Antibacterial Mechanism of Cinnamon Essential Oil Nanoemulsion against Pseudomonas deceptionensis CM2 Based on Non-targeted Metabolomics
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摘要: 目的：利用非靶向代谢组学技术研究肉桂精油纳米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）抑制假单胞菌CM2（Pseudomonas deceptionensis CM2）的作用机制。方法：P. deceptionensis CM2经CON处理4 h后，采用液相色谱-质谱分析技术鉴定差异代谢物，并分析差异代谢物的数量、种类及其在代谢通路中的调控表达。结果：采用二倍稀释法测得CON对P. deceptionensis CM2的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）为0.125 μL/mL。多元统计分析表明，经1×MIC的CON处理4 h后， P. deceptionensis CM2的代谢特征存在显著差异；P. deceptionensis CM2细胞共出现380种差异代谢物，主要包括杂环化合物、芳香族化合物、脂类、有机酸等，其中309种差异代谢物含量显著升高（P<0.05），71种差异代谢物含量显著下降（P<0.05）；这些差异代谢产物共参与13条代谢通路，主要涉及氨基酸、嘌呤、氨基糖、嘧啶等物质的代谢。结论：CON抑制P. deceptionensis CM2可能与其抑制氨基酸合成和能量代谢等代谢通路有关。本研究为CON在食品保鲜领域的应用提供了理论依据。Abstract: Objective: To investigate the underlying mechanism of cinnamon essential oil nanoemulsion (CON)-induced inactivation of Pseudomonas deceptionensis CM2 with the non-targeted metabolomics approaches. Methods: P. deceptionensis CM2 was treated with CON for 4 h, and the differential metabolites were identified by liquid chromatography-mass spectrometry combined. The number and type of differential compounds and their regulatory expression in metabolic pathways were also analyzed. Results: The minimum inhibitory concentration (MIC) of CON against P. deceptionensis CM2 was 0.125 μL/mL. Multivariate statistical analysis showed that there were significant differences in the metabolic profiles of P. deceptionensis CM2 after exposure to CON at 1×MIC for 4 h. For P. deceptionensis CM2 cells treated with CON at 1×MIC for 4 h, a total of 380 differential metabolites were identified, mainly including heterocyclic compounds, aromatic compounds, lipids, organic acids, etc. Among these differential metabolites, 309 metabolites were significantly up-regulated (P<0.05), and 71 metabolites were significantly down-regulated (P<0.05). These differential metabolites were mapped onto 13 metabolic pathways, mainly including the metabolism of amino acids, purine, amino sugar, pyrimidine, etc. Conclusion: CON might inactivate P. deceptionensis CM2 by affecting some metabolic pathways, such as amino acids biosynthesis and energy metabolism. This study would provide a theoretical basis for the application of CON in food preservation.
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植物精油（essential oil，EOs）是从植物的根、茎、叶、花、果实等部分提取的含有挥发性芳香物质的浓缩亲脂液体[1]。常见的植物精油包括肉桂精油、迷迭香精油、牛至精油、丁香精油和孜然精油等[2-3]。近年来，EOs在食品抗菌保鲜中的应用受到了广泛关注[4]，但其存在挥发性强、水溶性差等缺点，制约了其在食品保鲜领域的应用[5]。研究证实，纳米乳化技术能够有效提高EOs的水溶性及稳定性[6]。目前，关于EOs纳米乳的研究多集中于制备优化和抑菌活性评价等方面[7-8]，但其代谢组水平上的抗菌机制研究尚不充分。
代谢组学是对某一生物、组织或细胞中的所有低分子量代谢产物进行定性与定量分析的一门科学。代谢组学以指标分析为基础，高通量检测为手段，通过研究生物体内代谢物的种类与数量及其变化规律来阐述机体在正常生命状态及环境变化后的代谢过程，从而揭示生物体内的生命现象及其内在规律[9]。近年来，代谢组学被广泛应用于不同抗菌剂作用机制等方面的研究[10-12]。例如，Li等[11]发现，经终浓度为150 mg/L的丁香酚纳米乳处理48 h后，意大利青霉菌（Penicillium italicum）有34种代谢物下调；研究发现，丁香酚纳米乳干扰了P. italicum的三羧酸循环、脂质代谢和蛋白质合成等途径。经终浓度为1.5 μL/mL的芳樟醇处理2 h后，腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）出现170种差异代谢物，其中上调81种，下调89种；代谢通路分析表明，芳樟醇干扰了S. putrefaciens的三羧酸循环、糖酵解途径、氨基酸代谢、泛酸和辅酶A合成等代谢途径[12]。
肉桂精油提取自肉桂皮、肉桂叶等，来源广泛、安全环保、具有良好的抗菌和抗氧化特性[13]。前期研究表明，肉桂精油纳米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）对肉源假单胞菌腐CM2（Pseudomonas deceptionensis CM2）具有较强的抑菌效果，但相关作用机制尚不明确[14]。因此，本研究采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱联用技术（ultrahigh-performance liquid chromatograph Q extractive mass spectrometry，UHPLC-QE-MS）对CON处理组P. deceptionensis CM2胞内代谢产物进行分离和检测，结合多元统计分析确定差异代谢产物种类，通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对差异代谢物质进行通路富集分析，系统揭示CON抑制P. deceptionensis CM2的作用机制，以期为CON在食品安全控制领域中的应用提供科学理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
P. deceptionensis CM2菌株 由本实验室分离自腐败鸡肉；壳聚糖、果胶、肉桂精油 上海源叶生物科技有限公司；营养琼脂（nutrient agar，NA）、营养肉汤（nutrient broth，NB） 北京路桥技术有限责任公司；Tween 80、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和冰乙酸 北京索莱宝科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈 美国Thermo Fisher Scientific公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒创生物科技有限公司。
5424R型低温高速离心机 德国Eppendorf公司；LD2M-60KCS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SHP-250型生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；VC750型超声波破碎仪 美国Sonic公司；UltraturraxT25型高速分散器 德国IKA公司；THZ-103B型恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；Tecan Spark 20 M型多功能微孔板读数仪 瑞士Tecan公司；QE plus型高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；ACQUITY UPLC I-Class plus型色谱柱 美国Waters公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌悬液制备
用无菌接种环挑取活力旺盛的P. deceptionensis CM2单菌落接种于NB培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床中恒温振荡培养12 h。取25 mL培养物于50 mL离心管，离心（4 ℃，8000×g，10 min）收集菌体。用无菌NaCl溶液（0.85%，w/v）洗涤菌体2次，离心同上。将所得菌体重悬于浓度为0.01 mol/L的无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）并混匀，调整菌悬液的OD600值于1.2~1.3之间，制成活菌数约为8 lg CFU/mL的菌悬液备用。
1.2.2 CON制备
参考He等[15]的方法制备CON。称取0.6 g壳聚糖粉末溶于100 mL乙酸溶液（0.5%，v/v），室温下磁力搅拌（450 r/min，2 h）得到壳聚糖溶液（0.6%，w/v）。称取1.0 g的果胶粉末溶于100 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌2 h得到果胶溶液（1%，w/v）。将壳聚糖和果胶溶液1:1（v/v）混合，作为乳液基质，然后将肉桂精油加入基质溶液中，再加入吐温80作为乳化剂，吐温80与精油的比例为1:4（v/v），磁力搅拌20 min至分散均匀。然后用高速均质机在10000 r/min条件下均质2 min，形成粗乳液。通过功率为450 W的超声波设备处理7.5 min，进一步均质乳化即得CON，于4 ℃冷藏备用。
1.2.3 MIC和MBC测定
采用二倍稀释法测定CON的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）[16]。在96孔细胞培养板的前三排每孔各加入100 μL NB培养基，然后在每排第一孔中加入100 μL CON（稀释至肉桂精油浓度为8 μL/mL），用移液器吹打混匀后吸取100 μL混合溶液置于第二孔中，照此添加至第六孔，吸取第六孔中100 μL混合溶液弃去，然后在每孔中加入100 μL浓度约为8 lg CFU/mL的菌悬液，此时每孔CON中的肉桂精油浓度从左至右依次为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125和0.063 μL/mL。将96孔细胞培养板置于37 ℃培养24 h，通过多功能微孔板读数仪观察供试菌的生长情况，以完全没有微生物生长的最低的肉桂精油浓度作为MIC。在测得MIC的基础上，吸取100 μL上述无微生物生长孔中的液体培养基涂布于平板上，置于37 ℃培养24 h，以平板上无菌落生长的最低的肉桂精油浓度作为MBC。
1.2.4 CON处理
P. deceptionensis CM2菌悬液经终浓度为1×MIC的CON处理4 h后，于4 ℃、10000×g离心5 min，对照组用无菌水处理，收集细菌沉淀。菌体经PBS（4 ℃预冷）洗涤3次后，采用液氮进行冻存处理。
1.2.5 胞内代谢物的提取和制备
参考周继福等[17]的方法并适当改进。用1 mL甲醇溶液（−20 ℃预冷，80%，v/v）将样本转移到玻璃样品瓶中，加入200 μL氯仿并混匀，采用冰浴超声破碎3 min（功率为500 W）并全部转移至1.5 mL离心管，加入20 μL浓度为0.06 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸溶液作为内标；经冰浴超声提取20 min并于−40 ℃静置30 min后，于4 ℃、13000 r/min离心10 min；吸取800 μL上清液装入LC-MS进样瓶中挥干，加入300 μL甲醇溶液（20%，v/v）复溶并于−20 ℃下静置2 h，离心同上，吸取150 μL上清液，经0.22 μm有机相针孔过滤器过滤后，保存至−80 ℃冰箱备用。将对照组和1×MIC处理组样品提取液进行等体积混合作为质控样本（quality control，QC）。
1.2.6 液相色谱-质谱分析
采用ACQUITY UPLC I-Class plus超高效液相串联QE plus高分辨质谱仪组成的液质联用系统进行分析。
1.2.6.1 色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温为45 ℃；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸）；流速为0.35 mL/min；进样体积为2 μL。梯度洗脱程序为[18]：0～2.0 min，95% A；2.0～4.0 min，95%～70% A；4.0～8.0 min，70%～50% A；8.0～10.0 min，50%～20% A；10.0～14.0 min，20%～0% A；14.0～15.0 min，100% B；15.0～16.0 min，95% A。
1.2.6.2 质谱条件
采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）的QE Plus质谱仪分别在正负离子电离模式下采集数据[19]。正离子和负离子模式下的喷雾电压分别为3800和−3000 V；毛细管温度为320 ℃，辅助气加热器温度为350 ℃；正负离子的鞘气流速分别为40和35 arb，辅助气流速分别为10和8 arb；S-lens RF电压为50 V；质谱扫描范围为100～1200 m/z，一级扫描分辨率为70000 FWHM，二级扫描分辨率为17500 FWHM；归一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）和分步碰撞能量（stepped NCE）为10、20和40 eV。
1.2.6.3 质控样品监测
为了评价在上机过程中分析系统的稳定性，在待测样本进样前、中、后上机检测QC样品。可通过QC样本的重复性以考察整个分析过程中仪器稳定性，保证结果的可靠性[20]。
1.3 数据处理
每组样品做4次生物学平行试验；使用 SPSS 24.0 软件进行统计分析，采用t检验进行变量统计分析。
1.3.1 UPLC-MS原始数据预处理
将原始UPLC-MS/MS数据导入Progenesis QI v2.3软件（Nonlinear Dynamics, Newcastle，UK）进行基线过滤、积分、保留时间校正、峰识别、峰对齐和归一化等工作。采用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）及OPLS-DA置换检验区分处理组和对照组代谢轮廓的总体差异。
1.3.2 差异代谢物鉴定
使用欧易生物云平台（https://cloud.oebiotech.com/task/）配合使用人类代谢组数据库（The Human Metabolome Database, HMDB）、脂质图谱（Lipidmaps）（v2.3）和EMDB2.0等数据库注释Progenesis QI v2.3数据处理后的峰来进行差异代谢物的鉴定。基于其分析结果可得到变量权重值（variable importance in projection，VIP）>1的代谢物。最后，通过差异倍数（fold change，FC）分析得到不同处理间代谢物的变化倍数。CON处理组与对照组之间的差异代谢物筛选标准为VIP>1、t检验的P<0.05且|log2FC|>0。
1.3.3 代谢通路分析
通过MetaboAnalyst 4.0在线数据处理软件（http://www.metaboanalyst.ca）结合KEGG数据库（https://www.kegg.jp/kegg/）等进行代谢通路分析。
2. 结果与分析
2.1 CON抗菌活性分析
采用二倍稀释法测得CON抑制P. deceptionensis CM2的MIC为0.125 μL/mL，MBC为0.250 μL/mL。在后续的实验中，选用经终浓度为1×MIC的CON处理4 h后的P. deceptionensis CM2进行代谢组学分析。
2.2 多元统计分析结果
2.2.1 PCA结果
PCA是一种非监督分析，能够反应数据的原始情况，有利于了解数据的整体情况并从整体上进行把握。对代谢物进行主成分分析，可从总体反映样本组间和组内的变异度，观察样本间的总体分布趋势，判断可能存在的离散点[21]。采用PCA评价对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2细胞样本的变异度，观察不同处理组样本之间的整体趋势分布，结果见图1。
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图 1 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的主成分分析Figure 1. Principal component analysis of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells由图1可知，所有样本均处于95%置信区间（图1中椭圆形区域）内，各组样本之间有明显的分离趋势，组内样本较为紧密；PC1得分为56.4%，PC2得分为15.6%。模型解释率（R2X）是判别PCA模型质量好坏的主要参数，该值代表降维后的数据对原始数据的解释率，该值越接近1越理想，一般认为R2X大于0.5说明模型效果较好[22]。经计算，对照组和CON处理组的R2X为0.797，表明上述模型拟合效果良好。以上结果表明，对照组和肉桂精油纳米乳处理组样本在PCA得分图上区分明显，组内样本彼此靠近，且PCA模型稳定可靠。
2.2.2 PLS-DA结果
PLS-DA是一种有监督的判别统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，来实现对样品类别的预测[23]。PLS-DA加入分组变量，可弥补PCA方法的不足。采用PLS-DA模型进行对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2细胞样本进行有监督的统计分析，结果见图2。
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图 2 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的PLS-DA得分图Figure 2. PLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells由图2可知，对照组和CON处理组的样本点距离较远并有明显的聚集趋势，表明两组样品在代谢轮廓上存在明显差异且样本全部处于95%置信区间。PLS-DA的拟合参数包括R2X、解释率R2Y和预测率Q2。计算结果表明，PLS-DA正负离子模式的R2X为0.851，R2Y为1，Q2为0.995。上述3个模型参数指标均接近1，表明此模型拟合效果良好，具有很强的解释和预测能力，能有效区分对照组和CON处理组样品。
2.2.3 OPLS-DA结果
相对于PLS-DA，OPLS-DA模型的解析能力和有效性更高[24]。进一步采用OPLS-DA模型对各组P. deceptionensis CM2细胞样本差异代谢物进行有监督的统计分析，OPLS-DA得分结果见图3。
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图 3 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的OPLS-DA得分图Figure 3. OPLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells由图3可知，对照组和CON处理组的样本点距离较远，并有明显的聚集趋势，说明两组样品在代谢轮廓上存在差异。一般认为，当R2和Q2越接近1时，模型越稳定可靠[25]。经计算，OPLS-DA中R2X为0.851，表明上述模型拟合效果良好；R2Y为1，表明此模型的解释率高；Q2为0.993，表明此模型的预测能力很高。为验证建立的OPLS-DA模型的预测能力和解释能力，选择置换检验进行验证，对OPLS-DA模型的数据进行随机200次响应排序检验，以置换检验的置换保留度为横坐标，R2或Q2值为纵坐标，得到的置换检验结果见图4。
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图 4 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的OPLS-DA模型置换检验Figure 4. Permutation test of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells using OPLS-DA model由图4可知，OPLS-DA模型的R2为0.923，Q2为−0.014，表明OPLS-DA模型符合样本数据的真实情况，没有出现“过拟合”现象。以上结果说明OPLS-DA模型具备很强的解释和预测能力，可以用来区分对照组和CON处理组样品，结果可用于后续的差异代谢物分析。
2.3 差异代谢物分析
OPLS-DA模型中的VIP反映了每种代谢物在不同组之间相互关联的显著性，以区分对照组和处理组，代谢物VIP值越高表明对区分的贡献越大[26]。本研究以OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1、FC>1.0且P<0.05为条件对差异代谢产物进行筛选，并绘制火山图，结果见图5。
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图 5 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2的差异代谢产物火山图注：红色圆点表示显著上调的代谢产物；蓝色圆点表示显著下调的代谢产物；灰色圆点表示差异不显著的代谢产物。Figure 5. Volcano plot for the differential metabolites between the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells结果表明，与对照组细胞相比，经终浓度为1×MIC的CON处理4 h后，在P. deceptionensis CM2细胞共检测到380种差异性代谢物，主要包括杂环化合物、芳香族化合物、脂类和类脂质分子、有机酸及其衍生物、核苷酸、苯丙类和聚酮类化合物等；含量显著升高的差异性代谢物有309种，主要包括2-苯乙醇、尿嘧啶、L-天冬酰胺、D-脯氨酸和四磷酸二鸟苷等；含量显著降低的差异代谢物有71种，主要包括L-缬氨酸、柠檬酸、N-乙酰鸟氨酸、烟酰胺和氧化型谷胱甘肽等。Chen等[27]发现，经终浓度为0.4 mg/mL的肉桂精油处理6 h后，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有74种代谢物存在显著差异，主要包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂类等，其中上调29种，下调45种。
2.4 代谢通路富集分析结果
为确定P. deceptionensis CM2经CON处理后发生变化的相关代谢通路，基于KEGG数据库结合Metaboanalyst软件对定性的差异化合物进行代谢通路富集分析[28]。结果表明，对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2差异表达代谢物中显著富集的代谢通路共有49条，其中前20条代谢通路见图6。
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图 6 TOP-20代谢通路富集图注：图中红线和蓝线表示的P值分别为0.01和0.05；P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。Figure 6. TOP-20 enrichment of metabolic pathways由图6可知，共有13条代谢通路条柱高于蓝线，表明与对照组相比，经浓度为1×MIC的CON处理4 h后，P. deceptionensis CM2细胞有13条代谢通路具有显著性差异。与对照组相比，CON处理组细胞发生变化的代谢通路主要涉及氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸等）代谢、嘌呤代谢、氨基糖代谢、嘧啶代谢等。Li等[29]也得到了类似的结果，经1.5 mL/L的芳樟醇处理2 h后，莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）发生显著性变化的代通路主要涉及丙酮酸代谢、戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、甘油磷脂代谢、泛酸和辅酶A生物合成等。
如表1所示，经终浓度为1×MIC的CON处理4 h后，P. deceptionensis CM2细胞有13条代谢通路发生显著变化。在表1中，代谢通路的P值反映了其富集的显著性。筛选显著性富集通路；以富集因子（rich factor）为横坐标，差异代谢通路名称为纵坐标，绘制气泡图，结果见图7。
表 1 代谢通路富集结果Table 1. Enrichment of metabolic pathways通路名称 该通路的差异
代谢物数量所有通路的差异
代谢物数量该通路中属于模式
物种的代谢物总数所有通路中属于模式
物种的代谢物总数富集因子 P值 氨基糖和核苷酸糖的代谢 9 58 108 3164 0.0833 0.0001 嘧啶代谢 6 58 65 3164 0.0923 0.0010 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 4 58 28 3164 0.1429 0.0015 泛酸和辅酶A代谢 4 58 30 3164 0.1333 0.0020 磷酸转移酶 5 58 50 3164 0.1000 0.0020 氧化磷酸化 3 58 16 3164 0.1875 0.0028 嘌呤代谢 6 58 95 3164 0.0632 0.0072 氰基氨基酸代谢 4 58 45 3164 0.0889 0.0087 抗坏血酸和醛糖代谢 4 58 50 3164 0.0800 0.0125 氨酰-tRNA生物合成 4 58 52 3164 0.0769 0.0143 甘油磷脂代谢 4 58 52 3164 0.0769 0.0143 果糖和甘露糖代谢 4 58 54 3164 0.0741 0.0163 β-丙氨酸代谢 3 58 32 3164 0.0938 0.0199 在图7中，富集因子反映了代谢通路的富集程度；每个气泡代表一个代谢途径；气泡越大，表示富集到该通路上的代谢物数目越多。由图7可知，以富集因子>0.1和P<0.05为差异代谢通路筛选条件，筛选出4条差异代谢通路，分别为：a.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢；b.泛酸和辅酶A生物合成；c.磷酸转移酶系统；d.氧化磷酸化代谢。上述4条代谢途径均与氨基酸代谢和ATP合成有关。氨基酸代谢在维持细胞生命活动方面具有重要作用[30]。泛酸是CoA生物合成的关键前体，CoA是一种重要的辅助因子，参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量的代谢，包括TCA循环和氧化磷酸化[31]。以上结果表明CON处理可能通过抑制胞内氨基酸和能量代谢而导致P. deceptionensis CM2死亡。
2.5 差异代谢物的代谢通路分析结果
通过KEGG pathway mapper功能对差异代谢通路进行分析，结果见图8。
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图 8 CON处理后P. deceptionensis CM2细胞代谢通路变化注：红色圆圈代表经CON处理后含量升高的代谢物；蓝色圆圈代表经CON处理后含量下降的代谢物。Figure 8. Changes in the metabolic pathways of CON-treated P. deceptionensis CM2 cells由图8可知，细胞的碳水化合物代谢途径包括糖酵解途径和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环），在细胞能量代谢等生理活动中具有重要作用[32]。TCA循环是细胞能量生产的代谢枢纽。由图8可知，泛酸、柠檬酸、L-天冬氨酸、L-天门冬酰胺和L-缬氨酸等关键代谢物显著下调，表明CON处理抑制了P. deceptionensis CM2的氨基酸和ATP合成，进而导致能量生产无法正常进行，最终导致细胞死亡。
3. 讨论与结论
与对照组相比，经终浓度为1×MIC的CON处理4 h后，P. deceptionensis CM2细胞共出现380种差异性代谢物，主要包括杂环化合物、芳香族化合物、脂类和类脂质分子、有机酸及其衍生物、核苷酸、苯丙类和聚酮类等；共富集到13条差异显著的代谢通路，涉及氨基酸、嘌呤、氨基糖和嘧啶等物质代谢，表明CON失活P. deceptionensis CM2可能与其抑制内氨基酸的合成和能量代谢等生理活动有关。在今后的研究中，应综合运用蛋白质组学、转录组学等方法进一步阐明CON失活P. deceptionensis CM2的作用机制。此外，还应系统评价CON处理对食品表面微生物的杀灭效果及对食品营养、感官品质及货架期等指标的影响，探究脂质、蛋白质等食品组分对CON杀菌效果的影响及作用机制。
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图 1 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的主成分分析
Figure 1. Principal component analysis of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells
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图 2 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的PLS-DA得分图
Figure 2. PLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells
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图 3 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的OPLS-DA得分图
Figure 3. OPLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells
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图 4 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2代谢物的OPLS-DA模型置换检验
Figure 4. Permutation test of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells using OPLS-DA model
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图 5 对照组和CON处理组P. deceptionensis CM2的差异代谢产物火山图
注：红色圆点表示显著上调的代谢产物；蓝色圆点表示显著下调的代谢产物；灰色圆点表示差异不显著的代谢产物。
Figure 5. Volcano plot for the differential metabolites between the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells
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图 6 TOP-20代谢通路富集图
注：图中红线和蓝线表示的P值分别为0.01和0.05；P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。
Figure 6. TOP-20 enrichment of metabolic pathways
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图 8 CON处理后P. deceptionensis CM2细胞代谢通路变化
注：红色圆圈代表经CON处理后含量升高的代谢物；蓝色圆圈代表经CON处理后含量下降的代谢物。
Figure 8. Changes in the metabolic pathways of CON-treated P. deceptionensis CM2 cells
表 1 代谢通路富集结果
Table 1 Enrichment of metabolic pathways
通路名称 该通路的差异
代谢物数量所有通路的差异
代谢物数量该通路中属于模式
物种的代谢物总数所有通路中属于模式
物种的代谢物总数富集因子 P值 氨基糖和核苷酸糖的代谢 9 58 108 3164 0.0833 0.0001 嘧啶代谢 6 58 65 3164 0.0923 0.0010 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 4 58 28 3164 0.1429 0.0015 泛酸和辅酶A代谢 4 58 30 3164 0.1333 0.0020 磷酸转移酶 5 58 50 3164 0.1000 0.0020 氧化磷酸化 3 58 16 3164 0.1875 0.0028 嘌呤代谢 6 58 95 3164 0.0632 0.0072 氰基氨基酸代谢 4 58 45 3164 0.0889 0.0087 抗坏血酸和醛糖代谢 4 58 50 3164 0.0800 0.0125 氨酰-tRNA生物合成 4 58 52 3164 0.0769 0.0143 甘油磷脂代谢 4 58 52 3164 0.0769 0.0143 果糖和甘露糖代谢 4 58 54 3164 0.0741 0.0163 β-丙氨酸代谢 3 58 32 3164 0.0938 0.0199 
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