Simultaneous Determination of Ten Nucleosides in New Selenium-enriched Bamboo Shoots by HPLC-FP
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摘要: 目的：建立同时测定不同品种富硒竹笋中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷10种核苷类化合物含量的方法。方法：运用HPLC法同时测定21种不同品种竹笋的核苷类化合物含量，色谱柱为Inertsil ODS-3 C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），检测波长为260 nm，流速为0.8 mL·min−1，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。绘制21种富硒竹笋的指纹图谱进行相似度评价，确定共有峰，并用主成分分析、相关性分析和聚类分析对21种不同富硒竹笋的核苷类化合物含量测定结果进行分析。结果：10种核苷类成分在30 min内达到分离，线性关系良好（R2≥0.9990），精密度、稳定性、重复性、准确度试验RSD均小于2%。不同品种富硒竹笋中10种核苷类成分含量与结构比差异明显，并且核苷类化合物成分指标互相间存在着不同程度的相关性。通过主成分分析，提取了4个主成分，并确定了胸苷、胸腺嘧啶、腺苷、鸟苷为4项核心指标，可用于评价不同品种富硒竹笋的品质；通过相关性分析，得出尿嘧啶与胞苷、鸟苷与胸苷、胸苷与腺苷等指标间相关性较高，指标之间的含量会互相影响；通过聚类分析，得出新品富硒竹笋主要集中为一类，市场上常见的富硒竹笋主要分为两类。结论：该实验方法操作快速、简便，重现性好，可用于21种富硒竹笋中10种核苷类化合物的含量测定。同时，测定结果为竹笋的后期高效开发和利用提供理论依据。Abstract: Objective: To establish a method for simultaneous determination of cytosine, uracil, cytidine, hypoxanthine, uridine, thymidine, adenine, guanosine, thymidine and adenosine in different selenium-rich bamboo shoots. Methods: The determination was performed on Inertsil ODS-3 C18 column with mobile phase consisting of acetonitrile-water (gradient elution). The detection wavelength was set at 260 nm and the flow rate was 0.8 mL·min−1. The column temperature was 30 ℃, and the sample size was 20 μL. Fingerprints of 21 selenium-rich bamboo shoots were drawn for similarity evaluation of common peaks. The nucleosides of 21 selenium-rich bamboo shoots were analysised by principal component analysis, correlation analysis and cluster analysis. Results: 10 nucleosides were separated within 30 min, and the linear relationship was good (R2≥0.9990). RSDS of precision, stability, repeatability and accuracy tests were all less than 2%. Significant differences in the contents and structure ratio of 10 nucleosides were found in different selenium-rich bamboo shoots, and there were different degrees of correlation between nucleoside components. Four principal components were selected by principal component analysis. Thymidine, thymine, adenosine and guanosine were identified as four core indexes, which could be used to evaluate the quality of different selenium-rich bamboo shoots. The correlation between uracil and cytidine, guanosine and thymidine, thymidine and adenosine was high, and the contents of these indexes would influence each other. After cluster analysis, it was concluded that the new selenium-rich bamboo shoots were mainly concentrated in one category, and the common selenium-rich bamboo shoots in the market are mainly divided into two categories. Conclusion: The method was rapid, simple and reproducible, and could be used for the determination of 10 nucleosides in 21 selenium-rich bamboo shoots. At the same time, the results would provide a theoretical basis for the efficient development and utilization of bamboo shoots in the later period.
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富硒竹笋，禾本科竹亚科多年生常绿植物，是可食用竹种幼嫩的茎[1−2]，是一种备受人们欢迎的蔬菜，食用和栽培历史极为悠久。《本草纲目》中阐述了竹笋的药用功效：竹笋味甘、微寒、无毒[3−4]、具有消渴、利水道[5]、养气、清热化痰[6]、爽胃[7]等功效。现代研究表明，富硒竹笋含有丰富的核苷类成分[8−9]、膳食纤维[10]、蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类、维生素和矿物质元素[11−12]，是优良的保健蔬菜，且具有较高的药用价值，有降低血糖、促进创面愈合、延缓衰老、增强免疫功能、抑制细胞突变的作用，还可调节胃肠道等药理作用，对肥胖、高脂血、高血压、肿瘤等疾病具有预防作用[13]。
核苷类化合物是细胞的重要组成成分，作为生物活性成分，对机体的免疫系统、代谢系统、神经系统及心血管系统等有着很强的调节作用，例如抗血小板聚集、抗心律失常、抗氧化剂、抗癫痫以及抗肿瘤等，是改善人类健康和预防疾病的重要组成成分之一[14−15]。竹笋作为传统的药食同源植物，应用多以水为溶剂进行加工，其水溶性活性成分的生物活性研究已经受到一定的关注，富硒竹笋具有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷类物质[16−17]。因此，核苷类成分的含量可作为评价食品和药品品质的指标，核苷是一类由含氮碱基与糖缩合而成的糖苷，是构成生命体DNA和RNA的基本物质，核苷类成分已经被证实是重要的生物活性成分，与富硒竹笋生物活性（抗肿瘤、抗癫痫、抗氧化等）具有一定的关联性[18]。
目前，小柴胡[19]、熟地黄[20]、半夏[21]、食用菌[22]、龙眼[23]等药材和食材中已报道建立了核苷类物质的检测方法。但是竹笋中核苷类等含氮类化合物的液相检测方法报道较少，并且针对新品富硒竹笋中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷10种核苷的同时测定的报道也相对较少[24−25]。本研究采用HPLC法测定21种富硒竹笋中10种核苷类成分的含量，并采用主成分分析、相关性分析和聚类分析对其进行评价，比较21种富硒竹笋中化学成分的差异，探究21种竹笋的质量等同性，为解决竹笋基源单一的状况提供理论基础，为富硒竹笋的进一步高效开发利用和质量控制提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
富硒竹笋 共21种，主要包括两大类，分别为咸宁市农业科学院最新研发的新品富硒竹笋和市场上已有的富硒竹笋，所有实验所需富硒竹笋的品种认真检查，洗净、去除损坏部分，放入冰箱储存（2 ℃）。21种富硒竹笋的采样地点、采样时间和部位，如表1所示；磷酸二氢钾、磷酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈 色谱级，德国Merck公司；超纯水 实验室自制；对照品胞嘧啶（cytosine，CAS：71-30-7）、尿嘧啶（uracil，CAS：66-22-8）、胞苷（cytidine，CAS：65-46-3）、次黄嘌呤（hypoxanthine，CAS：68-94-0）、尿苷（uridine，CAS：58-96-8）、胸腺嘧啶（thymine，CAS：65-71-4）、腺嘌呤（adenine，CAS：73-24-5）、鸟苷（guanosine，CAS：118-00-3）、胸苷（thymidine，CAS：50-89-5）、腺苷（adenosine，CAS：58-61-7） 纯度质量分数均大于98%，上海麦克林生化科技有限公司。
表 1 21种富硒竹笋的基本信息Table 1. Basic information of 21 selenium-rich bamboo shoots分类 编号 品种 采样地点 采样时间 部位 新品富硒竹笋 X1 富硒竹X2 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X2 富硒竹X3 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X3 富硒竹Y1 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X4 富硒竹Y2 咸宁市咸安区 2022.10.10 笋尖 X5 富硒竹Y3 咸宁市咸安区 2022.10.14 笋尖 X6 富硒竹CK1 咸宁市咸安区 2022.10.02 笋尖 X7 富硒竹CK2 咸宁市咸安区 2022.10.09 笋尖 X8 富硒竹CK3 咸宁市咸安区 2022.10.11 笋尖 市场已有竹笋 S1 高节竹 咸宁市咸安区 2022.09.24 笋尖 S2 雷竹 咸宁市咸安区 2022.09.24 笋尖 S3 黄纹竹 咸宁市咸安区 2022.10.10 笋尖 S4 黄甜竹 咸宁市咸安区 2022.09.14 笋尖 S5 黄槽刚竹 咸宁市咸安区 2022.09.25 笋尖 S6 角竹 咸宁市咸安区 2022.10.04 笋尖 S7 石竹 咸宁市咸安区 2022.10.06 笋尖 S8 富阳乌哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.09.28 笋尖 S9 乌芽竹 咸宁市咸安区 2022.09.18 笋尖 S10 甜笋竹 咸宁市咸安区 2022.09.25 笋尖 S11 五月季 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 S12 黄杆乌哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.10.07 笋尖 S13 白哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.10.07 笋尖 HPLC-16岛津高效液相色谱仪 日本岛津公司；CM-RO-C2实验室超纯水机 宁波丹斯博顿环保科技责任有限公司；FA2004B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；KQ3200DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FSJ-A03D1型粉碎机 广东佛山市尚电电器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵 郑州博科仪器设备有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海Bullun实业有限公司医疗器械厂；VM-B漩涡混合器 上海舍岩仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的制备
1.2.1.1 对照品溶液的配制
分别精密称取对照品胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷各10 mg分别置于10个10 mL容量瓶中，加入超纯水定容，配置成质量浓度分别为1 mg·mL−1的单一对照品储备液，用超纯水稀释定容得到核苷类成分浓度为20 μg/mL混合标准品储备液，经0.45 μm滤膜过滤，置于进样瓶中，进HPLC系统分析。
1.2.1.2 供试品溶液的配制
取21种不同品种的新鲜富硒竹笋各约4 g，精密称定，用移液管精密量取20 mL超纯水置于锥形瓶中，放置18 h浸提，超声30 min，过滤。滤液过0.45 μm滤膜，取滤液作为供试品，经0.45 μm滤膜过滤，置于进样瓶中，待测。
1.2.2 HPLC色谱条件
用Shimadzu LC-16系统，Inertsil ODS-3，C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），本实验选用了不同种流动相进行考察，经过筛选，从乙腈-水、甲醇-水、甲醇-（0.02 mol·L−1）磷酸二氢钾、乙腈-（0.1 mol·L−1）磷酸二氢钾、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水中进行从流动相的比例进行最优条件的选择。梯度洗脱程序为0~5 min，1% B；5~10 min，1%~5% B；10~20 min，5%~15% B；20~25 min，15%~5% B；25~30 min，5%~1% B；设定柱温为30 ℃，流速为0.8 mL·min−1，检测波长为260 nm，进样量为20 μL。
1.2.3 方法学验证
1.2.3.1 线性回归方程
精密吸取混合标准品储备液2、10、20、40、80、120 μL分别置于2 mL的量瓶中，用移液管精密量取超纯水，经定容、摇匀后配制得到1、5、10、20、40、60 μg/mL的混合对照品溶液，用0.45 μm滤膜过滤，装入进样小瓶中，按照质量浓度由低到高分别进样，每个浓度提取配置混合标准品3份。横坐标（X）为质量浓度，纵坐标（Y）为峰面积，进行线性回归分析。
1.2.3.2 检出限（LOD）和定量限（LOQ）试验
将混合标准品溶液进行HPLC分析，得到各核苷对照品溶液最小检出限和最小定量限。最小检出限和最小定量限定义为信噪比分别等于3和10对应的进样量。
1.2.3.3 精密度实验
精密吸取混合标准品溶液20 μL，制备6份混合标准品溶液，按色谱条件测定，以峰面积计算RSD。
1.2.3.4 重复性实验
精密量取供试品溶液40 μL，制备6份混合标准品溶液，待测，记录峰面积，并计算各核苷化合物含量来表示RSD。
1.2.3.5 准确度实验
精密量取供试品溶液60 μL，共3份，再精密加入混合标准品溶液1、20、60 μL，一式三份进行HPLC色谱分析，以计算相对标准偏差（RSD）。
1.2.4 富硒竹笋指纹图谱的建立
将21种富硒竹笋对其10种核苷类化合物建立HPLC图谱，将所得的各色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012）中进行数据处理，设定以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，采用平均数生成对照图谱，经过多点校正、Mark峰匹配生成21种富硒竹笋共有模式指纹图谱。
1.3 数据处理
绘制21种富硒竹笋的HPLC指纹图谱，采用《中药色谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价，确定共有峰；采用SPSS 27.0软件进行主成分分析，Origin 2021版软件进行相关性分析和聚类分析从而对21种富硒竹笋中10种核苷类成分含量进行比较研究。
2. 结果与分析
2.1 HPLC条件的选择优化
流动相的组成也应被视为改善峰型的重要因素，本实验选用了不同种流动相进行考察。其结果如图1所示，显示同一条件下，甲醇作为有机相时，完全出峰的时间为25 min，乙腈作为有机相时，完全出峰时间为28 min。虽然甲醇作为有机相的保留时间小于乙腈作为有机相时的保留时间，但是前者的部分色谱峰分离度R小于1.5，且色谱峰宽，所以不宜采用甲醇作为有机相。乙腈作为有机流动相时有所改善，综合选择乙腈作为有机流动相。此外，溶液电离、流动相的pH对核苷类化合物的保留和选择性也有明显的影响。在水相中使用纯水作为流动相改性剂，以改善目标峰的拖尾现象，最终选用乙腈-水作为优选流动相，并进行梯度洗脱。在上述优化条件下，所有目标化合物可在28 min内完全地分离。最终确定色谱条件为以水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱程序为0~5 min，1% B；5~10 min，1%~5% B；10~20 min，5%~15% B；20~25 min，15%~5% B；25~30 min，5%~1% B。
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图 1 不同流动相的HPLC特征图谱注：a：乙腈-水，b：甲醇-水，c：乙腈-0.1%磷酸水，d：甲醇-0.1%磷酸水，e：乙腈-（0.1 mol·L−1）磷酸二氢钾，F：甲醇-（0.02 mol·L−1）磷酸二氢钾。Figure 1. HPLC characteristic chromatogram of different mobile phases2.2 方法学验证
2.2.1 线性回归方程
线性关系考察结果发现，峰面积（Y）与浓度（X）之间具有良好的相关性（R2≥0.9990），表明10种核苷类成分在其所在的浓度范围内线性关系良好，结果见表2。
表 2 目标化合物的回归方程、决定系数（R2）、线性范围、检出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2. Regression equation, coefficient of determination (R2), linear range and LOD and LOQ of target compounds名称 保留时间（min） 标准曲线方程 R2 线性范围（μg·mL−1） 检出限（LOD）（μg·g−1） 定量限（LOQ）（μg·g−1） 胞嘧啶 3.702 Y=44514X+33951 0.9990 1.0~60 2.78 8.33 尿嘧啶 4.953 Y=66160X−15461 0.9998 1.0~60 10.43 32.64 胞苷 7.051 Y=55004X−20110 0.9998 1.0~60 3.74 14.66 次黄嘌呤 8.625 Y=67007X−125362 0.9997 1.0~60 15.26 47.20 尿苷 10.693 Y=56799X−17368 0.9997 1.0~60 5.47 17.80 胸腺嘧啶 12.793 Y=72393X−32142 0.9998 1.0~60 3.30 10.83 腺嘌呤 17.217 Y=68469X+16655 0.9997 1.0~60 7.40 24.64 鸟苷 18.824 Y=98378X+334217 0.9991 1.0~60 4.65 16.45 胸苷 21.459 Y=61399X−23582 0.9999 1.0~60 8.25 26.70 腺苷 24.204 Y=87253X+2946.1 0.9999 1.0~60 4.13 14.29 2.2.2 检出限（LOD）和定量限（LOQ）试验
将混合标准品溶液多次稀释分别进行HPLC分析，得到各核苷对照品溶液最小检出限和最小定量限的比值接近1:3，表明在该条件下测得的结果相对准确，结果见表2。
2.2.3 精密度、稳定性、重复性、准确度试验
根据精密度实验结果发现，各组分色谱峰的保留时间波动在0.05 min内，各核苷类成分峰面积的RSD在0.31%~1.25%范围内，表明仪器精密度良好；根据稳定性实验结果发现，以峰面积计算各核苷化合物的RSD在0.75%~2.41%范围内，供试品溶液在48 h内稳定性良好；根据重复性实验结果发现，混合标准品中各核苷类化合物含量的RSD在0.43%~1.70%范围内，表明该方法的重复性良好；根据准确度实验结果发现，各个核苷回收率平均值分别为胞嘧啶92.34、尿嘧啶98.73、胞苷104.23、次黄嘌呤90.42、尿苷106.20、胸腺嘧啶96.45、腺嘌呤104.21、鸟苷102.44、胸苷97.23、腺苷98.60，RSD值均在0.33%~0.79%范围内，结果显示该方法对于确定10种目标化合物是准确的，结果见表3。
表 3 精密度、稳定性、重复性、准确度试验结果（RSD%，n=6）Table 3. Test results of precision, repeatability, stability and accuracy (RSD%, n=6)名称 精密度 稳定性 重复性 准确度 胞嘧啶 0.32 1.44 0.62 0.33 尿嘧啶 0.54 1.83 0.96 0.79 胞苷 0.31 1.56 1.52 0.53 次黄嘌呤 0.47 1.03 1.46 0.45 尿苷 0.74 2.41 0.43 0.38 胸腺嘧啶 0.56 0.75 1.28 0.41 腺嘌呤 0.53 1.33 1.70 0.74 鸟苷 1.25 1.24 0.92 0.68 胸苷 0.62 0.78 0.71 0.64 腺苷 0.44 0.94 0.53 0.43 2.3 样品的定量分析
按照1.2.1中的方法进行提取，按照1.2.2中的色谱条件分别对21种富硒竹笋的笋尖部分进行HPLC定量分析，根据得到的10种核苷类化合物的线性方程进行计算，最终得到的含量测定结果见表4和图2。
表 4 21种富硒竹笋样品中10种核苷化合物的含量（，n=3）Table 4. Contents of 10 nucleoside compounds in 21 selenium-enriched bamboo shoots (, n=3)样品
编号胞嘧啶
（μg·g−1）尿嘧啶
（μg·g−1）胞苷
（μg·g−1）次黄嘌呤
（μg·g−1）尿苷
（μg·g−1）胸腺嘧啶
（μg·g−1）腺嘌呤
（μg·g−1）鸟苷
（μg·g−1）胸苷
（μg·g−1）腺苷
（μg·g−1）X1 0.72±0.08 1.07±0.07 − 6.11±0.02 0.09±0.00 42.11±5.03 0.07±0.00 0.09±0.00 22.01±1.04 2.14±0.02 X2 0.13±0.01 0.15±0..01 0.29±0.04 1.42±0.01 − 6.84±0.23 0.26±0.01 0.18±0.02 2.08±0.04 0.68±0.04 X3 0.45±0.09 0.02±0.00 0.04±0.00 0.61±0.00 − 7.02±0.31 − 0.07±0.01 1.73±0.00 0.18±0.01 X4 0.90±0.11 0.09±0.00 − 0.83±0.01 0.47±0.02 38.14±2.87 − 1.12±0.03 21.75±2.03 6.40±0.43 X5 2.31±0.08 0.25±0.02 0.50±0.01 3.36±0.41 4.50±0.09 4.11±0.32 0.16±0.02 0.42±0.02 17.04±1.37 0.35±0.05 X6 0.82±0.01 − − 12.47±1.02 0.00 44.87±4.03 0.25±0.04 0.14±0.01 22.44±1.68 1.36±0.00 X7 1.02±0.02 0.68±0.01 1.37±0.12 0.75±0.02 0.42±0.05 60.26±8.54 0.12±0.02 7.87±0.41 43.31±2.93 5.14±0.02 X8 0.46±0.01 0.25±0.03 0.49±0.05 0.90±0.01 0.03±0.00 16.56±2.01 0.02±0.00 0.38±0.01 9.31±0.74 1.12±0.01 S1 0.84±0.06 0.28±0.01 0.55±0.01 2.88±0.34 3.60±0.07 45.67±5.20 0.02±0.00 − 22.96±2.00 4.29±0.10 S2 0.76±0.01 0.19±0.01 0.37±0.02 7.96±0.73 5.75±0.03 37.35±2.04 0.02±0.00 − 15.11±1.01 4.29±0.01 S3 0.43±0.01 0.10±0.01 0.21±0.01 0.08±0.00 3.11±0.01 42.79±4.82 1.04±0.03 0.64±0.02 23.00±2.04 3.84±0.01 S4 0.64±0.04 2.91±0.33 5.83±0.08 0.34±0.01 0.36±0.00 23.16±3.04 − − 1.09±0.00 2.59±0.02 S5 2.47±0.07 0.38±0.03 0.76±0.05 0.15±0.00 1.50±0.02 29.25±3.02 0.04±0.00 1.24±0.04 17.33±3.81 3.76±0.14 S6 1.28±0.13 1.27±0.01 2.54±0.21 1.71±0.13 0.70±0.01 40.41±3.23 − − 24.19±2.43 3.84±0.05 S7 0.40±0.01 0.11±0.01 0.21±0.01 2.60±0.02 1.40±0.04 35.02±4.30 0.05±0.00 1.41±0.11 11.93±1.54 2.87±0.23 S8 1.12±0.04 0.26±0.03 0.51±0.00 0.62±0.01 0.08±0.00 32.28±3.79 3.46±0.01 0.43±0.02 12.88±1.29 3.17±0.39 S9 0.95±0.02 0.80±0.03 1.59±0.07 1.05±0.02 1.78±0.01 29.75±2.01 0.06±0.00 4.48±0.33 22.21±0.98 3.21±0.24 S10 0.76±0.02 0.60±0.01 1.20±0.02 0.29±0.01 0.88±0.00 59.68±3.93 0.00 0.28±0.02 40.43±3.20 6.12±0.64 S11 1.42±0.05 0.18±0.01 0.36±0.01 − 0.20±0.00 4.80±0.32 0.25±0.00 0.98±0.01 13.10±0.22 1.79±0.22 S12 0.86±0.09 0.56±0.03 1.12±0.02 1.03±0.02 1.56±0.07 31.55±3.21 − − 18.76±1.23 3.04±0.24 S13 0.83±0.03 0.29±0.03 0.59±0.01 − 0.77±0.01 51.18±6.30 0.03±0.00 − 20.94±2.01 3.87±0.09 注：“−”表示没有此类核苷类化合物。 ![]()
图 2 21种富硒竹笋样品中10种核苷化合物的含量Figure 2. Contents of 10 Nucleoside Compounds in 21 Selenium-enriched Bamboo Shoots由表4和图2可知，不同品种富硒竹笋中10种核苷类成分含量差异明显，且核苷类成分结构比（每个核苷类成分所占该样品核苷类成分总量比值）也不相同。21种富硒竹笋中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷和总核苷类成分的平均含量分别为0.9311、0.4965、0.8828、2.1497、1.2950、32.5135、0.2777、0.9400、18.2668、3.0507、59.8727 μg·g−1。其中，胸腺嘧啶含量最高，平均含量达32.5135 μg·g−1，胸腺嘧啶和胸苷的平均含量占10种核苷类化合物平均总量的84.81%，而胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、腺嘌呤、鸟苷含量相对较低，占核苷总量的5.89%。
2.4 富硒竹笋指纹图谱的建立
将不同品种的富硒竹笋按照上述方法制备供试品溶液进行HPLC分析，不同核苷类化合物均在27 min内洗脱出来，将所得的各色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》中进行数据处理，生成核苷类化合物样品对照指纹图谱，如图3。
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图 3 混合标准品及样品提取物中核苷类成分的HPLC特征图谱注：1-胞嘧啶；2-尿嘧啶；3-胞苷；4-次黄嘌呤；5-尿苷；6-胸腺嘧啶；7-腺嘌呤；8-鸟苷；9-胸苷；10-腺苷。Figure 3. HPLC characteristic chromatogram of nucleosides in mixed standard and sample extracts对不同品种的富硒竹笋特征图谱分析，发现1~10号峰为所有样品溶液色谱峰中共有色谱峰，10个峰依次为胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷。且10个峰的峰面积和分离度较大，因此说明不同品种的富硒竹笋含有的核苷类化合物大致相同，但是含量有所差异。
以S1为对照图谱，计算共有峰的保留时间的RSD，结果见表5。从中得出每个峰号的共有峰数量代表不同品种中含有的核苷类化合物的种类，特征图谱分析结果与实验结果相一致。计算不同品种的富硒竹笋核苷类化合物的色谱图和对照图谱之间的相似度，结果见表5，从相似度结果来看，本实验收集的不同品种的富硒竹笋样品之间核苷类化合物有一定的差异性，说明富硒竹笋不同品种中均有一定的应用价值，其在富硒竹笋核苷类化合物质量方面能够发挥积极的作用。
表 5 共有峰保留时间和共有峰的峰数Table 5. Retention time of common peak and peak number of common peak峰数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 tR（min） 2.815 4.180 5.613 8.089 12.826 15.944 18.075 22.146 22.837 26.675 RSD（%） 1.23 0.47 1.05 0.75 0.58 0.73 0.65 0.55 0.47 0.89 共有峰个数 22 21 19 20 19 22 16 18 18 22 2.5 主成分分析（PCA）
应用SPSS分析软件对所有样品中10种核苷类成分含量进行主成分分析。提取标准为特征值>1，得到4个主成分。其中，第一主成分的方差贡献率为27.543%；第二个主成分的方差贡献率为48.916%；第三个主成分的方差贡献率为62.069%；第四个主成分的方差贡献率为74.390%，包含的信息量大，贡献率最高。主成分得分系数矩阵见表6。由表6可知，主成分1与胸腺嘧啶、鸟苷、胸苷、腺苷4个成分的相关性高于其他核苷类成分，相关系数在0.562~0.918之间；主成分2与尿嘧啶、胞苷2个成分的相关性高于其他核苷成分，相关系数在0.926~0.941之间；主成分3与次黄嘌呤、尿苷2个成分的相关性高于其他核苷类成分，相关系数在0.482~0.689之间；主成分4与胞嘧啶、腺嘌呤2个成分的相关性高于其他核苷类化合物，相关系数在0.223~0.805之间。主成分分析结果见表6和图4。
表 6 主成分得分系数矩阵Table 6. Score coefficient matrix of principal components指标 主成分1 主成分2 主成分3 主成分4 胞嘧啶 0.094 −0.069 0.375 0.805 尿嘧啶 0.087 0.926 0.234 −0.108 胞苷 0.083 0.941 0.221 −0.002 次黄嘌呤 −0.056 −0.442 0.482 −0.507 尿苷 0.119 −0.352 0.689 0.220 胸腺嘧啶 0.887 −0.071 −0.030 −0.351 腺嘌呤 −0.090 −0.145 −0.553 0.223 鸟苷 0.562 0.090 −0.234 0.304 胸苷 0.918 −0.190 0.018 0.046 腺苷 0.872 0.044 −0.042 −0.003 ![]()
图 4 21种富硒竹笋的主成分分析结果图注：X：新品富硒竹笋 ；S：市场已有竹笋。Figure 4. Results of principal component analysis of 21 selenium-enriched bamboo shoots将SPSS分析软件给出的主成分得分系数乘以主成分相对应的特征值的平方根，得到4个主成分种每个指标所对应的系数，关系如下：
F1 = 0.06X胞嘧啶 + 0.05X尿嘧啶 + 0.05X胞苷−0.03X次黄嘌呤+0.07X尿苷+0.53X胸腺嘧啶−0.05X腺嘌呤+0.34X鸟苷+0.55X胸苷+0.53X腺苷
F2 = −0.05X胞嘧啶 + 0.63X尿嘧啶 + 0.64X胞苷−0.3X次黄嘌呤−0.24X尿苷−0.05X胸腺嘧啶−0.10X腺嘌呤+0.06X鸟苷−0.13X胸苷+0.03X腺苷
F3 = 0.33X胞嘧啶 + 0.20X尿嘧啶 + 0.19X胞苷−0.42X次黄嘌呤+0.60X尿苷−0.03X胸腺嘧啶−0.48X腺嘌呤−0.2X鸟苷−0.02X胸苷+0.04X腺苷
F4 = 0.73X胞嘧啶 − 0.10X尿嘧啶 − 0.46X次黄嘌呤 +0.2X尿苷−0.32X胸腺嘧啶+0.2X腺嘌呤+0.27X鸟苷+0.04X胸苷
PCA分析结果显示（见图4），市场已有竹笋相对集中的聚集在一起，新品富硒竹笋分布均较散，表明在该大类里个体间的差异性较大。
2.6 相关性分析
多样本两指标之间相关系数绝对值越大，则这两个指标之间的联系越紧密。由此进一步考察不同品种富硒竹笋10种核苷类成分相互间的相关性，采用Person相关系数对不同品种富硒竹笋核苷类化合物含量进行相关性分析，结果见表7。由表7可知，21个品种富硒竹笋的10项指标之间相关性存在差异。尿嘧啶含量与胞苷含量存在极显著正相关（P<0.01）；胸腺嘧啶含量与胸苷和腺苷含量存在极显著正相关（P<0.05），胸苷和腺苷含量的变化共同影响胸腺嘧啶含量的变化；鸟苷含量与胸苷含量存在显著正相关，胸苷含量与腺苷含量存在极显著正相关（P<0.01）。此外，尿嘧啶与胞苷、鸟苷与胸苷、胸苷与腺苷等的相关系数绝对值大于0.05，指标间相关性较高。相关性分析结果表明，所检测的21种富硒竹笋的10种核苷指标间具有一定相关性，因而所统计数据信息重叠，因此采用主成分分析，提高这21种富硒竹笋品质评价的分析效率。
表 7 不同品种富硒竹笋10种核苷类化合物指标的相关性分析Table 7. Correlation analysis of 10 kinds of nucleoside compounds in different varieties of selenium-enriched bamboo shoots指标 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 −0.011 1 3 0.020 0.935** 1 4 −0.061 −0.159 −0.262 1 5 0.259 −0.179 −0.116 0.229 1 6 −0.145 0.071 0.023 0.164 0.038 1 7 0.029 −0.154 −0.131 −0.113 −0.112 −0.003 1 8 0.106 0.029 0.066 −0.190 −0.091 0.278 −0.056 1 9 0.192 −0.080 −0.110 0.053 0.103 0.798** −0.094 0.508* 1 10 0.030 0.078 0.109 −0.208 0.154 0.777** −0.011 0.289 0.685** 1 注：*表示在0.05水平（双侧）上显著相关，P<0.05；**表示在0.01水平（双侧）上极显著相关，P<0.01；1-胞嘧啶；2-尿嘧啶；3-胞苷；4-次黄嘌呤；5-尿苷；6-胸腺嘧啶；7-腺嘌呤；8-鸟苷；9-胸苷；10-腺苷。 2.7 聚类分析
以21种富硒竹笋样品10个共有峰的峰面积（部分缺失色谱峰面积以0为计）为变量，导入SPSS软件，将数据标准化后，采用Ward联结法，以平方Euclidean距离为分类依据，进行系统聚类分析，得到聚类树状图见图5。当距离为8时，21种富硒竹笋样品可分为3类，第Ⅰ类包括Y1、X3、CK3、五月季、Y3和黄甜竹，第Ⅱ类包括CK2、甜富硒竹笋，第Ⅲ类包括富阳乌哺鸡竹、石竹、黄槽竹、黄杆乌哺鸡竹、乌芽竹、雷竹、黄纹竹、高节竹、Y2、角竹、X2、白哺鸡竹、CK1。可见，新品富硒竹笋主要集中在第Ⅰ类，市场上常见的富硒竹笋主要分布在第Ⅱ类和第Ⅲ类。
3. 讨论与结论
当前使用的抗病毒药物中近50%是核苷类药物，许多抗肿瘤药物也是核苷类成分[26−27]。核苷类成分的研究具有广阔的前景，也可从中药中分离有效的核苷类成分作为先导化合物来寻求更为有效的药物[28−29]。富硒竹笋中核苷类成分的含量很高，具有开发作为补充核苷的功能性食品的潜力[30]。现代研究表明，富硒竹笋中的核苷类成分主要有鸟苷、尿嘧啶、腺苷等，具有免疫调节、影响机体心血管系统、抗肿瘤、保护神经系统等药理作用，是富硒竹笋重要功效成分之一。传统方法对于富硒竹笋中核苷类成分的提取方法和分析检测方法不仅分析时间长，所使用的提取和分析有机溶剂也具有很大的毒性。因此，开发一套完整的质量评价系统为其质量标准的建立提供理论参考依据[31]，为富硒竹笋的进一步高效开发利用和质量控制提供参考[32]。
以多种富硒竹笋的笋尖部位为考察物，通过HPLC对21种富硒竹笋的核苷类化合物进行定性和定量分析，具有科学性和综合性，利用HPLC-FD、主成分分析、相关性分析和聚类分析对其多种核苷类成分进行化学计量学分析，为解决竹笋基源单一的状况提供理论基础。
本研究发现，这21种富硒竹笋的10种核苷类化合物成分指标互相间存在着不同程度的相关性。通过主成分分析，提取了4个主成分，并确定了胸苷、胸腺嘧啶、腺苷、鸟苷为4项核心指标，可用于评价不同品种富硒竹笋的品质；通过相关性分析，得出尿嘧啶与胞苷、鸟苷与胸苷、胸苷与腺苷等指标间相关性较高，指标之间的含量会互相影响；通过聚类分析，得出新品富硒竹笋主要集中在第Ⅰ类，市场上常见的富硒竹笋主要分布在第Ⅱ类和第Ⅲ类。
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图 1 不同流动相的HPLC特征图谱
注：a：乙腈-水，b：甲醇-水，c：乙腈-0.1%磷酸水，d：甲醇-0.1%磷酸水，e：乙腈-（0.1 mol·L−1）磷酸二氢钾，F：甲醇-（0.02 mol·L−1）磷酸二氢钾。
Figure 1. HPLC characteristic chromatogram of different mobile phases
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图 2 21种富硒竹笋样品中10种核苷化合物的含量
Figure 2. Contents of 10 Nucleoside Compounds in 21 Selenium-enriched Bamboo Shoots
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图 3 混合标准品及样品提取物中核苷类成分的HPLC特征图谱
注：1-胞嘧啶；2-尿嘧啶；3-胞苷；4-次黄嘌呤；5-尿苷；6-胸腺嘧啶；7-腺嘌呤；8-鸟苷；9-胸苷；10-腺苷。
Figure 3. HPLC characteristic chromatogram of nucleosides in mixed standard and sample extracts
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图 4 21种富硒竹笋的主成分分析结果图
注：X：新品富硒竹笋 ；S：市场已有竹笋。
Figure 4. Results of principal component analysis of 21 selenium-enriched bamboo shoots
表 1 21种富硒竹笋的基本信息
Table 1 Basic information of 21 selenium-rich bamboo shoots
分类 编号 品种 采样地点 采样时间 部位 新品富硒竹笋 X1 富硒竹X2 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X2 富硒竹X3 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X3 富硒竹Y1 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 X4 富硒竹Y2 咸宁市咸安区 2022.10.10 笋尖 X5 富硒竹Y3 咸宁市咸安区 2022.10.14 笋尖 X6 富硒竹CK1 咸宁市咸安区 2022.10.02 笋尖 X7 富硒竹CK2 咸宁市咸安区 2022.10.09 笋尖 X8 富硒竹CK3 咸宁市咸安区 2022.10.11 笋尖 市场已有竹笋 S1 高节竹 咸宁市咸安区 2022.09.24 笋尖 S2 雷竹 咸宁市咸安区 2022.09.24 笋尖 S3 黄纹竹 咸宁市咸安区 2022.10.10 笋尖 S4 黄甜竹 咸宁市咸安区 2022.09.14 笋尖 S5 黄槽刚竹 咸宁市咸安区 2022.09.25 笋尖 S6 角竹 咸宁市咸安区 2022.10.04 笋尖 S7 石竹 咸宁市咸安区 2022.10.06 笋尖 S8 富阳乌哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.09.28 笋尖 S9 乌芽竹 咸宁市咸安区 2022.09.18 笋尖 S10 甜笋竹 咸宁市咸安区 2022.09.25 笋尖 S11 五月季 咸宁市咸安区 2022.10.12 笋尖 S12 黄杆乌哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.10.07 笋尖 S13 白哺鸡竹 咸宁市咸安区 2022.10.07 笋尖 
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表 2 目标化合物的回归方程、决定系数（R2）、线性范围、检出限（LOD）和定量限（LOQ）
Table 2 Regression equation, coefficient of determination (R2), linear range and LOD and LOQ of target compounds
名称 保留时间（min） 标准曲线方程 R2 线性范围（μg·mL−1） 检出限（LOD）（μg·g−1） 定量限（LOQ）（μg·g−1） 胞嘧啶 3.702 Y=44514X+33951 0.9990 1.0~60 2.78 8.33 尿嘧啶 4.953 Y=66160X−15461 0.9998 1.0~60 10.43 32.64 胞苷 7.051 Y=55004X−20110 0.9998 1.0~60 3.74 14.66 次黄嘌呤 8.625 Y=67007X−125362 0.9997 1.0~60 15.26 47.20 尿苷 10.693 Y=56799X−17368 0.9997 1.0~60 5.47 17.80 胸腺嘧啶 12.793 Y=72393X−32142 0.9998 1.0~60 3.30 10.83 腺嘌呤 17.217 Y=68469X+16655 0.9997 1.0~60 7.40 24.64 鸟苷 18.824 Y=98378X+334217 0.9991 1.0~60 4.65 16.45 胸苷 21.459 Y=61399X−23582 0.9999 1.0~60 8.25 26.70 腺苷 24.204 Y=87253X+2946.1 0.9999 1.0~60 4.13 14.29
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表 3 精密度、稳定性、重复性、准确度试验结果（RSD%，n=6）
Table 3 Test results of precision, repeatability, stability and accuracy (RSD%, n=6)
名称 精密度 稳定性 重复性 准确度 胞嘧啶 0.32 1.44 0.62 0.33 尿嘧啶 0.54 1.83 0.96 0.79 胞苷 0.31 1.56 1.52 0.53 次黄嘌呤 0.47 1.03 1.46 0.45 尿苷 0.74 2.41 0.43 0.38 胸腺嘧啶 0.56 0.75 1.28 0.41 腺嘌呤 0.53 1.33 1.70 0.74 鸟苷 1.25 1.24 0.92 0.68 胸苷 0.62 0.78 0.71 0.64 腺苷 0.44 0.94 0.53 0.43
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表 4 21种富硒竹笋样品中10种核苷化合物的含量（，n=3）
Table 4 Contents of 10 nucleoside compounds in 21 selenium-enriched bamboo shoots (, n=3)
样品
编号胞嘧啶
（μg·g−1）尿嘧啶
（μg·g−1）胞苷
（μg·g−1）次黄嘌呤
（μg·g−1）尿苷
（μg·g−1）胸腺嘧啶
（μg·g−1）腺嘌呤
（μg·g−1）鸟苷
（μg·g−1）胸苷
（μg·g−1）腺苷
（μg·g−1）X1 0.72±0.08 1.07±0.07 − 6.11±0.02 0.09±0.00 42.11±5.03 0.07±0.00 0.09±0.00 22.01±1.04 2.14±0.02 X2 0.13±0.01 0.15±0..01 0.29±0.04 1.42±0.01 − 6.84±0.23 0.26±0.01 0.18±0.02 2.08±0.04 0.68±0.04 X3 0.45±0.09 0.02±0.00 0.04±0.00 0.61±0.00 − 7.02±0.31 − 0.07±0.01 1.73±0.00 0.18±0.01 X4 0.90±0.11 0.09±0.00 − 0.83±0.01 0.47±0.02 38.14±2.87 − 1.12±0.03 21.75±2.03 6.40±0.43 X5 2.31±0.08 0.25±0.02 0.50±0.01 3.36±0.41 4.50±0.09 4.11±0.32 0.16±0.02 0.42±0.02 17.04±1.37 0.35±0.05 X6 0.82±0.01 − − 12.47±1.02 0.00 44.87±4.03 0.25±0.04 0.14±0.01 22.44±1.68 1.36±0.00 X7 1.02±0.02 0.68±0.01 1.37±0.12 0.75±0.02 0.42±0.05 60.26±8.54 0.12±0.02 7.87±0.41 43.31±2.93 5.14±0.02 X8 0.46±0.01 0.25±0.03 0.49±0.05 0.90±0.01 0.03±0.00 16.56±2.01 0.02±0.00 0.38±0.01 9.31±0.74 1.12±0.01 S1 0.84±0.06 0.28±0.01 0.55±0.01 2.88±0.34 3.60±0.07 45.67±5.20 0.02±0.00 − 22.96±2.00 4.29±0.10 S2 0.76±0.01 0.19±0.01 0.37±0.02 7.96±0.73 5.75±0.03 37.35±2.04 0.02±0.00 − 15.11±1.01 4.29±0.01 S3 0.43±0.01 0.10±0.01 0.21±0.01 0.08±0.00 3.11±0.01 42.79±4.82 1.04±0.03 0.64±0.02 23.00±2.04 3.84±0.01 S4 0.64±0.04 2.91±0.33 5.83±0.08 0.34±0.01 0.36±0.00 23.16±3.04 − − 1.09±0.00 2.59±0.02 S5 2.47±0.07 0.38±0.03 0.76±0.05 0.15±0.00 1.50±0.02 29.25±3.02 0.04±0.00 1.24±0.04 17.33±3.81 3.76±0.14 S6 1.28±0.13 1.27±0.01 2.54±0.21 1.71±0.13 0.70±0.01 40.41±3.23 − − 24.19±2.43 3.84±0.05 S7 0.40±0.01 0.11±0.01 0.21±0.01 2.60±0.02 1.40±0.04 35.02±4.30 0.05±0.00 1.41±0.11 11.93±1.54 2.87±0.23 S8 1.12±0.04 0.26±0.03 0.51±0.00 0.62±0.01 0.08±0.00 32.28±3.79 3.46±0.01 0.43±0.02 12.88±1.29 3.17±0.39 S9 0.95±0.02 0.80±0.03 1.59±0.07 1.05±0.02 1.78±0.01 29.75±2.01 0.06±0.00 4.48±0.33 22.21±0.98 3.21±0.24 S10 0.76±0.02 0.60±0.01 1.20±0.02 0.29±0.01 0.88±0.00 59.68±3.93 0.00 0.28±0.02 40.43±3.20 6.12±0.64 S11 1.42±0.05 0.18±0.01 0.36±0.01 − 0.20±0.00 4.80±0.32 0.25±0.00 0.98±0.01 13.10±0.22 1.79±0.22 S12 0.86±0.09 0.56±0.03 1.12±0.02 1.03±0.02 1.56±0.07 31.55±3.21 − − 18.76±1.23 3.04±0.24 S13 0.83±0.03 0.29±0.03 0.59±0.01 − 0.77±0.01 51.18±6.30 0.03±0.00 − 20.94±2.01 3.87±0.09 注：“−”表示没有此类核苷类化合物。
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表 5 共有峰保留时间和共有峰的峰数
Table 5 Retention time of common peak and peak number of common peak
峰数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 tR（min） 2.815 4.180 5.613 8.089 12.826 15.944 18.075 22.146 22.837 26.675 RSD（%） 1.23 0.47 1.05 0.75 0.58 0.73 0.65 0.55 0.47 0.89 共有峰个数 22 21 19 20 19 22 16 18 18 22
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表 6 主成分得分系数矩阵
Table 6 Score coefficient matrix of principal components
指标 主成分1 主成分2 主成分3 主成分4 胞嘧啶 0.094 −0.069 0.375 0.805 尿嘧啶 0.087 0.926 0.234 −0.108 胞苷 0.083 0.941 0.221 −0.002 次黄嘌呤 −0.056 −0.442 0.482 −0.507 尿苷 0.119 −0.352 0.689 0.220 胸腺嘧啶 0.887 −0.071 −0.030 −0.351 腺嘌呤 −0.090 −0.145 −0.553 0.223 鸟苷 0.562 0.090 −0.234 0.304 胸苷 0.918 −0.190 0.018 0.046 腺苷 0.872 0.044 −0.042 −0.003
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表 7 不同品种富硒竹笋10种核苷类化合物指标的相关性分析
Table 7 Correlation analysis of 10 kinds of nucleoside compounds in different varieties of selenium-enriched bamboo shoots
指标 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 −0.011 1 3 0.020 0.935** 1 4 −0.061 −0.159 −0.262 1 5 0.259 −0.179 −0.116 0.229 1 6 −0.145 0.071 0.023 0.164 0.038 1 7 0.029 −0.154 −0.131 −0.113 −0.112 −0.003 1 8 0.106 0.029 0.066 −0.190 −0.091 0.278 −0.056 1 9 0.192 −0.080 −0.110 0.053 0.103 0.798** −0.094 0.508* 1 10 0.030 0.078 0.109 −0.208 0.154 0.777** −0.011 0.289 0.685** 1 注：*表示在0.05水平（双侧）上显著相关，P<0.05；**表示在0.01水平（双侧）上极显著相关，P<0.01；1-胞嘧啶；2-尿嘧啶；3-胞苷；4-次黄嘌呤；5-尿苷；6-胸腺嘧啶；7-腺嘌呤；8-鸟苷；9-胸苷；10-腺苷。
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