Identification of Phytochemical Components in Lilium davidii var. unicolor using UHPLC-QTOF-MS
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摘要: 为探究地理标志产品兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）的植物化学成分，以甘肃省五个主要产区（兰州市榆中县、兰州市七里河区、定西市临洮县、定西市渭源县、临夏市永靖县）的兰州百合鳞茎为研究对象，基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法的非靶向代谢组学技术鉴定其植物化学成分。结果表明，在兰州百合鳞茎中初步鉴定出62种植物化学成分，包含谷胱甘肽等22种氨基酸、多肽及其衍生物，溶血磷脂酰胆碱等9种油脂和磷脂类，鼠李糖等7种糖类，阿魏酸、咖啡酸等7种酚酸类，山奈酚等4种黄酮类，核黄素、维生素C等4种天然维生素，阿魏酰腐胺等3种酚胺类，大丁苷等2种香豆素类，葫芦巴碱等2种生物碱，萜类组分松香酸和三萜皂苷类组分刺五加苷E。本研究丰富了兰州百合植物化学成分的现有数据，为兰州百合的研究与利用提供了科学依据。
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关键词:
- 兰州百合 /
- 植物化学成分 /
- 代谢组学 /
- 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（UHPLC-QTOF MS） /
- R语言
Abstract: To explore the profiles of phytochemical components in geographical indication product of China Lilium davidii var. unicolor, the bulbs of which derived from five major producing areas of Gansu Province (Yuzhong County, Lanzhou City, Qilihe District, Lanzhou City, Lintao County, Dingxi City, Weiyuan County, Dingxi City, Yongjing County, Linxia City) were detected using ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-QTOF MS). Based on untargeted metabolomics technology, a total of 62 phytochemical components were putatively annotated in the bulbs of L. davidii var. unicolor. Among them, there were 22 kinds of amino acids, peptides and their derivatives (e.g., glutathione), 9 kinds of lipids and phospholipids (e.g., lyso-phosphatidylcholin), 7 kinds of saccharides (e.g., rhamnose), 7 kinds of phenolic acids (e.g., ferulic acid and caffeic acid), 4 kinds of flavonoids (e.g., kaempferol), 4 kinds of natural vitamins (e.g., riboflavin and vitamin C), 3 kinds of phenolamines (e.g., feruloyl putrescine), 2 kinds of coumarins (e.g., gerberinside), 2 kinds of alkaloids (e.g., trigonelline), terpenoids (e.g., abietic acid) and triterpenoid saponins (e.g., eleutheroside E). The study would provide richer data and scientific evidence for the investigation and utilization of L. davidii var. unicolor. -
百合是一种具有观赏价值的多年生药食同源草本植物，可食用部位为鳞茎，药用历史悠久，秦汉时期已被记载于《神农百草经》[1]。《中华人民共和国药典（2020年版）》中将药用百合定义为百合（Lilium. brownii F.E.Brown var. viridulum Baker），卷丹（L. lancifolium Thunb.）或细叶百合（L. pumilum DC.）的干燥鳞茎[2]。百合对阴虚燥咳，虚烦惊悸和失眠多梦等症状均有疗效，除此之外，目前新鲜百合鳞茎作为一种特色蔬菜也颇受消费者青睐[3]。我国主流食用百合包括兰州百合（Lilium davidii var. unicolor），龙牙百合（L. brownii var. viridulum Baker）和卷丹[4]。兰州百合是目前主流食用百合之一，也是中国地理标志产品，味极甜美，具有较高营养保健价值，有“蔬菜人参”美誉，迄今已有400年的食用历史[5]。目前已有部分针对兰州百合鳞茎中营养素构成和植物化学成分的报道。郎利新等[6]对不同品种百合的氨基酸、脂肪酸、维生素和矿物质等成分进行测定，解析了成分组成和品种的关系。Li等[7]采用超声辅助提取兰州百合中的活性多糖，该多糖主要由超过50%的葡萄糖和超过10%的甘露糖组成。Li等[8]采用拉曼光谱法在兰州百合鳞茎中鉴定出淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、磷脂和阿魏酸等成分，该研究提供了无损检测方法。已有报道兰州百合中还含有山奈酚、槲皮素、芦丁、儿茶素、芸香苷、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、秋水仙碱等植物化学成分[9−10]。但是相比于药用百合，兰州百合中植物化学成分研究相对较少。
代谢组学是系统研究样本中分子量低于1500 Da小分子成分的技术[11]，随着仪器和分析手段的提升，该技术可以实现特定组织的高通量代谢物数据的定性和定量[12]，具有高灵敏度和高重复性等优点，已在食品科学领域广泛应用[13]。目前，该技术已被应用于百合植物化学成分研究。Chiang等[14]使用气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对新鲜和烘干的卷丹百合样品进行香气组分分析。Tang等[1]基于非靶向代谢组学方法对22种百合的酚酸类和黄酮类等差异组分进行比较研究，结合不同品种的抗氧化性进行相关性分析。Kong等[2]对5种百合的植物化学成分进行差异分析，关注了兰州百合中与甜味和苦味相关的组分。Liang等[5]对百合鳞茎中色素形成机制进行了探究。以上研究主要关注差异成分的比较，除此之外，组学数据也是单一品种成分鉴定的有力工具，可以无偏向性针对样品中能检测到的组分进行定性和相对定量。Miao等[15]采用液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L）中的植物化学成分多样性，应用高通量数据对单一品种进行了深入研究。
基于此，本研究拟采用基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）的代谢组学技术对兰州百合鳞茎中的植物化学成分进行高通量采集，进一步利用MS-DIAL和R语言等组学数据处理工具，以代谢组学标准倡议（Metabolomics standards initiative，MSI）提出的代谢物注释和鉴定标准为依据，对兰州百合中的植物化学成分进行鉴定分析，以期丰富兰州百合植物化学成分的现有数据，旨在为兰州百合的研究与利用提供数据支撑，为兰州百合等特色蔬菜的品质分析与评价工作提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）样品取自甘肃省的五个主要产区，采收时间为2021年9月-11月，样品信息见表1；乙腈 色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；甲酸 色谱纯，北京迪马科技有限公司；甲醇 色谱纯，德国Merck公司；纯净蒸馏水 广州屈臣氏食品饮料有限公司。
表 1 兰州百合样品信息Table 1. Sample information of L. davidii var. unicolor样品编号 产地 产地经纬度 样品生长年限 样品数 LZ-YZ 兰州市榆中县 E 104°6′45″、N 35°50′39″ 3年生 3家农户*3份样品 LZ-QLH 兰州市七里河区 E 103°47′9″、N 36°3′57″ 3年生 3家农户*3份样品 DX-LT 定西市临洮县 E 104°36′39″、N 35°34′45″ 3年生 3家农户*3份样品 DX-WY 定西市渭源县 E 104°12′54″、N 35°8′10″ 3年生 3家农户*3份样品 LX-YJ 临夏市永靖县 E 103°12′39″，N 35°36′4″ 3年生 3家农户*3份样品 TripleTOF 6600超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI） 美国AB SCIEX公司；Vortex Genius 3涡旋混合仪 德国IKA公司；SK8200LHC超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；08F107-42天平 武汉艾德姆衡器有限公司；XS204分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；3K15高速冷冻离心机 曦玛离心机（扬州）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 百合鳞茎样品前处理
取百合鳞茎的中层鳞片，清洗吸干水分，液氮研磨成粉末。参考Xu等[16]的方法提取代谢物。称取100 mg的粉末溶解于预冻的含0.0125%甲酸的300 μL甲醇溶液，涡旋混匀10 s，在20 ℃下水浴超声15 min，13000 r/min离心15 min，上清液经定性滤纸粗过滤后，依次过0.45 μm和0.22 μm的针式过滤器，得到待测样品，−80 ℃保存备用。
1.2.2 UHPLC条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相A：0.2%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0~11.50 min，5%~30% B；11.50~11.51 min，30%~100% B；11.51~15.00 min，100% B；15.01~18.00 min，5% B；柱温40 ℃，自动进样器温度4 ℃，进样量2.0 µL，流速0.30 mL/min。
1.2.3 QTOF-MS条件
使用信息依赖型（Information dependent acquisition，IDA）质谱采集模式采集百合鳞茎样品的代谢组学数据，得到其TOF-MS一级母离子扫描和高灵敏度下的二级产物离子扫描信息。IDA（Cycle time为551 ms）由TOF-MS扫描（Accumulation time为50 ms）和高灵敏度模式下的产物离子扫描（Accumulation time为30 ms）组成。质谱条件：电喷雾离子源（ESI+/−）；质谱扫描范围：一级母离子为100~1000 Da，产物离子为50~1000 Da；离子碰撞能量10 eV/−10 eV；喷雾电压：5500 V/−4500 V；去簇电压：60 V/−60 V；离子源温度：500 ℃；雾化器气压：50 psi；辅助加热气气压：50 psi；气帘气气压：25 psi。
1.3 数据处理
UHPLC-QTOF-MS数据分别通过MS-DIAL软件（版本4.90）和R语言[17]进行峰提取，峰对齐，与公共数据库和本地数据库的化合物匹配定性，峰表的导出处理和植物化学成分确定，合并两种处理工具得到的植物化学成分，得到最终结果。
峰提取时，MS的质量允许偏差设置为15 ppm。峰对齐时，保留时间（Retention time，RT）允许偏差设置为0.1 min，MS和MS/MS质量允许偏差分别为10 ppm和25 ppm，化合物峰在每组的检出率（Detection Rate，DR）至少为60%。
化合物匹配定性时，基于化合物峰的RT，精确质量，同位素比值和MS/MS谱信息，与公共数据库（BIOPEP，PepBank，Pubchem，Massbank、MONA、GNPS、HMDB、FooDB、RIKEN、fiehn等）和本地数据库进行匹配定性，形成化合物峰表。
利用Microsoft Office Excel 2019对化合物峰表信息进行分析，从而确定植物化学成分。以相对化合物峰面积大于1000、在总体样本中DR超过80%进行筛选，并且手动剔除反卷积的MS/MS谱图和参考MS/MS谱图镜像图对应较差的成分，最后，鉴定出的兰州百合鳞茎中的植物化学成分按照MSI的划分级别为2级（Putatively annotated compounds）。
最后，使用R语言进行可视化，绘制样本Upset图和植物化学成分聚类热图。
2. 结果与分析
2.1 兰州百合代谢组学数据概况
使用Upset图来展示五个主要产区之间的交叠关系，通常情况下Upset图由三个子图构成，左下方的柱状图表示集合的大小，后下方的交叠矩阵则表示集合的交集情况，每一列表示不同的交集组合，对应的上方数字和柱状图为交集的数量。UHPLC-QTOF MS在不同产区正负离子模式采集到的化合物峰数量如图1所示，在兰州百合的五个主要产区中，正离子模式共提取到7381个化合物峰，负离子模式共提取到4444个化合物峰，共有化合物峰分别占DX-LT、DX-WY、LX-YJ、LZ-QLH和LZ-YZ的96.3%、96.5%、96.6%、96.2%和98.1%，不同产区的样品峰重叠程度大，表明采集到的数据具有代表性，由此得到的定性匹配结果能反映兰州百合的普遍规律。五个主要产区由于生态因子不同，比如经纬度、海拔、平均气温、昼夜温差、日照、无霜期等存在差异，可能会导致同一物种的植物化学成分累积产生差异[18]。
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图 1 五个主要产区兰州百合样本化合物峰的Upset图注： A：正离子模式；B：负离子模式。Figure 1. Upset graph of features in L. davidii var. unicolor from five major producing areas2.2 兰州百合植物化学成分定性结果
化学分析工作小组（Chemical analysis working group，CAWG）提出的MSI中将代谢物定性分为四个等级，包括1级化合物（确证化合物，Identified compounds），2级化合物（潜在注释化合物，Putatively annotated compounds），3级化合物（潜在特征种类化合物，Putatively characterized compound classes）和4级化合物（未知化合物，Unknown compounds），其中2级定性化合物是基于其物理化学性质，并与公共图谱数据库进行匹配定性，但未经过标准品验证[19]。本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS的非靶向代谢组学，在正负离子模式下共定性出符合MSI中2级定性标准的62种植物化学成分，包括22种氨基酸、多肽及其衍生物类成分，9种油脂和磷脂类成分，7种糖类成分，7种酚酸类成分，4种黄酮类成分，4种天然维生素类成分，3种酚胺类成分，2种香豆素类成分，2种生物碱类成分，1种萜类成分和1种三萜皂苷类成分。这些成分的定性信息（种类、中英文名称、化学式、加和离子、保留时间、质荷比、质量偏差、MSDIAL总得分等）见表2，相对峰面积分类别的聚类热图见图2，成分在各组均稳定检出。
表 2 兰州百合植物化学成分定性信息Table 2. Detailed qualitative information of phytochemicals in L. davidii var. unicolor种类 No. 化合物
中文名称化合物
英文名称化学式 加和
离子平均保留
时间（min）质荷比 质量偏差
（ppm）MSDIAL
总得分1 色氨酸 Tryptophan C11H12N2O2 [M+H]+ 5.098 205.0959 4.681 98.2 2 苯丙氨酸 Phenylalanine C9H11NO2 [M+H]+ 3.497 166.0856 4.034 93.9 氨基酸
及其
衍生物3 赖氨酸 Lysine C6H14N2O2 [M+H]+ 1.061 147.1122 4.079 92.1 4 缬氨酸 Valine C5H11NO2 [M+H]+ 1.774 118.0866 −2.795 90.4 5 异亮氨酸 Isoleucine C6H13NO2 [M+H]+ 2.268 132.1015 3.104 90.2 6 酪氨酸 Tyrosine C18H32O7 [M+H]+ 2.044 182.0813 2.746 98.9 7 精氨酸 Arginine C6H14N4O2 [M+H]+ 1.462 175.1184 2.969 93 8 谷氨酰胺 Glutamine C5H10N2O3 [M+H]+ 1.191 147.0752 8.431 90.8 9 谷氨酸 Glutamic acid C5H9NO4 [M+H]+ 1.200 148.0589 7.767 90.4 10 脯氨酸 Proline C5H9NO2 [M+H]+ 1.080 116.0696 8.702 86 11 天冬氨酸 Aspartic acid C4H7NO4 [M-H]− 1.179 132.0303 −9.316 84.2 12 组氨酸 Histidine C6H9N3O2 [M-H]− 1.094 154.0622 −5.387 77.9 13 正缬氨酸 Norvaline C5H11NO2 [M+H]+ 3.496 118.0652 −8.046 99.6 14 谷氨酸-亮氨酸 Gamma-glutamylleucine C11H20N2O5 [M+H]+ 5.263 261.1436 4.174 85.3 15 谷胱甘肽 Glutathione C10H17N3O6S [M+H]+ 1.329 308.0900 3.635 94.2 16 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid C5H7NO3 [M+H]+ 1.184 130.0493 4.306 91.2 17 N-甲基谷氨酸 N-Methylglutamic acid C6H11NO4 [M+H]+ 1.317 162.0766 −3.085 88.8 18 N,N-二甲基精氨酸 N,N-Dimethylarginine C8H18N4O2 [M+H]+ 1.186 203.1499 4.332 77.4 19 N-乙酰-L-色氨酸 N-Acetyltryptophan C13H14N2O3 [M-H]− 9.846 245.0946 −5.916 76.4 20 丙二酰色氨酸 Malonyltryptophan C14H14N2O5 [M+H]+ 9.835 291.0974 −0.824 74.7 21 N-乙酰谷氨酸 N-acetyl-DL-glutamic acid C7H11NO5 [M+H]+ 1.916 190.0682 14.679 73.1 22 N-乙酰精氨酸 N-Acetylarginine C8H16N4O3 [M+H]+ 1.322 217.1276 8.889 72.2 脂类 23 苯丙酮酸 Phenylpyruvic acid C9H8O3 [M-H]− 8.794 163.0391 7.973 90.2 24 硬脂酸 Stearic acid C18H36O2 [M-H]− 16.670 283.2611 10.979 72.8 25 甘磷酸胆碱 Sn-glycero-3-phospho
cholineC8H21NO6P [M]+ 1.189 258.1091 1.666 93.3 26 二阿魏酰甘油 Diferuloyl glycerol C23H24O9 [M-H]− 13.122 443.1331 3.701 75.1 27 溶血磷脂酰乙醇胺 16:0 Lyso-phosphatidylethanolamine16:0 C21H44NO7P [M+H]+ 16.674 454.2896 7.066 95 28 溶血磷脂酰胆碱 16:0 Lyso-phosphatidylcholine16:0 C24H50NO7P [M+H]+ 16.672 496.3319 16.843 77.2 29 溶血磷脂酰胆碱 18:2 Lyso-phosphatidylcholine18:2 C26H50NO7P [M+H]+ 16.666 520.3383 3.517 87.8 30 D-赤型鞘氨醇
（C17碱）C17-Sphinganine C17H37NO2 [M+H]+ 13.176 288.2872 8.672 96.9 31 植物鞘氨醇 Phytosphingosine C18H39NO3 [M+H]+ 13.067 318.2972 9.771 81.4 糖类 32 葡萄糖 Glucose C6H12O6 [M-C6H10O5-H]− 1.213 179.0555 3.351 64.9 33 鼠李糖 Rhamnose C6H12O5 [M+H]+ 1.354 187.0575 1.016 100 34 蔗糖 Sucrose C12H22O11 [M-H]− 1.241 341.1083 −0.997 97.5 35 异麦芽酮糖 Isomaltulose C12H22O11 [M+NH4]+ 1.248 360.1497 0.833 91.1 36 蜜二糖 Melibiose C12H22O11 [M+Na]+ 1.239 365.1013 11.367 88.7 37 麦芽糖 Maltose C12H22O11 [M+H]+ 1.245 343.1227 2.215 80.5 38 松三糖 Melezitose C18H32O16 [M+NH4]+ 1.245 522.1991 7.124 79.5 酚酸类 39 阿魏酸 Ferulic acid C10H10O4 [M+H]+ 6.757 195.0630 6.818 78.1 40 反式-阿魏酸 trans-Ferulic acid C10H10O4 [M+H-H2O]+ 11.517 177.0544 1.468 87.2 41 迷迭香酸 Rosmarinic acid C18H16O8 [M+H-C9H10O5]+ 6.311 163.0388 5.336 79.5 42 对香豆酸 p-Coumaric acid C9H8O3 [M+H]+ 4.715 165.0503 −9.331 74.1 43 反式-邻香豆酸 trans-ortho-Coumaric acid C9H8O3 [M+H]+ 2.045 165.0540 3.696 73.1 44 反式-4-香豆酸 trans-4-Coumaric acid C9H8O3 [M-H]− 9.469 163.0388 8.035 71.7 45 咖啡酸 Caffeic acid C9H8O4 [M-H]− 6.800 179.0339 6.032 71.3 黄酮类 46 山奈酚 Kaempferol C15H10O6 [M+H]+ 1.872 287.0469 0.314 99.5 47 矢车菊-3-芸香糖苷 Keracyanin C27H31O15 [M]+ 6.227 595.1624 4.822 90.9 48 12α-羟基
紫穗槐苷元Dalbinol C23H22O8 [M+H]+ 13.104 427.1383 1.124 65 49 大豆苷 Daidzin C21H20O9 [M+H]+ 7.480 439.0982 3.462 67.8 50 核黄素
（维生素B2）Riboflavin C17H20N4O6 [M+H]+ 7.175 377.1401 14.398 75.9 天然
维生素51 烟酰胺
（维生素B3）Nicotinamide C6H6N2O [M+H]+ 1.773 123.0541 16.822 83.9 52 维生素C Ascorbic acid C6H8O6 [M-H]− 1.343 175.0238 5.656 78.1 53 胆碱
（类似生物素质）Choline C5H14NO [M]+ 1.169 104.1069 0.864 79.7 酚胺类 54 阿魏酰腐胺 Feruloyl putrescine C14H20N2O3 [M+H]+ 5.685 265.1550 −1.282 85.5 55 咖啡酰腐胺 Caffeoyl putrescin C13H18N2O3 [M+H]+ 4.049 251.1378 7.167 82.1 56 二香豆酰亚精胺 Dicoumaroyl spermidine C25H31N3O4 [M+H]+ 9.565 438.2372 6.070 89.4 香豆
素类57 香豆素 Coumarin C9H6O2 [M+H]+ 9.463 147.0443 −1.972 85.2 58 大丁苷 Gerberinside C16H18O8 [M+H]+ 7.856 339.1052 6.222 70.1 生物碱 59 异红介藜芦碱 Isorubijervine C33H53NO7 [M+H]+ 11.335 576.3893 5.621 96.1 60 葫芦巴碱 Trigonelline C7H7NO2 [M+H]+ 1.226 138.0539 6.519 92.3 萜类 61 刺五加苷E Eleutheroside E C34H46O18 [M+FA-H]- 8.543 787.2637 3.722 86.5 62 松香酸 Abietic acid C20H30O2 [M-H2O-H]- 14.916 301.2155 6.208 65.9 ![]()
图 2 兰州百合植物化学成分聚类热图注：成分编号对应表2。Figure 2. Heatmap of identified phytochemicals in L. davidii var. unicolor2.2.1 氨基酸、多肽及其衍生物
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的氨基酸包括色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和缬氨酸5种必需氨基酸，酪氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和组氨酸7种非必需氨基酸，除常见的蛋白质氨基酸，本研究检出了1种非蛋白质氨基酸—正缬氨酸。百合属植物富含氨基酸，氨基酸的组成和含量影响其营养价值，已有研究证明兰州百合中含有色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和组氨酸等18种氨基酸[20]，由于本研究未对兰州百合鳞茎样品进行水解等靶向提取和测定，仅针对游离氨基酸，因此本研究检出其中12种氨基酸。徐瑾等[20]的研究结果表明精氨酸为兰州百合游离氨基酸中的主体，与本研究结果一致，在氨基酸类成分中No.7（精氨酸）的蓝色较深（图2），相对峰面积较大，表明其在游离氨基酸中含量较高。除此之外，No.9（谷氨酸）蓝色也相对较深（图2），王馨雨等[21]测定百合鳞茎氨基酸时发现谷氨酸含量较高，谷氨酸是鲜味氨基酸，作为风味物质的重要前体可能对兰州百合的风味产生影响。
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的氨基酸衍生物包含焦谷氨酸，N-甲基谷氨酸，N,N-二甲基精氨酸，N-乙酰-L-色氨酸，丙二酰色氨酸，N-乙酰谷氨酸和N-乙酰精氨酸7种。谷氨酸-亮氨酸（Glu-Leu）和谷胱甘肽为在兰州百合鳞茎样品中检出的2种小分子肽。兰州百合以甜味著名，其中含量最高的糖类为蔗糖，毕继才等[22]研究证实呈味肽谷胱甘肽可延长蔗糖产生的甜味在口腔中滞留时长，该呈味肽可能对兰州百合的独特甜味有一定贡献，还需要进一步研究。
非蛋白质氨基酸正缬氨酸和二肽Glu-Leu这2种成分之前未在兰州百合中报道（图3A~图3B）。正缬氨酸是缬氨酸的同分异构体，早期在枯草杆菌抗菌肽中发现，该类氨基酸无法在自然界动植物体内大量合成和生产。二肽Glu-Leu是谷酰基二肽的一员，已在奶酪和大豆等物质中检出[23]，具有抗炎、抗氧化以及调节葡萄糖代谢等功能[24]。
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图 3 兰州百合首次检出成分的镜像图及结构式（氨基酸类，脂类和糖类）Figure 3. Mirror image and structural formula of the first detected components (amino acids, lipids, and saccharides) in L. davidii var. unicolor2.2.2 油脂和磷脂
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的脂肪酸包括硬脂酸和苯丙酮酸2种，磷脂类成分溶血磷脂酰乙醇胺16:0，溶血磷脂酰胆碱16:0和溶血磷脂酰胆碱18:2共3种。百合鳞茎中含有油脂和磷脂类化合物，主要油脂和磷脂种类因品种不同而存在差异，已有报道兰州百合中存在硬脂酸等脂肪酸，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油和溶血磷脂酰胆碱等磷脂类成分[25]。在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的鞘脂类成分包括D-赤型鞘氨醇和植物鞘氨醇。在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的脂类成分合成前体为甘磷酸胆碱和二阿魏酰甘油。二阿魏酰甘油是一种酚酸甘油酯，已有报道在多种百合鳞茎中检出1,3-O-二阿魏酰基甘油和1,2-O-二阿魏酰基甘油[2]，该成分是百合鳞茎的药用成分之一。
磷脂酰乙醇胺、D-赤型鞘氨醇、植物鞘氨醇和甘磷酸胆碱这4种成分之前未在兰州百合中报道（图3C~图3F）。磷脂酰乙醇胺自然存在于动植物细胞中，具有抗菌和抗氧化活性，广泛应用于食品等行业[26]。鞘氨醇类成分在百合中研究较少，鞘脂类成分是生物膜的组成成分之一，参与葡萄糖代谢、免疫和皮肤屏障等生化过程。植物鞘氨醇被称为“液体软黄金”，可以直接激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，调节细胞色素C向细胞质的释放，从而诱导细胞凋亡，达到抗癌效果[27]。作为脑磷脂生物合成的前体物质，甘磷酸胆碱可以增加神经组织中胆碱的利用度，被证实显著影响认知功能，具有治疗阿尔兹海默症的效果[28]。
2.2.3 糖类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的糖类包括葡萄糖和鼠李糖2种单糖，蔗糖、异麦芽酮糖、蜜二糖和麦芽糖4种双糖，以及松三糖。蔗糖、葡萄糖是百合鳞茎中常见的糖类成分[29]，鼠李糖多以结合态的形式存在于百合鳞茎中[7]。现有研究已明确蔗糖是兰州百合中含量最高的糖类成分[29]，本研究的聚类热图结果也发现蔗糖在糖类成分中蓝色最深（图2，No.34）。异麦芽酮糖是一种存在于甘蔗汁和蜂蜜中的还原性双糖，是一种理想的功能性甜味剂[30−31]。蜜二糖由D-半乳糖和D-葡萄糖通过-1,6-键结合成的二糖，是一种还原糖。松三糖则为蜜露蜂蜜中的特征非还原三碳糖，目前多从落叶松、黄杉等树的汁液中萃取得到。
异麦芽酮糖、蜜二糖和松三糖这3种低丰度糖类之前还未在兰州百合中报道（图3G~图3I）。异麦芽酮糖作为一种低血糖生成指数成分，与葡萄糖相比，通过抑制内源性葡萄糖生成和增加内脏葡萄糖摄取，限制了2型糖尿病患者餐后高血糖[32]；异麦芽酮糖还能抑制蔗糖引起的蛀牙[33]。膳食中的蜜二糖被证实能够影响摄入抗原诱导的T辅助性细胞反应，从而减轻过敏性皮炎[34]。上述新发现的单糖和二糖等糖类组分本身具有甜味，可能会对兰州百合的独特甜味产生贡献。
2.2.4 酚酸类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的酚酸分别为阿魏酸，反式-阿魏酸，迷迭香酸，对香豆酸，反式-邻-香豆酸，反式-4-香豆酸和咖啡酸共7种。酚酸类成分是一种广泛存在于自然界的抗氧化植物化学成分，阿魏酸和对香豆酸分布在百合的种子、果实中[8,35]，杨英[36]从兰州百合鳞茎中检出反式-4-香豆酸，咖啡酸。自然界中，阿魏酸主要以反式的形式存在，从图2可以看出，No.40（反式-阿魏酸）呈现蓝色，No.39（阿魏酸）呈现橙色，佐证了兰州百合中的阿魏酸以反式为主存在。酚酸类成分与水果蔬菜的涩味和香味等密切相关，天然存在于食品中的酚酸类成分通常是苦味和涩味的来源[37]，而阿魏酸和对香豆酸的结合，通常产生酸味，不会导致苦味和涩味[38]。
迷迭香酸和反式-邻-香豆酸这2种成分之前未在兰州百合中报道（图4A~图4B）。迷迭香酸是一种天然水溶性的酚酸类组分，分布于紫草科等植物中，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌和抗血栓形成等[39]。反式-邻-香豆酸多从肉桂（Cinnamomi Cortex）甲醇提取物中分离得到的，对SARS-CoV和HIV等感染具有抑制作用[40]。
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图 4 兰州百合首次检出成分镜像图和分子结构式（酚酸类，黄酮类，香豆素类，酚胺类，生物碱类和萜类）Figure 4. Mirror image and structural formula of the first detected components (phenolic acids, flavonoids, coumarins, amide compounds, alkaloids, and terpene) in L. davidii var. unicolor2.2.5 黄酮类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的黄酮类成分包括山奈酚，矢车菊素-3-芸香糖苷，12α-羟基紫穗槐苷元（Dalbinol）和大豆苷4种。已有研究从兰州百合鳞茎中检出山奈酚[36]和花色苷矢车菊素-3-芸香糖苷[41]。
Dalbinol和大豆苷这2种成分之前未在兰州百合中报道（图4C~图4D）。Dalbinol是从紫穗槐中分离纯化的鱼藤酮类化合物[42]，具有很好的抗肿瘤前景，能显著下调肝癌细胞SMMC-7721中Dvl-2和β-catenin等的蛋白水平，阻碍了Wnt通路从而抑制了肝癌细胞增殖[43]。大豆苷目前多从豆科植物葛根中提取得到[44]，具有抗氧化，抗癌，抗动脉粥样硬化等活性[45]。
2.2.6 天然维生素
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的天然维生素包括核黄素（维生素B2）、烟酰胺（维生素B3）、维生素C以及胆碱这4种。已有研究对兰州百合等18种不同品种百合中维生素组成和含量进行分析，共检测出包括维生素B1、B2、B3、C和E等5种维生素[6]，Tang等[1]在百合鳞茎中检出胆碱。维生素是维持人体生命活动必需的微量有机小分子化合物，广泛存在于自然界的动植物体内。除了人体必需的维生素以外，还有一些成分在不同程度上具有类似维生素的生物学功能，会被列入复合B族维生素，被称为“类似生物素质”，胆碱能够促进脑发育并提高记忆力，调控细胞凋亡，在信息传递中具有重要作用。见图2，No.52（维生素C）与其他检出的天然维生素相比，呈现明显的蓝色，维生素C是兰州百合中主要存在的天然维生素，此结果与前人研究一致[6]。
2.2.7 香豆素类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的香豆素类化合物包括香豆素和大丁苷2种。香豆素是果蔬和咖啡等中天然存在的化学成分，香豆素与兰州百合的鳞茎休眠相关性较强[46]。
大丁苷之前未在兰州百合中报道（图4E）。大丁苷是大丁草甲醇提取物中含量较高的香豆素类成分，在动物体内可代谢转化成具有抑菌活性的成分，具有抗菌活性[47]。
2.2.8 酚胺类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的酚胺类成分包括阿魏酰腐胺，咖啡酰腐胺和二香豆酰亚精胺3种。酚胺在植物中广泛存在，通常作为生殖器官和种子中的主要酚类组成，在植物发育、防御等方面发挥作用[48]。
阿魏酰腐胺、咖啡酰腐胺和二香豆酰亚精胺等3种成分之前未在兰州百合中报道（图4F~图4H）。阿魏酰腐胺参与植物的生长、发育和生化过程，可能会影响兰州百合中植物化学成分的生物合成[49]。咖啡酰腐胺的积累可以减少食草动物对植物叶片的损害[50]。二香豆酰亚精胺主要存在于花粉粒中，作为花发育的信号因子在植物体内发挥作用[51]。
2.2.9 生物碱
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的生物碱类成分包括异红介藜芦碱和葫芦巴碱2种。生物碱是百合属植物发挥药用属性的植物化学成分，目前百合中该类成分的研究主要集中在药用百合的主要生物碱秋水仙碱，澳洲茄碱等成分的生物活性验证上[52]。
异红介藜芦碱和葫芦巴碱这2种成分之前未在兰州百合中报道（图4I~图4J）。异红介藜芦碱是一种来源于百合科植物藜芦（Veratrum album）的生物碱[53]，葫芦巴碱是存在于咖啡，豌豆，胡芦巴种子中有活性的生物碱[54]。异红介藜芦碱具有类固醇环形结构，与药用百合中常见成分澳洲茄胺相似[55]。胡芦巴碱通过减弱N-甲基-D-天冬氨酸受体的活性，增强海马体CA1区，具有类似抗抑郁药的作用[56]。
2.2.10 萜类和三萜皂苷类
在兰州百合鳞茎样品中鉴定出的萜类化合物为松香酸。萜类成分是百合药用活性以及苦味的来源，二萜主要分布在五加科、唇形科和茜草科等，三萜是构成植物皂苷、树脂的重要成分[57]。刺五加苷E是在兰州百合鳞茎中鉴定出的三萜皂苷类组分。
刺五加苷E和松香酸这2种成分之前未在兰州百合中报道（图4K~图4L）。刺五加苷E是刺五加根茎和根提取物中的主要化合物，已有研究表明其具有抗疲劳等药理作用[58]。松香酸是来源于Pimenta racemosa var. Grissea的二萜类化合物，具有抗肥胖和抗氧化等作用[59]。
3. 结论
采用基于UHPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学技术，利用MS-DIAL软件和R语言等组学数据处理工具，开展兰州百合植物化学成分的鉴定工作。在正负离子模式下共定性出62种植物化学成分，包括正缬氨酸、谷胱甘肽等22种氨基酸、多肽及其衍生物，溶血磷脂酰胆碱等9种油脂和磷脂类成分，鼠李糖、异麦芽酮糖等7种糖类成分，阿魏酸、咖啡酸等7种酚酸类成分，山奈酚等4种黄酮类成分，核黄素、维生素C等4种天然维生素类成分，阿魏酰腐胺等3种酚胺类成分，大丁苷等2种香豆素类成分，葫芦巴碱等2种生物碱类成分和刺五加苷E等三萜皂苷类成分。非蛋白质氨基酸正缬氨酸，二肽（Glu-Leu），磷脂酰乙醇胺、D-赤型鞘氨醇、植物鞘氨醇和甘磷酸胆碱4种脂类成分，异麦芽酮糖、蜜二糖和松三糖3种糖类成分，迷迭香酸和反式-邻-香豆酸2种酚酸类成分，12α-羟基紫穗槐苷元和大豆苷2种黄酮类成分，阿魏酰腐胺、二香豆酰亚精胺和咖啡酰腐胺3种酚胺类成分，香豆素类成分大丁苷，异红介藜芦碱和葫芦巴碱2种生物碱类成分，萜类成分松香酸和三萜皂苷类成分刺五加苷E，共21种组分之前未在兰州百合中报道。
本研究采用非靶向代谢组学方法，极大地提高了数据采集的通量，因此发现了前述21种目前尚未在兰州百合中被广泛报道的低丰度植物化学成分，针对上述成分，后续还需要进一步验证，如采用特异性吸附材料，对低丰度组分进行靶向富集，并进一步分离纯化，采用核磁等手段进行结果确证。同时，上述低丰度组分对兰州百合的品质及营养功能的贡献也有待深入研究。本研究对兰州百合中的植物化学成分进行鉴定分析，丰富了兰州百合植物化学成分的现有数据，体现了其成分构成的多样性，其中酚酸类、黄酮类、香豆素类、生物碱类以及萜类等植物化学成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效，可为兰州百合的后续研究与利用提供数据支撑，为其它特色蔬菜的品质分析与评价工作提供科学依据。
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图 1 五个主要产区兰州百合样本化合物峰的Upset图
注： A：正离子模式；B：负离子模式。
Figure 1. Upset graph of features in L. davidii var. unicolor from five major producing areas
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图 2 兰州百合植物化学成分聚类热图
注：成分编号对应表2。
Figure 2. Heatmap of identified phytochemicals in L. davidii var. unicolor
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图 3 兰州百合首次检出成分的镜像图及结构式（氨基酸类，脂类和糖类）
Figure 3. Mirror image and structural formula of the first detected components (amino acids, lipids, and saccharides) in L. davidii var. unicolor
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图 4 兰州百合首次检出成分镜像图和分子结构式（酚酸类，黄酮类，香豆素类，酚胺类，生物碱类和萜类）
Figure 4. Mirror image and structural formula of the first detected components (phenolic acids, flavonoids, coumarins, amide compounds, alkaloids, and terpene) in L. davidii var. unicolor
表 1 兰州百合样品信息
Table 1 Sample information of L. davidii var. unicolor
样品编号 产地 产地经纬度 样品生长年限 样品数 LZ-YZ 兰州市榆中县 E 104°6′45″、N 35°50′39″ 3年生 3家农户*3份样品 LZ-QLH 兰州市七里河区 E 103°47′9″、N 36°3′57″ 3年生 3家农户*3份样品 DX-LT 定西市临洮县 E 104°36′39″、N 35°34′45″ 3年生 3家农户*3份样品 DX-WY 定西市渭源县 E 104°12′54″、N 35°8′10″ 3年生 3家农户*3份样品 LX-YJ 临夏市永靖县 E 103°12′39″，N 35°36′4″ 3年生 3家农户*3份样品 
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表 2 兰州百合植物化学成分定性信息
Table 2 Detailed qualitative information of phytochemicals in L. davidii var. unicolor
种类 No. 化合物
中文名称化合物
英文名称化学式 加和
离子平均保留
时间（min）质荷比 质量偏差
（ppm）MSDIAL
总得分1 色氨酸 Tryptophan C11H12N2O2 [M+H]+ 5.098 205.0959 4.681 98.2 2 苯丙氨酸 Phenylalanine C9H11NO2 [M+H]+ 3.497 166.0856 4.034 93.9 氨基酸
及其
衍生物3 赖氨酸 Lysine C6H14N2O2 [M+H]+ 1.061 147.1122 4.079 92.1 4 缬氨酸 Valine C5H11NO2 [M+H]+ 1.774 118.0866 −2.795 90.4 5 异亮氨酸 Isoleucine C6H13NO2 [M+H]+ 2.268 132.1015 3.104 90.2 6 酪氨酸 Tyrosine C18H32O7 [M+H]+ 2.044 182.0813 2.746 98.9 7 精氨酸 Arginine C6H14N4O2 [M+H]+ 1.462 175.1184 2.969 93 8 谷氨酰胺 Glutamine C5H10N2O3 [M+H]+ 1.191 147.0752 8.431 90.8 9 谷氨酸 Glutamic acid C5H9NO4 [M+H]+ 1.200 148.0589 7.767 90.4 10 脯氨酸 Proline C5H9NO2 [M+H]+ 1.080 116.0696 8.702 86 11 天冬氨酸 Aspartic acid C4H7NO4 [M-H]− 1.179 132.0303 −9.316 84.2 12 组氨酸 Histidine C6H9N3O2 [M-H]− 1.094 154.0622 −5.387 77.9 13 正缬氨酸 Norvaline C5H11NO2 [M+H]+ 3.496 118.0652 −8.046 99.6 14 谷氨酸-亮氨酸 Gamma-glutamylleucine C11H20N2O5 [M+H]+ 5.263 261.1436 4.174 85.3 15 谷胱甘肽 Glutathione C10H17N3O6S [M+H]+ 1.329 308.0900 3.635 94.2 16 焦谷氨酸 Pyroglutamic acid C5H7NO3 [M+H]+ 1.184 130.0493 4.306 91.2 17 N-甲基谷氨酸 N-Methylglutamic acid C6H11NO4 [M+H]+ 1.317 162.0766 −3.085 88.8 18 N,N-二甲基精氨酸 N,N-Dimethylarginine C8H18N4O2 [M+H]+ 1.186 203.1499 4.332 77.4 19 N-乙酰-L-色氨酸 N-Acetyltryptophan C13H14N2O3 [M-H]− 9.846 245.0946 −5.916 76.4 20 丙二酰色氨酸 Malonyltryptophan C14H14N2O5 [M+H]+ 9.835 291.0974 −0.824 74.7 21 N-乙酰谷氨酸 N-acetyl-DL-glutamic acid C7H11NO5 [M+H]+ 1.916 190.0682 14.679 73.1 22 N-乙酰精氨酸 N-Acetylarginine C8H16N4O3 [M+H]+ 1.322 217.1276 8.889 72.2 脂类 23 苯丙酮酸 Phenylpyruvic acid C9H8O3 [M-H]− 8.794 163.0391 7.973 90.2 24 硬脂酸 Stearic acid C18H36O2 [M-H]− 16.670 283.2611 10.979 72.8 25 甘磷酸胆碱 Sn-glycero-3-phospho
cholineC8H21NO6P [M]+ 1.189 258.1091 1.666 93.3 26 二阿魏酰甘油 Diferuloyl glycerol C23H24O9 [M-H]− 13.122 443.1331 3.701 75.1 27 溶血磷脂酰乙醇胺 16:0 Lyso-phosphatidylethanolamine16:0 C21H44NO7P [M+H]+ 16.674 454.2896 7.066 95 28 溶血磷脂酰胆碱 16:0 Lyso-phosphatidylcholine16:0 C24H50NO7P [M+H]+ 16.672 496.3319 16.843 77.2 29 溶血磷脂酰胆碱 18:2 Lyso-phosphatidylcholine18:2 C26H50NO7P [M+H]+ 16.666 520.3383 3.517 87.8 30 D-赤型鞘氨醇
（C17碱）C17-Sphinganine C17H37NO2 [M+H]+ 13.176 288.2872 8.672 96.9 31 植物鞘氨醇 Phytosphingosine C18H39NO3 [M+H]+ 13.067 318.2972 9.771 81.4 糖类 32 葡萄糖 Glucose C6H12O6 [M-C6H10O5-H]− 1.213 179.0555 3.351 64.9 33 鼠李糖 Rhamnose C6H12O5 [M+H]+ 1.354 187.0575 1.016 100 34 蔗糖 Sucrose C12H22O11 [M-H]− 1.241 341.1083 −0.997 97.5 35 异麦芽酮糖 Isomaltulose C12H22O11 [M+NH4]+ 1.248 360.1497 0.833 91.1 36 蜜二糖 Melibiose C12H22O11 [M+Na]+ 1.239 365.1013 11.367 88.7 37 麦芽糖 Maltose C12H22O11 [M+H]+ 1.245 343.1227 2.215 80.5 38 松三糖 Melezitose C18H32O16 [M+NH4]+ 1.245 522.1991 7.124 79.5 酚酸类 39 阿魏酸 Ferulic acid C10H10O4 [M+H]+ 6.757 195.0630 6.818 78.1 40 反式-阿魏酸 trans-Ferulic acid C10H10O4 [M+H-H2O]+ 11.517 177.0544 1.468 87.2 41 迷迭香酸 Rosmarinic acid C18H16O8 [M+H-C9H10O5]+ 6.311 163.0388 5.336 79.5 42 对香豆酸 p-Coumaric acid C9H8O3 [M+H]+ 4.715 165.0503 −9.331 74.1 43 反式-邻香豆酸 trans-ortho-Coumaric acid C9H8O3 [M+H]+ 2.045 165.0540 3.696 73.1 44 反式-4-香豆酸 trans-4-Coumaric acid C9H8O3 [M-H]− 9.469 163.0388 8.035 71.7 45 咖啡酸 Caffeic acid C9H8O4 [M-H]− 6.800 179.0339 6.032 71.3 黄酮类 46 山奈酚 Kaempferol C15H10O6 [M+H]+ 1.872 287.0469 0.314 99.5 47 矢车菊-3-芸香糖苷 Keracyanin C27H31O15 [M]+ 6.227 595.1624 4.822 90.9 48 12α-羟基
紫穗槐苷元Dalbinol C23H22O8 [M+H]+ 13.104 427.1383 1.124 65 49 大豆苷 Daidzin C21H20O9 [M+H]+ 7.480 439.0982 3.462 67.8 50 核黄素
（维生素B2）Riboflavin C17H20N4O6 [M+H]+ 7.175 377.1401 14.398 75.9 天然
维生素51 烟酰胺
（维生素B3）Nicotinamide C6H6N2O [M+H]+ 1.773 123.0541 16.822 83.9 52 维生素C Ascorbic acid C6H8O6 [M-H]− 1.343 175.0238 5.656 78.1 53 胆碱
（类似生物素质）Choline C5H14NO [M]+ 1.169 104.1069 0.864 79.7 酚胺类 54 阿魏酰腐胺 Feruloyl putrescine C14H20N2O3 [M+H]+ 5.685 265.1550 −1.282 85.5 55 咖啡酰腐胺 Caffeoyl putrescin C13H18N2O3 [M+H]+ 4.049 251.1378 7.167 82.1 56 二香豆酰亚精胺 Dicoumaroyl spermidine C25H31N3O4 [M+H]+ 9.565 438.2372 6.070 89.4 香豆
素类57 香豆素 Coumarin C9H6O2 [M+H]+ 9.463 147.0443 −1.972 85.2 58 大丁苷 Gerberinside C16H18O8 [M+H]+ 7.856 339.1052 6.222 70.1 生物碱 59 异红介藜芦碱 Isorubijervine C33H53NO7 [M+H]+ 11.335 576.3893 5.621 96.1 60 葫芦巴碱 Trigonelline C7H7NO2 [M+H]+ 1.226 138.0539 6.519 92.3 萜类 61 刺五加苷E Eleutheroside E C34H46O18 [M+FA-H]- 8.543 787.2637 3.722 86.5 62 松香酸 Abietic acid C20H30O2 [M-H2O-H]- 14.916 301.2155 6.208 65.9
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