Based on Network Pharmacology and Molecular Docking to Discuss the Mechanism of Antitussive and Expectorant Action of Ruanerli
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摘要: 采用网络药理学方法预测软儿梨止咳化痰作用及其机制，并采用分子对接和动物实验对预测结果予以验证。通过文献调研和TCMSP等数据库筛选得到软儿梨的成分与作用靶点，与GeneCards数据库中“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”相关的两组基因相映射，得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。通过Metascape平台对靶点基因进行GO和KEGG富集分析；通过STRING数据平台构建靶点基因间PPI网络；利用Cytoscape插件CytoHubba筛选软儿梨止咳化痰作用Top10基因，并通过Metascape数据平台对Top10基因进行KEGG通路富集以预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。通过Autodock Vina对预测所得Top10基因蛋白和软儿梨Top3活性成分进行分子对接；最后通过氨水引咳试验和酚红排泄试验对预测所得结果进行验证。经多数据库联合分析，发现软儿梨中已见报道的化学成分有51个，对应作用靶点282个，其中80个与止咳化痰作用有关，根据Degree值筛选出的Top10基因主要富集在与感染和免疫相关通路上。分子对接试验证明Top10基因与PPI网络中排名前3位的化学成分（咖啡酸、芦丁、戊醛）有较强的结合活性。动物实验证明软儿梨可以明显抑制小鼠氨水引发的咳嗽反应，降低血清中IL-6和IL-13水平，增加小鼠气管酚红的排泄量。PCR和WB检测发现，软儿梨可降低炎症相关基因IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA水平和蛋白表达，软儿梨的止咳化痰作用可能与降低炎性基因表达，减少致炎因子释放有关。Abstract: The antitussive and expectorant effects of Ruanerli and its mechanism were investigated by methods of network pharmacology. The outcomes predicted were verified by molecular docking and animal experiments. The components and targets of Ruanerli were obtained by literature investigation and TCMSP database screen. Mapping with two groups of genes related to "cough" and "sputum" from GeneCards database, the target genes of antitussive and expectorant effects of Ruanerli were obtained. GO and KEGG enrichment analysis of the target genes was performed by Metascape platform. The PPI network among the target genes was constructed through STRING data platform. Cytoscape plugin CytoHubba was used to screen the Top10 genes related to antitussive and expectorant effects of Ruanerli, and KEGG pathway enrichment was performed on the Top10 genes through Metascape data platform to predict the possible signal pathways involved in antitussive and expectorant effects of Ruanerli. Autodock Vina was used for molecular docking between the predicted Top10 gene proteins and the Top 3 active ingredients of Ruanerli. Finally, the predicted results were verified by ammonia induced cough test and phenol red excretion test. According to the analysis of multiple databases, 51 chemical components and 282 corresponding targets have been reported, eighty of them were related to the antitussive and expectorant effects of Ruanerli. The Top10 genes selected by Degree value were mainly concentrated in infection and immune-related pathways. Molecular docking test showed that the Top10 genes had strong binding activity with the Top3 chemical components (Caffeic acid, Rutin and Valeraldehyde) in PPI network. Animal experiments showed that the cough induced by ammonia was significantly inhibited when treated with Ruanerli in mice. The levels of IL-6 and IL-13 in serum were reduced and the excretion of phenol red in mice trachea was increased. PCR and WB detection showed that the mRNA levels and protein expressions of inflammatory genes IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 were decreased, suggesting that the antitussive and expectorant effects of Ruanerli might be related to decreasing the expression of inflammatory genes and the release of inflammatory factors.
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软儿梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）也叫冻梨、香水梨，是兰州特色水果。食用方法独特，具有后熟发酵及冻食特性。每年深秋采摘，新鲜果品口味欠佳，果肉硬而味酸，冷冻贮藏40多天后，果皮变黑，果肉发酵软化，其品质不因褐变而受到影响，果糖含量增加，此时食用梨软如泥，浆液充盈，味甜似蜜，是中国地方梨品种中的一个特色品种。2015年被农业部批准为“全国农产品地理标志”。兰州年产软儿梨3万多吨，但是由于技术原因，除直接食用和简单加工后制成果汁、果酒外，未见高附加值的下游产品，资源浪费巨大，高值化、多品类的开发利用成为现今迫切需求。
咳嗽是呼吸道系统的常见病。中医认为“肺主宣发和肃降”，肺气宣发通畅，则能主一身之气而呼吸调匀，助血液循环而贯通百脉[1−2]。但肺为娇脏，最易受外邪侵袭，如果受到风、寒、暑、湿、燥、火六淫的侵袭，就会造成肺失宣降，肺气上逆，引起咳嗽。按病邪性质咳嗽可分为风寒咳嗽、风热咳嗽、风燥咳嗽，痰湿咳嗽等[3−6]。秋冬时节，由于气候干燥多燥邪或风邪犯肺引发咳嗽，治疗多以清热去燥；而内伤咳嗽，多以脏器功能的失调为基础，以痰湿、痰热、肝火犯肺，肺阴亏损等为主要病症，治疗多以滋阴润肺为主[7−9]。软儿梨性凉味甘，富含果酸、苹果酸、柠檬酸、蔗糖、葡萄糖等成分，具有清热解毒、润燥止咳，生津化痰、滋身祛疾之功效[10−11]，是药食兼备的妙品。《本草纲目》记载软儿梨有润肺、止咳、凉心消炎、降火、解疮毒、解酒等多种功效，当地人常服食之以镇咳化痰，但其具体作用机制鲜见报道。本研究旨在采用网络药理学方法和生物信息分析技术对软儿梨止咳化痰作用进行研究，并通过分子对接和动物实验对分析结果进行验证，以期为软儿梨止咳化痰功效提供理论与试验依据。
1. 材料与方法
1.1 数据库与软件
中药系统药理学数据库（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、本草组鉴（http://herb.ac.cn）、ECTM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/）、STRING数据库（https://cn.string-db.org/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、Metascape分析平台（https://metascape.org/）、PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uiprot数据库（https://www.uniprot.org/）、PDB数据库（https://www.rcsb.org/）、Cytoscape 3.6.1、Autodock Vina 2.1、Chem3D、Pymol 3.3、Venny 2.1.0等。
1.2 材料与仪器
软儿梨冻梨 甘肃皋兰百璐通瓜果专业合作社提供，剥去表皮后自然解冻取汁1000 mL，相当于软儿梨冻梨1460.7 g，经高效液相色谱法测定，总酚含量为149.14 mg/kg、总黄酮含量为58.23 mg/kg[12]；SPF级昆明小鼠 100只，18~20 g，雌雄各半，甘肃中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0002，动物伦理审查批号：20220714；麻杏止咳糖浆 太极集团四川南充制药有限公司，国药准字Z51022042；氨水、酚红 青岛海湾精细化工有限公司；IL-6 ELISA试剂盒、IL-13 ELISA试剂盒 南京建成生物工程研究所；RT-PCR试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、RNA提取（Trizol法）试剂盒 上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗IL6多克隆抗体、兔抗IL1B多克隆抗体、兔抗MAPK3多克隆抗体、兔抗VEGFA多克隆抗体、兔抗PTGS2多克隆抗体 上海酶联生物科技有限公司。
UV-5500型紫外分光光度计、BS124S型电子天平、B-600型超微量分光光度计 上海元析仪器有限公司；TDL-5M型台式大容量低温离心机 上海精密仪器仪表有限公司；医用KJR-602C型超声雾化器 合肥康居人智能科技有限公司；SUNRISE酶联免疫检测仪 瑞士TECAN公司；PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪 美国Applied Biosystem公司；1645050型基础电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、小型rans-Blot转印槽 美国Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析
通过调研，收集文献已报道的软儿梨化学成分，TCMSP、本草组鉴、ECTM数据库中检索其对应的作用靶点。GeneCards数据库中分别以关键词“咳嗽（cough）”和“痰（sputum）”检索，得到与咳嗽和生痰相关的两组基因。将GeneCards数据库中所得两组基因与软儿梨的作用基因相映射，得到软儿梨止咳化痰作用的靶点基因。Venny 2.1.0绘制维恩图，Cytoscape绘制软儿梨止咳化痰作用成分-靶点图。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至Metascape数据分析平台，进行GO功能富集分析（包括Biological process、Cellular component、Molecular function）和KEGG通路富集分析。将软儿梨止咳化痰作用靶点基因提交至STRING数据平台，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI网络）。利用Cytoscape插件CytoHubba，根据Degree值过滤出PPI网络中的关键基因（Top10基因）。通过Metascape数据平台对Top10基因进行KEGG通路富集，预测软儿梨止咳化痰作用可能涉及的信号通路。
1.3.2 软儿梨止咳化痰作用Top10基因分子对接验证
Uiprot数据库、PDB数据库中检索下载Top10基因的蛋白结构，PubChem数据库中下载PPI网络中排名前3位的化学成分3D结构。采用Chem3D、Pymol对受体和配体进行加氢、去水、均电荷等预处理，采用Autodock Vina进行对接，设置对接20次，采用Pymol将结合能最小的对接结果可视化。
1.3.3 软儿梨止咳化痰作用动物试验验证
1.3.3.1 氨水引咳试验
SPF级昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18~20 g，随机分为5组，分别为软儿梨高、中、低剂量组（软儿梨原汁0.2、0.15、0.1 mL/10 g），麻杏止咳糖浆（0.1 mL/10 g）为阳性对照组，生理盐水（0.1 mL/10 g）为空白对照组；每天灌胃给药1次，连续10 d。于最后1次给药1 h后逐一将小鼠放入钟罩内，用医用超声雾化器以最大喷雾量（0.2 mL/min）向钟罩内喷入25%氨水气雾对小鼠进行引咳，15 s后将小鼠移出，记录从开始喷雾到小鼠产生第一次咳嗽所需时间（咳嗽潜伏期）和3 min内咳嗽次数[13]。小鼠典型咳嗽症状为：腹部内缩，同时张大口，有咳嗽声。并按公式计算止咳率。
止咳率(%)=给药组咳嗽潜伏期空白组咳嗽潜伏期×100 1.3.3.2 酚红排泄试验
SPF级昆明种小鼠50只，雌雄各半，分组及给药方法同氨水引咳试验。末次给药30 min后小鼠腹腔注射5%的酚红溶液0.5 mL（0.5 g/kg），30 min后处死动物，剥离甲状软骨下至气管分叉处的气管，放入盛有2 mL生理盐水的试管中，加入1 mol/L的NaOH 0.1 mL摇匀，于波长546 nm处测吸光度，根据标准曲线，计算酚红含量（μg/mL）[14]。
1.3.3.3 ELISA法检测血清炎症因子水平
氨水引咳试验中的小鼠，记录咳嗽潜伏期和3 min内咳嗽次数后，摘眼球取血，离心取血清，按ELISA试剂盒说明测定血清中IL-6和IL-13含量。
1.3.3.4 RT-PCR检测肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA表达
氨水引咳试验中的小鼠，摘眼球取血后，处死动物，冰上取出肺脏，分成两份，−80 ℃冰箱保存，分别供逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹（WB）使用。取−80 ℃保存的肺组织50 mg，按试剂盒说明书提取收集RNA，将得到的RNA溶于DEPC水中；取溶解后的RNA 2 μL，微量分光光度计于260、280 nm处测定吸光度，通过A260/A280计算RNA的纯度和浓度。通过逆转录试剂盒合成cDNA，NCBI Geneba（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Primer Bank（http://harvard.edu）搜索基因序列，根据基因序列设计引物（引物序列见表1），采用实时荧光定量PCR扩增，每个样品做3个复孔，扩增条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。
表 1 引物序列表Table 1. Primer sequence基因 引物 序列（5'→3'） 长度 IL6 正向 ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG 170 bp 反向 CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG VEGFA 正向 AGGGCAGAATCATCACGAAGT 183 bp 反向 AGGGTCTCGATTGGATGGCA PTGS2 正向 TAAGTGCGATTGTACCCGGAC 285 bp 反向 TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT IL1B 正向 AGCTACGAATCTCCGACCAC 289 bp 反向 CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA MAPK3 正向 CTACACGCAGTTGCAGTACAT 213 bp 反向 CAGCAGGATCTGGATCTCCC 1.3.3.5 Western Blot检测肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的蛋白表达
取适量−80 ℃保存的肝脏组织加入裂解液，8000 r/min，4 ℃低温匀浆10 min，冰上裂解20 min后冻融3次，低温离心10 min（8000 r/min，4 ℃），取上清，用5×上样缓冲液与蛋白样品按1:4的比例混合，100 ℃变性5 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，5% BSA封闭1 h，一抗（1:1000稀释）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光液显影，Image J软件分析目的蛋白与内参蛋白的灰度值，根据相应内参的灰度值计算目的蛋白的相对表达量。
1.4 数据处理
用SPSS 20.0软件对所有数据进行处理，计量资料用¯X+SD表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果
经文献调研发现，软儿梨中已见报道的化学成分有51个（表2），经TCMSP、本草组鉴、ECTM数据库检索得到对应作用靶点282个。GeneCards数据库中与咳嗽相关的基因有4425个，与生痰有关的基因有1737个，三者映射重叠基因有80个（图1a），软儿梨止咳化痰作用成分-靶点-疾病映射图见图1b。将80个交集基因提交至Metascape数据分析平台，得到KEGG通路富集（图1c）和GO功能富集（图1d）结果，如图可知，这80个基因可能与细胞内过氧化物酶活性（Peroxidase activity）、抗氧化活性（Antioxidant activity）、氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、对活性氧的反应（Response to reactive oxygen species）等生物过程有关，机制可能涉及TNF信号通路、IL-17信号通路、癌症信号通路等。通过STRING数据库，构建软儿梨止咳化痰作用靶点基因间的蛋白互作网络（PPI网络）（图1e）。利用Cytoscape插件CytoHubba，根据Degree值过滤出PPI网络中的关键基因（Top10基因）（图1f），分别是：GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3。Top10基因与软儿梨中所含化学成分对应关系如图1g所示。对Top10基因进行KEGG通路富集分析，前20条富集信号通路如图1h所示，其中12条信号通路与细菌、病毒及寄生虫感染有关（Pertussis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Pathogenic Escherichia coli infection、Chagas disease、Human cytomegalovirus infection、Yersinia infection、Leishmaniasis、Salmonella infection、Amoebiasis、Malaria、Legionellosis、Hepatitis B），4条信号通路与免疫相关疾病有关（IL-17 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、Rheumatoid arthritis、Toll-like receptor signaling pathway）（见图1i），提示软儿梨可能主要通过消除炎症感染、增加人体免疫力来发挥止咳化痰作用。
表 2 软儿梨化学成分表Table 2. Chemical composition table of Ruanerli序号 成分中文名 成分英文名 分子式 分子量（g/mol） 1 苹果酸 MLT（malic acid） C4H6O5 134.09 2 柠檬酸 citric acid C6H8O7 192.12 3 熊果苷 isohomoarbutin C13H18O7 286.28 4 儿茶酚 catechol C6H6O2 110.11 5 绿原酸 chlorogenic acid C16H18O9 354.31 6 咖啡酸 caffeic acid C9H8O4 180.16 7 对香豆酸 （Z）-p-coumaric acid C9H8O3 164.16 8 阿魏酸 ferulic acid C10H10O4 194.18 9 芦丁 rutine C27H30O16 610.5 10 2-甲基-丁醇 2-methyl-butanol C5H12O 88.15 11 3,7-二甲基-6-辛烯 （R）-3,7-dimethyl-
6-octenC13H24O2 212.33 12 反-2-己烯 trans-2-hexene C6H12 84.16 13 反-2-辛烯 trans-2-octen C10H18O2 170.25 14 环己醇 cyclohexanol C6H12O 100.16 15 二氢杨梅素 dihydromyricetin C9H20O 144.25 16 戊醇 amyl alcohol C5H12O 88.15 17 辛醇 capryl alcohol C8H18O 130.23 18 2-甲基萘 2-methylnaphthalene C11H10 142.2 19 邻苯二甲酸二乙酯 diethyl phthalate/
dimethyl phthalateC12H14O4 222.24 20 反-2-辛烯醛 trans-2-octenal C8H14O 126.2 21 庚醛 n-heptanal C7H14O 114.19 22 癸醛 1-decanal C10H20O 156.26 23 己醛 hexanal C6H12O 100.16 24 壬醛 1-nonaldehyde C9H18O 142.24 25 戊醛 valeraldehyde C5H10O 86.13 26 2-甲基丁酸 2-Methylbutyric acid C5H10O2 102.13 27 3,4二羟苯基-
D-丙氨酸3-（3,4-dihydroxyphenyl）-d-alanine C9H11NO4 197.19 28 β-苯基-L-丙氨酸 β-phenyl-L-alanine C9H11NO2 165.19 29 乙醛酸 glyoxylic acid C2H2O3 74.04 30 棕榈酸 palmitic acid C16H32O2 256.42 31 2-戊酮 2-pentanone C5H10O 86.13 32 α-法呢烯 a-farnesene C15H24 204.35 33 环十二烯 cyclododecene C12H22 166.3 34 十七烷甲酸 1-heptadecanecar-
boxylic acidC18H36O2 284.5 35 苯甲酸苄酯 benzyl benzoate C14H12O2 212.24 36 醋酸丁酯 butyl acetate C6H12O2 116.16 37 丁酸丁酯 butyl butyrate C8H16O2 144.21 38 3-苯基丁酸甲酯 3-benzyl methyl
butyrateC20H28N2O3 344.4 39 丁酸乙酯 ethyl butyrate C6H12O2 116.16 40 核黄素 riboflavin C17H20N4O6 376.4 41 硫胺素 thiamine C12H17N4OS+ 265.36 42 尼克酸 niacin C6H5NO2 123.11 43 维生素C vitamin C C6H8O6 176.12 44 蔗糖 cane sugar C12H22O11 342.3 45 乙醇 ethanol C2H6O 46.07 46 萘 naphthalene C10H8 128.169 47 丙酸 propionic acid C3H6O2 74.08 48 乙酸 acetic acid C2H4O2 60.05 49 丙酮 acetone C3H6O 58.08 50 苯乙烯 styrene C8H8 104.15 51 甲苯 toluene C7H8 92.14 ![]()
图 1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果注：a：软儿梨作用靶点基因-GeneCards中止咳化痰基因韦恩图；b：软儿梨-成分-靶点图；c：软儿梨止咳化痰基因KEGG通路富集图；d：软儿梨止咳化痰基因GO功能富集图；e：软儿梨止咳化痰基因蛋白互作网络图；f：软儿梨止咳化痰Top10基因；g：软儿梨中所含化学成分-Top10基因关系图；h：Top10基因KEGG通路富集圈图；i：Top10基因KEGG通路富集分组图。Figure 1. Results of network pharmacological analysis on the antitussive and expectorant effects of Ruanerli2.2 软儿梨止咳化痰作用Top10基因分子对接结果
分子对接结果显示，软儿梨止咳化痰作用Top10基因与PPI网络中排名前3位的化学成分（咖啡酸、苦丁、戊醛）的结合能均小于-5 kcal/mol（见图2），说明受体与配体能够自发结合，且具有较强的结合活性[15]，部分分子对接结果见图3。
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图 2 软儿梨止咳化痰作用Top10基因蛋白与Top3活性成分结合能图Figure 2. Binding energy graph of Top10 gene proteins for the antitussive and expectorant effects of Ruanerli and Top3 active components![]()
图 3 Top10基因蛋白与芦丁分子对接图注：a：GAPDH与芦丁分子对接图；b：IL6与芦丁分子对接图；c：IL1B与芦丁分子对接图；d：VEGFA与芦丁分子对接图；e：JUN与芦丁分子对接图；f：PTGS2与芦丁分子对接图；g：CASP3与芦丁分子对接图；h：CXCL8与芦丁分子对接图；i：IL10与芦丁分子对接图；j：MAPK3与芦丁分子对接图。Figure 3. Molecular docking diagram of Top10 gene proteins and rutin2.3 软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响
氨水是一种刺激性较强的化学物质，动物吸入氨水气雾后，可刺激呼吸道感受器，引起咳嗽[13]。由表3可知，经氨水刺激后小鼠出现明显咳嗽反应。与空白组比较，软儿梨组小鼠咳嗽次数显著减少（P<0.05），咳嗽潜伏期也有显著延长（P<0.05），且作用呈剂量依赖性，提示软儿梨对氨水所致咳嗽有较好的抑制作用。
表 3 软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响（n=10）Table 3. Effect of Ruanerli on cough response induced by ammonia in mice (n=10)组别 给药量（mL/10 g） 咳嗽潜伏期（s） 咳嗽次数（次/3 min） 止咳率（%） 空白对照组 生理盐水 35.1000±13.7554 15.9000±6.3675 100 软儿梨低剂量组 0.1 33.1111±8.2681 15.4444±8.8192 94.33 软儿梨中剂量组 0.15 50.9000±16.2580*# 11.2000±2.6998*# 145.01# 软儿梨高剂量组 0.2 63.0000±26.7664*#& 7.6000±5.6999*#& 179.49#& 麻杏止咳糖浆组 0.1 69.4000±19.1265*#& 6.3000±3.5917*#& 197.72#& 注：与空白对照组比较，*P<0.05；与软儿梨低剂量组比较，#P<0.05；与软儿梨中剂量组比较，&P<0.05；表4~表6同。 2.4 软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响
酚红是一种对人体无害的染料，经腹腔注射进入小鼠体内后可部分由呼吸道排泄，由祛痰作用的药物在使支气管分泌增加的同时，也使呼吸道黏膜的酚红排泄量增加，因此可由呼吸道酚红的排泄量间接推测药物的祛痰作用。在本实验中，酚红标准曲线为：Y=0.81048X−0.05511，r2=0.97959。经与标准曲线比对发现，与空白组比较软儿梨组酚红排泄量显著增加（P<0.05），其呈显著剂量依赖性（P<0.05）（见表4），提示软儿梨有促进支气管黏膜分泌（祛痰）的作用。
表 4 软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响Table 4. Effect of Ruanerli on phenol red excretion in respiratory tract of mice组别 动物数 给药量（mL/10 g） 酚红排泄量（μg/mL） 空白对照组 10 − 2.25±1.37 软儿梨低剂量组 10 0.1 2.44±0.89 软儿梨中剂量组 10 0.15 3.01±2.14*# 软儿梨高剂量组 10 0.2 3.85±2.01*#& 麻杏止咳糖浆组 10 0.1 4.18±1.56*#& 2.5 软儿梨对血清中炎症因子水平的影响
IL-6是一个26 kDa的多肽，生物效应极为广泛，主要包括[16−18]：调节B细胞的生长和分化；增强CTL、NK细胞的杀伤效应；刺激造血干细胞的增生分化；促进肝细胞合成急性相蛋白等。大量实验资料表明，IL-6在维持机体生理平衡中具有十分重要的地位，体内IL-6的异常与多种疾病有关。IL-13是趋化因子家族的一种细胞因子，可诱导单核细胞分化和炎症反应，在过敏、哮喘、肺纤维化和肿瘤发生中具有重要作用[19−21]。在本实验中，经ELISA检测发现，经氨水刺激后，小鼠血清中IL-6和IL-13的水平明显升高，经软儿梨处理后IL-6和IL-13的水平显著降低（P<0.05），且作用呈显著剂量依赖性（P<0.05）（表5），提示软儿梨可以降低血清中炎性介质的水平。
表 5 软儿梨对小鼠血清中炎症因子水平的影响（n=10）Table 5. Effect of Ruanerli on serum levels of inflammatory factors in mice (n=10)组别 给药量（mL/10 g） IL-6（pg/mL） IL-13（pg/mL） 空白对照组 — 5.61±1.34 0.81±0.11 软儿梨低剂量组 0.1 5.54±1.56 0.79±0.23 软儿梨中剂量组 0.15 3.90±1.02*# 0.62±0.15*# 软儿梨高剂量组 0.2 2.72±0.45*# 0.53±0.19*# 麻杏止咳糖浆组 0.1 2.32±0.78*#& 0.42±0.25*#& 2.6 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA表达及蛋白表达的影响
IL1是趋化因子家族的一种细胞因子，IL1B是其一种存在形式。低浓度的IL-1主要发挥免疫调节作用[22−23]，主要表现在：a. 与抗原协同作用，使CD4+T细胞活化，增加IL-2R表达；b. 促进B细胞生长和分化，可使脾细胞的溶血空斑数（PFC）增加100倍，说明IL-1也可促进抗体的形成；c. 促进单核巨噬细胞等的抗原递呈能力；d. 与IL-2或干扰素协同可以增强NK细胞活性；e. 吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；f.可刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应等。
血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又称血管通透因子（Vascular permeability factor，VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，其作用主要包括[24−25]：a. 促进内皮细胞增生。VEGF是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生。尤其是在低氧环境下，VEGF与内皮细胞膜上VEGF受体结合，引起受体的自身磷酸化，从而激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK），实现VEGF的有丝分裂原特性，诱导内皮细胞增生；b. 促进血管增生。在低氧环境下，VEGF通过提高血浆酶原活化因子（PA）和血浆酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的mRNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成；c. 增加血管通透性。VEGF是最强的可增加血管通透性的物质之一，该作用主要通过细胞小囊泡器来实现的，其特点是作用迅速、持续时间短。
前列腺素内过氧化物合成酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2），又名环加氧酶2，只存在于一些特殊的细胞内，诱导、增强和传递疼痛及炎症信号[26−27]。
丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，参与调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程[28−29]。MAPK3是这个激酶家族的一员，可作用于多个信号级联，调节多种细胞过程，如增殖、分化和细胞周期进程，以响应各种细胞外信号[30−31]。
在本实验中，经RT-PCR和Western blot检测发现，经氨水刺激后，空白组小鼠肺组织中炎症相关基因（IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3）的mRNA水平和蛋白表达明显增加，提示炎症激活。软儿梨中、高剂量组可显著降低炎症基因的mRNA水平和蛋白表达（P<0.05），且作用呈显著剂量依赖性（P<0.05）（结果见表6、图4~图5），提示软儿梨可能通过抑制炎症相关基因的表达，进而降低血清中炎性介质含量，发挥止咳化痰作用。
表 6 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3蛋白表达的影响（n=10）Table 6. Effect of Ruanerli on protein expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)组别 IL6 IL1B VEGFA PTGS2 MAPK3 空白对照组 0.855±0.0428 0.794±0.0397 0.571±0.0286 0.688±0.0344 0.613±0.0307 软儿梨低剂量组 0.762±0.0381* 0.712±0.0356* 0.532±0.0266* 0.645±0.03225* 0.589±0.02945* 软儿梨中剂量组 0.714±0.0357*# 0.665±0.03325*# 0.501±0.02505*# 0.574±0.0287*# 0.511±0.02555*# 软儿梨高剂量组 0.659±0.03295*#& 0.652±0.0326*# 0.449±0.02245*#& 0.415±0.02075*#& 0.456±0.0228*#& 麻杏止咳糖浆组 0.601±0.03005*#& 0.497±0.02485*#& 0.401±0.02005*#& 0.375±0.01875*#& 0.366±0.0183*#& ![]()
图 4 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA表达的影响（n=10）Figure 4. Effect of Ruanerli on mRNA expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)![]()
图 5 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3蛋白表达的影响Figure 5. Effect of Ruanerli on expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 proteins in lung tissue3. 结论
通过文献调研发现软儿梨中已见报道的化学成分有51个，对应作用靶点282个。与GeneCards数据库中咳嗽和生痰相关基因映射后得到80个软儿梨止咳化痰作用的相关基因。富集分析发现这80个基因可能与细胞内过氧化物酶活性、抗氧化活性、氧化还原酶活性、对活性氧的反应等生物过程有关，机制可能涉及TNF信号通路、IL-17信号通路、癌症信号通路等。根据Dgree值，从PPI网络中筛选出了软儿梨止咳化痰作用的Top10基因（GAPDH、IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、CXCL8、IL10、MAPK3）。通过对Top10基因进行KEGG通路富集分析发现，在前20条富集信号通路中12条与细菌、病毒及寄生虫感染有关，4条与免疫相关疾病有关，提示软儿梨可能主要通过消除炎症感染、增加人体免疫力来发挥止咳化痰作用。分子对接结果显示，软儿梨止咳化痰作用Top10基因与PPI网络中排名前3位的化学成分（咖啡酸、芦丁、戊醛）可以自由结合，且具有较小的结合能。动物试验表明，软儿梨可以明显抑制小鼠氨水引发的咳嗽反应，增加小鼠气管酚红的排泄量，降低血清中炎性介质IL-6和IL-13水平；PCR和WB检测结果显示，软儿梨可显著降低炎症相关基因IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3的mRNA水平和蛋白表达，且作用与剂量成正比，这与生信分析结果相符，提示软儿梨的止咳化痰作用可能与降低炎性基因表达，减少致炎因子释放有关。由于客观条件限制，本文未对软儿梨止咳化痰作用做进一步的研究，其中涉及的深层机制还需要更深入的探讨。
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图 1 软儿梨止咳化痰作用网络药理学分析结果
注：a：软儿梨作用靶点基因-GeneCards中止咳化痰基因韦恩图；b：软儿梨-成分-靶点图；c：软儿梨止咳化痰基因KEGG通路富集图；d：软儿梨止咳化痰基因GO功能富集图；e：软儿梨止咳化痰基因蛋白互作网络图；f：软儿梨止咳化痰Top10基因；g：软儿梨中所含化学成分-Top10基因关系图；h：Top10基因KEGG通路富集圈图；i：Top10基因KEGG通路富集分组图。
Figure 1. Results of network pharmacological analysis on the antitussive and expectorant effects of Ruanerli
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图 2 软儿梨止咳化痰作用Top10基因蛋白与Top3活性成分结合能图
Figure 2. Binding energy graph of Top10 gene proteins for the antitussive and expectorant effects of Ruanerli and Top3 active components
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图 3 Top10基因蛋白与芦丁分子对接图
注：a：GAPDH与芦丁分子对接图；b：IL6与芦丁分子对接图；c：IL1B与芦丁分子对接图；d：VEGFA与芦丁分子对接图；e：JUN与芦丁分子对接图；f：PTGS2与芦丁分子对接图；g：CASP3与芦丁分子对接图；h：CXCL8与芦丁分子对接图；i：IL10与芦丁分子对接图；j：MAPK3与芦丁分子对接图。
Figure 3. Molecular docking diagram of Top10 gene proteins and rutin
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图 4 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3 mRNA表达的影响（n=10）
Figure 4. Effect of Ruanerli on mRNA expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)
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图 5 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3蛋白表达的影响
Figure 5. Effect of Ruanerli on expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 proteins in lung tissue
表 1 引物序列表
Table 1 Primer sequence
基因 引物 序列（5'→3'） 长度 IL6 正向 ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG 170 bp 反向 CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG VEGFA 正向 AGGGCAGAATCATCACGAAGT 183 bp 反向 AGGGTCTCGATTGGATGGCA PTGS2 正向 TAAGTGCGATTGTACCCGGAC 285 bp 反向 TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT IL1B 正向 AGCTACGAATCTCCGACCAC 289 bp 反向 CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA MAPK3 正向 CTACACGCAGTTGCAGTACAT 213 bp 反向 CAGCAGGATCTGGATCTCCC 
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表 2 软儿梨化学成分表
Table 2 Chemical composition table of Ruanerli
序号 成分中文名 成分英文名 分子式 分子量（g/mol） 1 苹果酸 MLT（malic acid） C4H6O5 134.09 2 柠檬酸 citric acid C6H8O7 192.12 3 熊果苷 isohomoarbutin C13H18O7 286.28 4 儿茶酚 catechol C6H6O2 110.11 5 绿原酸 chlorogenic acid C16H18O9 354.31 6 咖啡酸 caffeic acid C9H8O4 180.16 7 对香豆酸 （Z）-p-coumaric acid C9H8O3 164.16 8 阿魏酸 ferulic acid C10H10O4 194.18 9 芦丁 rutine C27H30O16 610.5 10 2-甲基-丁醇 2-methyl-butanol C5H12O 88.15 11 3,7-二甲基-6-辛烯 （R）-3,7-dimethyl-
6-octenC13H24O2 212.33 12 反-2-己烯 trans-2-hexene C6H12 84.16 13 反-2-辛烯 trans-2-octen C10H18O2 170.25 14 环己醇 cyclohexanol C6H12O 100.16 15 二氢杨梅素 dihydromyricetin C9H20O 144.25 16 戊醇 amyl alcohol C5H12O 88.15 17 辛醇 capryl alcohol C8H18O 130.23 18 2-甲基萘 2-methylnaphthalene C11H10 142.2 19 邻苯二甲酸二乙酯 diethyl phthalate/
dimethyl phthalateC12H14O4 222.24 20 反-2-辛烯醛 trans-2-octenal C8H14O 126.2 21 庚醛 n-heptanal C7H14O 114.19 22 癸醛 1-decanal C10H20O 156.26 23 己醛 hexanal C6H12O 100.16 24 壬醛 1-nonaldehyde C9H18O 142.24 25 戊醛 valeraldehyde C5H10O 86.13 26 2-甲基丁酸 2-Methylbutyric acid C5H10O2 102.13 27 3,4二羟苯基-
D-丙氨酸3-（3,4-dihydroxyphenyl）-d-alanine C9H11NO4 197.19 28 β-苯基-L-丙氨酸 β-phenyl-L-alanine C9H11NO2 165.19 29 乙醛酸 glyoxylic acid C2H2O3 74.04 30 棕榈酸 palmitic acid C16H32O2 256.42 31 2-戊酮 2-pentanone C5H10O 86.13 32 α-法呢烯 a-farnesene C15H24 204.35 33 环十二烯 cyclododecene C12H22 166.3 34 十七烷甲酸 1-heptadecanecar-
boxylic acidC18H36O2 284.5 35 苯甲酸苄酯 benzyl benzoate C14H12O2 212.24 36 醋酸丁酯 butyl acetate C6H12O2 116.16 37 丁酸丁酯 butyl butyrate C8H16O2 144.21 38 3-苯基丁酸甲酯 3-benzyl methyl
butyrateC20H28N2O3 344.4 39 丁酸乙酯 ethyl butyrate C6H12O2 116.16 40 核黄素 riboflavin C17H20N4O6 376.4 41 硫胺素 thiamine C12H17N4OS+ 265.36 42 尼克酸 niacin C6H5NO2 123.11 43 维生素C vitamin C C6H8O6 176.12 44 蔗糖 cane sugar C12H22O11 342.3 45 乙醇 ethanol C2H6O 46.07 46 萘 naphthalene C10H8 128.169 47 丙酸 propionic acid C3H6O2 74.08 48 乙酸 acetic acid C2H4O2 60.05 49 丙酮 acetone C3H6O 58.08 50 苯乙烯 styrene C8H8 104.15 51 甲苯 toluene C7H8 92.14
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表 3 软儿梨对氨水致小鼠咳嗽反应的影响（n=10）
Table 3 Effect of Ruanerli on cough response induced by ammonia in mice (n=10)
组别 给药量（mL/10 g） 咳嗽潜伏期（s） 咳嗽次数（次/3 min） 止咳率（%） 空白对照组 生理盐水 35.1000±13.7554 15.9000±6.3675 100 软儿梨低剂量组 0.1 33.1111±8.2681 15.4444±8.8192 94.33 软儿梨中剂量组 0.15 50.9000±16.2580*# 11.2000±2.6998*# 145.01# 软儿梨高剂量组 0.2 63.0000±26.7664*#& 7.6000±5.6999*#& 179.49#& 麻杏止咳糖浆组 0.1 69.4000±19.1265*#& 6.3000±3.5917*#& 197.72#& 注：与空白对照组比较，*P<0.05；与软儿梨低剂量组比较，#P<0.05；与软儿梨中剂量组比较，&P<0.05；表4~表6同。
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表 4 软儿梨对小鼠呼吸道酚红排泄的影响
Table 4 Effect of Ruanerli on phenol red excretion in respiratory tract of mice
组别 动物数 给药量（mL/10 g） 酚红排泄量（μg/mL） 空白对照组 10 − 2.25±1.37 软儿梨低剂量组 10 0.1 2.44±0.89 软儿梨中剂量组 10 0.15 3.01±2.14*# 软儿梨高剂量组 10 0.2 3.85±2.01*#& 麻杏止咳糖浆组 10 0.1 4.18±1.56*#&
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表 5 软儿梨对小鼠血清中炎症因子水平的影响（n=10）
Table 5 Effect of Ruanerli on serum levels of inflammatory factors in mice (n=10)
组别 给药量（mL/10 g） IL-6（pg/mL） IL-13（pg/mL） 空白对照组 — 5.61±1.34 0.81±0.11 软儿梨低剂量组 0.1 5.54±1.56 0.79±0.23 软儿梨中剂量组 0.15 3.90±1.02*# 0.62±0.15*# 软儿梨高剂量组 0.2 2.72±0.45*# 0.53±0.19*# 麻杏止咳糖浆组 0.1 2.32±0.78*#& 0.42±0.25*#&
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表 6 软儿梨对肺组织中IL6、IL1B、VEGFA、PTGS2、MAPK3蛋白表达的影响（n=10）
Table 6 Effect of Ruanerli on protein expression of IL6, IL1B, VEGFA, PTGS2 and MAPK3 in lung tissue (n=10)
组别 IL6 IL1B VEGFA PTGS2 MAPK3 空白对照组 0.855±0.0428 0.794±0.0397 0.571±0.0286 0.688±0.0344 0.613±0.0307 软儿梨低剂量组 0.762±0.0381* 0.712±0.0356* 0.532±0.0266* 0.645±0.03225* 0.589±0.02945* 软儿梨中剂量组 0.714±0.0357*# 0.665±0.03325*# 0.501±0.02505*# 0.574±0.0287*# 0.511±0.02555*# 软儿梨高剂量组 0.659±0.03295*#& 0.652±0.0326*# 0.449±0.02245*#& 0.415±0.02075*#& 0.456±0.0228*#& 麻杏止咳糖浆组 0.601±0.03005*#& 0.497±0.02485*#& 0.401±0.02005*#& 0.375±0.01875*#& 0.366±0.0183*#&
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