Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Black Corn Kernel by Response Surface Method and Analysis of Its Antioxidant Activity
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摘要: 为探究黑玉米粒多糖的最佳提取工艺及其体外抗氧化活性。本研究以黑玉米粒为原材料，采用超声辅助法提取黑玉米粒多糖，探究超声功率、料液比、提取时间、提取温度、提取次数对黑玉米粒多糖得率的影响，在此基础上结合响应面法优化黑玉米粒多糖提取工艺，并通过测定DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率来评价黑玉米粒多糖的体外抗氧化能力。结果表明，在料液比1:20（g/mL）、提取温度74 ℃、提取时间60 min、提取3次的条件下，黑玉米粒多糖得率最高，可达41.09%±0.59%。黑玉米粒多糖对DPPH·、ABTS+·、·OH清除率的半数清除浓度（IC50）分别为1.959、1.529、0.3554 mg/mL，且清除能力在一定范围内与浓度呈量效关系，具有较强的体外抗氧化能力，为其深入研究及开发利用提供重要依据。Abstract: In order to explore the optimum extraction process of polysaccharide and antioxidant activity in vitro in black corn kernel. In this study, black corn kernel was used as raw material, ultrasonic-assisted extraction was applied to extract polysaccharides from black corn kernel. To explore the effects of ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction time, temperature and frequency on the yield of polysaccharide. The extraction process of polysaccharide from black corn kernel was optimized by response surface methodology. Besides, the antioxidant activity of the polysaccharide was investigated by measuring its scavenging ability on DPPH·, ABTS+·, and ·OH. The results showed that the extraction yield of polysaccharide from black corn kernel could reach up to 41.09%±0.59%, in these conditions: The solid-liquid ratio was 1:20 g/mL, the extraction temperature was 74 ℃, the extraction time was 60 min and the extraction frequency was 3 times. The IC50 values of scavenging rates on DPPH·, ABTS+· and ·OH were 1.959, 1.529 and 0.3554 mg/mL, respectively. Moreover, the scavenging rates showed a certain dose-effect relationship with the sample concentration, indicating that the polysaccharide had a strong antioxidant activity, thus providing a theoretical basis for further research and utilization.
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黑玉米（Zea mays L.）是被子植物门单子叶植物纲，禾本目玉蜀黍属植物[1]。黑玉米是玉米栽培品种的一种特殊类型，因富含大量黑色素而呈现黑色[2]。黑玉米浑身都是宝，其粒、须、苞叶、芯、秸秆都可生产使用，且营养丰富，黑玉米粒中多糖、氨基酸等含量均超过了黄玉米粒，而且微量元素硒的含量是黄玉米粒的3~8.5倍[3−4]。
多糖是一种广泛分布于动植物、藻类及微生物中的天然大分子聚合物，其由10个以上的单糖通过α-或β-糖苷键聚合形成[5]。多项研究结果表明，植物多糖具有增强免疫力[6]、抗疲劳[7]、抗氧化[8]、抑癌[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗病毒[12]等功效。目前研究表明黑玉米粒多糖具有抗疲劳、降血糖等功效，杨占群等[13−14]报道黑玉米粒多糖能够有效延长负重小鼠的运动时间，提高肌糖原和肝糖原的含量，降低尿素氮和乳酸的含量。Zhang等[15]研究表明黑玉米粒多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠有显著的降血糖作用。而有关黑玉米粒多糖体外抗氧化活性的研究报道不多，因此有必要对黑玉米粒多糖的提取方法开展研究，并探讨其体外抗氧化活性。
植物多糖的提取方法有热水浸提法、酶解萃取法、微波或者超声波辅助萃取法等[14]。魏俊青等[3]用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶分步酶法提取紫玉米多糖，多糖得率仅为8.42%，可见单用酶法得率较低。杨占群等[14]采用微波辅助酶法提取黑玉米多糖，多糖得率为49.21%。关海宁等[16]用超声辅助酶法提取黑玉米多糖，多糖得率为46.01%。微波或超声波辅助酶法均可大大提高黑玉米多糖的得率，但酶解法成本较高[17]，且采用微波辅助法得到的多糖分子量范围过广，会导致分支链分子质量的下降[18]，因而需要在保证提取率的同时降低成本，优化提取方法。超声波辅助热水提取法可利用超声波产生高速、强烈的空化效应增加固体与液体的界面接触，加速植物的高效萃取速度[19]，该方法操作简单，成本较低，具有高重现性被广泛应用于多糖提取[20]。关海宁等[21]用超声辅助水提醇沉法萃取黑玉米粒多糖，在超声功率180 W、超声温度60 ℃、pH6.8、醇沉浓度75%的最佳操作条件下，提取1次时多糖得率为16.11%。而研究发现提取时间、提取次数、液料比和超声功率是超声辅助提取多糖工艺优化中极受关注的变量参数[22−26]，同时对原材料进行预处理有利于除杂[27]，也有助于提高多糖提取率，因此本文对原材料进行浸泡预处理，并将提取次数、提取时间和料液比等因素作为考察条件开展更全面的提取工艺优化，旨在进一步提高超声波辅助水提醇沉法对黑玉米粒多糖的提取效率，并考察黑玉米粒多糖对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率，对其体外抗氧化活性进行研究，为其开发利用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜黑玉米 吉林省金塔实业（集团）股份有限公司；苯酚、浓硫酸 分析纯，广东广试试剂科技有限公司；无水乙醇 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖 分析纯，常德比克曼生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
SN-QX-65型超声波清洗机 上海市尚仪仪器设备有限公司；DD-6M型低速离心机 长沙市平凡仪器仪表有限公司；RE-5299型旋转蒸发器 广州市星烁仪器有限公司；Multiskan FC型酶标仪 赛默飞世尔科技公司；VORTEX-5型漩涡混合仪 海口市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黑玉米粒多糖的提取
黑玉米粒晒干后，95%乙醇浸泡过夜，50 ℃干燥至恒重，粉碎过60目筛。将脱脂粉碎后的黑玉米粒粉末与去离子水以料液比1:20（g/mL）混合，70 ℃、100 W超声提取1 h；然后3000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液，沉淀物再次超声辅助水提，重复以上步骤2次；将2次离心所得上清液旋蒸，浓缩至原液体积的1/5；向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇沉淀，不断搅拌，4 ℃静置过夜后，3000 r/min、4 ℃离心10 min，收集沉淀，沉淀物用去离子水溶解后旋蒸，冷冻干燥得黑玉米粒粗多糖，于干燥器中4 ℃保存，用于体外抗氧化活性测定。
1.2.2 单因素实验
以黑玉米粒为原材料，采用超声辅助水提醇沉法提取多糖进行单因素实验考察。在固定料液比1:20（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间60 min、提取2次的基础上，分别考察超声波功率（60、80、100、120、140 W）对多糖得率的影响；在固定料液比1:20（g/mL）、提取温度70 ℃、超声功率100 W、提取2次的基础上，分别考察提取时间（20、30、40、50、60、70、80 min）对多糖得率的影响；在固定料液比1:20（g/mL）、超声功率100 W、提取时间60 min、提取2次的情况下，分别考察不同提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对多糖得率的影响；在固定提取温度70 ℃、超声功率100 W、提取时间60 min、提取2次的情况下，分别考察不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）对多糖得率的影响；在固定料液比1:20（g/mL）、提取温度70 ℃、超声功率100 W、提取时间60 min的基础上，分别考察提取次数（1、2、3、4、5次）对黑玉米粒多糖得率的影响。
1.2.3 响应面优化试验
在单因素实验的结果上，基于Box-Behnken试验设计原理[28]，选用对多糖得率影响较大的提取次数、料液比、提取温度、提取时间为自变量，以黑玉米粒多糖的得率为观察指标，设计四因素三水平的响应面优化试验，试验因素和水平设计如表1所示。
表 1 响应面因素与水平设计Table 1. Response surface factors and level design水平 因素 A提取次数
（次）B料液比
（g/mL）C提取温度
（℃）D提取时间
（min）−1 1 1:15 60 50 0 2 1:20 70 60 1 3 1:25 80 70 1.2.4 多糖含量的测定
用苯酚-浓硫酸法[29]测定黑玉米粒多糖含量，以葡萄糖标准品质量浓度为x，吸光度为y，绘制标准曲线方程为y=5.8155x+0.0798，R2=0.9946。配制1 mg/mL的黑玉米粒多糖溶液，用去离子水稀释至0.1 mg/mL，准确吸取40 μL待测液，加入体积分数6%的苯酚溶液40 μL及浓硫酸200 μL，静置30 min后，在波长490 nm处测定吸光度值，按下式计算多糖得率：
多糖得率(%)=C×V×NM×100 式中：C为样品溶液中黑玉米粒多糖质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；N为提取液稀释倍数；M为黑玉米粒原料粉末重量，mg。
1.2.5 黑玉米粒多糖抗氧化活性测定
1.2.5.1 DPPH·清除率测定
参考文献[30−31]操作方法并稍加修改：配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取质量浓度分别为1、2、4、6、8、10 mg/mL的黑玉米粒多糖溶液100 μL，加入DPPH溶液100 μL，摇匀，置暗处反应30 min，在波长517 nm处测其吸光度为A1。取100 μL样品溶液加入100 μL无水乙醇，在波长517 nm处测定吸光值为A2。取100 μL蒸馏水加入100 μL DPPH溶液，在波长517 nm处测定吸光值为A3，以抗坏血酸为阳性对照，按下式计算自由基清除率：
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A3)×100 1.2.5.2 ABTS+自由基清除率测定
参考文献[32−33]操作方法并稍加改动：配制7 mmol/L ABTS溶液、2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，将两者等比例混匀，室温避光反应12 h以上，取适量混合液与无水乙醇混合稀释，使其在波长734 nm时的吸光度值为0.70±0.02，即得到ABTS工作液。分别取40 μL的浓度分别为1、2、4、6、8、10 mg/mL的黑玉米粒多糖溶液加入4 mL ABTS，均匀混合后，30 ℃避光反应20 min，在734 nm处检测其吸光度为A1。取40 μL样品溶液加入4 mL蒸馏水，在734 nm处测定吸光值为A2，取40 μL蒸馏水加入4 mL ABTS工作液，在734 nm处测定吸光值为A3，以抗坏血酸为阳性对照，按下式计算自由基清除率：
ABTS+自由基清除率 (%)=(1−A1−A2A3)×100 1.2.5.3 ·OH清除率测定
参考文献[34]的操作方法并略微修改：取质量浓度分别为1、2、4、6、8、10 mg/mL的黑玉米粒多糖溶液1 mL，与1 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）、1 mL H2O2溶液（6 mmol/L）混匀，反应10 min，再加入1 mL水杨酸溶液（6 mmol/L），37 ℃水浴30 min，测定510 nm下吸光度为A1。用1 mL蒸馏水代替水杨酸溶液测得吸光度为A2。用1 mL蒸馏水代替样品溶液测得吸光度为A3，以抗坏血酸为阳性对照，按下式计算·OH清除率：
⋅OH清除率(%)=(1−A1−A2A3)×100 1.3 数据处理
所有实验至少重复3次，数据以平均值±标准差表示，采用Design-Expert 12软件完成响应面设计并进行数据分析，并采用Duncan检验对各数据进行比较，P<0.01为极显著差异，P<0.05为显著差异；采用GraphPad prism 8进行作图及差异性分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 超声功率对多糖得率的影响
从图1可以看出，在一定的超声功率范围内，随着超声功率的增大，黑玉米粒多糖得率明显提高，当超声功率为100 W时，多糖得率为39.21%，合适的超声功率有助于多糖的释放。但当超声功率增加至120 W时，黑玉米粒多糖得率与超声功率100 W时的得率相比没有明显差异，继续增加超声功率至140 W时，多糖得率反而显著降低（P<0.05） 。研究发现适当功率的超声波有助于多糖的释放，但过高功率的超声会导致提取溶液中的多糖浓度增加，混合物黏度的增加会引起内聚力的增加，空化作用减弱[23]，并且多糖提取的同时伴随着多糖的降解，过高的超声功率还可能增加机械断裂效应，导致更多大分子多糖的降解[35−36]，从而降低多糖得率。因此最终确定最佳超声功率为100 W。
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2.1.2 提取时间对多糖得率的影响
由图2可知，当提取时间在20~60 min之间逐步延长，多糖得率也随之提高，当提取时间为60 min时，多糖得率达到39.23%。继续增加提取时间多糖得率却降低，原因是在合适的范围内延长超声时间，细胞受到超声波机械和空化作用增强，细胞壁破裂增多，多糖溶出增多，会导致多糖得率的升高[24]，但是提取时间过长会由于超声波空穴效应使多糖发生降解[22]，并易导致黑玉米粒中其他成分释放，从而影响多糖得率[27,37]。考虑超声提取时间在50、60、70 min时所提取的多糖得率有明显差异，因此选取50、60、70 min来进行响应面试验。
2.1.3 提取温度对多糖得率的影响
温度通过影响多糖分子之间的热效应，进而改变细胞膜的通透性和溶液黏度[38]。由图3可知，随着温度的升高，黑玉米粒多糖的得率也随之升高，当温度为70 ℃时，多糖得率达到39.35%。这是由于温度的上升增加了细胞膜的通透性和传热动力，使细胞内物质加快扩散利于物质浸出；当温度高于70 ℃，多糖得率却降低，原因为温度过高易使多糖分解，破坏多糖结构从而影响提取效果[37,39]。考虑超声提取温度在60、70、80 ℃时对多糖得率的影响有统计学差异，因此选取60、70、80 ℃为优化工艺的提取温度。
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图 3 提取温度对多糖得率的影响Figure 3. Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides2.1.4 料液比对多糖得率的影响
料液比可影响细胞内外渗透压，适当的料液比不但有利于多糖的溶出，并且能节约浸提液[40]。由图4可知，当料液比在1:20（g/mL）以下时，多糖得率随着溶剂用量的增加而提高，当液料比为1:20（g/mL）时，多糖得率达到38.21%。这是由于随着溶剂用量增加，多糖更易扩散，黑玉米粒粉末与溶剂的接触面积增大，反应更充分，利于多糖的析出，因此得率升高。继续增加溶剂用量，多糖得率反而下降，原因为达到一定比例后，溶剂用量的增加可能导致其他非多糖物质的析出，并影响多糖的醇沉，从而影响得率[37]。考虑料液比在1:15、1:20、1:25（g/mL）时对多糖得率的影响有统计学差异，因此选择料液比1:15、1:20、1:25（g/mL）来进行响应面优化。
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图 4 料液比对多糖得率的影响Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides2.1.5 提取次数对黑玉米粒多糖得率的影响
由图5可知，随着提取次数的增加，多糖得率先升高，后逐渐下降，在提取2次时，黑玉米粒多糖得率达到39.3%，后续增加提取次数，多糖得率反而下降。由于超声波与细胞壁共同产生“屏障效应”，因此单次超声辅助提取多糖类活性成分往往得率较低，需要多次提取来提高得率[23]，而提取次数过多易导致多糖结构破坏，使多糖得率反而下降[37]，因此选择提取次数为1、2、3次进行响应面试验。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面试验结果
基于黑玉米粒多糖单因素实验结果，以多糖得率（Y）为考察指标，根据统计学分析结果选择对多糖得率影响有统计学差异的四个因素（提取次数、料液比、提取温度与提取时间）进行四因素三水平响应面试验，确定最佳提取工艺条件，结果见表2。
表 2 响应面试验设计及试验结果Table 2. Experimental design and results of the response surface methodology实验号 A提取次数 B料液比 C提取温度 D提取时间 多糖得率
Y（%）1 −1 −1 0 0 14.58 2 1 −1 0 0 36.42 3 −1 1 0 0 26.57 4 1 1 0 0 33.61 5 0 0 −1 −1 18.34 6 0 0 1 −1 23.31 7 0 0 −1 1 21.52 8 0 0 1 1 37.75 9 −1 0 0 −1 18.07 10 1 0 0 −1 25.72 11 −1 0 0 1 18.16 12 1 0 0 1 37.98 13 0 −1 −1 0 16.74 14 0 1 −1 0 24.14 15 0 −1 1 0 34.01 16 0 1 1 0 26.77 17 −1 0 −1 0 14.38 18 1 0 −1 0 35.14 19 −1 0 1 0 20.57 20 1 0 1 0 38.14 21 0 −1 0 −1 18.24 22 0 1 0 −1 20.52 23 0 −1 0 1 22.21 24 0 1 0 1 36.09 25 0 0 0 0 37.77 26 0 0 0 0 38.02 27 0 0 0 0 40.67 28 0 0 0 0 39.91 29 0 0 0 0 39.78 利用表2实验数据进行回归拟合，得黑玉米粒多糖得率Y对各因素回归方程的模型为：Y=39.23+7.89A+2.12B+4.19C+4.13D−3.7AB−0.7975AC+3.04AD−3.66BC+2.9BD+2.81CD−5.49A2−6.67B2−6.55C2−8.17D2。
回归模型方差分析结果见表3。从表3得出，此模型极显著（P<0.0001）；失拟项不显著（P>0.05），说明此回归模型较为理想；R2=0.96、R2Adj=0.9201，表明模型准确度高，可用于优化多糖提取得率。根据模型中的P值可以得出，A、C、D、A2、B2、C2、D2对黑玉米粒多糖得率的影响都为极显著（P<0.01），而一次项B和交互项AB、AD、BC、BD、CD均表现为差异显著（P<0.05）。各因素对多糖得率的影响依次为A（提取次数）>C（提取温度）>D（提取时间）>B（料液比）。
表 3 回归方程方差分析Table 3. Analysis of variance of regression equations项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 2205.98 14 157.57 24.03 <0.0001 ** A 747.03 1 747.03 113.93 <0.0001 ** B 54.19 1 54.19 8.26 0.0122 * C 210.76 1 210.76 32.14 <0.0001 ** D 204.27 1 204.27 31.15 <0.0001 ** AB 54.76 1 54.76 8.35 0.0119 * AC 2.54 1 2.54 0.388 0.5434 AD 37.03 1 37.03 5.65 0.0323 * BC 53.58 1 53.58 8.17 0.0126 * BD 33.64 1 33.64 5.13 0.0399 * CD 31.7 1 31.7 4.83 0.0452 * A2 195.38 1 195.38 29.8 <0.0001 ** B2 288.43 1 288.43 43.99 <0.0001 ** C2 278.68 1 278.68 42.5 <0.0001 ** D2 432.66 1 432.66 65.98 <0.0001 ** 残差 91.8 14 6.56 失拟项 85.36 10 8.54 5.31 0.061 纯误差 6.43 4 1.61 总和 2297.77 28 注：P<0.01，极显著，用**表示；P<0.05，显著，用*表示。 2.2.2 响应面交互作用分析
各因素交互作用的响应面和等高线图见图6~图11。响应面曲面的陡峭程度反映了不同因素对黑玉米粒多糖得率的影响程度，响应面越陡，说明该因素对结果的影响越大，反之对试验结果影响越小[41−42]。等高线呈椭圆形，说明两个因素之间存在显著交互作用，呈圆形则说明交互作用对于响应值没有显著影响[43]。由图6~图11可知，AB、AD、BC、BD、CD所形成的响应面曲面坡度较陡峭，其等高线呈椭圆形，表明AB、AD、BC、BD、CD各自交互作用明显，对多糖得率的影响显著。对比可知，与表3模型方差分析结果一致。
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图 6 提取次数和料液比对多糖得率的影响Figure 6. Influence of extraction times and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides![]()
图 11 提取温度和提取时间对多糖得率的影响Figure 11. Influence of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides![]()
图 7 提取次数和提取温度对多糖得率的影响Figure 7. Influence of extraction times and extraction temperature on the yield of polysaccharides![]()
图 8 提取次数和提取时间对多糖得率的影响Figure 8. Influence of extraction times and extraction time on the yield of polysaccharides![]()
图 9 料液比和提取温度对多糖得率的影响Figure 9. Influence of solid-liquid ratio and extraction temperature on the yield of polysaccharides![]()
图 10 料液比和提取时间对多糖得率的影响Figure 10. Influence of solid-liquid ratio and extraction time on the yield of polysaccharides2.2.3 最佳条件确定与回归模型的验证
基于回归模型预测多糖提取的最佳条件为提取次数2.56次，料液比1:20.491（g/mL），提取温度73.921 ℃，提取时间59.333 min，在此条件下黑玉米粒多糖的理论得率为41.672%。考虑到实际操作，调整最佳提取条件为提取次数3次、料液比1:20（g/mL）、提取温度74 ℃、提取时间60 min时，在此工艺条件下进行3次重复验证实验，黑玉米粒多糖实际得率为41.09%±0.59%，与模型预测值高度相符，验证了此模型的有效性。本文在预先浸泡处理的基础上，降低超声功率、延长提取时间、增加提取温度和提取次数，最终得出了高于文献[21]的黑玉米粒多糖提取得率，工艺简便，适用性强，对黑玉米粒多糖的开发有实用意义。
2.3 体外抗氧化活性分析
2.3.1 DPPH·清除率试验
黑玉米粒多糖的DPPH·清除能力结果见图12。DPPH·具有单一电子，其醇溶液呈紫色，在517 nm处具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在517 nm吸光值下降，从而可评价样品的抗氧化能力[44]。由图12可知，当浓度为1~10 mg/mL时，黑玉米粒多糖对DPPH·的清除能力随质量浓度的增大而增强，其IC50为1.959 mg/mL，显著高于同为禾本科植物的玉米须多糖对DPPH·的清除能力[45]。结果表明，黑玉米粒多糖的DPPH·清除率在一定的范围内与多糖浓度成正相关，黑玉米粒多糖对DPPH·的清除能力较强，但其效果不如抗坏血酸明显。
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图 12 黑玉米粒多糖对DPPH·的清除作用Figure 12. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on DPPH·2.3.2 ABTS+·清除率试验
黑玉米粒多糖的ABTS+·清除能力结果见图13。ABTS+·被过二硫酸钾氧化生成绿色的ABTS溶液，在734 nm处有最大吸收，当一个物质加入到ABTS溶液后，溶液褪色，在734 nm吸光度值降低，说明该物质具有抗氧化能力[46]。从图13中可以看出黑玉米粒多糖浓度增加时，清除ABTS+·作用越强。当黑玉米粒多糖浓度为1~6 mg/mL时，黑玉米粒多糖对ABTS+·的清除率由40.34%上升至88.59%；当浓度为8 mg/mL时，其对ABTS+·基的清除率达到100%，与阳性药抗坏血酸的清除效果一样。经计算，黑玉米粒多糖清除ABTS+·的IC50为1.529 mg/mL，显著高于同为禾本科植物的玉米秸秆多糖对ABTS+·的清除能力[47]，说明黑玉米粒多糖具有很强的ABTS+·清除能力。
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图 13 黑玉米粒多糖对ABTS+·的清除作用Figure 13. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ABTS+·2.3.3 ·OH清除率试验
黑玉米粒多糖的·OH清除能力结果见图14。H2O2和亚铁离子发生反应形成·OH，加入水杨酸后可生成紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），在510 nm处具有最大吸收峰，当添加·OH清除剂时，体系色泽变浅，吸光度降低[48]。由图14可知，随着黑玉米粒多糖浓度的增大，黑玉米粒多糖对·OH的清除效果也随之增加，当浓度为1~10 mg/mL时，黑玉米粒多糖对·OH的清除率由54%上升至81.54%，略低于阳性药抗坏血酸的清除率。其清除·OH的IC50为0.3554 mg/mL，显著高于同为禾本科植物的玉米芯多糖对·OH的清除能力[49]。结果表明黑玉米粒多糖清除·OH活性与其浓度呈一定的线性关系，说明黑玉米粒多糖具有较好的·OH清除能力。
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图 14 黑玉米粒多糖对·OH的清除作用Figure 14. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ·OH3. 结论
本研究以黑玉米粒为原料，以多糖提取量为指标，通过响应面法优化获得黑玉米粒多糖提取的最优工艺条件：提取3次、料液比1:20（g/mL）、提取温度74 ℃、提取时间60 min，在此条件下测得的黑玉米粒多糖的得率为41.09%±0.59%，对于今后实际生产具有指导意义。同时对黑玉米粒多糖体外抗氧化能力进行测定，其对DPPH·、ABTS+·、·OH清除率的IC50分别为1.959、1.529、0.3554 mg/mL，结果表明黑玉米粒多糖具有较高的体外抗氧化能力。因此，本研究为今后黑玉米的综合开发利用奠定了基础，也为开发天然抗氧化剂和功能食品提供了科学依据。
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图 3 提取温度对多糖得率的影响
Figure 3. Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides
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图 4 料液比对多糖得率的影响
Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides
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图 6 提取次数和料液比对多糖得率的影响
Figure 6. Influence of extraction times and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides
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图 11 提取温度和提取时间对多糖得率的影响
Figure 11. Influence of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides
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图 7 提取次数和提取温度对多糖得率的影响
Figure 7. Influence of extraction times and extraction temperature on the yield of polysaccharides
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图 8 提取次数和提取时间对多糖得率的影响
Figure 8. Influence of extraction times and extraction time on the yield of polysaccharides
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图 9 料液比和提取温度对多糖得率的影响
Figure 9. Influence of solid-liquid ratio and extraction temperature on the yield of polysaccharides
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图 10 料液比和提取时间对多糖得率的影响
Figure 10. Influence of solid-liquid ratio and extraction time on the yield of polysaccharides
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图 12 黑玉米粒多糖对DPPH·的清除作用
Figure 12. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on DPPH·
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图 13 黑玉米粒多糖对ABTS+·的清除作用
Figure 13. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ABTS+·
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图 14 黑玉米粒多糖对·OH的清除作用
Figure 14. Scavenging effect of polysaccharides from black corn kernel on ·OH
表 1 响应面因素与水平设计
Table 1 Response surface factors and level design
水平 因素 A提取次数
（次）B料液比
（g/mL）C提取温度
（℃）D提取时间
（min）−1 1 1:15 60 50 0 2 1:20 70 60 1 3 1:25 80 70 
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表 2 响应面试验设计及试验结果
Table 2 Experimental design and results of the response surface methodology
实验号 A提取次数 B料液比 C提取温度 D提取时间 多糖得率
Y（%）1 −1 −1 0 0 14.58 2 1 −1 0 0 36.42 3 −1 1 0 0 26.57 4 1 1 0 0 33.61 5 0 0 −1 −1 18.34 6 0 0 1 −1 23.31 7 0 0 −1 1 21.52 8 0 0 1 1 37.75 9 −1 0 0 −1 18.07 10 1 0 0 −1 25.72 11 −1 0 0 1 18.16 12 1 0 0 1 37.98 13 0 −1 −1 0 16.74 14 0 1 −1 0 24.14 15 0 −1 1 0 34.01 16 0 1 1 0 26.77 17 −1 0 −1 0 14.38 18 1 0 −1 0 35.14 19 −1 0 1 0 20.57 20 1 0 1 0 38.14 21 0 −1 0 −1 18.24 22 0 1 0 −1 20.52 23 0 −1 0 1 22.21 24 0 1 0 1 36.09 25 0 0 0 0 37.77 26 0 0 0 0 38.02 27 0 0 0 0 40.67 28 0 0 0 0 39.91 29 0 0 0 0 39.78
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表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equations
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 2205.98 14 157.57 24.03 <0.0001 ** A 747.03 1 747.03 113.93 <0.0001 ** B 54.19 1 54.19 8.26 0.0122 * C 210.76 1 210.76 32.14 <0.0001 ** D 204.27 1 204.27 31.15 <0.0001 ** AB 54.76 1 54.76 8.35 0.0119 * AC 2.54 1 2.54 0.388 0.5434 AD 37.03 1 37.03 5.65 0.0323 * BC 53.58 1 53.58 8.17 0.0126 * BD 33.64 1 33.64 5.13 0.0399 * CD 31.7 1 31.7 4.83 0.0452 * A2 195.38 1 195.38 29.8 <0.0001 ** B2 288.43 1 288.43 43.99 <0.0001 ** C2 278.68 1 278.68 42.5 <0.0001 ** D2 432.66 1 432.66 65.98 <0.0001 ** 残差 91.8 14 6.56 失拟项 85.36 10 8.54 5.31 0.061 纯误差 6.43 4 1.61 总和 2297.77 28 注：P<0.01，极显著，用**表示；P<0.05，显著，用*表示。
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