Preparation Process Optimization and Characterization of Selenium-Curcumin Nanoparticles and Its Protective Effect on Alcoholic Liver Injury
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摘要: 目的：探索姜黄素纳米硒（Selenium-curcumin nanoparticles，SeNPs@Cur）的最佳制备工艺参数，并评价其对酒精性肝损伤的保护作用。方法：在单因素实验基础上，以粒径为指标，选择姜黄素浓度、抗坏血酸与亚硒酸钠摩尔比（VC:Na2SeO3）、反应时间和反应温度为考察因素，通过响应面优化SeNPs@Cur的工艺参数，并采用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）、傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）和能谱仪（Energy dispersive spectrometer，EDS）表征其结构。采用MTT法测定其对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用。结果：SeNPs@Cur的最佳制备工艺参数为：姜黄素浓度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3摩尔比10.39:1、反应时间1.98 h和反应温度34.00 ℃，在此条件下制备得到的SeNPs@Cur粒径为（100.79±3.46）nm，样品中姜黄素的载药率为12.80%±0.80%，硒含量为23.32%±0.07%。进一步的结构鉴定发现，制备所得的SeNPs@Cur为分散的球形纳米粒。而且，与模型组相比，经不同浓度SeNPs@Cur处理后，细胞活力从58.06%±0.43%分别提高至71.43%±1.39%、77.33%±3.54%和85.41%±4.61%，表明SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞具有保护作用，且呈浓度依赖性。结论：成功获得了具有抗酒精性肝损伤作用的SeNPs@Cur，为姜黄素的剂型改善及其应用提供了新的技术手段和理论参考数据。Abstract: Objective: In this work, the optimal preparation process parameters of selenium-curcumin nanoparticles (SeNPs@Cur) were explored and its protective effect on alcoholic liver injury was evaluated. Methods: On the basis of single factor experiment, with particle size as the index, curcumin dosage, molar ratio of VC to Na2SeO3, reaction time and reaction temperature were selected as influence factors. The process parameters of SeNPs@Cur were optimized by response surface methodology, and its structure was characterized by scanning electron microscope (SEM), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) and energy dispersive spectrometer (EDS). The protective effect of SeNPs@Cur on ethanol-induced LO2 cell injury was investigated by MTT method. Results: The optimal conditions of SeNPs@Cur were list as follows: Curcumin dosage of 5.92 mg/mL, molar ratio of VC to Na2SeO3 of 10.39:1, the reaction time of 1.98 h, and the reaction temperature of 34.00 ℃. Under these conditions, the SeNPs@Cur with a minimum size of (100.79±3.46) nm was obtained. The loading rate of curcumin and the selenium content in the sample were 12.80%±0.80% and 23.32%±0.07%, respectively. Further structural identification showed that the prepared SeNPs@Cur was dispersed spherical nanoparticles. Moreover, compared with the model group, after treatments with different dosages of SeNPs@Cur, the cell viabilities increased from 58.06%±0.43% to 71.43%±1.39%, 77.33%±3.54%, and 85.41%±4.61%, respectively, indicating that SeNPs@Cur had a protective effect on LO2 cells damaged by ethanol in a concentration-dependent manner. Conclusion: The SeNPs@Cur with anti-alcoholic liver injury effect was successfully obtained, which provided new technical means and theoretical reference data for formulation improvement and application of curcumin.
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酒精性肝损伤（Alcoholic liver injury，ALI）是临床上最为常见的肝病之一，主要由长期或大量摄入酒精引起。ALI最初表现为酒精性脂肪肝、肝炎，进而演变成肝纤维化、肝硬化和肝癌[1]。据世界卫生组织统计，每年全球约有300万人因酒精中毒死亡，在我国，随着酗酒人口的比例不断上升，ALI的防治变得尤为重要[2−3]。近年来，具有低毒副作用的食源性天然物质因在抗酒精性肝损伤领域存在巨大潜力而备受关注[4]。
姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜科植物根茎中提取的一种疏水性多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和护肝等生物活性[5]。研究表明，Cur可以改善由酒精、四氯化碳等化学物质诱导的肝损伤，是一种防治肝损伤的理想天然化合物[6−7]。然而，Cur的水溶性差，进入人体后存在难吸收、高浓度下生物利用度极低等问题，严重限制了其在酒精性肝损伤防治领域的应用[8−9]。为提高Cur的生物利用度，人们通过多种方法对Cur进行改性，其中，用药物载体对Cur进行包裹是可行的方法之一[10]。目前，常用的药物载体有脂质体、微球、纳米粒、环糊精和乳剂等，它们都具有载体用量少、药物荷载量高、粒径和渗透力可控、释放药物速率可控、毒性低、副作用少等优点[11]。然而，脂质体作为药物载体存在靶向效果不理想、稳定性欠佳等问题。同时，微球靶向给药系统也存在药物的突释等未解决的问题。而纳米技术作为近年来发展的一种新型技术，在生物学领域有着广泛的应用。其中，硒纳米粒子（粒子粒径在1~100 nm之间）因具有体积小、比表面积大、物理化学性质独特、对人体细胞毒性低等优点，被广泛用作药物载体[12]。
硒（Selenium，Se）是人体维持正常生理活动必需的微量元素，而常见的有机Se和无机Se的有益剂量和有害剂量的范围很窄，当Se摄入过量时，会对人体产生毒害作用[13−14]。随着纳米技术的出现，研究发现，将Se纳米化制备得到的纳米硒（Selenium nanoparticles，SeNPs）具有低毒性和高生物活性[15−16]。然而，SeNPs存在表面能高、不稳定、在水溶液中容易聚集等问题导致其生物活性低[17]，限制了它的临床应用。设想如果采用Cur作为稳定剂制备姜黄素纳米硒（SeNPs@Cur），这样既能结合Cur和SeNPs的优点，又能克服两者本身存在的不足[18]。故本研究通过化学还原法合成SeNPs@Cur，运用单因素实验和响应面试验对SeNPs@Cur的制备条件进行优化，并对其进行结构表征和抗酒精性肝损伤的作用研究，为Cur在防治酒精性肝损伤临床药物的应用开发提供新的技术手段和数据支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
亚硒酸钠（Na2SeO3，>98%） 美国Sigma公司；姜黄素（Cur，>95%）、抗坏血酸（VC，>99%） 中国上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶溶液、双抗溶液 美国Gibco公司；LO2细胞 美国 ATCC 公司。
AUW120电子天平 日本岛津公司；HL-6数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司；Zetasizer Nano ZSE马尔文纳米粒度电位仪 上海马尔文帕纳科公司；N-4000旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；FD8508真空冷冻干燥机 韩国Ilshin公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京谱析通用仪器有限责任公司；Agilent 7500Cx电感耦合等离子体质谱 美国Agilent公司；MIRA LMS扫描电子显微镜 捷克TESCAN公司；Oxford能谱仪 英国牛津仪器集团；NicoletiS-5型傅里叶变换红外光谱仪、Varioskan Flash全自动酶标仪 美国Thermo公司；JIDI-21D高速离心机 广州吉迪仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 SeNPs的制备
称取79.26 mg VC和7.78 mg Na2SeO3分别溶解于22.5 mL蒸馏水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL无水乙醇后与VC溶液混合，将混合液置于34 ℃度恒温水浴锅中加热并搅拌反应1.98 h，反应后的混合液用0.5 kDa的透析袋透析48 h，得到SeNPs溶液。
1.2.2 SeNPs@Cur的制备
1.2.2.1 单因素实验
参考Chen等[19]方法，对SeNPs@Cur的制备工艺参数略作修改。VC和Na2SeO3分别溶解于22.5 mL蒸馏水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL Cur无水乙醇溶液后与VC溶液混合，将混合液置于恒温水浴锅中加热并搅拌反应，反应后的混合液用0.5 kDa的透析袋透析48 h，得到SeNPs@Cur溶液。固定VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应时间为2 h，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同Cur浓度（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）对SeNPs@Cur粒径的影响；固定Cur浓度为6.0 mg/mL，反应时间为2 h，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同VC:Na2SeO3摩尔比（4:1、6:1、8:1、10:1、12:1）对SeNPs@Cur粒径的影响；固定Cur浓度为6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同反应时间（1、2、3、4和5 h）对SeNPs@Cur粒径的影响；固定Cur浓度为6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应时间为2 h，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同反应温度（25、30、35、40、45 ℃）对SeNPs@Cur粒径的影响。
1.2.2.2 响应面优化试验
在单因素实验的基础上，以Cur浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）四个因素为变量，SeNPs@Cur粒径（Y）为因变量设计响应面试验，试验设计的因素与水平见表1。使用Design-Expert 13软件分析多因素的交互作用，确定SeNPs@Cur的最佳制备工艺参数。根据最佳工艺参数制备SeNPs@Cur溶液，经透析、旋蒸、真空冷冻干燥后得SeNPs@Cur。
表 1 响应面试验因素与水平设计Table 1. Factors and levels of response surface experiments design因素 水平 −1 0 1 A：Cur浓度（mg/mL） 4 6 8 B：VC:Na2SeO3摩尔比 8:1 10:1 12:1 C：反应时间（h） 1 2 3 D：反应温度（℃） 30 35 40 1.2.3 SeNPs@Cur载药率的测定
称取5.0 mg Cur溶于50.0 mL无水乙醇，经超声充分溶解后，将Cur溶液稀释至1、2、4、6、8、10 μg/mL，在425 nm处测定其吸光度值，得到Cur标准曲线y=0.1569x−0.0083，R2=0.9998。
称取5.0 mg SeNPs@Cur样品溶于50.0 mL无水乙醇，经超声充分溶解后，在425 nm处测定其吸光度值，根据Cur标准曲线得到样品中的Cur含量，按公式（1）计算载药率。
载药率(%)=样品中Cur含量样品质量×100 (1) 1.2.4 SeNPs@Cur的结构表征
1.2.4.1 电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）
取SeNPs@Cur粉末100.0 mg置于消解液中（6.0 mL硝酸+0.5 mL双氧水）进行微波消解，随后使用ICP-MS测定样品中的Se含量。仪器工作参数为：入射功率1550 W，载气流量1.0 L/min，辅助气流量1.0 L/min，氦气流量4.0 L/min，进样深度10.0 mm，进样速率1.0 L/min。
1.2.4.2 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）
取微量SeNPs@Cur粉末样品均匀粘贴于导电胶上，使用溅射镀膜仪对其进行喷金处理，工作电流为10 mA，喷涂时间为45 s，随后用扫描电子显微镜在不同放大倍数下对SeNPs@Cur样品形貌进行拍摄，拍摄加速电压为3 kV。
1.2.4.3 傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）
取约2.0 mg SeNPs@Cur粉末样品与200 mg干燥的溴化钾（KBr）粉末混合后研磨均匀，将混合粉末进行压片处理，压制成半透明薄片，扫描其红外吸收光谱，扫描波数范围为4000~400 cm−1。
1.2.4.4 能谱仪（Energy dispersive spectrometer，EDS）
在上述实验方法1.2.4.2的样品条件下，使用能谱仪对样品进行能谱mapping元素分析，拍摄时加速电压为15 kV。
1.2.5 SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞的保护作用
1.2.5.1 细胞培养
LO2细胞复苏后，在37 ℃、5% CO2的培养箱中，培养于含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME高糖培养基，待细胞密度>70%时进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2.5.2 乙醇诱导LO2细胞损伤模型的建立
将细胞悬液稀释至8×104个细胞/mL，在96孔板中，对照组和实验组加入细胞悬液，空白组加入含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME高糖培养基，每孔100 μL。培养24 h后去除培养液，实验组加入乙醇浓度为200~1400 mmol/L的DEME高糖培养基，空白组和对照组加入DEME高糖培养基，每孔200 μL。分别培养3 h和6 h后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h，去除上清液，各孔加入150 μL DMSO溶液反应10 min。采用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光值，根据公式（2）计算细胞活力。
细胞活力(%)=A2−A0A1−A0×100 (2) 式中：A0表示空白组OD值；A1表示对照组OD值；A2表示实验组OD值。
1.2.5.3 SeNPs@Cur对乙醇诱导LO2细胞损伤的影响
将细胞悬液稀释至8×104个细胞/mL，在96孔板中，对照组和实验组加入细胞悬液，空白组加入含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME高糖培养基，每孔100 μL。培养24 h后去除培养液，实验组加入SeNPs@Cur浓度为125~500 μg/mL的DEME高糖培养基，空白组和对照组加入DEME高糖培养基，每孔100 μL。培养12 h后去除上清液，实验组加入乙醇浓度为800 mmol/L的DEME高糖培养基，空白组和对照组加入DEME高糖培养基，每孔200 μL。培养6 h后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h，然后去除上清液，各孔加入150 μL DMSO溶液反应10 min。采用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光值，根据公式（2）计算细胞活力。
1.3 数据处理
运用SPSS 26.0软件对数据结果进行统计学分析，Design-Expert 13.0进行响应面模型建立及分析，Origin 2021进行图片绘制。实验设置3个重复，实验数据均以平均值±标准差（¯X±SD）表示。
2. 结果与分析
2.1 Cur浓度、VC:Na2SeO3摩尔比、反应时间和反应温度对SeNPs@Cur粒径的影响
据报道，Cur的加入可以使SeNPs具有更高的稳定性[20]。为确定Cur的最佳浓度，考察不同Cur浓度对粒径的影响，结果如图1A所示。SeNPs@Cur粒径大小随Cur浓度的增加呈先下降后上升的趋势，在Cur浓度为6.0 mg/mL时粒径达到最小值为（101.18±1.71）nm。结果表明，适量的Cur可抑制SeNPs的聚集，使SeNPs@Cur粒径减小。这可能是Cur中的酚羟基可以吸附并包裹SeNPs，阻止了SeNPs的聚集，从而使得粒径减小。而过量的Cur则易导致Cur分子之间聚集使得游离的酚羟基减少，导致吸附和包裹SeNPs的能力减弱，从而使得SeNPs@Cur粒径增大。因此，选择6.0 mg/mL作为Cur的最佳浓度。
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图 1 不同Cur浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）对SeNPs@Cur粒径的影响注：不同小写字母表示组间存在显著差异（P<0.05），图6同。Figure 1. Effects of different Cur dosage (A), molar ratio of VC to Na2SeO3 (B), reaction time (C) and reaction temperatures (D) on particle size of SeNPs@Cur过量的VC可以使Na2SeO3完全反应，有助于SeNPs的合成[19]。为确定最佳VC:Na2SeO3摩尔比，考察不同VC:Na2SeO3摩尔比对粒径的影响，结果如图1B所示。当VC:Na2SeO3摩尔比为4:1时，所制得SeNPs@Cur的粒径为（121.93±3.86）nm，提高两者摩尔比到10:1时，SeNPs@Cur的粒径最小，为（106.38±0.83）nm，这主要是因为过量的VC可以改善晶核的生长从而稳定SeNPs@Cur[21]，然而，继续增大VC:Na2SeO3摩尔比会导致粒径变大，这可能是VC浓度进一步增大会使得反应体系不稳定，从而导致纳米颗粒增大。因此，选择10:1作为VC:Na2SeO3的最佳摩尔比。
反应时间是影响Na2SeO3还原成SeNPs的一个重要参数[22]。过短的反应时间会导致VC和Na2SeO3之间反应不完全，反之，长时间反应会导致SeNPs的聚集进而使粒径增大。为确定最佳反应时间，考察不同反应时间对粒径的影响，结果如图1C所示。当反应时间为2 h时，所制得SeNPs@Cur粒径为（103.65±1.74）nm，达到最小值。当反应时间超过2 h，所制得SeNPs@Cur粒径显著增大（P<0.05）。因此，选择2 h作为最佳反应时间。
升高反应温度会加剧分子的热运动，使SeNPs粒子更容易分散[23]。为确定最佳反应温度，考察不同反应温度对粒径的影响，结果如图1D所示。在25~35 ℃内，随着反应温度增加，SeNPs@Cur粒径呈减小趋势，当反应温度为35 ℃时，所制得SeNPs@Cur粒径显著性减小为（103.92±3.70）nm（P<0.05）。然而，当温度进一步提高时，SeNPs@Cur粒径显著增大（P<0.05）。这可能是由于高温容易导致纳米颗粒剧烈运动，从而增加碰撞的机会和强度导致纳米粒子不断的聚集，最终使得粒径增大[24]。因此，选择35 ℃作为最佳反应温度。
2.2 响应面优化SeNPs@Cur的制备工艺
以Cur浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）为变量，SeNPs@Cur粒径（Y）为因变量，进行响应面优化试验设计，方差分析结果见表2。使用Design-Expert 13软件分析4个因素对SeNPs@Cur粒径的影响，得SeNPs@Cur粒径（Y）的二次回归方程：Y=101.35+1.07A−4.29B−0.2C+1.84D−3.92AB−4.64AC+0.63AD+0.06BC−1.99BD−4.42CD+11.31A2+9.65B2+14.28C2+4.14D2。
表 2 二次回归模型的方差分析Table 2. ANOVA for quadratic model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型项 2578.63 14 184.19 40.48 <0.0001 A 34.58 1 34.58 7.6 0.0154 B 220.42 1 220.42 48.45 <0.0001 C 0.496 1 0.496 0.109 0.7462 D 40.7 1 40.7 8.95 0.0097 AB 61.62 1 61.62 13.54 0.0025 AC 86.18 1 86.18 18.94 0.0007 AD 1.57 1 1.57 0.3443 0.5667 BC 0.014 1 0.014 0.0031 0.9565 BD 15.87 1 15.87 3.49 0.0829 CD 78.3 1 78.3 17.21 0.001 A² 829.97 1 829.97 182.43 <0.0001 B² 603.41 1 603.41 132.63 <0.0001 C² 1322.32 1 1322.32 290.65 <0.0001 D² 111.42 1 111.42 24.49 0.0002 残差 63.69 14 4.55 失拟项 37.43 10 3.74 0.5699 0.7855 纯误差 26.27 4 6.57 矫正总和 2642.32 28 决定系数R2=0.9759 由表2中的二次回归模型方差分析结果可知，模型极显著（P<0.01），失拟项不显著（P=0.7855>0.05），决定系数R2=0.9759，说明模型拟合效果好，可信度高，该模型可用于对SeNPs@Cur粒径的预测。回归模型中一次项B和D，交互项AB、AC和CD，二次项A2、B2、C2和D2极显著（P<0.01），一次项A显著（P<0.05）。
由表2可知，Cur浓度与VC:Na2SeO3摩尔比、Cur浓度与反应时间、反应时间与反应温度之间存在显著的交互效应（P<0.05），其余的交互项不显著。图2是根据回归方程生成的响应面立体图，其反映了Cur浓度、VC:Na2SeO3摩尔比、反应时间和反应温度四者之间的相互作用。由图可知，各因素间的曲线较陡峭，等高线呈椭圆形，说明因素间的交互作用对SeNPs@Cur粒径影响较大[25]，SeNPs@Cur粒径在各因素设置水平范围内随着因素的增大呈先减小后增大的趋势。
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图 2 Cur浓度与VC:Na2SeO3摩尔比（A）、Cur浓度与反应时间（B）、反应时间与反应温度（C）的交互作用对SeNPs@Cur粒径影响的响应面图Figure 2. Response surface plots of the interactions of Cur dosage and molar ratio of VC to Na2SeO3 (A), Cur dosage and reaction time (B), reaction time and reaction temperature (C) on SeNPs@Cur particle size使用Design-Expert 13软件对模型最小值进行求解，得到SeNPs@Cur最优制备条件为：Cur浓度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3摩尔比10.39:1、反应时间1.98 h、反应温度34.00 ℃，模型预测该条件下所制得的SeNPs@Cur粒径为100.72 nm。为验证模型预测结果，实际设置Cur浓度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3=10.39:1、反应时间1.98 h、反应温度34.00 ℃进行SeNPs@Cur粒径的验证实验，在此条件下制得的SeNPs@Cur粒径为（100.79±3.46）nm，接近理论预测值，说明模型可靠，因此使用该条件制备SeNPs@Cur进行后续实验。对SeNPs@Cur进行载药率和Se含量的测定，结果显示，SeNPs@Cur的载药率为12.80%±0.80%；ICP-MS测得样品中Se含量为23.32%±0.07%，与Jiao等[26]得到的结果接近。
2.3 SeNPs@Cur的表征
2.3.1 SEM考察SeNPs@Cur的形貌
采用SEM观察SeNPs、Cur和SeNPs@Cur的表面形貌，结果如图3所示。SeNPs呈现为不规则颗粒聚集物，表明SeNPs易聚集，分散性较差[19]（图3A）。Cur则呈长条状，分布杂乱（图3B）。而SeNPs@Cur呈分散球形（图3C），这与Yu等[27]制备的SeNPs@Cur形态类似，表明SeNPs经Cur修饰后能够有效抑制其聚集，从而提高SeNPs的分散性。
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图 3 SeNPs（A）、Cur（B）和SeNPs@Cur（C）的SEM图（2000×）Figure 3. SEM images of SeNPs (A), Cur (B) and SeNPs@Cur (C) (2000×)2.3.2 SeNPs@Cur的红外光谱分析结果
为了确定SeNPs与Cur之间的结合方式，运用傅里叶变换红外光谱对SeNPs@Cur进行分析，结果如图4所示。SeNPs的红外光谱图几乎没有吸收峰，这与陈雪花等[28]得到的结果一致。在3505、1599、1508、1458、1281 cm−1分别对应苯环上的羟基伸缩振动，苯环上碳碳双键伸缩振动，羰基伸缩振动，碳氢键在结构平面内的弯曲振动，芳香环的羰基伸缩振动，均为Cur的特征吸收峰[27,29]。而SeNPs@Cur与Cur的峰形极其相似，无新的吸收峰产生，且羟基吸收峰的强度变弱，波数从3505 cm−1红移到3412 cm−1，这可能是由于Cur中的酚羟基与SeNPs表面的Se原子之间的发生了类似氢键的相互作用（O–H···Se）所致。综上所述，Cur主要通过酚羟基吸附结合在SeNPs表面。
2.3.3 SeNPs@Cur的表面元素分析
采用EDS对SeNPs@Cur进行表面元素分析，结果如图5和表3所示。由图5可知，SeNPs和SeNPs@Cur中均检测出C、O和Se三种元素，但对应的峰强度不同。由表3可知，SeNPs的Se、C、O含量分别为88.02%、10.81%、1.14%，元素含量占比中大部分是Se[30]。而在SeNPs@Cur中，C、O含量分别从SeNPs的10.81%和1.14%提高到48.51%和5.41%，增加的C和O主要是来源于Cur，可推断SeNPs成功负载了Cur。
表 3 SeNPs和SeNPs@Cur的表面元素组成Table 3. Surface element composition of SeNPs and SeNPs@CurC（%） O（%） Se（%） SeNPs 10.81 1.14 88.02 SeNPs@Cur 48.51 5.41 45.93 ![]()
图 5 SeNPs（A）和SeNPs@Cur（B）的SEM-EDS元素分析Figure 5. SEM-EDS element analysis of SeNPs (A) and SeNPs@Cur (B)2.4 SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞的保护作用
由图6A可知，LO2细胞经不同浓度的乙醇处理不同时间后，细胞活力随着乙醇浓度的增加呈下降趋势，且乙醇作用6 h的细胞活力低于3 h。在乙醇浓度为800 mmol/L，对LO2细胞作用6 h时，细胞活力下降至51.39%±6.02%，达到中度损伤。故后续实验选择800 mmol/L乙醇对LO2细胞作用6 h作为乙醇诱导LO2细胞损伤模型。
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图 6 不同浓度乙醇对LO2细胞活力（A）、SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞活力（B）和细胞形态（C）的影响Figure 6. Effects of different concentrations of ethanol on the cell viabilities of LO2 cells (A) and SeNPs@Cur on the cell viabilities (B) and cell morphology (C) of LO2 cells damaged by ethanol由图6B可知，模型组LO2细胞经800 mmol/L乙醇作用6 h后，细胞活力从空白组的100%±3.05%显著下降至58.06%±0.43%（P<0.05），表明乙醇处理导致细胞出现了损伤。当细胞经125、250、500 μg/mL的SeNPs@Cur进行干预后，细胞活力得到了显著性提升，分别从模型组的58.06%±0.43%提高至71.43%±1.39%、77.33%±3.54%、85.41%±4.61%，表明SeNPs@Cur能够显著改善乙醇诱导的肝细胞损伤，且呈现出浓度依赖性。而且，在不同浓度下，SeNPs@Cur处理后的细胞活力均高于Cur处理组和SeNPs处理组，表明SeNPs@Cur对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用强于单独处理的Cur和SeNPs，这可能是由于Cur经SeNPs负载后大大提高了Cur的生物利用度，同时SeNPs经Cur修饰后避免了SeNPs的聚集，从而提高了SeNPs@Cur的护肝活性。为了验证上述结果，进一步观察了不同样品处理对细胞形态的影响，结果如图6C所示。由图6C可知，相比于空白对照组，用乙醇处理细胞后，细胞数量明显减少，且细胞形态呈圆形。而用500 μg/mL SeNPs@Cur处理后，能够显著提高细胞数量，且细胞形态呈不规则的多边形，与空白对照组的细胞形态相似，这说明SeNPs@Cur能够改善乙醇诱导的肝细胞损伤，这一结果与细胞活力的实验结果（图6B）相一致。
3. 结论
本研究通过单因素实验及响应面试验对SeNPs@Cur的制备条件进行了优化，并对其进行了结构表征和抗酒精性肝损伤的作用研究。结果表明，SeNPs的最佳制备工艺参数为Cur浓度5.92 mg/mL、Vc:Na2SeO3摩尔比10.39:1、反应时间1.98 h和反应温度34.00 ℃，在此条件下制备的SeNPs@Cur粒径为（100.79±3.46） nm，接近模型的理论预测值。进一步对其进行结构鉴定发现，Cur通过酚羟基吸附结合在SeNPs表面形成均一球形的纳米粒子，从而使得SeNPs分散性得到提高。抗酒精性肝损伤研究发现，相比单独的Cur和SeNPs，SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞表现出更强的保护作用，说明Cur经SeNPs负载后能够增强Cur对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用。综上所述，采用SeNPs负载Cur是一种提高Cur生物利用度的有效途径，为SeNPs@Cur在酒精性肝病的防治领域提供了数据参考和理论支持。
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图 1 不同Cur浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）对SeNPs@Cur粒径的影响
注：不同小写字母表示组间存在显著差异（P<0.05），图6同。
Figure 1. Effects of different Cur dosage (A), molar ratio of VC to Na2SeO3 (B), reaction time (C) and reaction temperatures (D) on particle size of SeNPs@Cur
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图 2 Cur浓度与VC:Na2SeO3摩尔比（A）、Cur浓度与反应时间（B）、反应时间与反应温度（C）的交互作用对SeNPs@Cur粒径影响的响应面图
Figure 2. Response surface plots of the interactions of Cur dosage and molar ratio of VC to Na2SeO3 (A), Cur dosage and reaction time (B), reaction time and reaction temperature (C) on SeNPs@Cur particle size
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图 3 SeNPs（A）、Cur（B）和SeNPs@Cur（C）的SEM图（2000×）
Figure 3. SEM images of SeNPs (A), Cur (B) and SeNPs@Cur (C) (2000×)
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图 5 SeNPs（A）和SeNPs@Cur（B）的SEM-EDS元素分析
Figure 5. SEM-EDS element analysis of SeNPs (A) and SeNPs@Cur (B)
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图 6 不同浓度乙醇对LO2细胞活力（A）、SeNPs@Cur对乙醇损伤LO2细胞活力（B）和细胞形态（C）的影响
Figure 6. Effects of different concentrations of ethanol on the cell viabilities of LO2 cells (A) and SeNPs@Cur on the cell viabilities (B) and cell morphology (C) of LO2 cells damaged by ethanol
表 1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface experiments design
因素 水平 −1 0 1 A：Cur浓度（mg/mL） 4 6 8 B：VC:Na2SeO3摩尔比 8:1 10:1 12:1 C：反应时间（h） 1 2 3 D：反应温度（℃） 30 35 40 
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表 2 二次回归模型的方差分析
Table 2 ANOVA for quadratic model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型项 2578.63 14 184.19 40.48 <0.0001 A 34.58 1 34.58 7.6 0.0154 B 220.42 1 220.42 48.45 <0.0001 C 0.496 1 0.496 0.109 0.7462 D 40.7 1 40.7 8.95 0.0097 AB 61.62 1 61.62 13.54 0.0025 AC 86.18 1 86.18 18.94 0.0007 AD 1.57 1 1.57 0.3443 0.5667 BC 0.014 1 0.014 0.0031 0.9565 BD 15.87 1 15.87 3.49 0.0829 CD 78.3 1 78.3 17.21 0.001 A² 829.97 1 829.97 182.43 <0.0001 B² 603.41 1 603.41 132.63 <0.0001 C² 1322.32 1 1322.32 290.65 <0.0001 D² 111.42 1 111.42 24.49 0.0002 残差 63.69 14 4.55 失拟项 37.43 10 3.74 0.5699 0.7855 纯误差 26.27 4 6.57 矫正总和 2642.32 28 决定系数R2=0.9759
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表 3 SeNPs和SeNPs@Cur的表面元素组成
Table 3 Surface element composition of SeNPs and SeNPs@Cur
C（%） O（%） Se（%） SeNPs 10.81 1.14 88.02 SeNPs@Cur 48.51 5.41 45.93
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