Ameliorative Effects and Mechanism of Aqueous Extract of Moringa oleifera Leaves on Hepatic Fibrosis in Rats
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摘要: 研究辣木叶（Moringa oleifera Lam，LM）水提物对大鼠肝纤维化（Hepatic Fibrosis，HF）的改善作用和机制。60只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组（100 mg/kg），以及LM高、中、低剂量组（200、100、50 mg/kg），除空白组外，其余组大鼠通过腹腔注射硫代乙酰胺（Thiacetamide，TAA）建立HF模型，自第5周开始灌胃给药。给药结束后检测大鼠体重、肝脏指数、血清丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、HF指标（血清III型前胶原（procollagen III，PCIII）、IV型胶原（IV collagen IV-C）、层黏蛋白（laminin，LN）、透明质酸（hyaluronidase，HA）、肝脏羟脯胺酸（HYP）、Masson染色观察肝脏纤维组织病变、氧化应激指标（肝脏活性氧（reactive oxygen，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD），实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印记检测肝脏转运生长因子β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）/Smads通路基因表达。结果表明，与空白组比较，HF模型组大鼠体重极显著降低（P<0.01），肝脏指数显著增加，血清ALT、AST、PCIII、IV-C、LN、HA和肝脏HYP浓度极显著增加（P<0.01）；肝脏组织胶原纤维沉积显著增加，HF病变严重；肝脏ROS和MDA含量极显著增加（P<0.01），SOD活力极显著降低（P<0.01），表明模型组大鼠肝脏处于氧化应激和纤维化病变状态，肝脏功能受损。与模型组比较，LM各剂量组大鼠血清ALT、AST、PCIII、IV-C、LN、HA和肝脏HYP浓度不同程度的降低，肝脏组织胶原纤维沉积显著减少（P<0.05，P<0.01），肝脏ROS和MDA含量显著降低（P<0.05，P<0.01），SOD活力显著升高（P<0.05，P<0.01），表明LM能够降低肝脏氧化应激水平，改善大鼠HF，保护肝脏功能。对TGF-β1/Smads通路基因表达检测发现，模型组TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA基因mRNA和蛋白表达较空白组显著增加；相较于模型组，LM高、中剂量组大鼠肝脏TGF-β1、Smad2、Smad3和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）基因表达显著降低（P<0.05，P<0.01），LM低剂量组大鼠肝脏Smad3和α-SMA基因表达显著降低（P<0.05，P<0.01），表明LM可下调HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路基因表达。LM可能通过下调ROS-TGF-β1/Smads通路，改善TAA诱导的大鼠肝纤维化。Abstract: To investigate the ameliorative effects and mechanism of Moringa oleifera Lam (LM) leaf aqueous extract on hepatic fibrosis (HF) in rats. 60 male SD rats were randomly divided into normal group, model group, colchicine group (100 mg/kg), and LM high, medium and low dose groups (200, 100 and 50 mg/kg), except for the normal group, rats in the remaining groups were established as HF model by intraperitoneal injection of thioacetamide (TAA) and the corresponding drugs were administered from the 5 th week. At the end of drug administration, rats were examined for body weight, liver index, liver function indexes, including serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST). HF indices including serum procollagen type III (PCIII), collagen type IV (IV-C), laminin (LN), hyaluronic acid (HA), liver hydroxyproline acid (HYP). Masson staining was used to observe liver fibrotic tissue lesions. Indicators of Liver oxidative stress, including hepatic reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), and superoxide dismutase (SOD), were also detected. Real-time quantitative fluorescence PCR and protein immunoblotting were performed to detect hepatic TGF-β1/Smads pathway gene expression. Rats in the HF model group had significantly lower body weight, highly significantly increased liver index, serum ALT, AST, PCIII, IV-C, LN, HA and liver HYP concentrations compared with rats in the normal group (P<0.01). In addition, the liver tissue of rats in the model group showed a significant increase in collagen fibre deposition, severe liver fibrosis, highly significant increase in liver ROS and MDA content, and a highly significant decrease in SOD activity (P<0.01), indicating that the liver of rats in the model group was in a state of oxidative stress and fibrotic lesions, and liver function was impaired. Compared with the model group, serum ALT, AST, PCIII, IV-C, LN, HA and hepatic HYP concentrations were reduced to varying degrees in the LM group rats. In addition, collagen fibre deposition in liver tissue was significantly reduced, liver ROS and MDA content were significantly decreased, and SOD activity was significantly increased in the LM group rats, indicating that LM could reduce the level of liver oxidative stress, ameliorate liver fibrosis and protect liver function in rats (P<0.05, P<0.01). Gene expression detection of the TGF-β1/Smads pathway showed that the mRNA and protein expression of TGF-β1, Smad2, Smad3 and α-SMA genes were significantly increased in the model group compared with the control group. Compared with the model group, the liver TGF-β1, Smad2, Smad3 and α-SMA gene expressions were significantly lower in the LM high and medium dose groups (P<0.05, P<0.01), and the liver Smad3 and α-SMA gene expressions were significantly lower in the LM low dose group (P<0.05, P<0.01), indicating that LM could downregulate liver TGF-β1/Smads pathway gene expression in HF rats. LM would ameliorate TAA-induced liver fibrosis in rats by down-regulating the ROS-TGF-β1/Smads pathway.
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Keywords:
- liver fibrosis /
- Moringa oleifera leaf /
- oxidative stress /
- liver function
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肝脏纤维化（Hepatic Fibrosis，HF）是一种肝脏组织无效的损伤-修复，是多种慢性肝脏疾病中后期共同的病理过程，主要的病理表现为细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）积累和瘢痕形成[1]。当肝脏受到严重破坏或持续损伤时，ECM大量积累，纤维增生向肝实质细胞间隙延伸，并逐渐形成纤维索及纤维间隔，纤维间隔继续发展则连接形成纤维包裹[2]。HF之前的肝脏病变都是可逆的，但是当肝脏疾病发展到肝硬化和肝癌阶段，是不可逆转的，所以在HF阶段及时阻止并逆转肝脏疾病的发展，对于各种肝脏疾病的治疗具有重要的意义[3]。
人类机体很容易受到氧化应激的伤害，氧化应激是指机体内活性氧（ROS）积累过多，造成细胞和组织损伤的一种病理状态，ROS诱导的细胞损伤及炎症反应，影响细胞膜和细胞器的结构，释放大量的炎症因子，导致肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSC）活化、增殖和细胞外基质的合成、积累，导致HF的形成[4]。研究发现ROS与酒精性肝病和病毒性肝炎导致的HF发生具有密切的关系，在HF患者或实验性HF模型动物的血清和肝脏组织中，都检测到高浓度的ROS表达[5−6]。研究表明转化生长因子β1（Transforming Growth Factor β1，TGF-β1）与ROS具有协同作用，共同介导HF的发生。一方面TGF-β1激活细胞膜氧化酶和促进细胞线粒体复合物IV活性，导致细胞ROS合成增加；另一方面，TGF-β1抑制抗氧化还原酶的表达，降低细胞清除ROS的能力，导致细胞内ROS积累[7]。ROS的积累会促进了TGF-β1的表达，TGF-β1与细胞膜表面受体结合后招募Smad2和Smad3形成蛋白复合物，Smad2/3蛋白复合物被ROS介导的磷酸化激活后转移进入细胞核，作为转录因子与下游靶基因DNA结合，激活a-SMA、胶原纤维等HF基因的表达，导致HF发生[8]，因此抗氧化是治疗HF的重要方法。
辣木（Moringa oleifera Lam.）主要分布于我国云南、广东、福建、台湾等地[9]，2012年，辣木叶被卫生部批准为新资源食品。辣木含有丰富的蛋白质、维生素、多糖、多酚等多种营养成份和活性物质，具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤、清热解毒等功效，是一种药食同源的中草药[10−11]。研究发现辣木叶乙醇提取物具有较强的抗氧化作用[12]，对高脂饮食导致的肝损伤及高脂血症[13]、CCl4诱导的肝损伤[14]、奥氮平诱导的糖脂代谢紊乱[15]和肝癌[16]都具有一定的保护作用，其保护作用机制与抗氧化损伤、提高脂肪代谢速率和促进肝癌细胞凋亡有关，但是对辣木叶对肝纤维化是否具有改善作用缺乏目前尚无报道。
因此，本研究建立大鼠肝纤维化模型，用辣木叶水提物（LM）灌胃治疗后检测LM对大鼠肝纤维化病理损伤、肝脏功能和氧化应激的影响，旨在探讨LM对肝纤维化的改善作用，为辣木叶资源的开发利用提供研究基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级雄性大鼠 60只，6周龄的，体重180~200 g，购买自昆明医科大学实验动物学部，动物生产使用许可证SYXK（滇）K2020-0006，本研究获得昆明医科大学实验动物伦理委员会的批准通过（批准编号：kmmu20211491）；硫代乙酰胺（纯度≥98%） Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、羟脯胺酸（HYP）试剂盒 南京建成生物工程有限公司；PCIII、IV-C ELISA试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；LN ELISA试剂盒、HA ELISA试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；TGF-β1、α-SMA一抗 武汉华美生物工程有限公司；Smd2一抗、Smad3一抗 ABclonal公司；总RNA提取试剂盒 Axygen公司；逆转录试剂盒 Thermo Scientific公司；实时荧光定量PCR试剂盒 宝生生物工程有限公司；秋水仙碱片 云南昊邦制药有限公司；辣木叶干粉 陕西泰科生物科技有限公司。
Synergy2型多功能酶标仪 美国Biotek公司；Centrifuge5804R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；EG1150石蜡包埋机、RM2245切片机、DMLIM显微镜 德国Leica公司；GCZX3 型垂直电泳仪及转膜仪 美国BD公司；QuantStudioTM 6 Flx型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪 美国Thermo Fisher公司。
1.2 实验方法
1.2.1 辣木叶水提取物制备
辣木叶干粉200 g，加入2 L超纯水煮沸10 min，冷却到室温后用2 μm滤膜过滤，溶液经5000 r/min离心10 min后真空冷冻干燥，得到褐绿色的辣木叶水提物粉末（LM），−20 ℃冷冻保存，每次灌胃前需用生理盐水现配为相应的浓度。
1.2.2 动物分组及处理
60只大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组（100 mg/kg·d）、LM高、中、低剂量组（剂量分别为200、100、50 mg/kg·d），每组10只，除空白组外，其余组大鼠隔天注射硫代乙酰胺（TAA，剂量160 mg/kg）1次，共注射8周[17]，自造模开始后的第5周开始灌胃，药物组灌胃1 mL/kg药物，1次/d，空白组和模型组灌胃等量生理盐水，灌胃至第8周结束后处死大鼠，取大鼠血清和部分肝脏−80 ℃保存，另一部分肝脏用10%甲醛溶液固定。
1.2.3 检测指标
1.2.3.1 体重和肝脏指数检测
给药处理期间每周检测1次大鼠体重，给药结束后取大鼠肝脏，用预冷生理盐水快速清洗后滤纸吸干，称量肝脏质量，计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏重量/大鼠体重×100。
1.2.3.2 肝脏功能、氧化应激水平和HF指标检测
大鼠血清样根据试剂盒说明书检测转氨酶ALT、AST浓度评价肝脏功能；检测肝脏ROS、MDA浓度和SOD活性，评价肝脏氧化应激水平和抗氧化能力；检测血清HF四项指标（PCIII、IV-C、LN、HA）和羟脯氨酸（HYP）浓度，评价HF程度。
1.2.3.3 肝脏组织病理学观察
肝脏组织于甲醛固定液中固定7 d。脱水透明后石蜡包埋，切片后脱蜡、水化，然后进行Masson染色，封片后显微镜下观察肝脏纤维化水平，根据Ishak评分标准评估大鼠HF程度，根据肝脏纤维化严重程度评分为0~6分，分值越大代表纤维化程度越严重[18]。
1.2.3.4 肝脏TGF-β1/Smads通路基因表达检测
蛋白表达检测：肝脏组织约30 mg，加入蛋白裂解液后超声匀浆，冰浴裂解30 min后12000 r/min离心10 min，取上清用BCA法检测蛋白浓度，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白质通过湿转转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温2 h封闭后加入一抗孵育过夜，清洗后加入二抗室温孵育2 h，ECL化学放光检测蛋白表达，Image J软件分析目的蛋白条带相对表达量。mRNA表达检测：肝脏组织约20 mg提取总RNA，然后逆转录合成cDNA。NCBI网站设计大鼠TGF-β1、Smad2/3、α-SAM、β-actin（内参）基因引物，并通过Blast确定引物的特异性。根据实时荧光定量试剂盒操作说明检测目的基因mRNA表达水平。采用2−△△CT法分析每个基因mRNA的相对表达量。引物信息见表1。
表 1 PCR引物序列Table 1. Sequence of PCR primer基因名称 正向引物序列（5’→3’） 反向引物序列（5’→3’） TGF-β1 CTTGCCCTCTACAACCAACA CTTGCGACCCACGTAGTAGA Smad2 AGTGTTTGCCGAGTGCCTAAGTG GAGCAGCAAATTCTTGGTTGTTGA Smad3 TAGCACAGGCTCTTTGGATG GAAGCAGAGACTGGGTCCTC α-SMA GGAGCATCCGACCTTGCTAA CCATCTCCAGAGTCCAGCAC β-actin CCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC 1.3 数据处理
数据使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析和绘图，数据以平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析方法，P<0.05代表组间差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 大鼠一般情况观察
实验观察发现空白组大鼠精神状态好，毛发光泽，体重增长稳定。与空白组比较，模型组大鼠精神萎靡，毛发干枯且颜色暗淡，进食和饮水减少，行动迟缓，体重极显著降低（P<0.01），肝脏指数极显著增加（P<0.01），符合文献[17]报道的HF模型特征。与模型组比较，给药后（第8周）LM组和秋水仙碱组大鼠精神状态均有所改善，进食和饮水量增加，毛发恢复光泽，体重均显著增加（P<0.05，P<0.01），肝脏指数也显著降低（P<0.05，P<0.01）。本结果显示LM具有改善大鼠精神状态和显著下调肝脏指数的作用，见表2。
表 2 LM对HF大鼠体重和肝脏指数的影响Table 2. Effects of LM on body weight and liver index in HF rats组别 剂量
（mg/kg）第0周 第4周 第8周 肝脏指数 空白 − 235.72±6.11 278.80±9.95 307.49±10.24 3.72±0.37 模型 − 240.24±6.80 218.10±9.72** 209.90±10.77** 5.11±0.61** 秋水仙碱 100 234.09±8.00 214.20±12.18 238.39±11.38## 4.17±0.41## LM-高 200 237.96±8.51 221.83±8.12 251.05±11.73## 4.03±0.45## LM-中 100 233.27±6.85 217.97±10.16 245.05±9.86## 4.42±0.61# LM-低 50 236.02±7.01 219.30±8.48 239.12±11.10## 4.52±0.39# 注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01，表2~表6、图2同。 2.2 辣木叶对HF大鼠肝脏功能的保护作用
结果见表3，与空白组比较，模型组大鼠血清AST和ALT浓度都显著升高（P<0.01），表明HF大鼠肝脏功能受到损伤。秋水仙碱是逆转肝纤维和的药物之一，陶柏楠等[19]、胥文娟等[20]研究发现秋水仙碱能够降低HF大鼠血清ALT和AST，改善肝脏功能，本研究也发现，秋水仙碱组大鼠血清ALT和AST浓度较模型组显著降低（P<0.01），表明秋水仙碱能够改善HF大鼠肝脏功能。与模型组比较，LM高、中、低剂量都能够显著降低HF大鼠血清AST和ALT浓度（P<0.05或P<0.01）。本结果显示LM能够改善大鼠肝脏功能。
表 3 LM对HF大鼠血清AST、ALT浓度和肝纤维化评分的影响Table 3. Effects of LM on serum AST, ALT levels and liver fibrosis score in HF rats组别 剂量（mg/kg） AST（U/L） ALT（U/L） 肝纤维化评分 空白 − 30.40±6.75 56.09±17.43 0 模型 − 79.66±16.31** 192.36±63.05** 4.10±0.57** 秋水仙碱 100 47.93±17.11# 115.51±31.38## 2.60±0.84## LM-高 200 33.82±3.49## 94.76±31.86## 2.10±0.74## LM-中 100 35.35±8.74## 112.64±35.82# 2.50±0.97## LM-低 50 41.95±8.62## 120.01±24.73# 2.90±0.99## 2.3 LM改善HF大鼠肝纤维化病理损伤
HF病理损伤和肝纤维化评分如图1和表2所示，空白组大鼠肝脏组织细胞大小均匀，排列规整，细胞形态清晰，沿中央静脉呈现放射状分布，无炎性细胞浸润，也无变形和坏死。模型组大鼠肝脏细胞排列混乱，肝细胞显著变性，肝小叶结构遭到破坏，细胞染色不均，部分细胞呈空泡样改变，外基质分泌较多，汇管区纤维增生严重，形成清晰的纤维间隔，HF评分极显著增加（P<0.01），表明本研究成功建立了大鼠HF模型。与模型组比较，秋水仙碱组HF大鼠肝脏组织纤维增生显著减少，肝细胞空泡样改变得到显著缓解，炎性浸润程度降低，肝脏细胞排列相对规整，HF评分极显著降低（P<0.01）。而LM高剂量组大鼠肝脏组仅能观察到少量纤维增生和聚集，无肝细胞变性盒空泡样改变，HF评分较模型组极显著降低（P<0.01），LM抗HF病变的疗效和降低HF评分较秋水仙碱组有更大程度的改善，LM中、低剂量组也能在不同程度上缓解HF大鼠HF组织病变，并极显著降低HF评分（P<0.01）。
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图 1 LM减轻HF大鼠肝纤维化损伤（200×）注：A：空白组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：LM高剂量组；E：LM中剂量组；F：LM低剂量组。Figure 1. LM attenuates liver fibrosis injury in HF rats (200×)2.4 LM降低HF大鼠肝纤维化指标
肝脏细胞的炎性改变可以刺激纤维组织增生，导致血清HF四项指标（PCIII、IV-C、LN和HA）的异常升高，升高的幅度随着HF的程度加重而增加，因此血清肝纤四项的浓度可以作为评价HF程度的指标[21]。HYP是胶原纤维的主要成分之一，当肝脏内胶原纤维异常增多时，肝脏组织中的HYP含量也会随之升高，因此HYP含量与HF程度密切相关[22]。血清肝纤四项检测结果见表4，与空白组比较，模型组大鼠血清肝纤四项指标和肝脏HYP含量都极显著高于空白组（P<0.01），表明HF大鼠肝纤维化病变严重。与模型组比较，秋水仙碱组肝纤四项和HYP浓度都显著降低（P<0.05，P<0.01），而LM也能够显著降低大鼠血清中肝纤四项指标和HYP的含量（P<0.05，P<0.01），并且呈现剂量依赖关系。整体分析，LM高剂量组对肝纤四项和HYP含量的影响与秋水仙碱组相当。本结果显示LM能够抑制大鼠HF的发生和发展。
表 4 LM对HF大鼠肝纤维化指标含量的影响Table 4. Effects of LM on the content of liver fibrosis markers in HF rats组别 剂量（mg/kg） PCIII
（μg/L）IV-C
（μg/L）LN
（μg/L）HA
（μg/L）HYP
（μg/g）空白 − 1.83±0.24 43.64±6.64 219.33±41.06 86.24±10.06 206.41±31.41 模型 − 3.45±0.33** 85.13±7.68** 435.24±41.38** 140.21±13.24** 328.17±25.57** 秋水仙碱 100 2.690±0.21## 64.24±9.34## 330.01±32.01## 117.06±16.24# 255.53±17.06## LM-高 200 2.79±0.27## 61.03±9.19## 308.70±36.50## 117.56±13.19# 246.24±19.19## LM-中 100 2.94±0.40# 61.29±9.00## 317.76±44.92## 123.85±11.87# 276.32±12.88## LM-低 50 3.08±0.34# 70.06±8.52# 365.21±32.88# 133.76±14.99# 283.82±18.70## 注：PCIII为Ⅲ型前胶原；Ⅳ-C为Ⅳ型胶原；LN为层黏连蛋白；HA为透明质酸；HYP为羟脯胺酸。 2.5 LM对肝脏组织氧化应激的影响
HF的发生与氧化应激密切相关，课题组前期已证实LM具有抗氧化作用[15]，LM对HF大鼠肝脏氧化应激影响的结果见表5，与空白组比较，模型组大鼠肝脏组织氧化应激指标ROS和MDA含量都极显著高于空白组（P<0.01），抗氧化酶SOD活力显著降低（P<0.01），表明HF大鼠肝脏组织处于氧化应激状态，肝脏组织抗氧化损伤能力降低。与模型组比较，LM组大鼠肝脏组织ROS和MDA含量显著降低（P<0.05，P<0.01），肝脏SOD活力显著增加（P<0.05，P<0.01），表明LM具有抗氧化作用，可降低HF大鼠肝脏组织的氧化应激水平。
表 5 LM对HF大鼠肝脏组织氧化应激的影响Table 5. Effects of LM on oxidative stress in liver tissue in HF rats组别 剂量（mg/kg） ROS相对含量 MDA
（nmol/mg prot）SOD
（U/mg prot）空白 − 1.00±0.04 15.33±1.30 349.25±14.68 模型 − 1.43±0.11** 38.26±3.23** 227.20±10.46** 秋水仙碱 100 1.15±0.05## 26.19±4.09## 237.98±9.42## LM-高 200 1.13±0.04## 21.79±2.61## 278.30±13.55## LM-中 100 1.21±0.07## 24.59±2.45## 258.05±17.21## LM-低 50 1.29±0.06# 28.15±1.74## 240.21±14.61# 2.6 LM对肝脏TGF-β1/Smads通路基因表达的影响
mRNA检测结果见表6，模型组大鼠肝脏组织TGF-β1/Smads通路基因，包括TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA基因mRNA表达较空白组都极显著增加（P<0.01）。与模型组相比，秋水仙碱组α-SMA基因mRNA表达极显著降低（P<0.01），而TGF-β1、Smad2、Smad3基因mRNA表达无明显变化；LM高剂量组TGF-β1基因mRNA表达显著降低（P<0.05）；LM高、中剂量组Smds2基因mRNA表达显著降低（P<0.05）；LM高、中、低剂量组Smds3和α-SMA基因mRNA表达都显著降低（P<0.05，P<0.01）。
表 6 LM对HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路基因mRNA表达的影响Table 6. Effects of LM on mRNA expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats组别 剂量（mg/kg） TGF-β1 Smad2 Smad3 α-SMA 空白 − 1.06±0.39 1.01±0.14 1.02±0.21 1.03±0.29 模型 − 2.44±0.38** 2.65±0.50** 2.97±0.25** 4.05±0.65** 秋水仙碱 100 2.21±0.57 2.34±0.53 2.70±0.35 2.63±0.49## LM-高 200 1.68±0.55# 1.79±0.31# 1.69±0.31## 2.06±0.43## LM-中 100 2.04±0.51 2.06±0.16# 2.12±0.50## 2.65±0.21## LM-低 50 2.27±0.19 2.12±0.32 2.33±0.43# 2.70±0.32## 蛋白表达检测结果见图2，与空白组比较，模型组大鼠肝脏TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA基因蛋白表达都极显著升高（P<0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表达都极显著降低（P<0.01）；LM高、中剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表达都显著降低（P<0.05或P<0.01）；LM低剂量组Smad3和α-SMA表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。基因表达检测结果显示模型组大鼠肝脏组织TGF-β1/Smads通路被激活，肝星状细胞被活化，而LM能够下调TGF-β1/Smads通路表达，抑制肝星状细胞的活化。
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图 2 LM对HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路基因蛋白表达的影响Figure 2. Effects of LM on protein expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats3. 讨论与结论
HF的发生与氧化应激和炎症损伤密切相关，TGF-β1、血小板衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等细胞因子使静息状态的HSC被激活，合成以α-SMA为标志物的活化蛋白，被活化的肝星状细胞进一步转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞在各种细胞因子、趋化因子、生长因子的作用下，不断增殖并分泌ECM[23]。此外，ROS等刺激会导致ECM在肝脏组织中积累，形成纤维化瘢痕，影响肝脏的正常功能。所以消除损伤因素，降低HSC的活化和增殖，是治疗HF的主要策略之一[24]。辣木叶富含抗氧化活性物质，因此推测其可能通过抗氧化作用清除ROS等肝损伤因素，逆转肝纤维化。
肝毒试剂TAA诱导大鼠肝脏发生氧化应激，TAA处理后大鼠肝脏ROS含量和脂质氧化产物MDA[25−26]含量都显著增加，肝脏处于氧化应激损伤状态，肝脏组织内的ALT和AST会释放进入血液中[27]，血清中ALT和AST含量可以作为评价肝脏功能的指标[28]。本研究检测也证实了TAA诱导氧化应激损伤后，肝脏ROS和MDA含量都显著增加，血清ALT和AST浓度显著增加，大鼠肝脏功能受到损伤，而LM能够显著的降低肝脏氧化应激状态，保护肝脏功能。
肝星状细胞被激活后，会大量合成、分泌PCIII、IV-C、LN、HA等肝脏胶原纤维成份，这些成份血清含量可以作为评价HF的指标[29]。HYP是胶原蛋白中特有的氨基酸成份，肝脏组织中HYP含量也可以评价HF程度[30]。本研究检测了大鼠血清PCIII、IV-C、LN、HA和肝脏HYP含量，发现模型组大鼠上述指标都显著升高，表明TAA处理成功诱导了大鼠HF的发生。LM处理后，大鼠HF指标显著降低，表明LM成功减缓了大鼠肝脏纤维组织沉积，该结果也通过Masson染色的结果得到了验证。
在HF发生过程中，ROS能显著促进TGF-β1的表达[31]，而TGF-β1可通过抑制抗氧化还原酶的表达，如谷氧还原蛋白、过氧化氢（catalase，CAT）、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等，降低细胞清除ROS的能力，导致细胞内ROS进一步积累。TGF-β1与受体结合后，招募Smads蛋白形成复合物，Smads蛋白复合物被磷酸化后转移进入细胞核内，激活下游HF靶基因的表达，导致肝星状细胞活化标志物α-SMA表达上调[32]、ECM合成和分泌增加[3]。因此，TGF-β1和ROS协同作用，一方面促进HSC活化和增殖，增加ECM的合成；另一方面能够抑制与ECM降解相关的蛋白表达，抑制ECM的降解。本研究发现，在TAA诱导的纤维化肝脏组织内，肝脏组织ROS和MDA含量显著增加，TGF-β1/Smads通路激活，TGF-β1表达显著增加，其结合蛋白Smad2/3表达也显著增加，因此ROS-TGF-β1/Smads通路的激活是HF发生的重要因素。而LM处理后，大鼠肝脏组织ROS和MDA浓度都显著降低，TGF-β1、Smad2/3和、下游靶基因α-SMA表达都显著降低，胶原纤维含量也显著降低，表明LM可能通过抗氧化作用提高机体清除ROS的能力，抑制ROS-TGF-β1/Smads通路的激活，进而抑制下游肝星状细胞的活化和ECM的合成、分泌，减轻HF损伤。
多项研究表明，辣木叶提取物具有抗氧化、抗炎、增强免疫力等广泛的药理作用[10]，本研究结果显示LM能够提高机体抗氧化能力，显著降低HF大鼠肝脏ROS含量，改善大鼠HF损伤。作用机制研究结果显示，LM能够显著抑制HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路TGF-β1、Smad2/3和下游α-SMA、胶原纤维基因的表达，推测LM可能通过调控ROS-TGF-β1/Smads通路发挥抗肝纤维化作用，但是LM改善HF的药效物质基础还需要进一步的研究。
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图 1 LM减轻HF大鼠肝纤维化损伤（200×）
注：A：空白组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：LM高剂量组；E：LM中剂量组；F：LM低剂量组。
Figure 1. LM attenuates liver fibrosis injury in HF rats (200×)
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图 2 LM对HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路基因蛋白表达的影响
Figure 2. Effects of LM on protein expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats
表 1 PCR引物序列
Table 1 Sequence of PCR primer
基因名称 正向引物序列（5’→3’） 反向引物序列（5’→3’） TGF-β1 CTTGCCCTCTACAACCAACA CTTGCGACCCACGTAGTAGA Smad2 AGTGTTTGCCGAGTGCCTAAGTG GAGCAGCAAATTCTTGGTTGTTGA Smad3 TAGCACAGGCTCTTTGGATG GAAGCAGAGACTGGGTCCTC α-SMA GGAGCATCCGACCTTGCTAA CCATCTCCAGAGTCCAGCAC β-actin CCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC 
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表 2 LM对HF大鼠体重和肝脏指数的影响
Table 2 Effects of LM on body weight and liver index in HF rats
组别 剂量
（mg/kg）第0周 第4周 第8周 肝脏指数 空白 − 235.72±6.11 278.80±9.95 307.49±10.24 3.72±0.37 模型 − 240.24±6.80 218.10±9.72** 209.90±10.77** 5.11±0.61** 秋水仙碱 100 234.09±8.00 214.20±12.18 238.39±11.38## 4.17±0.41## LM-高 200 237.96±8.51 221.83±8.12 251.05±11.73## 4.03±0.45## LM-中 100 233.27±6.85 217.97±10.16 245.05±9.86## 4.42±0.61# LM-低 50 236.02±7.01 219.30±8.48 239.12±11.10## 4.52±0.39# 注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01，表2~表6、图2同。
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表 3 LM对HF大鼠血清AST、ALT浓度和肝纤维化评分的影响
Table 3 Effects of LM on serum AST, ALT levels and liver fibrosis score in HF rats
组别 剂量（mg/kg） AST（U/L） ALT（U/L） 肝纤维化评分 空白 − 30.40±6.75 56.09±17.43 0 模型 − 79.66±16.31** 192.36±63.05** 4.10±0.57** 秋水仙碱 100 47.93±17.11# 115.51±31.38## 2.60±0.84## LM-高 200 33.82±3.49## 94.76±31.86## 2.10±0.74## LM-中 100 35.35±8.74## 112.64±35.82# 2.50±0.97## LM-低 50 41.95±8.62## 120.01±24.73# 2.90±0.99##
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表 4 LM对HF大鼠肝纤维化指标含量的影响
Table 4 Effects of LM on the content of liver fibrosis markers in HF rats
组别 剂量（mg/kg） PCIII
（μg/L）IV-C
（μg/L）LN
（μg/L）HA
（μg/L）HYP
（μg/g）空白 − 1.83±0.24 43.64±6.64 219.33±41.06 86.24±10.06 206.41±31.41 模型 − 3.45±0.33** 85.13±7.68** 435.24±41.38** 140.21±13.24** 328.17±25.57** 秋水仙碱 100 2.690±0.21## 64.24±9.34## 330.01±32.01## 117.06±16.24# 255.53±17.06## LM-高 200 2.79±0.27## 61.03±9.19## 308.70±36.50## 117.56±13.19# 246.24±19.19## LM-中 100 2.94±0.40# 61.29±9.00## 317.76±44.92## 123.85±11.87# 276.32±12.88## LM-低 50 3.08±0.34# 70.06±8.52# 365.21±32.88# 133.76±14.99# 283.82±18.70## 注：PCIII为Ⅲ型前胶原；Ⅳ-C为Ⅳ型胶原；LN为层黏连蛋白；HA为透明质酸；HYP为羟脯胺酸。
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表 5 LM对HF大鼠肝脏组织氧化应激的影响
Table 5 Effects of LM on oxidative stress in liver tissue in HF rats
组别 剂量（mg/kg） ROS相对含量 MDA
（nmol/mg prot）SOD
（U/mg prot）空白 − 1.00±0.04 15.33±1.30 349.25±14.68 模型 − 1.43±0.11** 38.26±3.23** 227.20±10.46** 秋水仙碱 100 1.15±0.05## 26.19±4.09## 237.98±9.42## LM-高 200 1.13±0.04## 21.79±2.61## 278.30±13.55## LM-中 100 1.21±0.07## 24.59±2.45## 258.05±17.21## LM-低 50 1.29±0.06# 28.15±1.74## 240.21±14.61#
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表 6 LM对HF大鼠肝脏TGF-β1/Smads通路基因mRNA表达的影响
Table 6 Effects of LM on mRNA expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats
组别 剂量（mg/kg） TGF-β1 Smad2 Smad3 α-SMA 空白 − 1.06±0.39 1.01±0.14 1.02±0.21 1.03±0.29 模型 − 2.44±0.38** 2.65±0.50** 2.97±0.25** 4.05±0.65** 秋水仙碱 100 2.21±0.57 2.34±0.53 2.70±0.35 2.63±0.49## LM-高 200 1.68±0.55# 1.79±0.31# 1.69±0.31## 2.06±0.43## LM-中 100 2.04±0.51 2.06±0.16# 2.12±0.50## 2.65±0.21## LM-低 50 2.27±0.19 2.12±0.32 2.33±0.43# 2.70±0.32##
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