Effect of Hippophae rhamnoides Flavone on Improving Polycystic Ovarian Syndrome in Rats by Regulating TLR4/NF-κB Signaling Pathway
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摘要: 目的：探究沙棘黄酮改善大鼠多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）的作用及机制，为PCOS的防治提供新的思路。方法：采用高脂饲料联合灌胃来曲唑法复制PCOS模型，并随机分为模型组、低、高剂量沙棘黄酮组（200、400 mg/kg）及二甲双胍组（100 mg/kg），灌胃21 d后检测相关指标变化。结果：与模型组比较，低、高剂量沙棘黄酮组大鼠卵巢指数、发情间期时像百分率、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）含量、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、血清促黄体生成素（LH）活性及睾酮（T）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）含量显著降低（P<0.05，P<0.01），促卵泡刺激素（FSH）活性极显著增加（P<0.01）；低、高剂量沙棘黄酮组大鼠卵巢组织病理形态有所改善，Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子κBp65（NF-κBp65）mRNA及TLR4、MyD88、p-NF-κBp65蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论：沙棘黄酮可以改善PCOS大鼠症状，减轻胰岛素抵抗，调节性激素水平，修复卵巢组织病理改变，其机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。
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关键词:
- 沙棘黄酮 /
- 多囊卵巢综合征 /
- 炎症反应 /
- Toll样受体4/核转录因子κB信号通路
Abstract: Objective: To investigate the effect and mechanism of Hippophae rhamnoides flavone (HRF) on polycystic ovarian syndrome (PCOS) in rats, and to provide new ideas for the prevention and treatment of PCOS. Methods: A PCOS rat model was duplicated by giving rats a high-fat diet combined with the intragastric administration of letrozole, and the model rats were randomly divided into model group, low-dose HRF group (200 mg/kg HRF), high-dose HRF group (400 mg/kg HRF) and metformin group (100 mg/kg). Changes in the related indicators were detected on the 21 d after the rats were administered with the different agents by gavage. Results: Compared with that in the model group, the ovarian index, the percentage of interestrus temporal image, the fasting blood glucose (FBG) level, the fasting insulin (FINS) content, the insulin resistance index (HOMA-IR), the activities of serum luteinizing hormone (LH) and testosterone (T), the levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and C reactive protein (CRP) of rats in low- and high-dose HRF groups were respectively decreased significantly (P<0.05, P<0.01), while the activity of follicle stimulating hormone (FSH) was significantly increased (P<0.01). The histopathological morphology of ovarian tissue of rats treated with the low and high doses of HRF was improved, and the expression levels of toll-like receptor 4 (TLR4), myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factors-κBp65 (NF-κBp65) mRNAs as well as TLR4, MyD88 and p-NF-κBp65 proteins were significantly decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion: HRF could improve the symptoms of PCOS, alleviate the insulin resistance, regulate the level of sex hormones and repair the pathological changes in the ovarian tissue of rats with PCOS, and its mechanism may be related to its inhibition on the inflammatory response mediated by the TLR4/NF-κB signaling pathway. -
多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）以稀发排卵、无排卵为主要特征，并伴有肥胖、胰岛素抵抗、高雄激素血症及卵巢多囊样改变，为女性常见的内分泌、代谢性疾病[1]。PCOS在19~45岁育龄期女性中的发病率较高（约占6%~10%），是因排卵障碍引起不孕的重要因素；如治疗不及时，会增加子宫内膜癌、心脑血管疾病、糖尿病及代谢综合征的患病风险，对女性的身心健康造成极大威胁[2]。
沙棘（Hippophae rhamnoides L.）属于胡颓子科沙棘属植物，又称沙枣、达普、吉汉、酸柳等，具有药食同源性，其提取物在食品、药品等领域已被广泛应用。黄酮类化合物是沙棘的主要功能性成分，研究发现沙棘黄酮（Hippophae rhamnoides flavone，HRF）具有辅助降血糖、减脂、保护肝脏、抑菌及抗炎等多种功效[3]。徐虎军等[4]研究发现，沙棘柴术胶囊对肥胖症患者具有显著的疗效，也可以通过降低促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）/促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）比值及睾酮（testosterone，T）含量，发挥预防或治疗PCOS作用。但目前为止，关于沙棘中的主要活性成分沙棘黄酮是否具有治疗PCOS作用及相关机制未见报道。
在PCOS发病机制中慢性低度炎症起着关键性作用，参与了排卵障碍及卵泡异常发育等过程，主要表现为肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）等炎症因子含量显著增加[5]。PCOS发病机制复杂，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路介导的炎症反应在PCOS的进展中扮演着重要角色[6]。抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症因子分泌，阻断PCOS炎症反应，是预防及治疗PCOS的有效手段[7]。
本研究拟通过高脂饲料联合灌胃来曲唑复制PCOS模型，给予不同剂量的沙棘黄酮干预后，检测体质量、卵巢指数、发情间期时像百分率、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）及血清性激素等指标，并观察卵巢组织病理形态，以明确沙棘黄酮对大鼠PCOS症状、胰岛素抵抗、性激素水平及卵巢组织病理改变的影响。同时，评估血清炎症因子含量，并分析卵巢组织中TLR4/NF-κB信号通路相关基因及蛋白表达，初步阐明沙棘黄酮干预大鼠PCOS作用的分子机制，旨在从营养学角度为PCOS的防治提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙棘果实 产地为内蒙古呼伦贝尔市；SPF级雌性SD大鼠 6周龄，体质量（180±20）g，共60只，购于某大学实验动物公共服务平台[合格证号：SCXK（冀）2020-001]，并在该服务平台饲养[合格证号：SYXK（冀）2020-002，饲养环境湿度为55%~65%、温度为22~24 ℃，12 h/12 h明暗循环交替。本实验方案经河北医科大学第一医院伦理委员会审批（审查号：20200613），相关操作符合实验动物的3R原则；高脂饲料（0.5%食盐、1%麻油、10%鸡蛋、5%花生、5%奶粉、5%蔗糖、12%猪油及61.5%基础饲料） 北京博奥派克生物科技有限公司；盐酸二甲双胍（规格0.25 g/片，批号20211204） 石家庄以岭药业公司；来曲唑（规格2.5 mg/片，批号2021091502） 浙江海正药业公司；LH（货号H206-1-2）、FSH（货号H101-1-2）、T（货号H090-1-2）检测试剂盒 南京建成生物研究所；TNF-α（货号ERC102）、IL-6（货号ERC003）、CRP（货号ERC028）检测试剂盒 深圳欣博盛生物科技公司；苏木素伊红（hematoxylin eosin，HE，货号PH0427）染色试剂盒 武汉卡诺斯生物公司；Trizol（货号15596018）、逆转录试剂盒（货号12574035）、实时荧光定量PCR试剂盒（货号4385612） 美国Thermo Fisher公司；RIPA裂解液（货号R917927）、ECL发光试液（货号E917968） 上海麦克林生化公司；TLR4（货号ab217274）、髓样分化因子88（myeloid differential factor 88，MyD88，货号ab2064）、NF-κBp65（货号ab16502）、磷酸化NF-κBp65（phosphorylated NF-κBp65，p-NF-κBp65，货号ab194726）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH，货号ab8245）多克隆抗体 美国Abcam公司；IgG二抗（货号C86-SSA004） 上海博飞美科生物公司。
BK-200VET型全自动生化分析仪 济南欧莱博技术有限公司；XPE505C型分析天平（精度0.1 mg） 梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司；M-F24G型高速离心机 深圳瑞沃德生命科技有限公司；YT-MB96A型酶标仪 山东云唐智能科技有限公司；RM2125RTS型切片机 德国Leica公司；CMY-50Z型光学显微镜 上海点应光学仪器有限公司；QuantStudio 7 Pro型实时荧光定量PCR仪 美国Thermo Fisher公司；1704150型蛋白电泳及转印系统 美国Bio-Rad公司；JP-2880型凝胶成像仪 上海金鹏分析仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘黄酮的分离及纯化
将沙棘果实在干燥箱中于60 ℃下干燥24 h，随后采用小型粉碎机粉碎，过60目筛得到粉末样品。称取100 g粉末样品，加入3000 mL体积分数为60%的乙醇溶液，充分混合后室温静置30 min。以400 W的功率在50 ℃环境下超声30 min，1000 r/min离心10 min，制备上清液[8]。利用AB-8大孔树脂进行纯化[9]，滤液旋蒸（40 ℃，30 min）及干燥（60 ℃，4 h）后获得沙棘黄酮，其纯度为60.25%。
1.2.2 模型制备、分组及干预
喂养1周适应环境后，将SD大鼠分为对照组（n=10）和造模组（n=50），造模组大鼠给予高脂饲料并用1%羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）溶解的来曲唑灌胃（1 mg/kg），连续21 d，复制PCOS模型[10]；对照组大鼠给予基础饲料并用等体积的1% CMC-Na灌胃。通过连续阴道涂片检查大鼠动情周期，观察到大鼠失去动情周期，且阴道上皮持续白细胞增多则为造模成功[11]，共有43只大鼠造模成功，成功率为86%。取造模成功的大鼠40只，分为模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组，低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠分别灌胃200、400 mg/kg的沙棘黄酮[12]及100 mg/kg的二甲双胍[13]，对照组及模型组大鼠灌胃等体积的蒸馏水，每天1次，共灌胃21 d。
1.2.3 体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率检测
末次灌胃结束后，禁食不禁水12 h，用天平称各组大鼠体质量。采用吸入异氟烷法将大鼠麻醉，剖开腹部皮肤后经腹主动脉取血，分离血清；剖取卵巢组织，冷生理盐水冲洗残留血迹，滤纸拭干，称卵巢质量，按公式（1）计算卵巢指数。连续21 d通过阴道涂片检测动情周期，发情间期时像百分率用公式（2）计算。
卵巢指数(%)=卵巢质量(g)/体质量(g)×100 (1) 发情间期时像百分率(%)=发情间期(天数)/整个动情周期(天数)×100 (2) 1.2.4 FBG、FINS含量及HOMA-IR值检测
通过全自动生化分析仪检测FBG、FINS含量，HOMA-IR值按照公式（3）计算[14]。
HOMA−IR=FBG(mmol/L)×FINS(mmol/L)/22.5 (3) 1.2.5 血清性激素水平及炎症因子含量检测
采用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书的操作指南，分别检测血清性激素（LH、FSH及T）水平及炎症因子（TNF-α、IL-6及CRP）含量[15]。
1.2.6 卵巢组织病理形态观察
取大鼠卵巢组织，将其表面覆盖的包膜及脂肪组织去掉，置于10%甲醛溶液中固定48 h。将部分组织取出，修剪至合适大小后放于组织包埋盒中进行脱水、包埋。用切片机制备5 μm卵巢组织切片，常规HE染色[16]，检测卵巢组织病理形态。
1.2.7 卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达检测
采用实时荧光定量PCR法检测卵巢组织TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达[17]。卵巢组织总RNA提取采用Trizol法，逆转录反应制备模板cDNA。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，所用扩增引物由北京博尔迈生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1。以GAPDH为内参基因，扩增结束后用仪器自带软件进行数据分析，通过2−ΔΔCt法计算TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA相对表达量。
表 1 引物序列Table 1. Primers sequence基因名称 引物序列 产物长度（bp） TLR4 上游引物：5’-CAGAATGAGGACTGGGTG-3’ 185 下游引物：5’-GTGAAGGCAGAGGTGAAAG-3’ MyD88 上游引物：5’-CTCGCAGTTTGTTGGATG-3’ 173 下游引物：5’-TACCTAAGTATTTCTGGCAGT-3’ NF-κBp65 上游引物：5’-ACTGCCGGGATGGCTACTAT-3’ 159 下游引物：5’-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3’ GAPDH 上游引物：5’-TGTTTCCTCGTCCCGTAG-3’ 217 下游引物：5’-CAATCTCCACTTTGCCACT-3’ 1.2.8 卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达检测
采用Western Blot法检测卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达[18]。取冻存的大鼠卵巢组织，放于RIPA裂解液中，超声匀浆后提取总蛋白，通过二喹啉甲酸测蛋白浓度。蛋白样品加入体积比为1:4的上样缓冲液，充分混匀，煮沸变性。SDS-PAGE电泳结束后，将目的蛋白转移至PVDF膜，置于含5%脱脂牛奶的溶液中2 h，加入TLR4、MyD88、NF-κBp65、p-NF-κBp65及GAPDH多克隆抗体，均为1:2000倍稀释，4 ℃冰箱中放置过夜。漂洗后，加入相应的IgG二抗，1:5000倍稀释，常温环境下放置2 h。再次漂洗，通过ECL法显影，采用凝胶成像仪成像，Image Lab软件用于半定量分析。
1.3 数据处理
数据统计分析用SPSS 20.0软件进行。计量资料通过均数±标准差（¯x±s）表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，P<0.05或P<0.01表明差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 沙棘黄酮对各组大鼠体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率的影响
沙棘黄酮对各组大鼠体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率的影响，如表2所示。与对照组比较，模型组及低、高剂量沙棘黄酮组大鼠体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率均显著增加（P<0.05，P<0.01），二甲双胍组大鼠仅体质量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，沙棘黄酮各剂量组大鼠体质量无明显改变（P>0.05），而阳性药物二甲双胍可以使体质量下降（P<0.05），沙棘黄酮各剂量组及二甲双胍组大鼠卵巢指数、发情间期时像百分率显著降低（P<0.05，P<0.01）。目前，PCOS模型常用的造模方法主要包括高脂饮食联合来曲唑法、戊酸雌二醇法、雄激素法、人绒毛膜促性腺激素联合胰岛素法等，其中高脂饮食联合来曲唑法能更好地模拟人类PCOS的病理表现，且操作简单、成功率高、稳定性好，具备广泛的应用前景[19]。本研究采用高脂饮食联合来曲唑法建立PCOS大鼠模型，模型组大鼠表现出卵巢指数增加、发情间期延长等症状，而经沙棘黄酮干预后，卵巢指数增加及发情间期延长的现象均有改善，提示沙棘黄酮具有改善大鼠PCOS症状作用。
表 2 沙棘黄酮对各组大鼠体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率的影响（¯x±s，n=10）Table 2. Effects of HRF on body mass, ovarian index and percentage of interestrus time image of rats in each group (¯x±s, n=10)分组 剂量（mg/kg） 体质量（g） 卵巢指数（%） 发情间期时像百分率（%） 对照组 − 318.05±15.31 0.22±0.02 61.80±7.13 模型组 − 374.28±22.17** 0.37±0.04** 83.27±10.46** 低剂量沙棘黄酮组 200 367.59±28.46** 0.30±0.03**## 72.54±8.21**# 高剂量沙棘黄酮组 400 361.61±31.95** 0.25±0.03*## 69.46±8.75*## 二甲双胍组 100 349.33±30.24**# 0.23±0.02## 65.17±6.82## 注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，表3~表7同。 2.2 沙棘黄酮对各组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值的影响
胰岛素抵抗在PCOS发生、发展的病理过程中扮演着重要角色。研究发现[20]，PCOS患者伴胰岛素抵抗会增加2型糖尿病、心血管疾病、高血压的发病风险，也时常出现高胰岛素血症。流产、无排卵或排卵障碍等症状的发生风险在PCOS伴胰岛素抵抗人群中显著增加，进而降低受孕率，同时也会增加妊娠期高血压、妊娠期糖尿病的发生几率[21]。沙棘黄酮对各组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值的影响，如表3所示。与对照组比较，模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值显著升高（P<0.01）；与模型组比较，低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值显著下降（P<0.01）。研究发现[22]，PCOS患者中有50%~70%伴有胰岛素抵抗，胰岛素抵抗是PCOS远期并发症发生与否及发生时间长短的重要因素；胰岛素抵抗也可以引起高胰岛素血症，导致性激素的异常分泌。减轻胰岛素抵抗程度，对于治疗PCOS具有积极意义。高果糖和高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠用沙棘黄酮治疗14周后，发现沙棘黄酮可以通过抑制胰岛素抵抗及炎症反应，减轻该模型小鼠的认知损伤[23]。沙棘黄酮也能够降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠FBG含量，并减轻胰岛素抵抗程度[24−25]。本研究结果同样发现，在大鼠PCOS模型中，沙棘黄酮可以降低FBG、FINS含量及HOMA-IR值，具有减轻胰岛素抵抗作用。
表 3 沙棘黄酮对各组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值的影响（¯x±s，n=10）Table 3. Effects of HRF on FBG and FINS contents and HOMA-IR value of rats in each group (¯x±s, n=10)分组 剂量（mg/kg） FBG（mmol/L） FINS（mmol/L） HOMA-IR 对照组 − 5.58±0.31 9.02±0.78 2.24±0.12 模型组 − 9.74±1.14** 24.98±2.89** 10.81±1.23** 低剂量沙棘黄酮组 200 8.23±0.96**## 18.37±2.54**## 6.72±0.80**## 高剂量沙棘黄酮组 400 6.97±0.65**## 15.61±1.72**## 4.83±0.57**## 二甲双胍组 100 6.45±0.70**## 11.46±1.38**## 3.29±0.36**## 2.3 沙棘黄酮对各组大鼠血清LH、FSH活性及T含量的影响
本研究通过酶联免疫吸附法检测了沙棘黄酮对各组大鼠血清LH、FSH活性及T含量的影响，结果如表4所示。与对照组比较，模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠血清LH活性、T含量增加（P<0.01），模型组及低、高剂量沙棘黄酮组FSH活性降低（P<0.01）；与模型组比较，低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠血清LH活性、T含量极显著降低（P<0.01），而FSH活性极显著增加（P<0.01）。生殖功能障碍、代谢紊乱与性激素分泌失衡关系密切，其中LH、FSH及T等性激素对于保护和维持卵巢功能起着关键性作用[26]。LH可以影响雄激素、雌激素的合成及卵泡的发育、成熟，也影响着月经周期；FSH对卵母细胞等生殖细胞的增殖、生长、发育和成熟具有重要意义；T含量升高会抑制卵泡的发育成熟，并使卵母细胞数量降低。绿薄荷凉茶能够调节性激素LH、FSH及T水平，进而发挥治疗PCOS作用[27]。本研究结果同样发现，沙棘黄酮具有调节PCOS大鼠性激素水平作用，进而干预大鼠PCOS进展。
表 4 沙棘黄酮对各组大鼠血清LH、FSH活性及T含量的影响（¯x±s，n=10）Table 4. Effects of HRF on serum activities of LH and FSH and T content of rats in each group (¯x±s, n=10)分组 剂量（mg/kg） LH（mU/m） FSH（mU/mL） T（pg/mL） 对照组 − 11.53±0.87 7.82±0.82 41.24±0.49 模型组 − 30.48±4.16** 3.64±0.46** 115.33±9.18** 低剂量沙棘黄酮组 200 25.10±2.03**## 5.19±0.54**## 82.07±7.45**## 高剂量沙棘黄酮组 400 21.65±1.74**## 5.86±0.62**## 66.12±6.50**## 二甲双胍组 100 20.15±2.27**## 6.78±0.81## 53.42±4.34**## 2.4 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织病理形态的影响
本研究通过HE染色法检测了沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织病理形态的影响，结果如图1所示。对照组大鼠卵巢组织未见病理形态改变，结构正常；模型组大鼠卵巢组织颗粒细胞层降低，囊性扩张，卵泡细胞层增厚；低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠囊性扩张卵泡减少，卵巢组织病理形态均有不同程度的恢复。以上结果表明，沙棘黄酮能够修复PCOS大鼠卵巢组织的病理改变，促进卵泡发育。
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图 1 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织病理形态的影响注：红色箭头为颗粒细胞层；绿色箭头为卵泡细胞层（200×）。Figure 1. Effects of HRF on histopathological morphology of ovarian tissue of rats in each group (200×)2.5 沙棘黄酮对各组大鼠血清TNF-α、IL-6及CRP含量的影响
本研究通过ELISA法检测了沙棘黄酮对各组大鼠血清TNF-α、IL-6及CRP含量的影响，结果如表5所示。与对照组比较，血清TNF-α含量在模型组及低剂量沙棘黄酮组大鼠中极显著升高（P<0.01），IL-6含量在模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠中极显著升高（P<0.01），CRP含量在模型组及低、高剂量沙棘黄酮组大鼠中极显著升高（P<0.01）；与模型组比较，低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠血清TNF-α、IL-6及CRP含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。慢性低度炎症被认为是PCOS发病的重要机制，其在排卵过程中发挥了关键作用，TNF-α、IL-6及CRP等促炎因子含量的增加可以导致排卵障碍及卵泡异常发育[28]。研究发现[29]，姜黄素可以下调PCOS大鼠血清及卵巢组织中TNF-α、IL-6和CRP表达，通过抑制炎症反应发挥调节血糖及改善性激素水平作用。葡萄籽提取物也能够抑制IL-6等炎症因子表达，减轻大鼠血脂异常和炎症，改善PCOS全身症状[30]。在多种体内与体外模型中，沙棘黄酮均被证实具有抑制炎症反应的活性。在酒精性脂肪肝病小鼠模型中，经沙棘黄酮治疗后，TNF-α、IL-6及转化生长因子-β水平明显降低，表明其可以通过抑制炎症反应减轻肝脏损伤[31]。在脂多糖处理的小鼠腹腔巨噬细胞模型中，沙棘黄酮能呈剂量依赖性的抑制环氧化酶-2、NO、TNF-α及IL-6的表达与释放[32]。结合本研究结果，推测沙棘黄酮同样具有抑制PCOS大鼠炎症反应作用，进而改善PCOS症状。
表 5 沙棘黄酮对各组大鼠血清TNF-α、IL-6及CRP含量的影响（¯x±s，n=10）Table 5. Effects of HRF on serum contents of TNF-α, IL-6 and CRP of rats in each group (¯x±s, n=10)分组 剂量（mg/kg） TNF-α（pg/mL） IL-6（pg/mL） CRP（pg/mL） 对照组 − 4.72±0.31 0.71±0.05 0.59±0.06 模型组 − 8.91±1.03** 1.36±0.20** 1.05±0.14** 低剂量沙棘黄酮组 200 6.48±0.82**## 1.14±0.15**# 0.89±0.12**# 高剂量沙棘黄酮组 400 5.17±0.64## 0.92±0.08**## 0.82±0.09**## 二甲双胍组 100 5.23±0.70## 0.85±0.13**## 0.63±0.07## 2.6 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达的影响
本研究通过实时荧光定量PCR法检测了沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达的影响，结果如表6所示。模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达显著或极显著高于对照组（P<0.05，P<0.01），低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达极显著低于模型组（P<0.05，P<0.01）。TLR4在体内多种器官和组织中均有表达，为Toll样受体家族成员，MyD88为TLR4传输信号的适配器，二者结合后活化NF-κB，刺激TNF-α、IL-6及CRP等促炎因子表达，诱发炎症反应[33]。本研究结果发现，沙棘黄酮能使TLR4/NF-κB信号通路中3个关键基因TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达降低，表明沙棘黄酮具有抑制PCOS大鼠卵巢组织TLR4/NF-κB信号通路的作用。
表 6 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达的影响Table 6. Effects of HRF on mRNA levels of TLR4, MyD88 and NF-κBp65 in ovarian tissue of rats in each group分组 剂量（mg/kg） TLR4 MyD88 NF-κBp65 对照组 − 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.02 模型组 − 4.14±0.56** 6.53±0.83** 3.69±0.51** 低剂量沙棘黄酮组 200 3.25±0.39**# 4.86±0.64**## 2.54±0.29**## 高剂量沙棘黄酮组 400 2.28±0.32**## 4.72±0.48**## 2.06±0.23**## 二甲双胍组 100 2.16±0.20**## 1.45±0.27*## 1.38±0.12**## 2.7 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达的影响
为了进一步明确沙棘黄酮对PCOS大鼠卵巢组织TLR4/NF-κB信号通路的抑制作用，本研究通过Western Blot法检测了沙棘黄酮对TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达的影响，其中MyD88为可溶性衔接蛋白，是TLR信号通路中的关键接头分子，能激活NF-κB，从而在PCOS等多种疾病的发生发展中扮演重要角色[34]。结果发现，与对照组比较，模型组、低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达显著增加（P<0.01）；与模型组比较，低、高剂量沙棘黄酮组及二甲双胍组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达极显著降低（P<0.05，P<0.01），见图2及表7。多种食物中的有效成分均可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善PCOS症状。葛根中的活性成分葛根素可以降低PCOS大鼠氧化型低密度脂蛋白、炎性因子、性激素及胰岛素抵抗水平，该作用与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关[35]；红参提取物能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，使PCOS大鼠异常增加的卵巢重量恢复至正常，降低血清LH水平，并消除卵巢囊肿[36]。研究发现[37]，沙棘果提取物对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用，与抑制NF-κB信号通路，进而降低TNF-α和IL-6的表达有关。沙棘叶提取物能够抑制脂多糖诱导的MH-S细胞NF-κB的激活，减少NO、IL-6和TNF-α的产生，具有明显的抗炎活性[38]。沙棘黄酮能通过抑制小鼠TLR4/IL-6信号通路，降低血脂水平，减轻动脉粥样硬化斑块[39]。本研究结果发现，在PCOS大鼠模型中，沙棘黄酮也能够降低卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达，进一步证实其具有抑制TLR4/NF-κB信号通路活化的作用，进而降低炎症因子的表达。
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图 2 各组大鼠卵巢组织相关蛋白表达Figure 2. Protein levels of related proteins in ovarian tissue of rats in each group表 7 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达的影响Table 7. Effects of HRF on protein levels of TLR4, MyD88 and p-NF-κBp65 in ovarian tissue of rats in each group分组 剂量
（mg/kg）TLR4/
GAPDHMyD88/
GAPDHp-NF-κBp65/
NF-κBp65对照组 − 0.11±0.02 0.19±0.02 0.24±0.03 模型组 − 0.52±0.06** 0.48±0.05** 0.86±0.12** 低剂量沙棘黄酮组 200 0.34±0.04**# 0.41±0.03**# 0.60±0.08**## 高剂量沙棘黄酮组 400 0.27±0.03**## 0.36±0.03**## 0.51±0.06**## 二甲双胍组 100 0.23±0.03**## 0.31±0.04**## 0.38±0.04**## 3. 结论
本研究结果发现，沙棘黄酮可以降低PCOS大鼠卵巢指数、发情间期时像百分率、FBG、FINS含量、HOMA-IR、LH活性及T、TNF-α、IL-6、CRP含量，增加FSH活性；也能够缓解卵巢组织病理形态，降低TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA及TLR4、MyD88、p-NF-κBp65蛋白表达。结果证实，沙棘黄酮可以改善大鼠PCOS症状，减轻胰岛素抵抗，调节性激素水平，修复卵巢组织病理改变，其机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。综上，对于PCOS的防治，沙棘黄酮具有较大的潜力及应用价值，该研究可为沙棘黄酮作为食品功能因子或药品开发提供依据。
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图 1 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织病理形态的影响
注：红色箭头为颗粒细胞层；绿色箭头为卵泡细胞层（200×）。
Figure 1. Effects of HRF on histopathological morphology of ovarian tissue of rats in each group (200×)
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图 2 各组大鼠卵巢组织相关蛋白表达
Figure 2. Protein levels of related proteins in ovarian tissue of rats in each group
表 1 引物序列
Table 1 Primers sequence
基因名称 引物序列 产物长度（bp） TLR4 上游引物：5’-CAGAATGAGGACTGGGTG-3’ 185 下游引物：5’-GTGAAGGCAGAGGTGAAAG-3’ MyD88 上游引物：5’-CTCGCAGTTTGTTGGATG-3’ 173 下游引物：5’-TACCTAAGTATTTCTGGCAGT-3’ NF-κBp65 上游引物：5’-ACTGCCGGGATGGCTACTAT-3’ 159 下游引物：5’-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3’ GAPDH 上游引物：5’-TGTTTCCTCGTCCCGTAG-3’ 217 下游引物：5’-CAATCTCCACTTTGCCACT-3’ 
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表 2 沙棘黄酮对各组大鼠体质量、卵巢指数及发情间期时像百分率的影响（¯x±s，n=10）
Table 2 Effects of HRF on body mass, ovarian index and percentage of interestrus time image of rats in each group (¯x±s, n=10)
分组 剂量（mg/kg） 体质量（g） 卵巢指数（%） 发情间期时像百分率（%） 对照组 − 318.05±15.31 0.22±0.02 61.80±7.13 模型组 − 374.28±22.17** 0.37±0.04** 83.27±10.46** 低剂量沙棘黄酮组 200 367.59±28.46** 0.30±0.03**## 72.54±8.21**# 高剂量沙棘黄酮组 400 361.61±31.95** 0.25±0.03*## 69.46±8.75*## 二甲双胍组 100 349.33±30.24**# 0.23±0.02## 65.17±6.82## 注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，表3~表7同。
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表 3 沙棘黄酮对各组大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IR值的影响（¯x±s，n=10）
Table 3 Effects of HRF on FBG and FINS contents and HOMA-IR value of rats in each group (¯x±s, n=10)
分组 剂量（mg/kg） FBG（mmol/L） FINS（mmol/L） HOMA-IR 对照组 − 5.58±0.31 9.02±0.78 2.24±0.12 模型组 − 9.74±1.14** 24.98±2.89** 10.81±1.23** 低剂量沙棘黄酮组 200 8.23±0.96**## 18.37±2.54**## 6.72±0.80**## 高剂量沙棘黄酮组 400 6.97±0.65**## 15.61±1.72**## 4.83±0.57**## 二甲双胍组 100 6.45±0.70**## 11.46±1.38**## 3.29±0.36**##
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表 4 沙棘黄酮对各组大鼠血清LH、FSH活性及T含量的影响（¯x±s，n=10）
Table 4 Effects of HRF on serum activities of LH and FSH and T content of rats in each group (¯x±s, n=10)
分组 剂量（mg/kg） LH（mU/m） FSH（mU/mL） T（pg/mL） 对照组 − 11.53±0.87 7.82±0.82 41.24±0.49 模型组 − 30.48±4.16** 3.64±0.46** 115.33±9.18** 低剂量沙棘黄酮组 200 25.10±2.03**## 5.19±0.54**## 82.07±7.45**## 高剂量沙棘黄酮组 400 21.65±1.74**## 5.86±0.62**## 66.12±6.50**## 二甲双胍组 100 20.15±2.27**## 6.78±0.81## 53.42±4.34**##
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表 5 沙棘黄酮对各组大鼠血清TNF-α、IL-6及CRP含量的影响（¯x±s，n=10）
Table 5 Effects of HRF on serum contents of TNF-α, IL-6 and CRP of rats in each group (¯x±s, n=10)
分组 剂量（mg/kg） TNF-α（pg/mL） IL-6（pg/mL） CRP（pg/mL） 对照组 − 4.72±0.31 0.71±0.05 0.59±0.06 模型组 − 8.91±1.03** 1.36±0.20** 1.05±0.14** 低剂量沙棘黄酮组 200 6.48±0.82**## 1.14±0.15**# 0.89±0.12**# 高剂量沙棘黄酮组 400 5.17±0.64## 0.92±0.08**## 0.82±0.09**## 二甲双胍组 100 5.23±0.70## 0.85±0.13**## 0.63±0.07##
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表 6 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达的影响
Table 6 Effects of HRF on mRNA levels of TLR4, MyD88 and NF-κBp65 in ovarian tissue of rats in each group
分组 剂量（mg/kg） TLR4 MyD88 NF-κBp65 对照组 − 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.02 模型组 − 4.14±0.56** 6.53±0.83** 3.69±0.51** 低剂量沙棘黄酮组 200 3.25±0.39**# 4.86±0.64**## 2.54±0.29**## 高剂量沙棘黄酮组 400 2.28±0.32**## 4.72±0.48**## 2.06±0.23**## 二甲双胍组 100 2.16±0.20**## 1.45±0.27*## 1.38±0.12**##
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表 7 沙棘黄酮对各组大鼠卵巢组织中TLR4、MyD88及p-NF-κBp65蛋白表达的影响
Table 7 Effects of HRF on protein levels of TLR4, MyD88 and p-NF-κBp65 in ovarian tissue of rats in each group
分组 剂量
（mg/kg）TLR4/
GAPDHMyD88/
GAPDHp-NF-κBp65/
NF-κBp65对照组 − 0.11±0.02 0.19±0.02 0.24±0.03 模型组 − 0.52±0.06** 0.48±0.05** 0.86±0.12** 低剂量沙棘黄酮组 200 0.34±0.04**# 0.41±0.03**# 0.60±0.08**## 高剂量沙棘黄酮组 400 0.27±0.03**## 0.36±0.03**## 0.51±0.06**## 二甲双胍组 100 0.23±0.03**## 0.31±0.04**## 0.38±0.04**##
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期刊类型引用(1)
1. 宁鹏，吴丽萍，陈晓红，黄娴，林静. 中药治疗多囊卵巢综合征作用机制的研究进展. 中国医药导报. 2024(28): 67-71 . 
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