.13±6.94 B7 辛酸乙酯 354.38±9.65b 329.48±14.44b 334.19±11.65b 393.88±10.08a B8 乙酸乙酯 478.11±14.56c 517.93±21.77b 600.72±4.91a 487.13±7.53bc B9 9-十六碳烯酸乙酯 − 81.70±0.97b − 267.37±12.29a B10 对苯二甲酸二辛酯 − 583.21±12.54 − − B11 反油酸乙酯 − − 56.28±2.35b 106.49±4.78a 酸类 C1 乙酸 703.99±21.20b 446.34±11.32d 485.36±9.17c 983.87±5.77a C2 癸酸 − 35.42±4.19b 2.83±0.44c 107.72±1.41a C3 正辛酸 147.39±5.76c − 193.33±2.40b 218.87±6.85a 酚类 D1 2-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯酚 78.53±3.18 − − − D2 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚 579.32±10.09d 1766.51±2.48b 2350.96±5.45a 958.35±9.69c 醇类物质是影响果酒香气最重要的物质之一，主要来源于酵母发酵和氨基酸转化。CK与3种不同浸渍处理样品中检测到的醇类共6种，其中未经浸渍的沃柑果酒醇类物质质量浓度最高，总量为7700.56 μg/L，检出4种；4 ℃浸渍12 h组检出3种，总量为2273.07 μg/L；4 ℃浸渍24 h组检出种类最多为6种，总量为5970.16 μg/L，与该处理组在感官评价香气标准中评分最高的结果相符合，说明该工艺提高了酒体香气的复杂性；4 ℃浸渍36 h组检出3种，总量为2462.51 μg/L。其中，呈玫瑰花香的苯乙醇在经过低温浸渍处理后得到了显著的提高（P<0.05），在4 ℃浸渍12 h、24 h中分别提高了50.04%和68.50%；CK组的2,3-丁二醇显著低于低温浸渍处理组（P<0.05），4 ℃浸渍36 h处理组显著高于其它所有处理组（P<0.05），与CK组相比提升了约3倍；此外，异戊醇与（2R,3R）-（-）-2,3-丁二醇在经过低温浸渍处理后含量显著降低（P<0.05），异戊醇在酒体中是一种苦杏仁味、油臭味，降低其含量有利于降低酒体的苦涩味。总体来说，低温浸渍处理的酒样酒体会更加醇厚，能使沃柑果酒表现出花香、果香等气味，使得香气复杂醇厚，可能因为浸渍温度低时间长，沃柑中的氨基酸等物质发生生化反应造成的[26]。
果酒中的酯类物质来源于浆果、脂肪酸氧化以及醇、醛和氨基酸的代谢合成[11]。4组酒样共检测出11种酯类化合物，但低温浸渍工艺和未经浸渍工艺酿造的沃柑果酒在种类和含量上存在较大区别，CK组酯类物质的种类和总量最少，共检出6种，总量为3168.10 μg/L；4 ℃浸渍12 h组检出8种，总量为3426.55 μg/L；4℃浸渍24 h组酯类总量最高为8687.04 μg/L，共检出7种；4 ℃浸渍36 h组检出10种，总量为5367.86 μg/L。分析可知，在经过低温浸渍处理后，沃柑果酒中的十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十一酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯等呈现花香、果香的酯类含量都得到了显著提升（P<0.05），其中，4 ℃浸渍36 h组十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯含量提升最多，与CK相比分别提升了2.14、0.94、1.92、0.11倍；己二酸二（2-乙基己）酯、乙酸乙酯在4 ℃浸渍24 h处理组中含量最高，为CK组的4.20和1.02倍。
沃柑果酒中酸味主要来源于酵母利用糖类进行生化反应的次生代谢产物。沃柑果酒中共检测乙酸、癸酸、正辛酸3种酸类香气，CK组与4 ℃浸渍12 h组酸类物质种类检出最少，共检出2种，总量分别为851.38和481.75 μg/L；4 ℃浸渍24 h组检出3种，总量为681.51 μg/L；4 ℃浸渍36 h组检出酸类总量最高为1310.46 μg/L，共检出3种。分析可知，与CK相比，4 ℃低温浸渍36 h增加了乙酸的含量，而4 ℃低温浸渍12、24 h则可以降低乙酸含量；此外，低温浸渍处理显著提升了正辛酸的含量，且浸渍时间越长浓度越高，说明浸渍时间对正辛酸含量影响较大。研究发现低浓度挥发性酸类会增加果酒香气的复杂性，但浓度高于一定阈值后，反而会对果酒香气产生负面影响 [27]。因此，酸类香气主要起辅助作用，含量不宜过多。
2.8 挥发性香气成分主成分分析
为考察不同低温浸渍对沃柑果酒挥发性香气成分影响的差异性，试验采用PCA的方法对挥发性香气成分进行直观分析，PC1、PC2的特征值及贡献率见表6。PC1的贡献率为50.47%，PC2的贡献率为30.44%，两者的累计贡献率为80.91%，说明对原始数据的解释程度效果良好，取PC1与PC2做主成分分析与载荷图（图4）。
表 6 PC的特征值及贡献率Table 6. Characteristic values and contribution rate of PCPC 特征值 贡献率（%） 累计贡献率（%） 1 11.10 50.47% 50.47% 2 6.70 30.44% 80.91% 各个指标之间连线的距离反映了每个指标之间的相关性，距离越短，正相关性越强。由图4可知，不同低温浸渍处理组在PCA上的位置有明显区别，表明不同时间、温度的低温浸渍处理对沃柑果酒香气有显著影响；其中4 ℃浸渍12 h与24 h处理组间相关性较大，而与4 ℃浸渍36 h和CK组相关性较弱。对各挥发性物质间关系进行分析可知，十六酸乙酯（B1）、癸酸乙酯（B2）、月桂酸乙酯（B3）间以及2,3-丁二醇（A2）、十一酸乙酯（B4）、亚油酸乙酯（B6）、9-十六碳烯酸乙酯（B9）、癸酸（C2）间正相关性较强，说明物质之间联系紧密。CK组与异戊醇（A3）、2-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯酚（D1）相关性较强，4 ℃浸渍12 h对对苯二甲酸二辛酯（B10）的积极影响较大，4 ℃浸渍24 h处理对己二酸二（2-乙基己）酯（B5）的含量有正向的影响。总体来说，大部分的挥发性物质主要聚集在4 ℃浸渍36 h处理组附近，余下部分多聚集在4 ℃浸渍12和24 h处理组附近，与CK组都相距较远，说明低温浸渍处理对挥发性物质有积极的影响，并且4 ℃浸渍36 h处理组对挥发性物质正面影响最大。
3. 结论
本研究探究了不同低温浸渍时间与浸渍温度对沃柑果酒的品质影响，结果表明不同低温浸渍工艺对沃柑果酒总酸含量影响较小，与未经浸渍工艺相比，低温浸渍酒样残糖都显著升高，酒精度则降低；与之相反，多酚、黄酮含量升高，DPPH自由基清除率显著提升，色度差变大；香气物质分析表明，冷浸渍酒样香气物质种类多，含量高，感官特性好，十六酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十一酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯等呈花香、果香的酯类含量得到显著提升，而异戊醇等苦味物质含量降低（P<0.05）。总体表明：4 ℃浸渍24 h工艺沃柑果酒品质最好，与未经浸渍工艺相比，总酚、黄酮含量分别提升38.31%和24.39%，DPPH自由基清除率为83.33％，感官评分达到86.64分。综上所述，低温浸渍工艺对沃柑果酒的品质具有提升作用，可作为沃柑果酒酿造前的预处理方法。该研究对低温浸渍工艺未来在沃柑果酒的应用提供了理论支撑，为提高沃柑果酒的品质提供了新的依据。然而，低温浸渍工艺对后续沃柑果酒发酵的影响方面还需要进一步研究。
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图 2 不同低温浸渍处理沃柑果酒的黄酮含量
Figure 2. Flavonoid contents of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments
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图 3 不同低温浸渍处理沃柑果酒的DPPH自由基清除率
Figure 3. DPPH free radical clearance rate of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments
表 1 沃柑果酒感官品评评分标准
Table 1 Standard for sensory evaluation of orah fruit wine
项目 分值 评分标准 外观（35） 20~35 澄清透明、有光泽 10~20 澄清透明、色泽不足 1~10 浑浊、无光泽 香气（30） 20~30 香气纯正、浓郁优雅 10~20 果香不足、但尚且和谐 1~10 果香不良、或有异味 口感（35） 20~35 酒体饱满、舒心爽口、酸甜度适中、余味悠长 10~20 舒心爽口、略酸或略甜 1~10 酸涩、平淡、有异味 
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表 2 不同低温浸渍处理对沃柑果酒基础理化指标的影响
Table 2 Effects of different low temperature impregnation treatments on the basic physicochemical indexes of orah fruit wine
温度 时间 总酸（g/L） 总糖（g/L） pH 可溶性固形物（°Brix） 酒精度（%vol） CK − 10.96±0.22ab 1.74±0.33d 4.23±0.01a 8.33±0.29bc 15.17±0.12a 4 ℃ 12h 11.61±0.50a 2.85±0.23ab 4.19±0.02a 8.83±0.17a 14.87±0.19ab 24 h 11.29±0.50a 2.21±0.23c 4.20±0.03a 8.40±0.16abc 14.17±0.24c 36 h 11.61±0.47a 2.55±0.32bc 4.18±0.02a 8.43±0.21abc 14.27±0.18c 9 ℃ 12 h 10.35±0.19b 2.69±0.18abc 4.20±0.06a 8.80±0.22ab 14.10±0.08c 24 h 10.92±0.58ab 2.50±0.35bc 4.20±0.05a 8.57±0.17abc 14.47±0.45bc 36 h 11.33±0.26a 2.99±0.15ab 4.21±0.04a 8.33±0.12bc 14.30±0.19c 14 ℃ 12 h 11.08±0.18ab 3.05±0.24ab 4.22±0.02a 8.73±0.21abc 14.50±0.36bc 24 h 11.55±0.34a 3.26±0.30a 4.22±0.03a 8.53±0.26abc 14.00±0.14c 36 h 10.28±0.10b 2.71±0.32abc 4.24±0.03a 8.27±0.12c 14.17±0.11c 注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05，表3~表5同。
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表 3 不同低温浸渍处理沃柑果酒的色泽指标
Table 3 Color indexes of orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments
温度 浸渍时间 色泽指标 L* a* b* dE* CK 0 59.61±0.16b 1.52±0.05h 36.76±0.15c - 4 ℃ 12 h 51.23±0.09d 3.57±0.02b 37.10±0.08b 8.63±0.08f 24 h 38.54±0.09i 4.47±0.01a 32.63±0.09g 21.67±0.11a 36 h 41.66±0.07h 3.08±0.01c 32.82±0.06g 18.44±0.08b 9 ℃ 12 h 59.65±0.25b 1.80±0.02f 37.06±0.20b 0.41±0.18i 24 h 57.63±0.13c 1.68±0.01g 36.31±0.14d 2.03±0.14g 36 h 43.13±0.02g 2.27±0.03d 31.34±0.04h 17.37±0.03c 14 ℃ 12 h 50.73±0.11e 2.11±0.05e 34.07±0.14e 9.30±0.15e 24 h 48.62±0.02f 2.07±0.03e 33.26±0.01f 11.55±0.02d 36 h 60.22±0.11a 1.43±0.02i 38.03±0.08a 1.41±0.11h
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表 4 不同低温浸渍处理沃柑果酒的感官评分
Table 4 Sensory evaluation of different low temperature impregnation treatments for orah fruit wine
温度 浸渍时间 色泽（35分） 香气（30分） 口感（35分） 总分（100分） CK − 29.89±2.35a 20.03±2.06b 25.59±2.30cd 75.48±2.36c 4 ℃ 12 h 26.03±1.69a 26.34±2.38a 29.52±3.06abc 81.83±3.25ab 24 h 27.49±2.31a 27.20±2.15a 31.93±1.63a 86.64±2.31a 36 h 26.11±3.67a 25.65±3.01a 27.03±2.59bcd 78.83±2.56bc 9 ℃ 12 h 29.23±2.09a 25.13±1.98a 30.71±2.23ab 85.04±2.31a 24 h 27.04±3.01a 23.82±1.56ab 29.29±1.99abc 80.09±1.98bc 36 h 24.82±2.55a 27.03±3.67a 26.01±2.35cd 77.75±3.25bc 14 ℃ 12 h 26.02±3.07a 27.00±2.30a 23.52±2.41d 76.54±2.31c 24 h 26.52±3.09a 26.10±2.53a 23.91±1.66d 76.51±3.21c 36 h 28.61±2.11a 24.11±2.31ab 25.20±3.01cd 77.88±3.11bc
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表 5 不同低温浸渍处理沃柑果酒的香气成分含量
Table 5 Contents of aroma components in orah fruit wine with different low temperature impregnation treatments
类别 序号 化合物名称 质量浓度（μg/L） CK 4 ℃浸渍12 h 4 ℃浸渍24 h 4 ℃浸渍36 h 醇类 A1 苯乙醇 1130.03±22.82c 1695.55±68.65b 1904.20±23.26a 1081.76±22.13c A2 2,3-丁二醇 155.15±3.33d 316.99±5.13b 186.46±6.79c 620.94±15.75a A3 异戊醇 5545.82±12.64a − 738.69±26.07b 759.80±30.92b A4 （2R,3R）-（-）-2,3-丁二醇 869.55±2.94a − 529.28±8.23b − A5 二甲基硅烷二醇 − 260.52±16.77a 235.68±4.01a − A6 异丁醇 − − 2375.85±2.38 − 酯类 B1 十六酸乙酯 254.25±3.73d 475.09±7.33c 513.20±4.81b 797.83±7.70a B2 癸酸乙酯 433.79±4.36d 560.06±7.82c 672.75±20.63b 845.21±18.78a B3 月桂酸乙酯 180.64±8.58c 328.27±22.33b 354.01±20.34b 527.69±14.84a B4 十一酸乙酯 − − − 51.26±2.63 B5 己二酸二（2-乙基己）酯 1466.93±25.81c 550.81±15.39d 6155.90±18.29a 1711.87±12.70b B6 亚油酸乙酯 − − − 179.13±6.94 B7 辛酸乙酯 354.38±9.65b 329.48±14.44b 334.19±11.65b 393.88±10.08a B8 乙酸乙酯 478.11±14.56c 517.93±21.77b 600.72±4.91a 487.13±7.53bc B9 9-十六碳烯酸乙酯 − 81.70±0.97b − 267.37±12.29a B10 对苯二甲酸二辛酯 − 583.21±12.54 − − B11 反油酸乙酯 − − 56.28±2.35b 106.49±4.78a 酸类 C1 乙酸 703.99±21.20b 446.34±11.32d 485.36±9.17c 983.87±5.77a C2 癸酸 − 35.42±4.19b 2.83±0.44c 107.72±1.41a C3 正辛酸 147.39±5.76c − 193.33±2.40b 218.87±6.85a 酚类 D1 2-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯酚 78.53±3.18 − − − D2 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚 579.32±10.09d 1766.51±2.48b 2350.96±5.45a 958.35±9.69c
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表 6 PC的特征值及贡献率
Table 6 Characteristic values and contribution rate of PC
PC 特征值 贡献率（%） 累计贡献率（%） 1 11.10 50.47% 50.47% 2 6.70 30.44% 80.91%
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