Simultaneous Determination of Benzimidazoles and Their Metabolites Residues in Dairy Products by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
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摘要: 建立了乳制品中苯并咪唑类药物及其代谢物固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱的分析方法。样品经含0.2%甲酸的乙腈提取后离心，上清液使用固相萃取柱进行净化，UPLC HSS T3色谱柱分离，电喷雾正离子模式下多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）测定。结果显示，在1.0~50 μg/L范围内的线性相关系数r≥0.995（除三氯苯达唑为0.9578），方法检出限（Limit of Detection，LOD）（S/N=3）为0.002 mg/kg（除阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑和噻苯咪唑-5-羟基为0.003 mg/kg），方法定量限（Limit of Quantitation，LOQ）（S/N=10）为0.005 mg/kg（除阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑和噻苯咪唑-5-羟基为0.010 mg/kg）。在0.005、0.01、0.05 mg/kg三个加标水平下回收率在62.5%~117.6%之间，相对标准偏差RSD在1.92%~12.17%之间。该方法操作简单、灵敏度高，适用于乳制品中苯并咪唑类药物及其代谢物的定量分析。
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关键词:
- 固相萃取 /
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 苯并咪唑类药物及其代谢物 /
- 乳制品 /
- 残留量测定
Abstract: A method for the simultaneous determination of benzimidazoles and their metabolites in dairy products was established using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (MS). After extracting the samples with acetonitrile containing 0.2% formic acid, the extracts were centrifuged and purified by solid phase extraction column, and then separated by UPLC HSS T3 chromatographic column, determined in multi reaction monitoring (MRM) method with a positive ESI mode. The results showed that the linear correlation coefficient (r) within the range of 1.0~50 μg/L was greater than 0.995 (except for triclabendazole, which was 0.9578). The method had a limit of detection (LOD) (S/N=3) of 0.002 mg/kg (except for albendazole-2-aminosulfone, thiabendazole, and thiabendazole-5-hydroxy, which were 0.003 mg/kg). The limit of quantitation (LOQ) (S/N=10) was 0.005 mg/kg (except for albendazole-2-aminosulfone, thiabendazole, and thiabendazole-5-hydroxy, which were 0.010 mg/kg). The recoveries at three spiked levels of 0.005, 0.01 and 0.05 mg/kg ranged from 62.5% to 117.6%, with relative standard deviations (RSD) between 1.92% and 12.17%. The method is simple to operate, highly sensitive, and suitable for the quantitative analysis of benzimidazoles and their metabolites in dairy products. -
苯并咪唑类（Benzimidazoles，BMZs）药物是具有苯环和咪唑环结构的一类芳香族杂环化合物，有抗寄生虫、抗菌及抗病毒等作用[1]，在现代农业中不仅用于防治动物寄生虫感染，还用于防治植物病虫害，广泛应用于水产和禽畜养殖业、种植业。常见的苯并咪唑类药物包括阿苯达唑（Albendazole，ABZ）、氟苯达唑（Flubendazole，FLU）、甲苯达唑（Mebendazole，MBZ）以及三氯苯达唑（Triclabendazole，TCB）等[2]。
大部分BMZs药物在动物体内会通过肝脏迅速代谢，其残留的主要部位为肝脏和肾脏[3]，在动物的其他组织和乳汁中会有一种或多种代谢产物残留[3−6]，代谢产物的种类取决于母体药物的结构和动物种类。BMZs在进行生物转化时，其代谢反应均发生在化合物侧链，主要包括氧化、氨基甲酸酯结构水解以及羰基还原等反应。阿苯达唑、三氯苯达唑和芬苯达唑具有易氧化的硫化物键，因此，其代谢产物可能是亚砜（SO）和砜（SO2）。甲苯达唑和氟苯达唑具有羰基，该羰基可被还原形成羟基。阿苯达唑、芬苯达唑、甲苯达唑和氟苯达唑具有氨基甲酸酯基团，可水解形成氨基苯并咪唑。噻苯达唑可能被氧化，导致5-OH-TBZ的形成。在TBZ和TCB存在的情况下，牛奶中最常见和持久的残留物分别是5-OH-TBZ和TCB-SO2[6]。
BMZs及其代谢产物的主要毒性是致畸性、致突变性及胚胎毒性[6−8]。过度或违规使用BMZs会导致BMZs及其代谢产物在动物体内蓄积，通过食物链的传递影响身体健康，引起腹泻、贫血以及坏死性淋巴结肿大等症状[7]。部分代谢产物的毒性更强，如羟基甲苯咪唑（MBZ-OH）比甲苯咪唑（MBZ）具有更强的胚胎毒性[5]。GB 31650-2019中规定了常见的几种苯并咪唑药物及其代谢产物在各动物种类靶组织的残留限量[9]。奶中阿苯达唑（ABZ）的残留标志物为ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和ABZ之和；芬苯达唑（FBZ）残留标志物为FBZ、奥芬达唑（OFZ）和OFZ-SO2的总和，以OFZ-SO2等效物表示；甲苯咪唑（MBZ）残留标志物为MBZ等效物（含MBZ-OH和MBZ-NH2）总和；噻苯达唑（TBZ）的残留标志物为TBZ与TBZ-OH之和；三氯苯达唑残留标志物为三氯苯达唑酮。因此为准确检测食品中BMZs的残留量，需同时对其代谢产物进行定量并综合分析。
目前，BMZs及其代谢产物常用的检测方法主要有HPLC法[10−12]、HPLC-MS/MS法[13−15]、荧光分析法[16−18]、毛细管电泳法[19−20]和免疫分析法[21−22]等。其中HPLC-MS/MS具有准确性和灵敏度高，选择性和抗干扰性强等特点，广泛应用于兽药残留分析测定[23]。我国已颁布的现行标准GB/T 22972-2008《牛奶和奶粉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[24]、GB/T 21324-2007《食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物残留量检测方法》[25]和GB/T 22955-2008《河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中苯并咪唑类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[26]都是选用液相色谱-串联质谱法检测BMZs，但其适用样品基质范围较窄。GB/T 22972-2008针对乳制品基质，但其检测目标不包括BMZs代谢产物。常见的文献及标准方法中前处理步骤多采用正己烷液液萃取除脂，之后固相萃取柱净化。本文拟采用具有除脂作用的固相萃取小柱一步净化去除干扰物质。
由于涉及到婴幼儿、孕产妇和老年人等敏感群体的身体健康，乳和乳制品质量安全问题一直是社会关注和讨论的焦点。近年来，每年更新的《食品安全监督抽检实施细则》并未将苯并咪唑类兽药列入监测范围，但由于其潜在的致畸性和致突变性，依然有必要对该药物及其代谢物检测进行深入研究和重点监测。本文参考相关标准方法与文献报道，针对GB 31650-2019[9]规定的苯并咪唑药物及其代谢产物，基于液相色谱-串联质谱技术建立了乳制品中目标物残留量的检测方法，优化了色谱、质谱条件以及样品前处理条件，适合大批量日常分析检测。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
阿苯达唑（Albendazole，ABZ）、阿苯达唑亚砜（Albendazole-sulfoxide，ABZ-SO）、阿苯达唑砜（Albendazole-sulfone，ABZ-SO2）、阿苯达唑-2-氨基砜（Albendazole-2-aminosulfone，ABZ-NH2-SO2）、丙苯咪唑（Cambendazol，CAM）、芬苯达唑（Fenbendazole，FBZ）、芬苯达唑砜（Fenbendazole-sulfone，FBZ-SO2）、氟苯达唑（Flubendazole，FLU）、2-氨基氟苯达唑（2-Aminoflubendazole，FLU-NH2）、甲苯咪唑（Mebendazole，MBZ）、甲苯咪唑-5-羟基（Mebendazole-5-hydroxy，MBZ-OH）、氨基甲苯咪唑（Mebendazole-amine，MBZ-NH2）、奥芬达唑（Oxfendazole，OFZ）、奥苯达唑（Oxibendazole，OXI）、噻苯达唑（Thiabendazole，TBZ）、噻苯咪唑-5-羟基（Thiabendazole-5-hydroxy，TBZ-OH）、三氯苯达唑（Triclabendazole，TCB） 浓度100 μg/mL，北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈 色谱纯，西班牙Scharlau公司；甲酸 LC-MS 级试剂，美国Anaqua公司；Oasis PRiME HLB固萃柱（6 mL，200 mg） 美国沃特世公司；尼龙66针式滤膜（0.22 μm） 天津津腾公司；氮气、氩气（>99.999%） 南京特种气体厂有限公司；实验用水 由Milli-Q超纯水机制备；实验中所需样品（巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳及调制乳） 大型连锁超市。
超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱仪（配有ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪及MassLynx V4.1 数据处理操作平台） 美国沃特世公司；Allegra 64R台式冷冻高速离心机 美国贝克曼公司；N-EVAP-116 34位氮吹仪 美国Organomation Associates公司；Milli-Q Reference 超纯水机 美国默克密理博公司；XS204型电子分析天平（感量0.00001 g） 瑞士梅特勒托利多公司；JP-100超声波清洗器 深圳市洁盟清洗设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
乳制品样品于4 ℃冰箱保存，测试前放置于室温后颠倒混匀，称取均匀样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈，涡旋混合30 s，超声提取5 min，4 ℃条件下5000 r/min离心5 min。移取全部上清液通过PRiME HLB小柱，5 mL乙腈淋洗小柱，吹干柱床收集全部滤液。滤液经氮气吹干后加2 mL含0.1%甲酸的乙腈/水（v/v=50/50）溶解残渣，过0.22 μm滤膜，待仪器分析。
空白基质提取浓缩液的制备。计算配制标准曲线溶液的使用量，称取适量空白基质样品，按上述步骤处理，得到的空白基质提取浓缩液用于配制标准工作曲线。
1.2.2 标准溶液的制备
17种BMZs混合标准溶液于−18 ℃冰箱冷冻保存。使用前放置室温，移取适量的混合标准溶液用“1.2.1”空白基质提取液稀释，配制质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100、500、1000 μg/L的混合标准工作液，置于棕色试剂瓶中，4 ℃保存备用。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：Waters UPLC HSS T3柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液；流速0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL；梯度洗脱程序：0~0.6 min，保持10% A；0.6~2.9 min，10%~95% A；2.9~4.2 min，保持95% A；4.2~4.3 min，95%~10% A。
1.2.4 质谱条件
电离模式：ESI（+）；毛细管电压3.0 kV；透镜电压0.5 V；源温130 ℃；脱溶剂温度320 ℃；脱溶剂气流速620 L/h；锥孔气流速50 L/h；采集模式：MRM采集，其他参数见表1。
表 1 17种苯并咪唑类药物及其代谢物的质谱检测参数Table 1. MS/MS parameters for the benzimidazoles and their metabolites detection序号 化合物 保留时间（min） 母离子（m/z） 子离子（m/z） 锥孔电压（V） 碰撞能量（eV） 1 阿苯达唑 2.72 266.1 159，234.1* 20 35，15 2 阿苯达唑亚砜 2.25 282.1 208，240.1* 20 25，10 3 阿苯达唑砜 2.61 298.1 224*，190.8 20 25，35 4 阿苯达唑-2-氨基砜 1.81 240.1 133*，198 20 25，15 5 丙苯咪唑 2.29 303.1 217.1*，261 20 25，15 6 芬苯达唑 3.10 300.1 159，268* 20 30，15 7 芬苯达唑砜 2.86 332.1 300.1*，159 20 20，35 8 氟苯达唑 2.93 314.1 123，282* 20 30，20 9 2-氨基氟苯达唑 2.22 256.1 123*，95 20 25，35 10 甲苯咪唑 2.85 296.1 264*，105 20 20，30 11 甲苯咪唑-5-羟基 2.6 298.1 159*，107.2 20 20，35 12 氨基甲苯咪唑 2.16 238.1 133.1，105* 20 35，20 13 奥芬达唑 2.52 316.1 284.1，191.1* 20 15，20 14 奥苯达唑 2.34 250.1 218.1*，176 20 15，25 15 噻苯达唑 1.89 202.1 175*，131 20 20，25 16 噻苯咪唑-5-羟基 1.77 218 191.1*，176.1 20 20，15 17 三氯苯达唑 3.94 359 274*，199 20 35，40 注：*表示定量离子。 1.2.5 定性定量方法
根据目标物质保留时间、特征离子峰相对丰度进行定性。定量方法采用外标法，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，再将实测得到的样品峰面积带入公式中计算各成分含量。
1.3 数据处理
使用Masslynx软件采集质谱信号，TargetLynx处理谱图，Excel软件对数据进行处理。
2. 结果与分析
2.1 色谱条件优化
BMZs属于弱碱性化合物，中等极性，易溶于极性有机溶剂，在水中溶解度较小[6]。目前，多数用于BMZs测定的液相方法都是使用反相色谱柱开发的。本试验考察了不同色谱柱测定BMZs时的分离效果，分别选用Waters Cortects C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）、UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）考察分离效果。结果显示，Cortects C18色谱柱在BMZs分离过程中易出现化合物同时出峰的情况，BEH C18易出现部分化合物拖尾现象。相较前两个色谱柱，HSS T3色谱柱可对多组分进行较好分离，且峰形较好，相互干扰较小。本试验选用UPLC HSS T3色谱柱。
分别以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液为流动相考察了不同流动相体系色谱分离的影响。结果显示，当流动相中加入甲酸后，各目标组分的响应信号增强，且有较好色谱峰峰形，说明甲酸可显著提高BMZs的离子化效率，提高检测灵敏度。乙腈相比甲醇更易将BMZs洗脱下来，色谱峰性更好，因此，本研究选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。17种BMZs可在5 min内完成分离，分离结果如图1所示。
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图 1 17种苯并咪唑类药物及其代谢物在不同流动相体系下的总离子流图（HSS T3色谱柱）注：A：乙腈-水；B：乙腈-0.1%甲酸水溶液；C：乙腈-0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵溶液；D：甲醇-水；E：甲醇-0.1%甲酸水溶液；F：甲醇-0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵溶液。Figure 1. Total ion chromatography of 17 benzimidazoles and their metabolites in different mobile phase systems (HSS T3 column)2.2 质谱条件优化
BMZs是一类含有两个氮原子的苯并咪唑杂环化合物，母体苯并咪唑核上各侧链和基团的取代产生新成员。咪唑核中既包含酸性氮原子又包含碱性氮原子，在合适的条件下，分子可以被质子化或去质子化[6]。实验发现该类化合物在酸性环境ESI正离子模式下响应值更高，本文选择ESI正离子模式进行分析。
采用直接进样方式，分析17种BMZs混标溶液（浓度1.0 μg/mL），通过优化毛细管电压、锥孔电压等质谱参数，确定化合物母离子及子离子采集参数。选取响应强度较高、干扰较小的两个子离子作为定量子离子和定性子离子，建立MRM定量方法。BMZs及代谢物的质谱采集参数见表1。
由于BMZs均有苯并咪唑杂环结构，因此在检测分析中易出现质量接近的碎片离子。如阿苯达唑砜（ABZ-SO2，分子式C12H15N3O4S，精确分子量297.0783）与甲苯咪唑-5-羟基（MBZ-OH，分子式C16H15N3O3，精确分子量297.1113），它们的母离子[M+H]+分子量很接近，也可以产生质量相同的子离子m/z 298/266，保留时间接近，低分辨质谱难以区分。参考赵超群等[27]的研究，选择两物质各自特有的离子对进行定量分析，阿苯达唑砜的监测离子对为m/z 298.1/224和298.1/190.8，甲苯咪唑-5-羟基监测离子对为m/z 298.1/159和298.1/107.2。图2为17种BMZs的定量离子色谱图。
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图 2 添加17种苯并咪唑类药物及其代谢物的空白牛奶样品定量离子色谱图（0.01 mg/kg）Figure 2. Quantitative ion chromatogram of a blank milk sample spiked with a mixture of the benzimidazoles and theirmetabolites (0.01 mg/kg)2.3 样品前处理
兽药残留分析是痕量分析，实际样品中存在大量脂类物质，缩短色谱柱的使用寿命，也很大程度上干扰了目标化合物的分析。样品前处理的主要目的是富集目标物、去除干扰物、消除基质影响，提高方法的灵敏度、重现性和选择性，因此选择合适的前处理方法是多残留检测分析的关键。常用的提取溶剂主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，其中乙腈对苯并咪唑类药物提取效果较好。同时，固相萃取柱对前处理净化效果影响很大，本文使用多种固相萃取柱进行净化，发现对脂肪类物质有较好吸附作用的PRiME HLB小柱净化后滤液较清澈，色谱图干扰杂峰较少，净化效果较好。因此本实验采用酸性乙腈水溶液提取样品中的BMZs，PRiME HLB小柱通过式净化。
2.4 线性关系、检出限和定量限
在本方法确定的检测条件下，以“1.2.1”所制空白基质提取液配制系列质量浓度的混合标准工作溶液，进行液相色谱质谱分析。横坐标x为质量浓度（μg/L）、纵坐标y为定量离子峰面积，绘制标准曲线并得到线性回归方程见表2。通过向空白阴性样品中添加目标物来考察方法的检出限（LOD，S/N=3）、定量限（LOQ，S/N=10），见表2。
表 2 17种苯并咪唑类药物及其代谢物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限Table 2. Linear equation, linear range, correlation coefficient (r), LOD and LOQ of 17 benzimidazoles and their metabolites序号 化合物 线性范围（μg/L） 线性方程 r LOD（mg/kg） LOQ（mg/kg） 1 阿苯达唑 1.0~100 y=45321x+143314 0.9963 0.002 0.005 2 阿苯达唑亚砜 1.0~250 y=18165.8x+45760.9 0.9985 0.002 0.005 3 阿苯达唑砜 1.0~100 y=37675.3x−11709.9 0.9997 0.002 0.005 4 阿苯达唑-2-氨基砜 1.0~250 y=534.362x+829.161 0.9991 0.003 0.010 5 丙苯咪唑 1.0~250 y=21969x+78433 0.9980 0.002 0.005 6 芬苯达唑 1.0~50 y=79260.8x−8332.66 0.9997 0.002 0.005 7 芬苯达唑砜 1.0~100 y=35475.3x+37875.7 0.9987 0.002 0.005 8 氟苯达唑 1.0~100 y=44298.5x+131444 0.9963 0.002 0.005 9 2-氨基氟苯达唑 1.0~250 y=20762.1x+118946 0.9957 0.002 0.005 10 甲苯咪唑 1.0~50 y= 93110.3x+46391 0.9995 0.002 0.005 11 甲苯咪唑-5-羟基 1.0~250 y=13850.6x−53178.5 0.9969 0.002 0.005 12 氨基甲苯咪唑 1.0~100 y=28939.7x+39586.3 0.9990 0.002 0.005 13 奥芬达唑 1.0~250 y=10954.9x−22774.9 0.9976 0.002 0.005 14 奥苯达唑 1.0~100 y=36256.5x+78835.5 0.9978 0.002 0.005 15 噻苯达唑 1.0~250 y=232.595x+3688.03 0.9968 0.003 0.010 16 噻苯咪唑-5-羟基 1.0~1000 y=795.93x−1454.78 0.9987 0.003 0.010 17 三氯苯达唑 1.0~250 y=12471.4x−83733.5 0.9578 0.002 0.005 根据GB/T 27404-2008[28]规定，校准曲线相关系数应不低于0.99。从表2可知，三氯苯达唑相关系数r为0.9578，不符合上述规定。其余16种BMZs在质量浓度1.0~100 μg/L范围内线性关系良好（除芬苯达唑和甲苯咪唑线性范围为1.0~50 μg/L）。采用在空白巴氏杀菌乳和发酵乳样品中添加BMZs混标溶液的方法，测得BMZs的LOD为0.002 mg/kg，其中噻苯达唑、噻苯咪唑-5-羟基和阿苯达唑-2-氨基砜在本仪器条件下信号强度相比其他苯并咪唑类药物较弱，LOD为0.003 mg/kg；BMZs的LOQ为0.005 mg/kg，其中噻苯达唑、噻苯咪唑-5-羟基和阿苯达唑-2-氨基砜的LOQ为0.010 mg/kg。
2.5 回收率与精密度
在空白巴氏杀菌乳和发酵乳样品中添加17种BMZs混标溶液进行加标回收率试验，共添加3个浓度水平（0.005、0.01、0.05 mg/kg），每个水平重复6次，加标回收率和精密度试验结果见表3。
表 3 空白样品中17种苯并咪唑类药物及其代谢物的回收率与精密度（n=6）Table 3. Recovery and repeatability for benzimidazoles and their metabolites spiked in blank sample (n=6)序号 化合物 添加量
（mg/kg）巴氏杀菌乳 发酵乳 回收率
（%）RSD
（%）回收率
（%）RSD
（%）1 阿苯达唑 0.005 108.5 6.48 120.8 9.23 0.01 95.7 5.02 123.2 6.76 0.05 98.4 7.24 102.5 4.72 2 阿苯达唑亚砜 0.005 92.5 6.17 114 5.19 0.01 93.7 4.65 110.8 6.17 0.05 97.1 5.23 105.3 3.31 3 阿苯达唑砜 0.005 78.7 5.62 68.8 5.34 0.01 80.4 2.22 90.4 2.15 0.05 82.6 8.98 85.6 3.18 4 阿苯达唑-2-氨基砜 0.005 90.4 2.90 83.6 7.35 0.01 82.3 1.92 78.8 4.34 0.05 88.9 6.06 64.6 7.89 5 丙苯咪唑 0.005 86.8 6.76 74.4 6.85 0.01 80.3 6.08 69.8 11.59 0.05 103.0 6.72 80.8 4.61 6 芬苯达唑 0.005 83.6 5.69 92.8 4.15 0.01 79.4 7.55 104.4 2.06 0.05 76.8 4.31 62.5 4.33 7 芬苯达唑砜 0.005 72.8 2.58 68.5 3.67 0.01 86.2 3.20 79.4 7.76 0.05 80.4 3.03 76.7 7.80 8 氟苯达唑 0.005 89.4 7.40 92.8 5.57 0.01 93.8 5.09 115.6 8.56 0.05 96.7 9.61 97.0 5.19 9 2-氨基氟苯达唑 0.005 94.2 4.90 117.6 6.96 0.01 104.1 2.89 104.8 3.01 0.05 108.4 3.38 90.5 5.88 10 甲苯咪唑 0.005 80.7 8.56 66.4 8.58 0.01 72.4 6.39 92.2 4.14 0.05 84.3 6.13 81.4 1.98 11 甲苯咪唑-5-羟基 0.005 83.9 7.97 72.4 12.17 0.01 87.6 7.02 66.6 9.31 0.05 89.0 5.57 75.6 7.76 12 氨基甲苯咪唑 0.005 92.5 4.98 107.2 6.80 0.01 87.4 4.82 92.6 2.28 0.05 97.1 2.47 91.6 5.84 13 奥芬达唑 0.005 80.6 5.09 64.8 1.97 0.01 89.7 7.31 72.1 2.63 0.05 78.3 2.02 71.1 4.98 14 奥苯达唑 0.005 82.2 8.57 74.6 8.06 0.01 95.4 4.78 97.0 6.62 0.05 96.8 9.30 80.9 3.33 15 噻苯达唑 0.005 70.3 8.41 73.6 5.77 0.01 76.4 2.25 85.5 5.23 0.05 90.7 4.73 96.6 2.34 16 噻苯咪唑-5-羟基 0.005 79.0 7.02 68.4 8.52 0.01 84.2 5.38 65.6 9.15 0.05 82.9 6.79 75.0 8.06 17 三氯苯达唑 0.005 69.2 9.82 88.4 4.67 0.01 80.6 2.06 71.2 7.17 0.05 89.4 7.95 73.5 2.16 根据GB/T 27404[28]规定，待测组分≤0.1 mg/kg，回收率在60%~120%之间。由表3可知，本文实验中，阿苯达唑在发酵乳的三个加标水平回收率在102.5%~123.2%之间，不符合规定。低水平添加实验回收率偏高可能由于基质效应引起，在实际应用中应引起重视。除阿苯达唑外，BMZs及代谢物在三个加标水平的回收率在62.5%~117.6%之间，相对标准偏差RSD在1.92%~12.17%之间，满足实际检测要求。
2.6 基质效应的测定
在对复杂样品的痕量分析中，基质效应是不容忽视的问题，基质效应表现为基质增强或抑制作用[29]。本研究分别用初始流动相和空白基质溶液配制标准曲线，比较两条标准曲线的差异，从而判断基质效应的强弱。本研究通过标准曲线斜率法评价基质效应，计算公式如下：基质效应（ME，%）=[（空白基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线的斜率）−1]×100，ME为负值表示存在基质抑制作用，正值表示存在基质增强作用。由表4结果表明，在乳制品基质中17种BMZs均存在不同程度的基质效应，其绝对值为1.71%～56.07%。有2种BMZs（2-氨基氟苯达唑、氨基甲苯咪唑）在发酵乳基质中表现为基质增强效应，剩余15种BMZs表现为基质抑制效应，其中阿苯达唑亚砜、噻苯达唑和氟苯达唑基质效应绝对值超过50%。综合考虑，本实验采用基质匹配标准溶液的方法尽可能减少基质干扰，使定量分析更加准确。
表 4 17种苯并咪唑及代谢物在不同乳制品残留量检测中的基质效应研究Table 4. Matrix effects for the determination of 17 benzimidazoles and their metabolites residues in different dairy products序号 化合物 巴氏杀菌乳ME（%） 发酵乳ME（%） 1 阿苯达唑 −36.87 −29.50 2 阿苯达唑亚砜 −62.83 −50.27 3 阿苯达唑砜 −51.32 −41.06 4 阿苯达唑-2-氨基砜 −55.43 −44.34 5 丙苯咪唑 −57.78 −46.22 6 芬苯达唑 −53.88 −43.11 7 芬苯达唑砜 −49.38 −39.51 8 氟苯达唑 −70.09 −56.07 9 氟苯达唑-2-氨基 −21.34 1.71 10 甲苯咪唑 −25.32 −20.26 11 甲苯咪唑-5-羟基 −52.99 −42.39 12 氨基甲苯咪唑 −12.39 6.42 13 奥芬达唑 −57.49 −45.99 14 奥苯达唑 −46.85 −37.48 15 噻苯达唑 −63.91 −51.13 16 噻苯咪唑-5-羟基 −45.87 −36.70 17 三氯苯达唑 −59.95 −47.96 2.7 实际样品测定
分别利用本研究建立的UPLC-MS/MS分析方法对市场上购置的20批次乳制品（灭菌乳、发酵乳和调制乳）进行测定。经检测未检出阳性样品，与使用标准方法GB/T 22972-2008的测定结果一致。
3. 结论
本文针对乳制品采用PRiME HLB固相萃取柱净化，优化了质谱条件和液相条件，建立了乳制品中多种BMZs及代谢物的SPE-UPLC-MS/MS检测方法。实验选择含0.1%甲酸的乙腈溶液进行超声提取，SPE净化，HSS T3色谱柱梯度洗脱。方法学评价表明，除三氯苯达唑和阿苯达唑外，15种苯并咪唑及代谢物加标回收率（62.5%~117.6%）和精密度（1.92%~12.17%）良好，检出限为0.002 mg/kg（阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑和噻苯咪唑-5-羟基为0.003 mg/kg），定量限为0.005 mg/kg（阿苯达唑-2-氨基砜、噻苯达唑和噻苯咪唑-5-羟基为0.010 mg/kg）。该方法具有简便、快速和准确等特点，为进一步保障食品安全提供了有力技术支持。
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图 1 17种苯并咪唑类药物及其代谢物在不同流动相体系下的总离子流图（HSS T3色谱柱）
注：A：乙腈-水；B：乙腈-0.1%甲酸水溶液；C：乙腈-0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵溶液；D：甲醇-水；E：甲醇-0.1%甲酸水溶液；F：甲醇-0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵溶液。
Figure 1. Total ion chromatography of 17 benzimidazoles and their metabolites in different mobile phase systems (HSS T3 column)
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图 2 添加17种苯并咪唑类药物及其代谢物的空白牛奶样品定量离子色谱图（0.01 mg/kg）
Figure 2. Quantitative ion chromatogram of a blank milk sample spiked with a mixture of the benzimidazoles and theirmetabolites (0.01 mg/kg)
表 1 17种苯并咪唑类药物及其代谢物的质谱检测参数
Table 1 MS/MS parameters for the benzimidazoles and their metabolites detection
序号 化合物 保留时间（min） 母离子（m/z） 子离子（m/z） 锥孔电压（V） 碰撞能量（eV） 1 阿苯达唑 2.72 266.1 159，234.1* 20 35，15 2 阿苯达唑亚砜 2.25 282.1 208，240.1* 20 25，10 3 阿苯达唑砜 2.61 298.1 224*，190.8 20 25，35 4 阿苯达唑-2-氨基砜 1.81 240.1 133*，198 20 25，15 5 丙苯咪唑 2.29 303.1 217.1*，261 20 25，15 6 芬苯达唑 3.10 300.1 159，268* 20 30，15 7 芬苯达唑砜 2.86 332.1 300.1*，159 20 20，35 8 氟苯达唑 2.93 314.1 123，282* 20 30，20 9 2-氨基氟苯达唑 2.22 256.1 123*，95 20 25，35 10 甲苯咪唑 2.85 296.1 264*，105 20 20，30 11 甲苯咪唑-5-羟基 2.6 298.1 159*，107.2 20 20，35 12 氨基甲苯咪唑 2.16 238.1 133.1，105* 20 35，20 13 奥芬达唑 2.52 316.1 284.1，191.1* 20 15，20 14 奥苯达唑 2.34 250.1 218.1*，176 20 15，25 15 噻苯达唑 1.89 202.1 175*，131 20 20，25 16 噻苯咪唑-5-羟基 1.77 218 191.1*，176.1 20 20，15 17 三氯苯达唑 3.94 359 274*，199 20 35，40 注：*表示定量离子。 
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表 2 17种苯并咪唑类药物及其代谢物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限
Table 2 Linear equation, linear range, correlation coefficient (r), LOD and LOQ of 17 benzimidazoles and their metabolites
序号 化合物 线性范围（μg/L） 线性方程 r LOD（mg/kg） LOQ（mg/kg） 1 阿苯达唑 1.0~100 y=45321x+143314 0.9963 0.002 0.005 2 阿苯达唑亚砜 1.0~250 y=18165.8x+45760.9 0.9985 0.002 0.005 3 阿苯达唑砜 1.0~100 y=37675.3x−11709.9 0.9997 0.002 0.005 4 阿苯达唑-2-氨基砜 1.0~250 y=534.362x+829.161 0.9991 0.003 0.010 5 丙苯咪唑 1.0~250 y=21969x+78433 0.9980 0.002 0.005 6 芬苯达唑 1.0~50 y=79260.8x−8332.66 0.9997 0.002 0.005 7 芬苯达唑砜 1.0~100 y=35475.3x+37875.7 0.9987 0.002 0.005 8 氟苯达唑 1.0~100 y=44298.5x+131444 0.9963 0.002 0.005 9 2-氨基氟苯达唑 1.0~250 y=20762.1x+118946 0.9957 0.002 0.005 10 甲苯咪唑 1.0~50 y= 93110.3x+46391 0.9995 0.002 0.005 11 甲苯咪唑-5-羟基 1.0~250 y=13850.6x−53178.5 0.9969 0.002 0.005 12 氨基甲苯咪唑 1.0~100 y=28939.7x+39586.3 0.9990 0.002 0.005 13 奥芬达唑 1.0~250 y=10954.9x−22774.9 0.9976 0.002 0.005 14 奥苯达唑 1.0~100 y=36256.5x+78835.5 0.9978 0.002 0.005 15 噻苯达唑 1.0~250 y=232.595x+3688.03 0.9968 0.003 0.010 16 噻苯咪唑-5-羟基 1.0~1000 y=795.93x−1454.78 0.9987 0.003 0.010 17 三氯苯达唑 1.0~250 y=12471.4x−83733.5 0.9578 0.002 0.005
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表 3 空白样品中17种苯并咪唑类药物及其代谢物的回收率与精密度（n=6）
Table 3 Recovery and repeatability for benzimidazoles and their metabolites spiked in blank sample (n=6)
序号 化合物 添加量
（mg/kg）巴氏杀菌乳 发酵乳 回收率
（%）RSD
（%）回收率
（%）RSD
（%）1 阿苯达唑 0.005 108.5 6.48 120.8 9.23 0.01 95.7 5.02 123.2 6.76 0.05 98.4 7.24 102.5 4.72 2 阿苯达唑亚砜 0.005 92.5 6.17 114 5.19 0.01 93.7 4.65 110.8 6.17 0.05 97.1 5.23 105.3 3.31 3 阿苯达唑砜 0.005 78.7 5.62 68.8 5.34 0.01 80.4 2.22 90.4 2.15 0.05 82.6 8.98 85.6 3.18 4 阿苯达唑-2-氨基砜 0.005 90.4 2.90 83.6 7.35 0.01 82.3 1.92 78.8 4.34 0.05 88.9 6.06 64.6 7.89 5 丙苯咪唑 0.005 86.8 6.76 74.4 6.85 0.01 80.3 6.08 69.8 11.59 0.05 103.0 6.72 80.8 4.61 6 芬苯达唑 0.005 83.6 5.69 92.8 4.15 0.01 79.4 7.55 104.4 2.06 0.05 76.8 4.31 62.5 4.33 7 芬苯达唑砜 0.005 72.8 2.58 68.5 3.67 0.01 86.2 3.20 79.4 7.76 0.05 80.4 3.03 76.7 7.80 8 氟苯达唑 0.005 89.4 7.40 92.8 5.57 0.01 93.8 5.09 115.6 8.56 0.05 96.7 9.61 97.0 5.19 9 2-氨基氟苯达唑 0.005 94.2 4.90 117.6 6.96 0.01 104.1 2.89 104.8 3.01 0.05 108.4 3.38 90.5 5.88 10 甲苯咪唑 0.005 80.7 8.56 66.4 8.58 0.01 72.4 6.39 92.2 4.14 0.05 84.3 6.13 81.4 1.98 11 甲苯咪唑-5-羟基 0.005 83.9 7.97 72.4 12.17 0.01 87.6 7.02 66.6 9.31 0.05 89.0 5.57 75.6 7.76 12 氨基甲苯咪唑 0.005 92.5 4.98 107.2 6.80 0.01 87.4 4.82 92.6 2.28 0.05 97.1 2.47 91.6 5.84 13 奥芬达唑 0.005 80.6 5.09 64.8 1.97 0.01 89.7 7.31 72.1 2.63 0.05 78.3 2.02 71.1 4.98 14 奥苯达唑 0.005 82.2 8.57 74.6 8.06 0.01 95.4 4.78 97.0 6.62 0.05 96.8 9.30 80.9 3.33 15 噻苯达唑 0.005 70.3 8.41 73.6 5.77 0.01 76.4 2.25 85.5 5.23 0.05 90.7 4.73 96.6 2.34 16 噻苯咪唑-5-羟基 0.005 79.0 7.02 68.4 8.52 0.01 84.2 5.38 65.6 9.15 0.05 82.9 6.79 75.0 8.06 17 三氯苯达唑 0.005 69.2 9.82 88.4 4.67 0.01 80.6 2.06 71.2 7.17 0.05 89.4 7.95 73.5 2.16
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表 4 17种苯并咪唑及代谢物在不同乳制品残留量检测中的基质效应研究
Table 4 Matrix effects for the determination of 17 benzimidazoles and their metabolites residues in different dairy products
序号 化合物 巴氏杀菌乳ME（%） 发酵乳ME（%） 1 阿苯达唑 −36.87 −29.50 2 阿苯达唑亚砜 −62.83 −50.27 3 阿苯达唑砜 −51.32 −41.06 4 阿苯达唑-2-氨基砜 −55.43 −44.34 5 丙苯咪唑 −57.78 −46.22 6 芬苯达唑 −53.88 −43.11 7 芬苯达唑砜 −49.38 −39.51 8 氟苯达唑 −70.09 −56.07 9 氟苯达唑-2-氨基 −21.34 1.71 10 甲苯咪唑 −25.32 −20.26 11 甲苯咪唑-5-羟基 −52.99 −42.39 12 氨基甲苯咪唑 −12.39 6.42 13 奥芬达唑 −57.49 −45.99 14 奥苯达唑 −46.85 −37.48 15 噻苯达唑 −63.91 −51.13 16 噻苯咪唑-5-羟基 −45.87 −36.70 17 三氯苯达唑 −59.95 −47.96
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