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中国精品科技期刊2020

酪蛋白肽锌螯合物的制备及体外消化分析

周桂成, 肖珊, 王波, 王际辉

周桂成,肖珊,王波,等. 酪蛋白肽锌螯合物的制备及体外消化分析[J]. 食品工业科技,2023,44(23):270−279. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023020002.
引用本文: 周桂成,肖珊,王波,等. 酪蛋白肽锌螯合物的制备及体外消化分析[J]. 食品工业科技,2023,44(23):270−279. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023020002.
ZHOU Guicheng, XIAO Shan, WANG Bo, et al. Preparation and in Vitro Digestive Analysis of Casein-Derived Peptide-Zinc Chelates[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(23): 270−279. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023020002.
Citation: ZHOU Guicheng, XIAO Shan, WANG Bo, et al. Preparation and in Vitro Digestive Analysis of Casein-Derived Peptide-Zinc Chelates[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(23): 270−279. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023020002.

酪蛋白肽锌螯合物的制备及体外消化分析

基金项目: 广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515110211);广东省普通高校特色创新项目(2021KTSCX132);东莞理工学院高层次人才(创新团队)科研启动项目(KCYCXPT2017007);广东省创新强校创新团队项目(2021KCXTD035)。
详细信息
    作者简介:

    周桂成(1997−),男,硕士研究生,研究方向:发酵工程,E-mail:755136932@qq.com

    通讯作者:

    王波(1988−),男,博士,讲师,研究方向:生物活性肽的消化、吸收、代谢以及构效关系,E-mail:bwang@dgut.edu.cn

    王际辉(1970−),男,博士,教授,研究方向:天然活性产物与微生态制剂研发及应用,E-mail:wangjihui@dgut.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.2

Preparation and in Vitro Digestive Analysis of Casein-Derived Peptide-Zinc Chelates

  • 摘要: 为开发安全高效且易吸收的补锌剂,利用碱性蛋白酶酶解和乳酸菌发酵相结合的方法制备生物活性肽,并以此多肽制备了酪蛋白肽锌螯合物。采用光谱法对螯合物结构进行表征,利用体外消化模型和Caco-2细胞实验对其胃肠消化特性及生物安全性进行评价。结果表明,制备酪蛋白肽的最优条件为酶解pH为9、碱性蛋白酶添加量为0.3%(w/v),乳酸菌发酵时间为12 h,此时反应体系中多肽含量为142.39±0.95 mg/g,对锌的螯合率为31.41%±0.97%。与锌螯合后,酪蛋白肽表面的致密结构遭到破坏,形成疏松的状态;光谱学分析表明,Zn2+能与酪蛋白肽上的活性基团进行结合,螯合位点为羧基氧、羟基氧和氨基。体外模拟消化结果显示,酪蛋白肽锌螯合物在消化过程中锌溶解性优于硫酸锌;在胃肠消化后酪蛋白肽锌螯合物DPPH和ABTS+自由基的清除能力分别提升了26.19%±3.30%和71.96%±7.06%,而铁还原力下降了36.26%±2.80%;同时,在消化过程中肽锌螯合物的β-转角与无规则卷曲含量减少,β-折叠结构增加,Zn2+起到了维持多肽结构的作用。细胞实验表明,当浓度大于0.4 mg/mL时,肽锌螯合物胃肠道消化物对Caco-2细胞表现出一定的细胞毒性。最后,利用质谱技术分别从酪蛋白水解物和肽锌螯合物中鉴定出15条和13条乳源多肽。研究结果可以为高效安全的酪蛋白肽锌补充剂的制备和应用提供科学依据。
    Abstract: In this study, casein peptides were obtained by alcalase hydrolyzation and Lactobacilus fermentation to prepare the casein peptide-zinc chelates, which are a kind of efficient and well-absorbed zinc supplement. The structure of casein peptide-zinc chelates was characterized by spectroscopic instruments. The digestive stability and safety were also assayed using in vitro digestive model and Caco-2 cell experiment. The results indicated that the optimal conditions for preparing casein peptides were as follows: Volume of alcalase was 0.3% (w/v), pH of reaction system was 9.0, Lactobacilus fermentation time was 12 h. Under this condition, the peptide content was 142.39±0.95 mg/g, and the zinc chelation rate was 31.41%±0.97%. The chelation with zinc destroyed the structure of casein peptides leading to a loose surface structure. Spectroscopic analysis showed that Zn2+ can bind to the reactive groups on casein peptides, with the chelating sites being carboxyl oxygen, hydroxyl oxygen and amino groups. The results of in vitro digestion showed that casein peptide-zinc chelates possessed better solubility than that of zinc sulfate. After gastrointestinal digestion, the DPPH and ABTS+ scavenging ability of casein peptide-zinc chelates increased by 26.19%±3.30% and 71.96%±7.06%, respectively. However, the ferric ion reducing power of the casein peptide-zinc chelates decreased by 36.26%±2.80%. At the same time, the β-turn and random coil content of the casein peptide-zinc chelate decreases during digestion, the β-sheet structure increases and Zn2+ play a role in maintaining the peptide structure. Furthermore, the cytotoxicity test indicated that casein peptide-zinc chelates gastrointestinal digest were toxic to Caco-2 cells when the concentration exceeded 0.4 mg/mL. Finally, 15 and 13 dairy-derived peptides were identified from casein hydrolysate and casein peptide-zinc chelates, respectively, using mass spectrometry. These results will provide scientific evidence for the development and application of efficient casein peptide-zinc chelates.
  • 锌在人体内起着维持机体免疫功能和正常生长发育的作用,同时也是1000多种蛋白质结构和功能调节的辅因子[1]。由于人体内没有有效且可靠的锌存储位点,摄入足够的锌是维持体内锌平衡的关键[2]。机体获取锌的途径主要包括日常饮食摄入和口服锌补充剂两种形式。然而,膳食锌在人体的吸收效率较低,食物基质中的成分,例如植酸、多酚、皂苷和纤维素等在胃肠中与锌发生结合会形成难溶的复合物[3],阻碍锌的吸收和利用。同时,食物中的矿物质,如铁、钙、铜离子会竞争部分非特定金属离子转运体和载体蛋白,抑制机体对锌的吸收。因此,开发高效补锌剂对改善人体锌营养状况具有现实意义。目前,补锌剂主要分为无机锌盐、有机弱酸锌、氨基酸锌和以肽作为配体的补锌剂等四类。然而在实际应用中,无机盐补锌剂会改变食物的理化和感官性质,引起人体胃肠道不适[4];有机弱酸锌制备工艺复杂、且易与其他营养素发生拮抗,不宜长期摄入[5];氨基酸锌具有良好的稳定性,但其锌含量较低,较难满足机体日常需要。目前,以肽作为配体的补锌剂因其安全可靠、锌利用率高等优点,具有成为高效可靠锌补充剂的潜力[6]

    酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质,同时也是生物活性多肽的重要来源[78]。酪蛋白肽能够与矿物质结合,促进微量元素在人体中的高效吸收。近年来,许多学者利用不同的食源性生物活性肽,如蛋清肽[9]、牡蛎肽[10]、南瓜种子肽[11]等,制备出稳定可溶的肽锌螯合物。然而,肽锌螯合物在人体内的消化和吸收是一个复杂的过程,不同的肽锌螯合物之间由于分子量[12]、电荷性质[13]、疏水性[11]、氨基酸组成等差异,其稳定性和生物利用率也不同。需要对更多来源的多肽进行开发,寻找更安全、高效和稳定的锌配体,满足人们日常对锌的需要。

    实验室前期研究发现,利用碱性蛋白酶水解酪蛋白得到的多肽具备一定的锌螯合能力,但是其肽锌螯合物的胃肠消化稳定性较低。在此基础上,利用乳酸菌发酵对酶解法进行进一步补充[14],制备了更多潜在的、具备优异锌螯合特性和消化稳定性的多肽。本研究利用酪蛋白为原料,通过碱性蛋白酶酶解与乳酸菌发酵结合的方式获得具有高效锌螯合能力的多肽,与七水合硫酸锌反应制备肽锌螯合物,并对其结构进行表征;通过模拟体外消化,探讨酪蛋白肽锌螯合物在消化过程中的锌溶解性和抗氧化性的变化,对胃肠消化产物进行圆二色谱测定,分析肽锌螯合物在消化过程中的二级结构变化。为推动酪蛋白肽的利用与酪蛋白肽锌螯合物的开发提供理论支持。

    MRS肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司;酪蛋白 生物试剂级、七水合硫酸锌 分析纯,上海源叶生物科技有限公司;碱性蛋白酶(1:200000) 北京索莱宝生物科技有限公司;4-(2-pyridylazo) resorcinol(PAR)、HEPES-KOH 缓冲液(pH7.9)、硼酸钠、十二烷基硫酸钠、邻苯二甲醛、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、谷胱甘肽(GSH)、4,4'-二(1H-1,2,4-三唑-1-基)-1,1'-联苯(TPTZ) 均为分析纯,上海阿拉丁公司;胃蛋白酶P7000、胰液素P1750 美国Sigma公司;血锌浓度试剂盒 南京建成科技有限公司;邻苯二甲醛、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 分析纯,上海麦克林生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯;所有实验用水均为去离子水;植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) LPA和LPB是实验室先前从西兰花中筛选得到的两株具有高发酵能力的乳酸菌;Caco-2 细胞 中国科学院。

    Chiracan V100圆二色光谱仪 英国Applied Photophysics公司;Nicolet IS50显微红外光谱系统、Easy-nano 1200色谱仪器、Q Exactive Plus质谱仪器、EVOLUTION 220紫外可见光谱仪 美国Thermo公司;F7100荧光光谱仪 日本日立公司;Spark多功能微孔板检测仪 瑞士Tecan公司;EM-30 Plus超高分辨率扫描电镜 韩国Coxem公司;ZS90马尔文纳米激光粒度仪 英国马尔文帕纳科公司。

    植物乳酸菌LPA和LPB在MRS培养基上37 ℃连续培养(3代×24 h)。6000×g下离心5 min,使菌种悬浮在无菌盐水(0.9%)中。在20 mL酪蛋白培养基(5%,w/v)中加入0.15%的碱性蛋白酶,酶解2 h,调节pH至6.5,按3%的接种量(v/v)加入植物乳酸菌,在37 ℃条件下发酵12 h。然后,对不同的发酵条件进行优化,固定发酵条件为酶解pH7、碱性蛋白酶添加量0.15%,以不同发酵时间(6、8、10、12、14、16 h)分别进行酶解与发酵;固定发酵条件为酶解pH为7、发酵时间为12 h以不同碱性蛋白酶添加量(0、0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%)分别进行酶解与发酵;固定发酵条件为发酵时间为12 h、0.30%碱性蛋白酶添加量,以不同初始的酶解pH(5、6、7、8、9、10)分别进行酶解与发酵。发酵产物用1 mol/L HCl调节pH至4.6,在6000×g,4 ℃条件下离心10 min,取上清液,用1 mol/L NaOH调节pH至7.0,离心收集上清液冷冻干燥并储存在−80 ℃中备用。

    根据Zhu等[15]的方法,将1.2.1中得到的发酵产物在40 mmol/L HEPES-KOH缓冲液(pH7.5)中重新溶解,与ZnSO4·7H2O(250 μmol/L)以49:1的比例充分混合,在37 ℃水浴中反应10 min。然后加入200 μL 2 mmol/L 4-(2-pyridylazo)resorcinol(PAR),以HEPES-KOH缓冲液为空白,在波长500 nm下测定吸光值。锌螯合率计算公式为:

    (%)=(1)×100
    (1)

    多肽含量的测定参考Spellman等[16]的方法,将100 mL硼酸钠(0.1 mol/L)和10 mL 20%(w/v)十二烷基硫酸钠混合均匀,搅拌至沉淀消失。取160 mg邻苯二甲醛溶于4 mL乙醇,转移到上述溶液中。加入400 μL巯基乙醇,用去离子水定容至200 mL。取200 μL 1.2.1中得到的发酵产物与3 mL邻苯二甲醛工作液充分混匀,室温下避光孵育2 min,测量340 nm处的吸光值。取不同浓度的DL-丝氨酸绘制标准曲线,样品结果以每克样品的丝氨酸毫克当量表示。

    10 mL酪蛋白肽(10 mg/mL)与硫酸锌(锌螯合肽:硫酸锌质量比为1:1)混合,将反应混合物的pH调节至6.0,50 ℃条件下反应1 h,随后将混合物转移到冰水浴中迅速冷却,加入无水乙醇(1:4,v/v)并静置,在8000 r/min条件下离心10 min,收集沉淀冷冻干燥得到肽锌螯合物。

    取一定量的酪蛋白肽及肽锌螯合物粉末于感电胶上,进行喷金处理后,利用COXEM扫描电镜进行观察,其中,加速电压为3 kV,放大倍数为:×1.0 k。

    使用Nicolet IS50显微红外光谱系统,在4000~675 cm−1范围内对酪蛋白肽及肽锌螯合物冻干粉进行扫描,选择模式为透射模式,采用冷却后检测器进行检测。

    将酪蛋白肽和肽锌螯合物溶于去离子水,配制成1 mg/mL溶液,平衡120 s,采用马尔文激光粒度仪测定Zeta电位。

    使用日立公司的F-7100荧光分光光度计,对酪蛋白肽螯合锌离子后的荧光特性进行分析。在酪蛋白肽溶液(5 mg/mL)中加入不同浓度(1、2、4、6、8和10 mmol/L)的硫酸锌溶液反应30 min。采用扫描模式,在激发波长为280 nm和发射波长为300~500 nm的条件下进行扫描。

    根据文献[17]报道的方法,取一定量酪蛋白肽及肽锌螯合物溶于去离子水,配制成不同浓度溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),取2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液与样品溶液充分混合,于517 nm处测吸光值。以还原型谷胱甘肽作为阳性对照。取2 mL 95% 乙醇和2 mL样品混合反应作为对照组,取2 mL 95%乙醇样品和2 mL DPPH溶液混合反应作为空白组,对DPPH自由基的清除率用以下公式计算:

    DPPH(%)=(1)×100
    (2)

    根据文献[18]报道的方法,将ABTS溶液(7 mmol/L)和过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)混合,在室温避光放置16 h,得到ABTS母液。随后对ABTS母液稀释,使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02。将0.5 mL不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL)的样品溶液和3 mL的ABTS稀释液混合,在室温避光反应5 min。然后测量734 nm处的吸光值。以还原型谷胱甘肽作为阳性对照,空白组用去离子水代替样品。ABTS+自由基清除率计算如下:

    ABTS+(%)=(1)×100
    (3)

    根据文献[19]报道的方法,将30 mL TPTZ溶液(10 mmol/L)与30 mL FeCl3溶液(20 mmol/L)充分混合,加入300 mL醋酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH3.6)进行稀释得到TPTZ工作液。 将100 μL 不同浓度样品溶液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)与 3 mL TPTZ工作液在 37 ℃下混合 30 min,在593 nm处测量吸光值。以不同浓度Trolox 标准品制作标准曲线,以还原型谷胱甘肽作为阳性对照,结果表示为 Trolox 当量(mmol Trolox/L)。

    将肽锌螯合物、硫酸锌分别溶解于去离子水(1 mg/mL)中,调节pH至2.0,37 ℃孵育5 min后,按1:35(w/w)的酶底物比加入胃蛋白酶(≥250 units/mg solid)消化2 h。胃消化完成后,用饱和NaHCO3调pH至6.8,1:25(w/w)加入胰酶(4×USP),继续用1 mol/L NaOH调节至pH7.5后消化2 h。分别在体外消化0、15、30、60、120、135、150、180和240 min时取一定量样品,沸水浴10 min灭酶后进行测试。抗氧化活性的测定按照1.2.9的方法进行。根据Xie等[20]的方法计算抗氧化活性残留率,抗氧化活性残留率表示为:

    (%)=×100
    (4)

    取等量不同消化时间的胃肠道消化液在8000×g下离心10 min。收集上清液,根据血锌浓度试剂盒的方法测定锌含量。肽锌螯合物总锌含量测定,取50 mg肽锌螯合物溶解在6 mol/L盐酸中,120 ℃消化4 h,真空干燥除去其中的盐酸,用去离子水定容到5 mL,利用血锌浓度试剂盒的方法测定锌含量。锌的溶解度计算如下:

    (%)=()×100
    (5)

    酪蛋白肽及肽锌螯合物溶于去离子水(0.25 mg/mL)中,然后用圆二色谱仪(CD)在190~260 nm之间进行扫描,使用以下仪器参数:带宽1.0 nm,扫描速度100 nm/min。每个获取的光谱代表平均三次连续扫描。采用CDNN软件进行二级结构分析。

    根据文献[21]报道的方法,取1.2.10中的消化样品溶于含10%血清的DMEM培养基中。待Caco-2细胞融合度达到约80%后,弃去培养基,用PBS洗涤Caco-2细胞两次后利用胰酶进行消化得到细胞悬液。将细胞以2.5×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中,在37 ℃二氧化碳培养箱中孵育24 h后弃去培养基,每孔分别加入200 µL不同浓度酪蛋白肽和肽锌螯合物胃肠消化产物(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 mg/mL),每个样品设置6个平行孔。继续孵育24 h后弃去样品,每孔加入100 µL 5 mg/mL MTT。孵育4 h后弃去MTT,每孔加入200 µL二甲基亚砜,细胞培养板低速摇动10 min。用酶标仪在570 nm处测定吸光值。以含培养基而不含细胞组作为空白组,以等量含10%血清的DMEM培养基代替样品组作为对照组,细胞存活率计算如下:

    (%)=(1)×100
    (6)

    将1.2.4中得到的酪蛋白肽与肽锌螯合物以1 mg/mL浓度在去离子水中溶解并进行质谱检测。

    分离柱:75 μm×200 mm(C18,1.9 μm粒径,120 Å孔径);色谱分离时间:60 min,A:0.1% 甲酸水溶液,B:80%乙腈;流速:200 nL/min,

    梯度洗脱梯度:在0~45 min内,B:3%~32%;在45~55 min内,B:32%~100%;在55~60 min内,B:100%~100%。

    扫描范围200~2000 Da;分辨率70000;最大离子注入时间100 ms;MS/MS离子注入时间75 ms。

    使用ProteinDiscovery 2.4.0(美国Thermo Scientific公司)进行数据分析。基于UniProt数据库,得到准确的多肽分子量和氨基酸序列。

    每组实验数据至少测定三次,计算平均值和误差值,并采用SPSS 26.0软件进行显著性分析,用 Origin 2018软件作图。

    利用实验室筛选的两株具有高发酵能力的植物乳杆菌对酪蛋白进行发酵,结果如图1所示,通过碱性蛋白酶预处理与植物乳杆菌发酵相结合的方式获取的酪蛋白肽对锌离子的螯合率分别为17.63%±0.83%和15.17%±0.81%,均高于其单菌发酵组(12.07%±0.53%和13.63%±0.13%)或单酶处理组(8.69%±0.53%)。碱性蛋白酶与植物乳杆菌LPA共同作用制备的酪蛋白肽具有更优的锌螯合能力。在植物乳杆菌的作用下,酪蛋白更容易被水解释放出大量的生物活性肽[22];利用碱性蛋白酶预酶解,有利于缩短发酵的过程[23],减少发酵过程中被污染的可能性。因此,选择碱性蛋白酶与植物乳杆菌LPA的发酵组合对后续发酵条件进行优化。

    图  1  不同制备条件对酪蛋白肽锌螯合率及多肽含量的影响
    注:A:不同发酵组合酪蛋白肽的锌螯合率;B:不同发酵时间酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;C:不同酶添加量酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;D:不同初始pH酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;图中不同小写字母表示差异显著,P<0.05,图6图9同。
    Figure  1.  Effect of different preparation conditions on zinc chelation rate and peptide content of casein peptides

    图1B所示,随着发酵时间的增加,酪蛋白肽对锌的螯合率下降。发酵初始阶段,酪蛋白肽水解程度较低,较长的肽段可能更有利于锌离子的结合。在8~12 h阶段酪蛋白肽的多肽含量和锌螯合能力逐渐增加,在12 h时酪蛋白肽的锌螯合能力达到最高,为18.36%±0.55%。在这一阶段,多肽在微生物作用下释放出更多能结合Zn2+的活性基团。随着水解程度的增加,部分锌螯合位点被破坏,水解产物的锌螯合率逐渐降低[24]。对不同酶添加量下酪蛋白发酵产物进行分析,酶处理组多肽含量与锌螯合率均高于无酶组,酶的加入促进了锌螯合多肽的形成。在碱性蛋白酶的作用下,酪蛋白肽部分关键位点被暴露出来,无酶组中难以利用的部分变得可以利用[25]。在酶加入量为0.3%时,酪蛋白肽锌螯合率达到最高(25.16%±1.74%)。对不同酶解初始pH下酪蛋白发酵产物进行分析,在酶解初始pH为9时,酪蛋白肽具有最高的锌螯合能力31.41%±0.97%。碱性条件有利于酪蛋白的酶解并为后续发酵阶段提供更多的水解产物[26],提高乳酸菌对酪蛋白的利用率。根据上述实验,确定最优的发酵组合为乳酸杆菌A与碱性蛋白酶共同发酵,最佳的发酵条件为酶解pH9、碱性蛋白酶添加量为0.3%(w/v)、乳酸菌发酵时间为12 h并以此作为后续制备酪蛋白肽的发酵条件。

    扫描电子显微镜(SEM)是观察多肽形貌特征的有效工具。图2A图2B分别显示了酪蛋白肽和酪蛋白肽锌螯合物的表面形态。酪蛋白肽显示出表面光滑的片状,与锌螯合后呈粗糙疏松颗粒状结构,与Zhang等[27]观察到的现象相似。肽锌螯合物在形成过程中,微观结构发生了变化,锌的存在破坏了多肽表面原本致密的结构,酪蛋白肽的空间构象发生改变并重新排列[11],形成更疏松的结构。同时,多肽氨基酸残基上部分亲水基团被Zn2+屏蔽[28],使多肽趋向于聚集状态。因此,锌离子的螯合显著改变了酪蛋白肽的微观结构。

    图  2  酪蛋白肽和肽锌螯合物SEM图(×1.0 k)
    注:A:酪蛋白肽;B:肽锌螯合物。
    Figure  2.  SEM images of casein peptide and peptide-zinc chelate (×1.0 k)

    酪蛋白肽在1400.66、1556.00、1648.41、2954.03和3284.54 cm−1的红外范围内出现了红外峰,分别对应于蛋白质结构中的酰胺III、II、I和酰胺B和A带。如图3所示,Zn2+加入后,多肽的红外光谱发生了显著变化。肽锌螯合物的NH带出现在3254.50 cm−1处,可能是Zn2+的加入引起-NH伸缩振动和氢键的取代[28]。在2939.29 cm−1处有一个肽锌螯合物-CH2基团的伸缩振动。在添加Zn2+之后,酪蛋白肽1648.41和1556.00 cm−1处的峰移至较低的频率(1641.04和1535.59 cm−1),表明Zn2+与NH发生了结合[29]。在1400.66 cm−1处观察到酰胺III带的变化,这是由C-N伸缩振动、N-H变形和-CH2基团的振动形成的[27,30]。肽锌螯合物在978.30 cm−1处的峰消失,Zn2+的作用可能会导致一些较弱的吸收带被屏蔽[15]。推测酪蛋白肽主要通过多肽键上的羧基氧、羟基氧、氨基参与Zn2+的配位形成多肽锌螯合物。Zn2+与酪蛋白肽螯合并引起多肽结构的改变。

    图  3  酪蛋白肽和肽锌螯合物FTIR图
    Figure  3.  FIRT diagram of casein peptide and peptide-zinc chelate

    酪蛋白肽和肽锌螯合物的 Zeta 电位如图4所示。Zeta电位是反映分散体系中粒子的表面电荷状态的重要指标。酪蛋白肽的Zeta电位为−12.76±0.46 mV,在与锌离子螯合后,肽锌螯合物的Zeta电位为−6.84±0.67 mV,发生了极显著变化(P<0.001),Zn2+的加入导致了酪蛋白肽Zeta电位值上升。

    图  4  酪蛋白肽和肽锌螯合物zeta电位图
    注:***表示P<0.001。
    Figure  4.  Zeta potential diagram of casein peptide and peptide-zinc chelate

    图5所示,当荧光激发波长为280 nm时,观察到酪蛋白肽在356 nm处出现吸收峰,随着Zn2+浓度的增加(1、2、4、6、8、10 mmol/L),酪蛋白肽荧光吸收峰强度逐渐降低且当Zn2+浓度超过4 mmol/L时,荧光猝灭幅度减弱。在引入Zn2+后,多肽的空间结构发生折叠[31],导致荧光强度下降。同时,随着Zn2+浓度增加,酪蛋白肽的荧光猝灭幅度逐渐减弱。这可能是在螯合过程中,酪蛋白肽对Zn2+的螯合逐渐达到饱和[32],酪蛋白肽的结构变化减缓。因此,Zn2+能与酪蛋白肽上的活性基团进行结合并形成可溶性肽锌螯合物。同时, 酪蛋白肽的Zn2+结合位点是有限的。

    图  5  不同浓度的Zn2+肽锌螯合物的荧光光谱图
    Figure  5.  Fluorescence spectra of peptide-zinc chelate at different concentrations of Zn2+

    多肽的金属结合活性与抗氧化能力相关[33],与金属离子结合后,多肽的抗氧化活性降低。本研究通过测定DPPH的自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和铁离子还原能力,全面系统地对肽锌螯合物的抗氧化活性进行评价。如图6A所示,酪蛋白肽对DPPH自由基的清除能力表现出明显的剂量效应,在浓度为2.5 mg/mL时增加到69.51%±0.82%。同一浓度下肽锌螯合物的DPPH自由基的清除能力为45.55%±0.66%。在与锌螯合后,酪蛋白肽仍然保留着一定的抗氧化能力。

    图  6  酪蛋白肽和肽锌螯合物抗氧化性测定
    注: A:酪蛋白肽和肽锌螯合物DPPH自由基清除率的测定;B:酪蛋白肽和肽锌螯合物ABTS+自由基清除率的测定;C:酪蛋白肽和肽锌螯合物铁还原力的测定。
    Figure  6.  Determination of antioxidant properties of casein peptide and peptide-zinc chelate

    同时,酪蛋白肽和肽锌螯合物都显示出ABTS+自由基清除能力。如图6B所示,在0.02~0.10 mg/mL浓度范围内随着浓度的增加,酪蛋白肽和肽锌螯合物的ABTS+自由基清除能力逐渐提高,且在0.10 mg/mL时酪蛋白肽对ABTS+自由基清除能力达到57.90%±0.78%,肽锌螯合物对ABTS+自由基清除能力则为21.68%±1.64%。对其铁离子还原能力进行对比,在浓度为5 mg/mL时,酪蛋白肽和肽锌螯合物的铁离子还原能力分别为0.256±0.003 μmol Trolox/mL和0.10±0.005 μmol Trolox/mL。相同浓度条件下,酪蛋白肽具有更好的抗氧化活性,锌的加入导致多肽发生聚集,在一定程度上阻碍了多肽的活性部位,肽锌螯合物的抗氧化活性降低。

    对体外模拟消化过程中肽锌螯合物锌的溶解度及其抗氧化活性残留率进行研究。结果如图7所示。在胃消化阶段,肽锌螯合物与硫酸锌的溶解度都在85%以上。进入肠道消化阶段后,两者溶解度出现了极显著(P<0.001)差异,硫酸锌的溶解度下降至2.67%±1.50%,这可能是肠消化阶段偏弱碱性的pH环境导致Zn2+解离并形成沉淀[34]。而肽锌螯合物锌溶解度在120 min时仍然在54.25%±1.20%,并随着消化的进行最终稳定在43.06%±2.15%。对于肠吸收而言,大多数矿物质的生物利用率主要取决于它的溶解度。以肽作为配体的锌补充剂,有利于维持锌在胃肠道消化中的溶解度[35]。在本研究中,利用碱性蛋白酶与植物乳杆菌LPA共同作用制备酪蛋白肽,其肽锌螯合物在胃肠道消化阶段具有很好的溶解性,这对于人体肠道对锌的吸收是有利的。

    图  7  消化过程中肽锌螯合物和硫酸锌中锌离子溶解率(A)和酪蛋白肽锌螯合物抗氧化活性残留率(B)
    注: Pep、Pep-G、Pep-I分别表示酪蛋白肽、胃消化后的酪蛋白肽、胃肠消化后的酪蛋白肽;Pep-Zn、Pep-Zn-G、Pep-Zn-I分别表示肽锌螯合物、胃消化后的肽锌螯合物、胃肠消化后的肽锌螯合物;*表示 P<0.05; **表示 P<0.01;***表示 P<0.001。
    Figure  7.  Rate of zinc dissolution of peptide-zinc chelate and zinc sulfate during digestion (A) and remaining ratios of antioxidant activity of casein peptide-zinc chelate (B)

    图7B所示,在消化过程中,酪蛋白肽和肽锌螯合物的抗氧化活性逐渐增强。酪蛋白肽的ABTS+自由基清除能力在胃消化阶段增加了26.19%±1.68%,在肠消化阶段增加了69.05%±6.23%;DPPH自由基清除能力在胃消化阶段时增加5.35%±3.58%,肠消化阶段时增加21.34%±4.53%,而肽锌螯合物的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力在胃消化阶段时分别增加了11.72%±2.95%和39.25%±3.24%,在肠消化阶段则增加了26.19%±3.30%和71.96%±7.06%。在胃蛋白酶和胰酶作用下,酪蛋白肽会进一步被水解为更小的片段,抗氧化活性也随之改变[36]。消化过程中肽锌螯合物的抗氧化能力极显著提高(P<0.001),这可能与肽锌螯合物结构的变化相关,胃肠消化环境有利于其抗氧化能力的重新释放。

    然而,酪蛋白肽和肽锌螯合物的铁还原力在消化过程中有所下降,在胃消化阶段酪蛋白肽铁还原力抗氧化活性残留率为82.76%±1.49%,低于肽锌螯合物的铁还原力抗氧化活性残留率(89.70%±2.69%)。在肠消化阶段,两者的铁还原力抗氧化活性残留率分别下降了43.95%±0.59%和36.26%±2.80%。这可能是胃肠消化过程中部分疏水性氨基酸失去活性,导致酪蛋白肽和肽锌螯合物的铁还原力下降[27]

    对Zn2+螯合前后多肽的圆二特性变化进行分析,研究酪蛋白肽与锌螯合过程中二级结构的变化[37]。结果如图8所示,酪蛋白肽和肽锌螯合物在198 nm处均出现最小值。与锌螯合后,肽锌螯合物的圆二光谱峰减弱。通过CDNN软件对肽锌螯合物二级结构进行分析,计算出酪蛋白肽的α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲含量分别为5.6%、19.5%、39.9%和34.2%,在螯合后分别变为5.9%、18.1%、46.3%和31.5%。结果表明,在Zn2+作用下部分β-转角与无规则卷曲转化为β-折叠。Zn2+的加入有利于诱导肽锌螯合物折叠结构的形成。在消化过程中,酪蛋白肽和肽锌螯合物的二级结构发生了变化。简单来说,酪蛋白肽和肽锌螯合物的β-转角与无规则卷曲结构减少,β-转角结构在消化结束后分别降低了2.1%和0.9%,这可能与β-转角在消化过程中的降解有关[36]。在胃消化阶段,肽锌螯合物的无规则卷曲结构减少,无规则卷曲的变化幅度(1.1%)小于酪蛋白肽无规则卷曲的幅度(2.7%),酪蛋白肽和肽锌螯合物的β-折叠的含量分别增加到46.4%和49.2%。受胃消化环境的影响,H+与Zn2+会竞争给电子基,导致肽锌螯合物中的锌发生部分解离[37],然而本研究中多肽有序的结构却被保留了下来。在肠道消化阶段,β-折叠结构含量增加,说明消化过程中肽锌螯合物结构变得更加致密有序。与酪蛋白肽相比,肽锌螯合物在胃肠道消化过程中的二级结构变化幅度较小,Zn2+的加入在一定程度上维持了在消化过程中多肽的二级结构。

    图  8  酪蛋白肽和肽锌螯合物圆二色谱
    注: Pep、Pep-G、Pep-I分别表示酪蛋白肽、胃消化后的酪蛋白肽、胃肠消化后的酪蛋白肽;Pep-Zn、Pep-Zn-G、Pep-Zn-I分别表示肽锌螯合物、胃消化后的肽锌螯合物、胃肠消化后的肽锌螯合物;A:酪蛋白肽圆二色谱图;B:肽锌螯合物圆二色谱图;C:酪蛋白肽二级结构含量;D:酪蛋白肽圆二色谱图二级结构含量。
    Figure  8.  Circular dichroism of casein peptide and peptide zinc chelate

    图9所示,在0.05~0.50 mg/mL范围内,酪蛋白肽胃肠消化产物对Caco-2细胞的生长具有促进作用。肽锌螯合物胃肠消化产物在低浓度时对细胞有增殖活性,在浓度为0.05 mg/mL时,细胞存活率为130.02%±3.42%;当浓度超过0.4 mg/mL后,Caco-2细胞活力降低,在0.5 mg/mL时仅为40.91%±1.05%。倒置显微镜下对Caco-2细胞进行观察(图10),当肽锌螯合物胃肠消化产物达到一定浓度后,细胞形态发生改变,细胞数目减少。许多研究表明,锌与细胞的凋亡相关[38],当外源锌环境发生改变时,细胞氧化应激也会发生改变、生长受到抑制[39]

    图  9  不同浓度的酪蛋白肽和肽锌螯合物胃肠消化产物对Caco-2细胞存活率的影响
    Figure  9.  Effects of casein peptides gastrointestinal digestion and zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products at different concentrations on the viability of Caco-2 cells
    图  10  不同浓度肽锌螯合物胃肠消化产物对Caco-2细胞的影响
    Figure  10.  Effects of zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products with different concentration on Caco-2 cells

    利用质谱对酪蛋白水解物和肽锌螯合物进行鉴定,鉴定出来自牛源的多肽分别为15种和13种,氨基酸序列如表1所示,鉴定得到的肽分子量均小于3000 Da。有研究报道[40],低分子量肽(<3000 Da)和高分子量肽(>10000 Da)的金属螯合能力相对较高。此外,也有研究表明, Zn2+与食源性多肽C端羧基、N端氨基、羰基、酰胺键以及氨基酸Asp、Glu、Cys和His等通过共价键或静电作用进行螯合物[41], Gln和Lys是促进金属螯合的重要部位。Ser的侧链羟基被认为在多肽锌的螯合中起着重要的作用[42],Cys的巯基,Lys的羧酸基、多肽亚氨基(NH)和羰基(C=O)可以参与锌的配位[43]。Glu残基的侧链羧酸基也是锌结合的重要位点[11]。本研究中鉴定的多肽序列中包含许多能对锌螯合起重要贡献的氨基酸。

    表  1  酪蛋白水解物和肽锌螯合物的多肽序列
    Table  1.  Sequences of peptides identified by casein hydrolysate and peptide-zinc chelates
    酪蛋白水解物 GRAVY 分子量(Da) 肽锌螯合物 GRAVY 分子量(Da)
    1 DELQDKIHPF −1.160 1241.616 DELQDKIHPF −1.160 1241.616
    2 DTDYKKYL −1.788 1045.520 EKVNELSK −1.387 946.5204
    3 DVIGPPEPIL 0.480 1049.588 KKISQRYQKF −1.800 1325.769
    4 KKISQRYQKF −1.800 1325.769 LQDMGSDVIPEDDEERGEL −1.105 2146.944
    5 KKYKVPQL −1.262 1003.630 MHQPHQPLPPTVMF −0.421 1691.803
    6 KMPDDDSSCKLPKKSVHEL −1.168 2173.063 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1957.954
    7 LIVTQTMKGL 0.900 1103.649 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1973.948
    8 SDIPNPIGSENSEKTTMPLW −0.830 2216.054 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2144.033
    9 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1957.954 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2160.028
    10 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1973.948 SEYIIKSDENVRKENKKERHGSA −1.800 2717.397
    11 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2144.033 SMANRGKDTNGSQFF −1.080 1675.749
    12 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2160.028 TDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.708 2576.218
    13 TDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPL −0.708 2648.240 TEEEKNRLNFL −1.473 1392.712
    14 TDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.584 2576.218
    15 TEEEKNRLNFL −1.473 1392.712
    注:Grand average of hydropathicity (GRAVY)通过https://web.expasy.org/protparam/网站在线预测,负值越大表示亲水性越强,正值越大表示疏水性越强。
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    另一方面,部分氨基酸对锌的螯合能力较弱,但是在肽锌螯合物的稳定性、溶解性和空间构象等方面具有重要作用,需要进一步确定其对肽锌螯合物在胃肠道内的消化稳定性及经肠道吸收后肽锌螯合物生物利用率的贡献。后续工作将对鉴定出来的多肽序列进行筛选,探究肽锌螯合物在消化过程中的稳定性和跨小肠吸收机制。

    本研究利用碱性蛋白酶对酪蛋白进行预处理,通过乳酸菌发酵获得锌螯合多肽并与硫酸锌反应制备肽锌螯合物,获得多肽的锌螯合率为31.41%±0.97%。酪蛋白肽中的羧基氧、羟基氧、氨基参与了Zn2+的配位。在模拟胃肠消化过程中,肽锌螯合物的抗氧化能力随消化时间延长逐渐升高,其中锌离子溶解性优于硫酸锌。随着消化过程进行,肽锌螯合物变得更为有序,Zn2+在一定程度上维持了酪蛋白肽的二级结构。然而,当浓度达到0.4 mg/mL以上时,肽锌螯合物会改变细胞形态,影响细胞增殖并表现出一定的细胞毒性。研究结果为高效安全的酪蛋白肽锌补充剂的制备和应用提供了一定的科学依据。

  • 图  1   不同制备条件对酪蛋白肽锌螯合率及多肽含量的影响

    注:A:不同发酵组合酪蛋白肽的锌螯合率;B:不同发酵时间酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;C:不同酶添加量酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;D:不同初始pH酪蛋白肽的锌螯合率和多肽含量;图中不同小写字母表示差异显著,P<0.05,图6图9同。

    Figure  1.   Effect of different preparation conditions on zinc chelation rate and peptide content of casein peptides

    图  2   酪蛋白肽和肽锌螯合物SEM图(×1.0 k)

    注:A:酪蛋白肽;B:肽锌螯合物。

    Figure  2.   SEM images of casein peptide and peptide-zinc chelate (×1.0 k)

    图  3   酪蛋白肽和肽锌螯合物FTIR图

    Figure  3.   FIRT diagram of casein peptide and peptide-zinc chelate

    图  4   酪蛋白肽和肽锌螯合物zeta电位图

    注:***表示P<0.001。

    Figure  4.   Zeta potential diagram of casein peptide and peptide-zinc chelate

    图  5   不同浓度的Zn2+肽锌螯合物的荧光光谱图

    Figure  5.   Fluorescence spectra of peptide-zinc chelate at different concentrations of Zn2+

    图  6   酪蛋白肽和肽锌螯合物抗氧化性测定

    注: A:酪蛋白肽和肽锌螯合物DPPH自由基清除率的测定;B:酪蛋白肽和肽锌螯合物ABTS+自由基清除率的测定;C:酪蛋白肽和肽锌螯合物铁还原力的测定。

    Figure  6.   Determination of antioxidant properties of casein peptide and peptide-zinc chelate

    图  7   消化过程中肽锌螯合物和硫酸锌中锌离子溶解率(A)和酪蛋白肽锌螯合物抗氧化活性残留率(B)

    注: Pep、Pep-G、Pep-I分别表示酪蛋白肽、胃消化后的酪蛋白肽、胃肠消化后的酪蛋白肽;Pep-Zn、Pep-Zn-G、Pep-Zn-I分别表示肽锌螯合物、胃消化后的肽锌螯合物、胃肠消化后的肽锌螯合物;*表示 P<0.05; **表示 P<0.01;***表示 P<0.001。

    Figure  7.   Rate of zinc dissolution of peptide-zinc chelate and zinc sulfate during digestion (A) and remaining ratios of antioxidant activity of casein peptide-zinc chelate (B)

    图  8   酪蛋白肽和肽锌螯合物圆二色谱

    注: Pep、Pep-G、Pep-I分别表示酪蛋白肽、胃消化后的酪蛋白肽、胃肠消化后的酪蛋白肽;Pep-Zn、Pep-Zn-G、Pep-Zn-I分别表示肽锌螯合物、胃消化后的肽锌螯合物、胃肠消化后的肽锌螯合物;A:酪蛋白肽圆二色谱图;B:肽锌螯合物圆二色谱图;C:酪蛋白肽二级结构含量;D:酪蛋白肽圆二色谱图二级结构含量。

    Figure  8.   Circular dichroism of casein peptide and peptide zinc chelate

    图  9   不同浓度的酪蛋白肽和肽锌螯合物胃肠消化产物对Caco-2细胞存活率的影响

    Figure  9.   Effects of casein peptides gastrointestinal digestion and zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

    图  10   不同浓度肽锌螯合物胃肠消化产物对Caco-2细胞的影响

    Figure  10.   Effects of zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products with different concentration on Caco-2 cells

    表  1   酪蛋白水解物和肽锌螯合物的多肽序列

    Table  1   Sequences of peptides identified by casein hydrolysate and peptide-zinc chelates

    酪蛋白水解物 GRAVY 分子量(Da) 肽锌螯合物 GRAVY 分子量(Da)
    1 DELQDKIHPF −1.160 1241.616 DELQDKIHPF −1.160 1241.616
    2 DTDYKKYL −1.788 1045.520 EKVNELSK −1.387 946.5204
    3 DVIGPPEPIL 0.480 1049.588 KKISQRYQKF −1.800 1325.769
    4 KKISQRYQKF −1.800 1325.769 LQDMGSDVIPEDDEERGEL −1.105 2146.944
    5 KKYKVPQL −1.262 1003.630 MHQPHQPLPPTVMF −0.421 1691.803
    6 KMPDDDSSCKLPKKSVHEL −1.168 2173.063 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1957.954
    7 LIVTQTMKGL 0.900 1103.649 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1973.948
    8 SDIPNPIGSENSEKTTMPLW −0.830 2216.054 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2144.033
    9 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1957.954 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2160.028
    10 SDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.663 1973.948 SEYIIKSDENVRKENKKERHGSA −1.800 2717.397
    11 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2144.033 SMANRGKDTNGSQFF −1.080 1675.749
    12 SDIPNPIGSENSGKTTMPLW −0.675 2160.028 TDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.708 2576.218
    13 TDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPL −0.708 2648.240 TEEEKNRLNFL −1.473 1392.712
    14 TDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPL −0.584 2576.218
    15 TEEEKNRLNFL −1.473 1392.712
    注:Grand average of hydropathicity (GRAVY)通过https://web.expasy.org/protparam/网站在线预测,负值越大表示亲水性越强,正值越大表示疏水性越强。
    下载: 导出CSV
  • [1]

    MARET W, KREL A. Cellular zinc and redox buffering capacity of metallothionein/thionein in health and disease[J]. Molecular Medicine,2007,13(7):371−375.

    [2]

    MILLER L V, HAMBIDGE M, NAAKE V L, et al. Size of the zinc pools that exchange rapidly with plasma zinc in humans:Alternative techniques for measuring and relation to dietary zinc intake[J]. Journal of Nutrition,1994,124(2):268−276.

    [3]

    FREDLUND K, ISAKSSON M, LENA R, et al. Absorption of zinc and retention of calcium:Dose-dependent inhibition by phytate[J]. Journal of Trace Elements in Medicine & Biology,2006,20(1):49−57.

    [4]

    AKBAR B, NILOUFAR N, ABOLFAZL M, et al. Evaluation and comparison of zinc absorption level from 2-alkyle 3-hydroxy pyranon-zinc complexes and zinc sulfate in rat in vivo[J]. Advanced Biomedical Research,2013,2(1):77. doi: 10.4103/2277-9175.116432

    [5]

    LEE S Y, NAM S, CHOI Y, et al. Fabrication and characterizations of hot-melt extruded nanocomposites based on zinc sulfate monohydrate and soluplus[J]. Applied Sciences,2017,7(9):902. doi: 10.3390/app7090902

    [6]

    MIQUEL E, FARRÉ R. Effects and future trends of casein phosphopeptides on zinc bioavailability[J]. Trends in Food Science & Technology,2007,18:139−143.

    [7]

    ADAMS C, SAWH F, GREEN-JOHNSON J M, et al. Characterization of casein-derived peptide bioactivity:Differential effects on angiotensin-converting enzyme inhibition, cytokine, and nitric oxide production[J]. Journal of Dairy Science,2020,103(7):5805−5815.

    [8]

    YANG Y J, WANG B, LI B. Structural requirement of casein peptides for transcytosis through the caco-2 cell monolayer:Hydrophobicity and charge property affect the transport pathway and efficiency[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(42):11778−11787.

    [9]

    WANG D, LIU K X, CUI P B, et al. Egg-white-derived antioxidant peptide as an efficient nanocarrier for zinc delivery through the gastrointestinal system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68(7):2232−2239.

    [10]

    CHEN D, LIU Z Y, HUANG W Q, et al. Purification and characterisation of a zinc-binding peptide from oyster protein hydrolysate[J].Journal of Functional Foods,2013,5(2):689−697. doi: 10.1016/j.jff.2013.01.012

    [11]

    LU D, PENG M Y, YU M, et al. Effect of enzymatic hydroysis on the zinc binding capacity and in vitro gastrointestinal stability of peptides derived from pumpkin ( Cucurbita pepo L.) seeds[J]. Frontiers in Nutrition,2021,8:647782.

    [12]

    WANG B, LI B. Effect of molecular weight on the transepithelial transport and peptidase degradation of casein-derived peptides by using Caco-2 cell model[J]. Food Chemistry,2017,218:1−8.

    [13] 王波, 杨继国, 任杰, 等. 酪蛋白肽电荷性质对其肽锌螯合物的胃肠稳定性及吸收的影响[J]. 中国食品添加剂,2019,30(3):59−66. [WANG B, YANG J G, REN J, et al. Effect of charge properties of casein-derived peptides on in vitro gastrointestinal stability and absorption of zinc-peptide complexes[J]. China Food Additives,2019,30(3):59−66. doi: 10.3969/j.issn.1006-2513.2019.03.003

    WANG B, YANG J G, REN J, et al. Effect of charge properties of casein-derived peptides on in vitro gastrointestinal stability and absorption of zinc-peptide complexes[J]. China Food Additives, 2019, 303): 5966. doi: 10.3969/j.issn.1006-2513.2019.03.003

    [14]

    GARCÍA A V, DEMAND V, KERN K, et al. Enzymatic hydrolysis and fermentation of pea proteinisolate and its effects on antigenic proteins, functional properties, and sensory profile[J]. Foods,2022,11(1):118.

    [15]

    ZHU S Y, ZHENG Y M, HE S, et al. Novel Zn-binding peptide isolated from soy protein hydrolysates:Purification, structure, and digestion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,69(1):483−490.

    [16]

    SPELLMAN D, MCEVOY E, CUINN G O, et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein:Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal,2003,13(6):447−453.

    [17] 韦献雅, 殷丽琴, 钟成, 等. DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J]. 食品科学,2014,35(9):317−322. [WEI X Y, YIN L Q, ZHONG C, et al. Advances in the DPPH radical scavenging assay for antioxidant activity evaluation[J]. Food Science,2014,35(9):317−322. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201409062

    WEI X Y, YIN L Q, ZHONG C, et al. Advances in the DPPH radical scavenging assay for antioxidant activity evaluation[J]. Food Science, 2014, 359): 317322. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201409062

    [18]

    WHANG C, WANG B, LI B, et al. Degradation and antioxidant activities of peptides and zinc-peptide complexes during in vitro gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry,2015,173:733−740.

    [19]

    ELKHTAB E, EL-ALFY M, SHENANA M, et al. New potentially antihypertensive peptides liberated in milk during fermentation with selected lactic acid bacteria and kombucha cultures[J]. Journal of Dairy Science,2017,17(12):459.

    [20]

    XIE N N, WANG B, JIANG L P, et al. Hydrophobicity exerts different effects on bioavailability and stability of antioxidant peptide fractions from casein during simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell absorption[J]. Food Research International,2015,76(OCT.PT.3):518−526.

    [21] 郑淋, 游丽君, 赵谋明, 等. 不同杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化活性的影响[J]. 食品与发酵工业,2011,37(3):109−112. [ZHENG L, YOU L J, ZHAO M M, et al. Effect of sterilization on the antioxidant activity of loach peptide[J]. Food and Fermentation Industries,2011,37(3):109−112. doi: 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.03.033

    ZHENG L, YOU L J, ZHAO M M, et al. Effect of sterilization on the antioxidant activity of loach peptide[J]. Food and Fermentation Industries, 2011, 373): 109112. doi: 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.03.033

    [22]

    LI J P, GONG C, WANG Z Y, et al. Oyster-derived zinc-binding peptide modified by plastein reaction via zinc chelation promotes the intestinal absorption of zinc[J]. Marine Drugs,2019,17(6):341.

    [23]

    SHU G W, HUANG J, BAO C J, et al. Effect of different proteases on the degree of hydrolysis and angiotensin i-converting enzyme-inhibitory activity in goat and cow milk[J]. Biomolecules,2018,8(4):101.

    [24]

    ZHU K X, WANG X P, GUO X N. Isolation and characterization of zinc-chelating peptides from wheat germ protein hydrolysates[J]. Journal of Functional Foods,2015,12:23−32.

    [25]

    CHEN G W, LIN H T V, HUANG L W, et al. Purification and identification of cholesterol micelle formation inhibitory peptides of hydrolysate from high hydrostatic pressure-assisted protease hydrolysis of fermented seabass byproduct[J]. International Journal of Molecular Sciences,2021,22(10):5295.

    [26] 万春艳, 赵谋明, 赵海锋, 等. 大豆蛋白水解物对酿酒酵母生长和发酵性能的影响[J]. 食品与发酵工业, 2011, 37(9):50−53. [WAN C Y, ZHAO M M, ZHAO H F, et al. Effects of soy protein hydrolysates on the growth and fermentation characteristics of brewer's yeast[J]. Food and Fermentation Industries, 2011, 37(9):50−53.

    WAN C Y, ZHAO M M, ZHAO H F, et al. Effects of soy protein hydrolysates on the growth and fermentation characteristics of brewer's yeast[J]. Food and Fermentation Industries, 2011, 37(9): 50−53.

    [27]

    ZHANG Z R, ZHOU F B, LIU X L, et al. Particulate nanocomposite from oyster ( Crassostrea rivularis) hydrolysates via zinc chelation improves zinc solubility and peptide activity[J]. Food Chemistry,2018,258:269−277.

    [28]

    YIANNIKOURIS A, CONNOLLY C, POWER R, et al. Characterization of metal-peptide complexes in feed supplements of essential trace elements[J]. Metallomics,2009,1(3):235−248.

    [29]

    REDDI A R, GUZMAN T R, BREECE R M, et al. Deducing the energetic cost of protein folding in zinc finger proteins using designed metallopeptides[J]. Journal of the American Chemical Society,2007,129(42):12815−12827.

    [30]

    ECKERT E, BAMDAD F, CHEN L Y. Metal solubility enhancing peptides derived from barley protein[J]. Food Chemistry,2014,159:498−506.

    [31]

    SUN R N, LIU X F, YU Y, et al. Preparation process optimization, structural characterization and in vitro digestion stability analysis of Antarctic krill ( Euphausia superba) peptides-zinc chelate[J]. Food Chemistry,2021,340:128056.

    [32]

    WANG C, LI B, WANG B, et al. Degradation and antioxidant activities of peptides and zinc-peptide complexes during in vitro gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry,2015,173: 733−740.

    [33]

    LIU X Y, WANG Z X, YIN F W, et al. Zinc-chelating mechanism of sea cucumber ( Stichopus japonicus)-derived synthetic peptides[J]. Marine Drugs,2019,17(8):438.

    [34]

    PHAM T L, KOVERMANN M, THOMAS F. Switchable zinc (II)-responsive globular β-sheet peptide[J]. ACS Synthetic Biology,2021,11(1):254−264.

    [35] 阮国瑞. 核桃楸多肽—钙螯合物的制备及性质研究[D]. 北京:北京林业大学, 2019. [RUAN G R. Preparation and properties of Juglans mandshurica Maxim. calcium-chelating peptide[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2019.

    RUAN G R. Preparation and properties of Juglans mandshurica Maxim. calcium-chelating peptide[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2019.

    [36]

    WANG Y, BAI H S, WANG S J, et al. Casein phosphopeptide-calcium chelate:Preparation, calcium holding capacity and simulated digestion in vitro[J]. Food Chemistry,2023,401:134218.

    [37]

    KRISHNA S S, MAJUMDAR I, GRISHIN N V. Structural classification of zinc fingers:Survey and summary[J]. Nucleic Acids Research,2003,31(2):532−550.

    [38]

    PARVEEN N, ANSARI M O, AHMAD M F, et al. Zinc:An element of extensive medical importance[J]. Current Medicine Research and Practice,2017,7(3):90−98.

    [39]

    KOCDOR H, ATES H, AYDIN S, et al. Zinc supplementation induces apoptosis and enhances antitumor efficacy of docetaxel in non-small-cell lung cancer[J]. Drug Design, Development and Therapy,2015,9:3899.

    [40]

    TAMAMURA H, OTAKA A, MURAKAMI T, et al. An anti-HIV peptide, T22, forms a highly active complex with Zn(II)[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,1996,229(2):648.

    [41]

    KATIMBA H A, WANG R, CHENG C. Current findings support the potential use of bioactive peptides in enhancing zinc absorption in humans[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2021,258:269−277.

    [42]

    GERBINO E, MOBILI P, TYMCZYSZYN E, et al. FTIR spectroscopy structural analysis of the interaction between Lactobacillus kefir S-layers and metal ions[J]. Journal of Molecular Structure,2011,987:186−192.

    [43]

    WANG C, LI B, AO J. Separation and identification of zinc-chelating peptides from sesame protein hydrolysate using IMAC-Zn2+ and LC-MS/MS[J]. Food Chemistry,2012,134(2):1231−1238. doi: 10.1016/j.foodchem.2012.02.204

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-02-05
  • 网络出版日期:  2023-10-03
  • 刊出日期:  2023-11-24

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