豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析

闫彦君; 张友慧; 高凤; 李雅; 刘常金

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010088

豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析

闫彦君^1,,
张友慧¹,
高凤¹,
李雅¹,
刘常金^{1, 2, ,}

1.
天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457
2.
天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457

基金项目: 天津市科技支撑计划项目（19YFZCSN00560）。

详细信息

作者简介:
闫彦君（1998−），女，硕士研究生，研究方向：生物与医药，E-mail：885014748@qq.com

通讯作者:
刘常金（1969−），男，博士，副教授，研究方向：农产品保鲜物流与加工，E-mail：cjliu@tust.edu.cn

中图分类号: TS201.3
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出版历程
- 收稿日期: 2023-01-11
- 网络出版日期: 2023-08-04
- 刊出日期: 2023-10-09

Changes in the Bacterial Phases of Soybean Curd Sheets and Analysis of Spoilage Ability of Dominant Bacteria Stored at Normal Temperature

1.
College of Food Science & Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
2.
National Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

摘要

摘要: 本文以中国传统豆类食品豆腐皮为研究对象，采用传统分离鉴定和高通量测序技术共同分析豆腐皮的腐败菌，并将优势菌回接至无菌豆腐皮，通过定期测定样品贮藏过程中菌落总数、挥发性盐基氮（TVB-N）、pH、感官评分和质构特性来确定优势菌对品质的影响，通过扫描电子显微镜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）来确定优势菌对蛋白的影响。结果表明，豆腐皮的菌相在贮藏过程中发生了明显变化，贮藏2 d的优势腐败菌主要为不动杆菌（Acinetobacter）、葡萄球菌（Staphylococcus）和库特氏菌（Kurthia）。对上述腐败菌，选择3株有代表性的进行回接，发现一株产蛋白酶的松鼠葡萄球菌和混菌的致腐能力最强，可以导致TVB-N、黏性显著增加，硬度、弹性和咀嚼性显著下降（P<0.05）。扫描电子显微镜显示接种松鼠葡萄球菌和混菌的样品表面蛋白结构扭曲，有许多孔洞；SDS-PAGE结果表明大豆蛋白的7S亚基出现不同程度的褪色或消失，25 kDa以下区域明显加深且出现一个新的条带；傅里叶红外光谱显示样品的β-折叠降低，β-转角增加。因此，松鼠葡萄球菌被鉴定为豆腐皮常温贮藏的特定腐败菌，为后续靶向控制豆腐皮中腐败菌的生长提供参考。
- 豆腐皮 /
- 高通量测序 /
- 优势腐败菌 /
- 腐败能力 /
- 蛋白结构
Abstract: The bacterial phase changes and the effect of dominant spoilage bacteria on quality were studied with traditional identification method and high-throughput sequence technique using Chinese traditional food soybean curd sheets as materials. Sterile soybean curd sheets were inoculated with three dominant bacteria and their combination. The total viable counts, total volatile base nitrogen (TVB-N), pH, sensory score, and texture characteristics of samples during normal temperature storage were measured periodically for spoilage potential. The scanning electron microscopy, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) were used to determine the effect of spoilage bacteria on the protein. The results indicated the bacterial phases of soybean curd sheets changed obviously during storage, and Acinetobacter, Staphylococcus as well as Kurthia became the dominant bacteria after 2 days of storage. The selected representative spoilage bacteria were re-inoculated to the samples, one protease-producing Staphylococcus sciuri and the mixed bacteria had the strongest spoilage potential, because the TVB-N and viscosity increased greatly, while the hardness, springiness, and chewiness decreased significantly (P<0.05). Scanning electron microscopy revealed that the surface protein structure of the samples was distorted and many holes appeared. SDS-PAGE result showed that the band of soybean protein 7S subunit faded or disappeared, however, the bands below 25 kDa were deepened obviously and a new band appeared. FTIR showed that the soybean protein β-sheet structure decreased, while the β-turn structure increased. In conclusion, Staphylococcus sciur is identified as specific spoilage bacteria of soybean curd sheets during normal temperature storage, it provides a valuable reference for the spoilage bacteria control and prolong the product shelf-life.
- soybean curd sheets /
- high-throughput sequencing /
- dominant spoilage bacteria /
- spoilage ability /
- protein structure

HTML全文

豆腐皮是一种廉价的优质蛋白质来源，富含不饱和脂肪酸、卵磷脂、大豆异黄酮和膳食纤维等多种营养物质^[1]，在我国和东南亚人民的日常饮食中发挥着不可替代的作用^[2]。由于豆腐皮生产卫生条件较差，且水分和蛋白含量很高，因此非常容易受到环境微生物的污染而腐败变质^[3-4]。因此，为了保证食品安全，防止豆制品发生腐败变质是一个重要的研究课题^[5]。

尽管豆腐皮的菌群结构由大量微生物组成，但只有少数种类的微生物能导致产品品质发生不良变化，这些微生物被称为特定腐败微生物（Specific Spoilage Organisms，SSOs）。食品中腐败菌的鉴定主要依赖传统培养分离鉴定，但此方法耗时耗力，且自然界中只有 0.1%~3.0%的细菌可以培养^[6]，故该方法对于豆制品腐败菌的研究存在较大的障碍。近年来，多种对于微生物核酸组分及基因序列的研究方法不断兴起，高通量测序技术则是其中的一种，已广泛应用于食品微生物的研究^[7]。江杨阳等^[8]将传统培养和高通量测序两种方法联合使用，更加精准地确定了小龙虾冷藏过程中的腐败菌变化，回接后发现一株气单胞菌的致腐能力最强。但目前将两种方法联合应用到非发酵豆制品的研究还较少。

目前体外筛选抑菌药物来抑制SSOs的生长已成为筛选有效防腐剂的一种省时的方法^[9]。为了识别细菌群落中的SSOs，需要将分离的腐败菌回接到产品中，通过感官评定、菌落总数、pH、TVB-N、内源荧光强度和总巯基含量等指标共同确定微生物的腐败潜力^[10-12]。有学者研究了气单胞菌、嗜冷假单胞菌和腐败希瓦氏菌对无菌鲢鱼的腐败效果，发现嗜冷假单胞菌表现出最强的蛋白水解活性，导致可溶性肽和TVB-N含量的升高^[13]。于淑池等^[14]研究发现，在冷藏卵形鲳鲹的优势腐败菌中，致腐能力最强的是腐败希瓦氏菌。总之，阐明产品不同优势菌的腐败潜能，揭示细菌诱导产品变质的机理，可为体外筛选有效的食品防腐剂提供支撑。

目前，关于豆制品的研究主要集中在优势菌的鉴定和保鲜技术开发等方面^[15-17]，而豆腐皮常温贮藏过程中微生物群落组成变化及不同优势菌的致腐能力还鲜有报道。基于此，本研究以豆腐皮为研究对象，通过传统16S rDNA鉴定结合高通量测序共同分析豆腐皮在常温贮藏过程中的菌群结构变化，通过回接确定豆腐皮的SSOs，并阐明腐败菌对大豆蛋白的降解机制，为靶向抑制腐败菌的生长提供参考。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐皮　购于宜家人超市，用冰袋在30 min内运输到实验室，置于4 ℃冰箱冷藏备用，实验前测得豆腐皮蛋白含量为25.42%；干酪素、平板计数琼脂、LB肉汤培养基（Luria-Bertani，LB）、甘油、阿拉伯胶、HCl-Tris缓冲液（pH6.8、pH8.8）、十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）、30%凝胶储备液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝R250　天津索罗门生物科技有限公司；乙醇（75%）、硼酸、盐标液（0.01 mol/L）、二硫苏糖醇、甲醇、碳酸钾　分析纯，天津市江天化工技术股份有限公司；冰乙酸（99.5%）　分析纯，天津四海聚力科技有限公司；过硫酸铵　分析纯，凯玛特（天津）化工科技有限公司；DNA提取试剂盒　天津泰进科技有限公司。

ZHJH-C1109B超净工作台　上海智城分析仪器制造有限公司；UV-1800紫外分光光度计　上海美谱达仪器有限公司；HPS-25型生化培养箱、HZQ-F160全温震荡培养箱　哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；PHSJ-4A pH计　梅特勒-托利多集团；TA-XT plus质构仪　英国 Stable Micro Systems 公司；IS50傅里叶红外光谱仪　美国 Thermo 公司；SU1510扫描电子显微镜　日本日立公司；FD加热型冷冻干燥机　上海欣谕仪器有限公司；TGL-21型高速冷冻离心机　四川蜀科仪器有限公司；XFS-280压力蒸汽灭菌锅　浙江新丰医疗器械有限公司；Universal Hood Ⅱ 凝胶成像仪　美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

将购买的豆腐皮在无菌操作台中切成大小一致的薄片（约5 cm×5 cm），置于无菌袋中在4 ℃条件下保存备用。

1.2.2 16S rDNA鉴定

样品在常温条件下储存两天腐败后，通过涂布PCA平板法对典型菌株进行分离和纯化。选择纯化后的单菌落进行革兰氏染色检验和菌种保藏。根据DNA提取试剂盒使用说明书提取基因组DNA，使用细菌通用引物27F和1492R对豆腐皮不同优势菌的16S rDNA片段扩增。先通过1%琼脂糖凝胶电泳检验扩增产物，随后送往苏州金唯智生物技术有限公司测序。将测序结果上传至NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST中进行比对，并为菌株申请序列号。通常，相似度大于97%以上的序列被鉴定为相同的菌属。

1.2.3 腐败菌产蛋白酶能力测定

参考张利等^[18]的方法制备酪素培养基（0.4%干酪素，0.107% Na₂HPO₄·7H₂O，0.036% KH₂PO₄，1.7%琼脂，121 ℃灭菌20 min），以测定相关菌株产蛋白酶情况。调整菌悬液浓度至6 lg（CFU/g），将无菌滤纸片贴在酪素培养基表面，取20 μL菌悬液于滤纸片上，然后置于常温条件下培养72 h。培养结束后测量菌落直径及蛋白水解圈的直径，不同菌株的产蛋白酶能力通过HC的大小来判断，计算公式如下。

H C = \frac{蛋 白 水 解 圈 直 径 (c m)}{菌 落 直 径 (c m)}

$\mathrm{H}\mathrm{C}=\frac{\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{水}\mathrm{解}\mathrm{圈}\mathrm{直}\mathrm{径}(\mathrm{c}\mathrm{m})}{\mathrm{菌}\mathrm{落}\mathrm{直}\mathrm{径}(\mathrm{c}\mathrm{m})}$

1.2.4 高通量测序

将豆腐皮贮藏在常温环境中，分别在第0、1、2 d时进行取样。将豆腐皮样品送至苏州金唯智生物技术有限公司，委托其进行基于Illumina MiSeq测序技术的高通量测定。

1.2.5 无菌豆腐皮的制备及接种

无菌豆腐皮的制备参考Li等^[19]的方法，略作修改。具体如下：将分割好的豆腐皮浸泡在75%的乙醇中30 s，然后在无菌蒸馏水中清洗3次，沥干水分后放入无菌培养皿中，在超净台中紫外灭菌30 min。经平板计数培养，得到的无菌豆腐皮的菌落总数小于2 lg（CFU/g）。

挑取从豆腐皮中分离出的单菌落接种于LB肉汤中，于37 ℃培养12 h后得到菌液备用。将菌液在4 ℃、9000 r/min条件下离心10 min，并用生理盐水重悬菌液，重复离心两次后再次重悬菌液，并调节浓度至6 lg（CFU/g）。将无菌豆腐皮分别浸泡在不同菌悬液中30 s后取出并沥干水分，达到4 lg（CFU/g）的接种水平。对照为浸泡在无菌生理盐水的样品，将所有接种好的豆腐皮置于无菌均质袋中，并在25 ℃培养箱中进行贮藏。

1.2.6 菌落总数测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定豆腐皮菌落总数^[20]。将5 g豆腐皮样品置于无菌均质袋中，加入45 mL生理盐水并用拍打式均质器拍打90 s，制成1:10（g:mL）的样品匀液，取1 mL该匀液于9 mL生理盐水中，制成1:100的样品匀液，并按照上述方法依次制备10 倍系列稀释样品匀液。取1 mL适宜稀释度的样品匀液于培养皿中，倒入平板计数琼脂并摇动混匀，于37 ℃培养48 h后计算菌落总数。

1.2.7 TVB-N测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中微量扩散法测定样品TVB-N^[21]。将10 g研磨后的豆腐皮分散在100 mL蒸馏水中，期间不时摇晃浸渍30 min。混合物经过抽滤之后，收集滤液并冷藏备用，通过扩散皿测定TVB-N含量。

1.2.8 pH测定

将10 g研磨均匀的豆腐皮与100 mL蒸馏水混合并用拍打式均质器拍打90 s，过滤后使用pH计测量样品的pH。

1.2.9 感官评分

参考杨立娜等^[16]对干豆腐的感官评价方法，略有改动。由食品学院的感官评价小组（共10人）根据表1对样品进行评分，每个成员单独进行，每评价完一个指标用清水漱口。总分=0.2×色泽+0.3×气味+0.3×质地+0.2×粘液程度，满分为10分。

表 1 豆腐皮感官评价标准

Table 1. Sensory evaluation criteria of soybean curd sheets

项目	0~2.5	2.6~5	5.1~7.5	7.6~10
色泽20%	深黄色	暗黄色	黄色稍深	淡黄色
气味30%	严重臭味	有异味	豆香味较淡，无异味	浓郁豆香味
质地30%	无弹性，质地变软	弹性一般，质地变差	弹性较好	弹性好，质地紧密
粘液程度20%	黏手，拉丝明显	稍有粘液	表面微湿	无粘液

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1.2.10 质构特性分析

采用质构测定仪，测定样品的硬度、弹性、黏性、胶着性、咀嚼性和回复性。将样品切割成2 cm×2 cm的小块，每个样品分别取10块摞叠在一起放在载物台中心进行测定，每组样品测量3次。质构测定参数，探头：P100，测前速度：2 mm/s，测中速度：1 mm/s，测后速度：1 mm/s；形变量：35%；停留时间：5 s。

1.2.11 微观结构观察

将冻干后的样品切成小块，用锤子轻击使其自然断裂，粘样和镀金膜后通过扫描电子显微镜观察样品断面的微观形态结构。

1.2.12 SDS-PAGE

参照赖晗^[22]的方法并根据试验稍作修改。将豆腐皮冻干后粉碎过60目筛，取1 g粉末溶于10 mL PBS（0.02 mol/L，pH8.5）磷酸盐缓冲液中，从中吸取20 μL与上样缓冲液混合，沸水浴5 min后冷却至室温，10000 r/min 离心5 min制成样液。上述样液各取10 μL、Marker 取5 μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电泳时使用5%的浓缩胶和10%的分离胶，电压全程80 V。电泳结束后将胶小心取出，先用考马斯亮蓝R-250溶液染色两个小时，再用甲醇-乙酸溶液脱色若干次，最后采用凝胶成像仪对胶进行拍照和分析。

1.2.13 二级结构测定

取1 mg冻干（过60目筛）样品和150 mg KBr使用玛瑙研钵研磨均匀后压片，采用傅里叶变换红外光谱对波段4000~600 cm⁻¹进行扫描。先使用OMNIC软件对图像进行校正并找到酰胺I带（1700~1600 cm⁻¹），然后使用 Peakfit V 4.12 分析α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的比例。

1.3 数据处理

评价腐败菌致腐性的实验均重复三次，使用Origin 2018软件进行作图，利用SPSS 19.0软件（IBM SPSS Statistics 23）中的AVOVA进行统计分析和方差分析，结果表示为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2. 结果与分析

2.1 16S rDNA鉴定及产蛋白酶能力比较

2.1.1 16S rDNA鉴定

从常温条件下贮存2 d腐败后的豆腐皮中分离出了7株具有典型形态的腐败菌，经革兰氏染色后发现有6株革兰氏阳性菌和1株革兰氏阴性菌，测序后同源比对结果如表2所示。结果显示，腐败豆腐皮分离菌株中NAT-1与约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）有较高的同源性，NAT-2、NAT-3和NAT-7与松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）有较高的同源性，NAT-4、NAT-5与库尔特氏杆菌（Kurthia populi）和吉氏库特菌（Kurthia gibsonii）有较高的同源性，NAT-6与乙酰微小杆菌（Exiguobacterium acetylicum）有较高同源性。与以前的研究相比，本次研究中鉴定的腐败菌略有不同。目前的研究发现，豆制品中腐败菌主要有葡萄球菌、李斯特菌、芽孢杆菌和假单胞菌等^{[2, 4, 15]}。据报道，生产及贮藏环境的不同会改变产品中微生物的分布情况^[23]。所以鉴定结果有差异的原因可能是由于原料的生产和贮藏环境不同，导致产品被不同的微生物所污染。

表 2 豆腐皮分离菌株16S rDNA序列同源性分析

Table 2. Homology analysis of 16S rDNA sequence of strains isolated from soybean curd sheets

菌株编号	碱基长度	同源性（%）	GenBank相似菌种	GenBank登录号
NAT-1	955	99.47	Acinetobacter johnsonii	OP703584
NAT-2	952	100.00	Staphylococcus sciuri	OP703585
NAT-3	961	99.82	Staphylococcus sciur	OP703587
NAT-4	907	99.78	Kurthia populi	OP703586
NAT-5	955	99.79	Kurthia gibsonii	OP703589
NAT-6	984	99.90	Exiguobacterium acetylicum	OP703590
NAT-7	962	100.00	Staphylococcus sciuri	OP703591

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2.1.2 产蛋白酶能力比较

酪蛋白筛选培养基中的营养物质可以作为菌株生长的能量来源，根据菌株产生的蛋白酶水解圈与菌落直径比值（HC）的大小来判断菌株的腐败能力是一种简单高效的办法^[24]。如表3所示，NAT-3和NAT-7的HC都大于3，其他菌株都不产蛋白酶。腐败细菌产生的胞外蛋白酶通常参与腐败过程，导致产品腐败变质，相关研究表明气单胞菌^[25]、沙雷氏菌^[18]和热杀环丝菌^[26]能分泌多种蛋白酶分解环境中的营养物质以获取能量。最近的研究发现，大多数葡萄球菌具有脂肪酶、蛋白酶和肽酶活性^[27]，与本文的研究结果一致。因此，本研究结果表明两株葡萄球菌具有较高的蛋白水解潜力。

表 3 不同菌株产蛋白酶能力比较

Table 3. Comparison of protease-producing ability of each strain

菌株	NAT-1	NAT-2	NAT-3	NAT-4	NAT-5	NAT-6	NAT-7
HC	--	--	3.00	--	--	--	3.25

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2.2 高通量测序结果

采用高通量测序技术进一步确定豆腐皮在常温贮藏期间菌群结构的变化，豆腐皮菌属的相对丰度如图1所示。豆腐皮的微生物组成在第0 d时相对丰富，优势菌主要有土芽孢杆菌属（Geobacillus sp. 78.8%），不动杆菌属（Acinetobacter sp. 10%），钩端螺菌属（Leptospirillum sp. 2.7%）和棒杆菌属（Corynebacterium sp. 2.7%）等。土芽孢杆菌是一种革兰氏阳性嗜热细菌，大量产生的原因是豆腐皮的生产过程中经历了高温，不耐热的细菌被杀死^{[2, 28]}。豆腐皮的菌相组成在贮藏过程中发生了较大变化，微生物多样性逐渐降低，不动杆菌属（40.7%）仍为优势菌，葡萄球菌属（Staphylococcus sp. 22.1%）和库特氏菌属（Kurthia sp. 21.1%）在两天内迅速增加，成为贮藏2 d时的优势菌。有学者对两条不同豆腐工业生产线的细菌污染情况进行了研究，发现葡萄球菌、冷杆菌、大球菌、芽孢杆菌和不动杆菌是各半成品中的优势菌属，这表明部分腐败菌是在生产过程中引入的^[28]。李博等^[29]研究了37 ℃贮藏时内酯豆腐优势菌群的变化，发现新鲜样品中的优势菌坚强芽孢杆菌在贮藏1 d后被屎肠球菌所代替，可以说明不同腐败菌之间对环境的适应能力不同。在本研究中，在新鲜样品中占绝对优势的土芽孢杆菌被葡萄球菌和库特氏菌所取代。不动杆菌在整个贮藏期一直都是优势菌，其对环境的适应性很强，广泛存在于各种食物中，包括蔬菜、饮料和动物原料^[30-31]。葡萄球菌是一种常见的食品污染物，可导致肉类蛋白质的分解。研究发现葡萄球菌是哈尔滨红肠贮藏初期的次要成员，但在货架期结束时成为了最主要的腐败菌^[32]。由于微生物的代谢活动，新鲜的大豆制品是最容易腐烂的食物之一。在本研究中，不动杆菌属、葡萄球菌属和库特氏菌属是豆腐皮的优势菌属。

图 1 豆腐皮在常温贮藏过程中菌相变化

Figure 1. Changes in the bacterial phases of soybean curd sheets during storage at normal temperature

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上述研究结果表明，传统方法鉴定出的7株腐败菌全部在高通量测序中检测到，且大多都是数量较优势的菌属，但豆腐皮中优势菌的实际腐败能力尚未报道。为了控制腐败微生物、提高产品的货架期，确定不同优势菌的致腐能力及腐败机理，故根据分离过程中腐败菌的数量和蛋白酶产生能力，选取优势菌约氏不动杆菌（NAT-1）、吉氏库特菌（NAT-5）、松鼠葡萄球菌（NAT-7）及其混菌进行腐败潜能测定。

2.3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中菌落总数变化

豆制品的新鲜度可通过菌落总数指标来判定。根据GB/T22106-2008规定，当菌落总数高于5.00 lg（CFU/g）时，代表豆腐皮不可食用。由图2可见，对照组的菌落总数在贮藏2 d 内低于1.00 lg（CFU/g），整个贮藏过程中始终低于3.00 lg（CFU/g），这表明成功地制备了无菌豆腐皮。不同接种组的初始菌落总数在4.22~4.49 lg（CFU/g）之间，适用于腐败能力的比较。接种NAT-7样品的菌落总数在贮藏前2 d增长较快，在贮藏2 d后各组增长减慢并趋于平缓，NAT-1、NAT-5、NAT-7和MIX的菌落总数分别达到8.59±0.44、8.28±0.29、9.01±0.28和8.90±0.36 lg（CFU/g）。趋于平缓可能是因为豆腐皮中的营养物质被消耗，微生物代谢产物积累，微生物数量达到稳定^[25]。有研究报道样品中的细菌数量应该达到6或7 lg（CFU/g），以便产生足够的可以检测的代谢产物^[33]。在本研究中，接菌后的豆腐皮贮藏4 d可以使腐败特性清晰可见。

图 2 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中的菌落总数变化

注：同一贮藏时间字母不同表示差异显著（P<0.05），图3~图5同。

Figure 2. Changes of total number of colonies in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中TVB-N变化

食品贮藏过程中蛋白质的降解主要是由细菌引起的，蛋白降解会产生氨及胺类等碱性挥发性含氮化合物^[34]。它与高蛋白食品的新鲜度密切相关，值越高说明腐败越严重，现已被广泛用于评估SSOs的腐败潜力^[35]。由图3可知，各组第0 d时TVB-N值均在5.20 mg/100 g左右，不同接种组的TVB-N水平在贮藏过程中均呈上升趋势。NAT-1和NAT-5组的TVB-N产量较低，而接种NAT-7和MIX组的TVB-N含量在贮藏期间迅速增加，在第4 d分别达到了51.77 mg/100 g和26.91 mg/100 g，显著高于对照和其他接种组（P<0.05）。刘舒彦等^[36]研究发现，在加州鲈鱼的优势腐败菌中，分解鱼肉蛋白能力最强的是巴氏葡萄球菌，且贮藏24 h后TVB-N含量达到160 mg/100 g。还有学者发现嗜冷假单胞菌具有很强的蛋白水解活性，其TVB-N产量最高，原因是蛋白质交联被菌体产生的蛋白酶破坏，释放出氨基酸和生物胺^[13]。故NAT-7产TVB-N能力最强可能归因于其具有较强的蛋白水解活性，混菌样品贮藏第4 d时的TVB-N值仍然很高，说明NAT-7在少量存在时也可以导致蛋白质降解生成TVB-N。

图 3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中TVB-N变化

Figure 3. Changes of TVB-N in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中pH变化

对照及接种组pH的变化如图4所示。由图可见，各组的初始pH为7.10，对照组在整个贮藏过程中变化不大。接种NAT-1、NAT-5、NAT-7和MIX的样品pH在前2 d下降到6.72~6.90，然后在贮藏第4 d时分别上升到7.07、6.84、7.38和7.22。接种NAT-7样品在贮藏第4 d时的pH显著高于其他组（P<0.05）。其他研究人员也报告了类似的趋势^[37]，pH最初降低可能与一些微生物能利用豆腐皮中的碳水化合物、糖类和其他营养物质产生酸类物质有关，而贮藏后期pH升高可能跟微生物的代谢导致蛋白质和氨基酸分解产生碱性物质有关^[38]。值得注意的是，在上文的研究中NAT-7在贮藏结束时表现出最高的产TVB-N能力，验证了碱性物质的积累使pH提高。

图 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中pH变化

Figure 4. Changes of pH in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.6 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化

腐败微生物可以加速豆制品中蛋白质和氨基酸的降解，代谢产物逐渐积累使豆制品出现色泽、质地变差，散发胺臭味等腐败变质现象，感官评分是评价豆制品品质的重要指标。由图5可知，在贮藏期间所有组的感官评分均呈现下降的趋势，接种组的感官评分显著低于对照组（P<0.05）。对照组贮藏第4 d时的感官评分为7.31，而接种NAT-7和MIX组在贮藏4 d时产品显示出较高的腐败，豆腐皮变得极软且粘手，散发出令人拒绝的胺臭味，得分分别达到1.14和2.37。感官评分结果表明，松鼠葡萄球菌的腐败能力最强，可能与其产蛋白酶破坏豆腐皮中的蛋白质有关，与其他学者的研究结果一致^[36]。

图 5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化

Figure 5. Changes of sensory score in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.7 接种不同腐败菌豆腐皮质构特性变化

质构是影响消费者接受大豆产品的一个重要参数。不同处理组在常温贮藏期间质构的变化如表4所示。结果表明，对照组和接种NAT-1的质构特性在贮藏过程中变化不大。而NAT-7显著改变了豆腐皮的质构特性（P<0.05），硬度、弹性、胶着性、咀嚼性和回复性分别下降了74.58%、51.61%、89.77%、95.45%和75.93%，黏性增加了46450.00%，在感官评价环节豆腐皮变得松散且粘手，此处验证了该变化。接种混菌的样品变化趋势与NAT-7一致，但是破坏程度低于NAT-7。产蛋白酶的NAT-7改变了豆腐皮的质构特性，这与两株产蛋白酶的芽孢杆菌能显著破坏腐竹质构特性的报道相一致^[39]。一些研究人员还发现腐败链球菌的接种显著加速了鱼的软化，并改变了黏性等质地指数^[40]。由此可以得出结论，食品质构的变化与腐败能力强的腐败菌密切相关，松鼠葡萄球菌（NAT-7）引起的豆腐皮质构破坏可能与其产生蛋白酶有关。

表 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中质构变化

Table 4. Changes of texture in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

样品名称	贮藏时间（d）	硬度（g）	黏性（g.sec）	弹性	胶着性（g）	咀嚼性（g）	回复性
对照	0	1790.06±56.81^a	0.02±0.01^b	0.94±0.01^a	1574.67±35.45^a	1464.89±54.01^a	0.55±0.01^a
	2	1717.81±228.21^a	0.10±0.05^b	0.93±0.01^a	1534.02±31.40^a	1432.51±20.51^a	0.56±0.01^a
	4	1748.09±47.26^a	0.83±0.06^a	0.93±0.01^a	1572.05±24.62^a	1454.19±25.64^a	0.55±0.01^a
NAT-1	0	1793.17±72.50^a	0.02±0.01^c	0.95±0.01^a	1561.54±44.15^a	1456.09±61.63^a	0.55±0.01^a
	2	1717.81±228.21^a	0.54±0.10^b	0.94±0.02^ab	1543.71±204.69^a	1446.27±222.50^a	0.54±0.01^a
	4	1711.78±72.69^a	1.10±0.05^a	0.91±0.01^c	1511.28±81.57^a	1484.60±25.30^a	0.53±0.01^a
NAT-5	0	1819.66±43.29^b	0.02±0.02^c	0.94±0.02^a	1563.15±51.40^b	1485.40±33.74^b	0.55±0.02^a
	2	1688.34±297.67^b	0.93±0.12^b	0.89±0.05^a	1518.01±253.66^b	1365.13±297.91^b	0.53±0.01^a
	4	2409.46±139.48^a	1.33±0.06^a	0.95±0.01^a	2130.53±125.02^a	2021.33±123.93^a	0.53±0.01^a
NAT-7	0	1813.00±85.18^a	0.02±0.01^c	0.93±0.02^a	1580.72±24.29^a	1473.72±95.29^a	0.54±0.02^a
	2	1760.90±101.20^a	5.85±0.42^b	0.93±0.03^a	1572.16±78.63^a	1494.86±68.59^a	0.54±0.01^a
	4	460.87±91.35^b	9.31±0.33^a	0.45±0.04^b	161.75±37.60^b	67.12±14.98^b	0.13±0.02^b
MIX	0	1813.00±85.15^a	0.01±0.01^c	0.93±0.02^a	1571.01±76.16^a	1460.24±44.92^a	0.54±0.01^a
	2	1688.05±92.62^a	1.15±0.09^b	0.97±0.03^a	1517.65±79.15^a	1467.90±37.70^a	0.55±0.01^a
	4	1518.36±24.79^b	5.76±0.36^a	0.85±0.02^b	1283.49±76.09^b	1095.12±61.37^b	0.40±0.02^b
注：同一菌液处理、同一指标字母不同表示不同贮藏时间差异显著（P<0.05）。

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2.8 接种不同腐败菌豆腐皮微观结构变化

通过扫描电子显微镜（×250）观察接种不同腐败菌的豆腐皮在常温贮藏过程中断面微观结构的变化，进一步阐述腐败菌对豆腐皮的破坏作用。未接菌豆腐皮样品（图6a）第0 d的结构完整、致密均匀，表面相对平滑，但仍可见些许裂痕孔洞，这可能是豆腐皮制作过程中形成的典型结构，裂痕可能是制样时断面不规则所致。贮藏4 d后，未接种样品的结构（图6b）显示出轻微变化，有几个深孔，这可能是由于未杀灭的微生物生长或孢子萌发。接种了腐败菌NAT-1（图6c）和NAT-5（图6d）的样品变化较轻微。而接种NAT-7（图6e）和MIX（图6f）的样品表面变得结构松散，形状扭曲，孔穴变多加深，结构的完整性遭到极大的破坏。以前也有研究报道了类似的结果，接种腐败链球菌的样品显示出肌纤维的相互分离和严重的质地软化^[40]。NAT-7对豆腐皮的蛋白结构有强烈的破坏作用，这可能是由于腐败菌产生的蛋白酶水解大豆蛋白网络结构，这也是导致豆腐皮极度软化的原因。

图 6 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中微观结构变化

注：a，对照第0 d样品；b，对照第4 d样品；c，接种NAT-1第4 d样品；d，接种NAT-5第4 d样品；e，接种NAT-7第4 d样品；f，接种MIX第4 d样品。

Figure 6. Changes of microstructure in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.9 SDS-PAGE凝胶电泳结果分析

为了确定菌株对豆腐皮蛋白分子量的影响，故进行了SDS-PAGE分析。未接种第0 d样品的蛋白质条带表明，豆腐皮含有7S大豆球蛋白中典型的α′、α和β亚基，11S中的酸性亚基（图7），这与其他研究一致^[41]。未接菌和接种NAT-1的样品在贮藏4 d后的蛋白条带与原样品的差异不大。接种NAT-5的样品α亚基褪色消失，但在25 kDa以下的小分子区域没有出现明显的条带，说明NAT-5对豆腐皮蛋白质结构的破坏作用较弱。然而，接种NAT-7和混菌的样品中，α′亚基和α亚基条带消失，25 kDa以下的小分子蛋白区域颜色明显加深，并出现一条新的条带，这表明大豆蛋白由于微生物的作用而降解为小肽。据报道，细菌蛋白酶在肉类蛋白的水解中起着重要的作用，导致肽和氨基酸的释放^[42]。Shen等^[39]研究发现两种芽孢杆菌产生的蛋白酶可以水解腐竹（大豆制品）7S球蛋白的α、α′亚基以及11S大豆球蛋白的酸性亚基，与本文的研究结果基本一致。SDS-PAGE结果表明，豆腐皮贮藏过程中蛋白质的降解，特别是7S大豆球蛋白α亚基的降解是NAT-7破坏豆腐皮品质的重要机制。

图 7 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中SDS-PAGE变化

注：1，对照第0 d样品；2，对照第4 d样品；3，接种NAT-1第4 d样品；4，接种NAT-5第4 d样品；5，接种NAT-7第4 d样品；6，接种MIX第4 d样品。

Figure 7. Changes of SDS-PAGE in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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2.10 接种不同腐败菌豆腐皮二级结构变化

红外光谱的酰胺I带（1700~1600 cm⁻¹）可以对蛋白质的二级结构进行定量分析，故利用FTIR研究了优势菌对豆腐皮蛋白二级结构的影响。α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和β-转角的含量分别用相应面积占总面积的百分比表示，结果如表5所示。第0 d未接种样品含有38.60%的β-折叠、21.29%的无规卷曲、22.05%的α-螺旋和18.06%的β-转角。β-折叠是豆类主要的二级结构，这与大豆分离蛋白中β-折叠所占比例最高的结果一致^[43]。贮藏4 d后，未接菌样品的蛋白质结构未发生明显变化，接种NAT-1和NAT-5的样品出现轻微变化，表明不动杆菌和库特氏菌对蛋白质的二级结构影响不大。接种NAT-7和MIX的样品二级结构发生了显著变化（P<0.05），β-折叠下降了10.14%~11.97%，β-转角增加了11.41%~11.65%。这与微生物分泌的蛋白酶可导致四川预浸泡豆杆中β-折叠减少和β-转角增加的报道相一致，但在他们的研究中α-螺旋减少无规则卷曲增加，这可能是菌株产生的蛋白酶不同导致的^[39]。蛋白质的α-螺旋和β-折叠通常被认为是比无规则卷曲和β-转角更有组织的二级结构^[44]。本研究表明，NAT-7产生的蛋白酶改变了大豆蛋白的二级结构，使部分β-折叠转化为β-转角，导致结构无序性增加，从而使豆腐皮的质构特性发生变化。

表 5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中二级结构变化

Table 5. Changes of secondary structure in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

样品名称	贮藏时间（d）	β-折叠（%）	无规则卷曲（%）	α-螺旋（%）	β-转角（%）
对照	0	38.60±0.41^a	21.29±0.11^c	22.05±0.62^b	18.06±0.23^c
对照	4	38.23±0.25^a	20.01±0.58^d	23.54±0.22^a	18.23±0.17^bc
NAT-1	4	36.35±0.87^b	22.13±0.47^b	23.13±0.69^a	18.38±0.61^bc
NAT-5	4	35.62±0.19^b	22.88±0.27^a	22.51±0.33^ab	18.99±0.37^b
NAT-7	4	26.63±0.44^c	22.97±0.32^a	20.93±0.43^c	29.47±0.56^a
MIX	4	28.46±0.63^c	21.07±0.32^c	20.76±0.85^c	29.71±0.35^a
注：同一列数据中字母不同表示差异显著（P<0.05）。

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3. 结论

本文采用传统分离鉴定和高通量的方法共同分析腐败菌，并将优势菌回接至无菌豆腐皮，探究了腐败菌对产品理化、感官、质构特性和蛋白结构的影响。研究结果表明，传统16S rDNA测序鉴定出了7株腐败菌，其全部在高通量测序中检测到。豆腐皮的菌相在常温贮藏期间发生了较大变化，其中不动杆菌（Acinetobacter）、葡萄球菌（Staphylococcus）和库特氏菌（Kurthia）为常温贮藏的优势腐败菌。对上述菌株进行致腐能力测定，发现松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）及其混菌的致腐能力最强，具有很强的产蛋白酶能力，导致产品的TVB-N和黏性显著增加，硬度、弹性和咀嚼性显著下降（P<0.05），严重破坏了豆腐皮的理化品质和质构特性。同时通过扫描电子显微镜、SDS-PAGE和傅里叶红外光谱进一步表征了腐败菌对豆腐皮蛋白的影响，发现葡萄球菌和混菌可以破坏大豆蛋白的微观结构，使其形状扭曲并出现孔洞，降解大豆蛋白并改变蛋白的二级结构。综上所述，松鼠葡萄球菌是豆腐皮常温贮藏期间的特定腐败菌，在今后关于豆腐皮保鲜的研究中，应重点关注这种腐败菌。此外，基于SSOs的快速检验技术、货架期预测及抑菌剂的筛选仍需要进一步研究。

图 1 豆腐皮在常温贮藏过程中菌相变化

Figure 1. Changes in the bacterial phases of soybean curd sheets during storage at normal temperature

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图 2 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中的菌落总数变化

注：同一贮藏时间字母不同表示差异显著（P<0.05），图3~图5同。

Figure 2. Changes of total number of colonies in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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图 3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中TVB-N变化

Figure 3. Changes of TVB-N in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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图 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中pH变化

Figure 4. Changes of pH in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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图 5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化

Figure 5. Changes of sensory score in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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图 6 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中微观结构变化

注：a，对照第0 d样品；b，对照第4 d样品；c，接种NAT-1第4 d样品；d，接种NAT-5第4 d样品；e，接种NAT-7第4 d样品；f，接种MIX第4 d样品。

Figure 6. Changes of microstructure in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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图 7 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中SDS-PAGE变化

注：1，对照第0 d样品；2，对照第4 d样品；3，接种NAT-1第4 d样品；4，接种NAT-5第4 d样品；5，接种NAT-7第4 d样品；6，接种MIX第4 d样品。

Figure 7. Changes of SDS-PAGE in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

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表 1 豆腐皮感官评价标准

Table 1 Sensory evaluation criteria of soybean curd sheets

项目	0~2.5	2.6~5	5.1~7.5	7.6~10
色泽20%	深黄色	暗黄色	黄色稍深	淡黄色
气味30%	严重臭味	有异味	豆香味较淡，无异味	浓郁豆香味
质地30%	无弹性，质地变软	弹性一般，质地变差	弹性较好	弹性好，质地紧密
粘液程度20%	黏手，拉丝明显	稍有粘液	表面微湿	无粘液

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表 2 豆腐皮分离菌株16S rDNA序列同源性分析

Table 2 Homology analysis of 16S rDNA sequence of strains isolated from soybean curd sheets

菌株编号	碱基长度	同源性（%）	GenBank相似菌种	GenBank登录号
NAT-1	955	99.47	Acinetobacter johnsonii	OP703584
NAT-2	952	100.00	Staphylococcus sciuri	OP703585
NAT-3	961	99.82	Staphylococcus sciur	OP703587
NAT-4	907	99.78	Kurthia populi	OP703586
NAT-5	955	99.79	Kurthia gibsonii	OP703589
NAT-6	984	99.90	Exiguobacterium acetylicum	OP703590
NAT-7	962	100.00	Staphylococcus sciuri	OP703591

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表 3 不同菌株产蛋白酶能力比较

Table 3 Comparison of protease-producing ability of each strain

菌株	NAT-1	NAT-2	NAT-3	NAT-4	NAT-5	NAT-6	NAT-7
HC	--	--	3.00	--	--	--	3.25

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表 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中质构变化

Table 4 Changes of texture in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

样品名称	贮藏时间（d）	硬度（g）	黏性（g.sec）	弹性	胶着性（g）	咀嚼性（g）	回复性
对照	0	1790.06±56.81^a	0.02±0.01^b	0.94±0.01^a	1574.67±35.45^a	1464.89±54.01^a	0.55±0.01^a
	2	1717.81±228.21^a	0.10±0.05^b	0.93±0.01^a	1534.02±31.40^a	1432.51±20.51^a	0.56±0.01^a
	4	1748.09±47.26^a	0.83±0.06^a	0.93±0.01^a	1572.05±24.62^a	1454.19±25.64^a	0.55±0.01^a
NAT-1	0	1793.17±72.50^a	0.02±0.01^c	0.95±0.01^a	1561.54±44.15^a	1456.09±61.63^a	0.55±0.01^a
	2	1717.81±228.21^a	0.54±0.10^b	0.94±0.02^ab	1543.71±204.69^a	1446.27±222.50^a	0.54±0.01^a
	4	1711.78±72.69^a	1.10±0.05^a	0.91±0.01^c	1511.28±81.57^a	1484.60±25.30^a	0.53±0.01^a
NAT-5	0	1819.66±43.29^b	0.02±0.02^c	0.94±0.02^a	1563.15±51.40^b	1485.40±33.74^b	0.55±0.02^a
	2	1688.34±297.67^b	0.93±0.12^b	0.89±0.05^a	1518.01±253.66^b	1365.13±297.91^b	0.53±0.01^a
	4	2409.46±139.48^a	1.33±0.06^a	0.95±0.01^a	2130.53±125.02^a	2021.33±123.93^a	0.53±0.01^a
NAT-7	0	1813.00±85.18^a	0.02±0.01^c	0.93±0.02^a	1580.72±24.29^a	1473.72±95.29^a	0.54±0.02^a
	2	1760.90±101.20^a	5.85±0.42^b	0.93±0.03^a	1572.16±78.63^a	1494.86±68.59^a	0.54±0.01^a
	4	460.87±91.35^b	9.31±0.33^a	0.45±0.04^b	161.75±37.60^b	67.12±14.98^b	0.13±0.02^b
MIX	0	1813.00±85.15^a	0.01±0.01^c	0.93±0.02^a	1571.01±76.16^a	1460.24±44.92^a	0.54±0.01^a
	2	1688.05±92.62^a	1.15±0.09^b	0.97±0.03^a	1517.65±79.15^a	1467.90±37.70^a	0.55±0.01^a
	4	1518.36±24.79^b	5.76±0.36^a	0.85±0.02^b	1283.49±76.09^b	1095.12±61.37^b	0.40±0.02^b
注：同一菌液处理、同一指标字母不同表示不同贮藏时间差异显著（P<0.05）。

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表 5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中二级结构变化

Table 5 Changes of secondary structure in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature

样品名称	贮藏时间（d）	β-折叠（%）	无规则卷曲（%）	α-螺旋（%）	β-转角（%）
对照	0	38.60±0.41^a	21.29±0.11^c	22.05±0.62^b	18.06±0.23^c
对照	4	38.23±0.25^a	20.01±0.58^d	23.54±0.22^a	18.23±0.17^bc
NAT-1	4	36.35±0.87^b	22.13±0.47^b	23.13±0.69^a	18.38±0.61^bc
NAT-5	4	35.62±0.19^b	22.88±0.27^a	22.51±0.33^ab	18.99±0.37^b
NAT-7	4	26.63±0.44^c	22.97±0.32^a	20.93±0.43^c	29.47±0.56^a
MIX	4	28.46±0.63^c	21.07±0.32^c	20.76±0.85^c	29.71±0.35^a
注：同一列数据中字母不同表示差异显著（P<0.05）。

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期刊类型引用(1)

王唯，赵武奇，田媛，贺刘成，陈月圆. 神仙豆腐的货架期预测模型. 食品与机械. 2024(07): 94-102 .

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图(7) / 表(5)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
1.2.2 16S rDNA鉴定
1.2.3 腐败菌产蛋白酶能力测定
1.2.4 高通量测序
1.2.5 无菌豆腐皮的制备及接种
1.2.6 菌落总数测定
1.2.7 TVB-N测定
1.2.8 pH测定
1.2.9 感官评分
1.2.10 质构特性分析
1.2.11 微观结构观察
1.2.12 SDS-PAGE
1.2.13 二级结构测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 16S rDNA鉴定及产蛋白酶能力比较
2.1.1 16S rDNA鉴定
2.1.2 产蛋白酶能力比较
2.2 高通量测序结果
2.3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中菌落总数变化
2.4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中TVB-N变化
2.5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中pH变化
2.6 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化
2.7 接种不同腐败菌豆腐皮质构特性变化
2.8 接种不同腐败菌豆腐皮微观结构变化
2.9 SDS-PAGE凝胶电泳结果分析
2.10 接种不同腐败菌豆腐皮二级结构变化
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
1.2.2 16S rDNA鉴定
1.2.3 腐败菌产蛋白酶能力测定
1.2.4 高通量测序
1.2.5 无菌豆腐皮的制备及接种
1.2.6 菌落总数测定
1.2.7 TVB-N测定
1.2.8 pH测定
1.2.9 感官评分
1.2.10 质构特性分析
1.2.11 微观结构观察
1.2.12 SDS-PAGE
1.2.13 二级结构测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 16S rDNA鉴定及产蛋白酶能力比较
2.1.1 16S rDNA鉴定
2.1.2 产蛋白酶能力比较
2.2 高通量测序结果
2.3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中菌落总数变化
2.4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中TVB-N变化
2.5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中pH变化
2.6 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化
2.7 接种不同腐败菌豆腐皮质构特性变化
2.8 接种不同腐败菌豆腐皮微观结构变化
2.9 SDS-PAGE凝胶电泳结果分析
2.10 接种不同腐败菌豆腐皮二级结构变化
3. 结论

参考文献(44)

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豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析

作者简介: 闫彦君（1998−），女，硕士研究生，研究方向：生物与医药，E-mail：885014748@qq.com

通讯作者: 刘常金（1969−），男，博士，副教授，研究方向：农产品保鲜物流与加工，E-mail：cjliu@tust.edu.cn

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