Effects of Pretreatment with Three Different Enzymes on Physicochemical Properties, Biological Activity andSensory of Banana Jiaosu
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摘要: 为比较不同酶前处理后对水果发酵酵素品质的影响，本文采用香蕉作为原料，选用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶分别对香蕉进行前处理，比较不同酶前处理对香蕉酵素的理化指标、抗氧化及感官的影响。结果显示：酶处理对pH和总酸的影响较小；酶前处理组利用还原糖的能力显著，还原糖含降低了10 g/L左右；发酵第72 h时，纤维素酶和木瓜蛋白酶处理组总酚含量显著提升1.31倍左右（P<0.05），同时纤维素酶处理组类黄酮含量较其余处理组显著提升了40%左右（P<0.05）；纤维素酶处理组发酵72 h后SOD酶活力与其他组相比显著提高9倍左右，其余两组显著提高3倍左右（P<0.05）；在发酵过程中，纤维素酶前处理组在产γ-氨基丁酸的能力上显著，在第72 h时提高25%（P<0.05）；纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶前处理提高了香蕉酵素发酵过程中DPPH和ABTS+自由基清除活力和FRAP还原力，使抗氧化活性提升。纤维素酶与其他酶相比，在发酵糖的利用和产SOD酶的能力上更为强大，并具有高度的抗氧化活性和优异的口感。本研究为香蕉酵素的生产提供了理论依据，并扩展了其应用前景。Abstract: In order to compare the effects of different enzyme pretreatments on the quality of fruit fermented Jiaosu. Bananas were used as raw materials in this paper. Cellulase, pectinase and papain were used to pretreat bananas, and the effects of different enzyme pretreatments on the physical and chemical indexes, antioxidant, sensory of banana enzyme were compared. The results showed that enzyme treatment had little effect on pH and total acid. The ability of reducing sugar utilization in the enzyme pretreatment group was significant, and the final sugar content was reduced by about 10 g/L. At 72 h of fermentation, the total phenolic content of cellulase and papain treatment groups was significantly increased by about 1.31 times (P<0.05), and the flavonoid content of cellulase treatment group was significantly increased by about 40% compared with the other treatment groups (P<0.05). After 72 h fermentation, the SOD activity of cellulase treatment group was significantly increased by about 9 times compared with other groups, and the other two groups were significantly increased by about 3 times (P<0.05). During the fermentation process, the ability of cellulase pretreatment group to produce γ-aminobutyric acid was significantly and increased by 25% at 72 h (P<0.05). The pretreatment of cellulase, papain and pectinase increased the DPPH and ABTS+ free radical scavenging activity and FRAP reducing power during the fermentation of banana enzyme, and enhanced the antioxidant activity. Compared with other enzymes, cellulase was more powerful in the utilization of fermented sugar and the ability to produce SOD enzymes, and had high antioxidant activity and excellent taste. This study provides a theoretical basis for the production of banana Jiaosu, and expands the research and application of banana Jiaosu.
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Keywords:
- banana Jiaosu /
- cellulose /
- pectinase /
- protease /
- antioxidant activity /
- flavor substances
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水果酵素是一种发酵食品，是指以可用于食品加工的水果为主要原料，添加或不添加辅料，通过微生物发酵制成，含有特定的生物活性成分，适合人们食用[1]。其不仅含有植物本身的多种维生素、酶和矿物质等营养物质[2]，还通过微生物发酵产生了新的次生代谢物及活性成分，可满足人们对口感、风味、营养以及健康功能的需求[3−4]。姜忠丽等[5]研究证实糙米酵素有效成分具有抗氧化作用，可加速自由基的消除，防止各种细胞的氧化损伤，进而增强生物体内新陈代谢的作用。林金莺等[6]在诺丽酵素长效抗自由基的探究中得出诺丽酵素具有强而稳定的抗自由基能力、抗疲劳作用。目前，酵素产品已经成功实现商业化，并在国内外市场上有广阔的发展空间[7−9]。
香蕉（Musa spp.）属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa），含有较为丰富的营养功能性成分和活性物质，具备保健功能。香蕉果肉富含各种营养成分，如矿物质、抗性淀粉和膳食纤维等。此外，还含有酚类化合物、类胡萝卜素、植物甾醇、胺类和抗氧化剂等活性物质，这些活性物质赋予香蕉多种功能，如降血糖、降血压、抗菌、抗氧化和抗溃疡等[10]。同时具备了降低胆固醇、预防胃溃疡和高血压等功效，是世界上最受欢迎的水果之一[11]。目前国内香蕉主要的加工产品有香蕉饮料、香蕉粉、香蕉片等[10]。由于香蕉富含果胶、糖类、单宁等物质，在加工过程中极易发生褐变，造成颜色和风味劣变，同时由于粘度高，也使其渣汁分离困难，限制了香蕉加工产业的发展[12]。传统酵素食品在加工过程中通常直接添加微生物进行发酵[13]。但是，酶前处理会增加酵素本身的理化性质和风味，有研究发现，酶前处理会增加蜜桃酵素中可溶性固形物含量，对后期蜜桃酵素的品质也有显著影响[14]。但是，不同的酶是否会达到同样的效果以及酶处理对香蕉酵素是否也会有同样效果目前还不清楚。
本文通过比较自然发酵和不同酶前处理对香蕉酵素发酵过程中理化指标、抗氧化活性、γ-氨基丁酸含量、超氧化物歧化酶活力以及风味感官的不同变化，对其发酵规律进行初步探究，以期获得美味和营养兼具的新型发酵饮品，同时为香蕉酵素产品的开发提供技术支持和理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
香蕉 高山甜香蕉，广西；绵白糖（食品级） 大润发超市；福林-酚、芦丁、DNS、Al(NO3)3、NaNO2、葡萄糖、Na2CO3（食品级）、焦亚硫酸钾（食品级）等 分析纯，北京索莱宝科技有限公司；DPPH、ABTS、FRAP、SOD、γ-氨基丁酸试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶（10000 U/g）、果胶酶（30000 U/g）、木瓜蛋白酶（100000 U/g） 南宁庞博生物工程有限公司；商品化果蔬酵素发酵剂（植物乳杆菌N13、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和嗜热链球菌） 安琪酵母股份有限公司。
SW-CJ-1F型超净工作台 沃宏实验仪器有限公司；ZDM-1101型酶标仪 卓的仪器设备（上海）有限公司；1 L密封式发酵罐 青岛市城阳区大润发；101-00S型电热鼓风干燥箱 上华脉仪器有限公司；DT-IO1200型 pH计 杭州秋籁科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 香蕉酵素制备工艺
酿造方法参考之前的研究并进行修改[15−16]。挑选成熟后的香蕉，选取没有腐烂和病斑的果实，带果皮清洗并将其破碎，随后装入罐中，按1:2（v/v）果肉与水的比例进行混合，分三组，分别加入80 mg/kg的纤维素酶，果胶酶和木瓜蛋白酶，分别在55 ℃、pH6，50 ℃、pH5.5和55 ℃、pH6的条件下酶解4 h，以不添加酶的为空白对照，加入170 g/L（w/v）的绵白糖，用食品级Na2CO3调节pH至5.5左右，随后加入0.1 g/L（m/v）食品级焦亚硫酸钾，搅拌均匀，封口静置2 h，随后95 ℃加热5 min进行杀菌。利用商品化的发酵剂进行发酵，取1 g溶于30 ℃温水中活化，混匀静置10 min。随后以10 mL/L的接种量接种，（37±1） ℃恒温发酵，分别于发酵第0、24、48、72 h同一时间点取样。
1.2.2 pH和总酸含量测定
取新鲜发酵液，10000 r/min离心20 min，取上清液。pH采用pH计测定。总酸含量的测定参照食品中总酸的测定（GB 12456-2021）。
1.2.3 还原糖含量测定
采用DNS（二硝基水杨酸）法[17]，适当修改。取500 μL样品加入1 mL DNS中，沸水浴20 min后，于540 nm测定吸光值。标准曲线以葡萄糖作为标准品，y=0.8881x+0.0561，R2=0.9981。
1.2.4 总酚和类黄酮含量测定
采用福林-酚法测定总酚含量[18]，适当修改。取1 mL标准液或样品液于15 mL试管中，分别加入1 mL福林酚显色剂及3 mL 20% Na2CO3，混匀，于50 ℃水浴反应30 min。在765 nm波长下测定吸光度。每个浓度做3组平行实验，以没食子酸为标准品，吸光度为纵坐标，作标准曲线：y=0.08473x−0.01762，R2=0.9894。测得的样品吸光度代入回归方程计算样品中总酚含量。
采用NaNO2-Al（NO3）3法测定类黄酮含量[19]。准确移取0.50 mL样品溶液置于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.50 mL，静置5 min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.50 mL，摇匀静置5 min后加入4% NaOH溶液4.00 mL，摇匀后用60%乙醇定容，25 ℃条件下放置15 min后，测定在510 nm波长处的吸光度。配制芦丁标准溶液，加入试液测定吸光度得标准曲线方程：y=0.0288x−0.0079，R2=0.9994。测得的样品吸光度代入回归方程计算样品中类黄酮含量。
1.2.5 SOD酶活力测定
按照SOD酶活力试剂盒进行测定。
1.2.6 γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）含量测定
按照γ-氨基丁酸试剂盒进行测定。
1.2.7 抗氧化活性测定
DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力，FRAP还原力（以FeSO4为标准品作标准曲线，y=0.3485x−0.0054，R2=0.9983）测定采用试剂盒进行检测。
1.2.8 感官评价
采用9点快感标度法[20]评价发酵结束后香蕉酵素的感官性质，从20~25岁的学生中选出20名进行感官评价，男女比例为1:1，组成评定小组。该小组对食品的颜色、酸甜度、香气、味道、体态、风味和整体接受性等七个性质进行评价。评分分为9个等级，对应评价人员的喜好程度。其中，9代表极度喜欢，8代表很喜欢，7代表中等喜欢，6代表轻度喜欢，5代表无所谓，4代表轻度不喜欢，3代表中等不喜欢，2代表很不喜欢，1代表极度不喜欢。
1.3 数据处理
每组实验均重复3次，以平均值±标准差的形式展示。采用Origin 2021软件绘图；采用IBM SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析（ANOVA），其中P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 不同酶前处理发酵过程酵素理化性质的变化
pH和总酸是反映酵素整体发酵状况的理化指标[21]。不同酶前处理后，根据表1和表2的数据显示，在发酵过程中，pH和总酸含量呈现出相反的变化趋势。由表1可以看出，发酵结束后，几种酵素的pH从4降到了3左右，说明发酵过程中产生的酸性物质逐渐增加。根据表2的数据显示，在发酵过程中，第48 h时发酵液的总酸含量从0.41±0.08~2.46±0.19 g/L上升到2.23±0.19~3.81±0.11 g/L，这可能是由于此时碳源充足，乳酸菌可以利用碳源迅速产生乳酸和乙酸等物质，导致总酸含量不断上升。在发酵后期，随着乳酸菌数量的减少，总酸含量在最后24 h发酵期间，增幅减小。木瓜蛋白酶和果胶酶处理发酵后总酸含量差异不大，纤维素酶处理组总酸较高但差值并不大，相比于空白对照组三组酶处理后总酸含量较低。但总体而言酶处理对总酸含量有影响但影响幅度不大。
表 1 香蕉发酵前后pH变化Table 1. Changes in pH before and after fermentation of banana发酵时间（h） 空白 纤维素酶 木瓜蛋白酶 果胶酶 0 5.582±0.027a 5.620±0.106a 5.707±0.065a 5.711±0.056a 24 4.263±0.003b 4.260±0.007b 3.903±0.001c 4.599±0.011a 48 3.718±0.002c 3.772±0.004b 3.772±0.004b 3.829±0.005a 72 3.662±0.001d 3.734±0.001b 3.727±0.002c 3.770±0.003a 注：表中不同字母代表每一个时间点不同组之间的差异（P<0.05）；表2同。 表 2 香蕉发酵前后总酸含量变化（g/L）Table 2. Changes in total acid content before and after fermentation of banana (g/L)发酵时间（h） 空白 纤维素酶 木瓜蛋白酶 果胶酶 0 0.22±0.19a 0.29±0.07a 0.23±0.08a 0.21±0.07a 24 0.89±0.19c 1.17±0.17b 2.46±0.19a 0.41±0.08d 48 3.81±0.11a 3.42±0.06b 3.74±0.05a 2.23±0.19c 72 4.52±0.17a 4.20±0.15b 3.33±0.10c 3.28±0.12c 还原糖含量的变化可以反映出发酵液中微生物活动的情况[22]。由图1所示，在72 h发酵过程中，所有组的糖含量均是下降的趋势，在发酵过程中，乳酸菌等生物利用了大量的葡萄糖和果糖进行生长代谢。同时酶处理组在发酵72 h时，总还原糖糖含量降低至130.00 g/L，而空白组还原糖含量为146.00 g/L。这可能是由于酶对香蕉多糖的降解，产生更多葡萄糖，从而加强乳酸菌对糖的利用而导致的[23]。
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2.2 不同酶前处理发酵过程中总酚和类黄酮的变化
为了更加详细地评价不同酶处理对酵素营养物质的影响，检测了总酚和类黄酮含量（图2），几组总酚的变化均为持续升高。空白组在第72 h总酚含量提高到了原来的1.23倍，其余三种酶处理组，均提高约1.31倍左右，显著高于对照组（P<0.05）。其中，纤维素酶处理组相较于其他处理，总酚含量有明显提升，这可能是在其处理下，果肉和果皮中与纤维素结合的不溶多酚类物质转化为可溶的游离态多酚[24]。
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图 2 不同酶前处理发酵过程中总酚含量的变化Figure 2. Changes in total phenol content during fermentation with different enzyme pretreatments类黄酮在自然界的植物中广泛存在，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化、保肝和降糖降脂等活性[25]。从图3可以看出，在发酵过程中，处理组的类黄酮含量逐渐上升，并在72 h时达到最大值，分别为3.60 mg/g（纤维素酶）、3.22 mg/g（果胶酶）、3.26 mg/g（木瓜蛋白酶），并相较于24 h提高了40%左右，与对照组出现显著差异（P<0.05），这与李江等[26]的研究相似。同时，在第72 h时，空白对照组类黄酮含量出现了下降趋势，这可能是因为是其中含有过氧化物酶导致氧化分解而下降[27]。而酶处理组持续升高，可能是因为酶水解糖类物质从而加速黄酮醇类物质与糖苷结合，从而成黄酮醇配糖体，其在发酵期间会发生水解，导致黄酮含量升高[15]。
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图 3 不同酶前处理发酵过程中类黄酮含量的变化Figure 3. Changes in flavonoid content during fermentation with different enzyme pretreatments2.3 不同酶前处理发酵过程中SOD酶活的变化
由图4所示，在第48 h时，无酶空白对照组的SOD酶活力达到最大值，为93 U/mL，而在72 h时又下降，这可能是因为空白组初始pH较低，发酵后上升，降低了SOD酶活力[28]。其余三组处理组，均在72 h时达到最大值，分别为387 U/mL（纤维素酶）、209 U/mL（木瓜蛋白酶）和138 U/mL（果胶酶），较第1 d分别提高了9倍、4倍和3倍，均显著高于对照组（P<0.05）。在发酵24 h左右，SOD作为胞内酶，可以通过微生物的细胞裂解释放出来[29]，从而导致了SOD酶活性在后续发酵过程中升高。
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图 4 不同酶前处理发酵过程中SOD酶活力变化Figure 4. Changes in SOD enzyme activity during fermentation with different enzyme pretreatments2.4 不同酶前处理发酵过程中γ-氨基丁酸的变化
γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质的天然氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中[30]。γ-氨基丁酸具有抗衰老、降血压、改善肝功能、调节激素分泌、改善睡眠、增强记忆力、防治肥胖等重要生理功能[31−32]。由图5可以看出，经过发酵后，所有组的含量均有提升，对照组提高了25%左右，而处理组则提高了1倍多，特别是纤维素酶处理组，从初始值4.93 μmol/mL提高到11.45 μmol/mL，显著高于对照组（P<0.05）。这可能是由于酶的添加促进了酵素中蛋白和糖类的水解，从而促进其pH和GABA的变化[33]，同时GABA在以糙米为材料发酵的酵素产品中也发现了同样的趋势[34]。
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图 5 不同酶前处理发酵过程中γ-氨基丁酸含量的变化Figure 5. Changes in γ-aminobutyric acid during fermentation with different enzyme pretreatments2.5 不同酶前处理发酵过程中抗氧化活性的变化
进一步研究香蕉酵素发酵过程中抗氧化活性的变化，发现不同的酶处理对发酵的抗氧化能力有明显差异，具体结果见图6~图8。果胶酶，纤维素酶和木瓜蛋白酶均在第72 h达到DPPH自由基清除活力最大值，分别为14.1%、19.8%、15%，经过72 h发酵后，纤维素酶处理组DPPH自由基清除力相较空白对照组提高了2~3倍。这种提高的机制比较复杂，据Karaman等[35]的报道，酚类物质能够轻易地释放一个氢离子，这一特性是其强大自由基清除能力的主要原因。因此，酶前处理发酵使得DPPH自由基清除力提高可能与酚类物质的增加有关。同时，相较于未加酶处理组有显著差异（P<0.05）。
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图 6 不同酶前处理发酵过程中DPPH自由基清除力的变化Figure 6. Changes in DPPH radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments![]()
图 8 不同酶前处理发酵过程中FRAP还原力的变化Figure 8. Changes in FRAP reducing power during fermentation with different enzyme pretreatments对于ABTS+自由基清除活力，三组酶处理组均在第72 h达到最高值，分别为56.2%（空白）、68.8%（纤维素酶）、62.6%（木瓜蛋白酶）和63.2%（果胶酶），相较于24 h提高了5%~6%，三种处理相较于空白对照组均表现出显著差异，且纤维素酶的清除活力最高（P<0.05）。未处理组与初始相比也有提高，但清除活力显著低于其他处理组（P<0.05）。酚类物质与ABTS+自由基清除能力有关，而有机酸等物质的芳香环数量、分子数量和羟基取代基的性质也会对其产生影响[36]。
对于FRAP还原力，所有处理组均在48 h达到最大值，值得注意的是，纤维素酶处理组在FRAP还原力上也表现出了极大的优势，三个时间点的活力均显著高于其余处理组和对照组（P<0.05），在48 h时达到49.00 μmol/mL左右，较24 h提高了45%左右。其余两种酶处理组在48 h时与空白对照组也有显著差异，但在72 h时还原力显著降低（P<0.05）。酵素FRAP还原力呈现先上升后下降的趋势，Yang等[37]的研究发现，酵素的FRAP能力与SOD的活力和酚类物质的有关，同时也发现了抗氧化能力在发酵后期降低的现象。综上所述，DPPH自由基清除活力和ABTS+自由基清除活力呈现上升趋势，这可能与香蕉在发酵过程中活性物质的变化以及乳酸菌代谢产物的作用密切相关。总的来说，纤维素酶在发酵48~72 h时有利于香蕉酵素抗氧化活性的提升。
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图 7 不同酶前处理发酵过程中ABTS+自由基清除力的变化Figure 7. Changes in ABTS+ radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments2.6 不同酶前处理发酵对酵素感官品质的影响
感官评价是判断食品是否受到消费者认可的重要因素。如图9所示，与其它酶处理组相比，空白对照组处理的香蕉酵素发酵后呈现暗黄色，不如其它组的棕色更具吸引力，因此平均分较低。对于酸甜度，纤维素酶处理组得分最高（7.14±0.06），而空白组的酸度明显，导致得分较低。香气方面，所有发酵组均有明显的香蕉果香和发酵味，香味柔和，得分较高。味道方面，空白组口感较涩，而酶处理组的味道则是酸甜清爽。在外观方面，所有样品都有少量细小果肉沉淀，评分在5~6分之间。在风味方面，酶辅助发酵组具有明显的果香味，得分高于对照组。总的来说，纤维素酶处理组和果胶酶处理组在整体包括整体印象和接受度方面得分较高。纤维素酶处理组的香蕉酵素在颜色（6.25±0.09）和味道（6.52±0.08）方面得分较高，而在酸甜度（7.14±0.06）、香气（7.33±0.11）、风味（7.14±0.08）和整体（7.42±0.09）得分方面最高。纤维素酶处理发酵有助于改善香蕉酵素的感官品质，提高其可接受度。
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图 9 不同酶前处理发酵过程中感官性质的变化Figure 9. Changes of sensory properties during fermentation with different enzyme pretreatments3. 结论
本文利用了3种不同的酶对香蕉进行前处理，探究其对香蕉发酵酵素品质的影响。结果表明，不同酶前处理对香蕉酵素发酵的酸度变化较为一致。不同酶前处理后，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶对还原糖的利用要高于对照组。同时，纤维素酶处理使总酚和类黄酮含量显著提升；纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶处理后SOD酶活性均有显著提高，纤维素酶处理下最为显著。在三种酶中，纤维素酶和木瓜蛋白酶的处理有利于在发酵72 h后提高香蕉酵素的抗氧化活性。经过纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶处理后，纤维素酶处理的香蕉酵素中γ-氨基丁酸的含量最高，72 h后提高了约25%。在感官评价方面，纤维素酶处理组得分最高。
综上所述，纤维素酶处理显著提高了发酵液的总酚含量、类黄酮含量和SOD酶活性，增强了抗氧化活性，提高了γ-氨基丁酸含量并具备较好的感官品质。此外，还需要进一步研究发酵选用的菌种、发酵的工艺流程和发酵过程内部产物生成的相关性，以期为果蔬酵素开发更好的平台和策略，同时也为高质量香蕉酵素的开发提供新的依据和新思路。
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图 2 不同酶前处理发酵过程中总酚含量的变化
Figure 2. Changes in total phenol content during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 3 不同酶前处理发酵过程中类黄酮含量的变化
Figure 3. Changes in flavonoid content during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 4 不同酶前处理发酵过程中SOD酶活力变化
Figure 4. Changes in SOD enzyme activity during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 5 不同酶前处理发酵过程中γ-氨基丁酸含量的变化
Figure 5. Changes in γ-aminobutyric acid during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 6 不同酶前处理发酵过程中DPPH自由基清除力的变化
Figure 6. Changes in DPPH radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 8 不同酶前处理发酵过程中FRAP还原力的变化
Figure 8. Changes in FRAP reducing power during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 7 不同酶前处理发酵过程中ABTS+自由基清除力的变化
Figure 7. Changes in ABTS+ radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments
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图 9 不同酶前处理发酵过程中感官性质的变化
Figure 9. Changes of sensory properties during fermentation with different enzyme pretreatments
表 1 香蕉发酵前后pH变化
Table 1 Changes in pH before and after fermentation of banana
发酵时间（h） 空白 纤维素酶 木瓜蛋白酶 果胶酶 0 5.582±0.027a 5.620±0.106a 5.707±0.065a 5.711±0.056a 24 4.263±0.003b 4.260±0.007b 3.903±0.001c 4.599±0.011a 48 3.718±0.002c 3.772±0.004b 3.772±0.004b 3.829±0.005a 72 3.662±0.001d 3.734±0.001b 3.727±0.002c 3.770±0.003a 注：表中不同字母代表每一个时间点不同组之间的差异（P<0.05）；表2同。 
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表 2 香蕉发酵前后总酸含量变化（g/L）
Table 2 Changes in total acid content before and after fermentation of banana (g/L)
发酵时间（h） 空白 纤维素酶 木瓜蛋白酶 果胶酶 0 0.22±0.19a 0.29±0.07a 0.23±0.08a 0.21±0.07a 24 0.89±0.19c 1.17±0.17b 2.46±0.19a 0.41±0.08d 48 3.81±0.11a 3.42±0.06b 3.74±0.05a 2.23±0.19c 72 4.52±0.17a 4.20±0.15b 3.33±0.10c 3.28±0.12c
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