Optimization of Mixed Fermentation Process of Purple Rice Flour and Its Nutritional Improvement
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摘要: 为优化婴幼儿辅助食品的营养品质，本文以紫米为原料，采用米根霉与植物乳杆菌混菌发酵的方式进行紫米粉预发酵，并将其进行挤压熟化处理，制备成可冲调即食的婴幼儿紫米粉，以还原糖含量、花色苷含量、感官评分、可滴定酸度计算得到的综合评分为指标，优选出紫米粉混菌发酵工艺参数。结果表明，紫米粉混菌发酵最佳工艺参数为米根霉与植物乳杆菌菌种混合比例8:1 g/mL、接种量0.8%、料水比1:0.8 g/mL、发酵时间12 h、发酵温度31 ℃。与原紫米粉对照相比，预发酵粉的体外淀粉消化率由50.27%提升至62.37%，游离酚含量由204.46 mg GAE/100 g DW增加到231.44 mg GAE/100 g DW，植酸降解了25.64%；经过预发酵及挤压熟化处理后的婴幼儿紫米粉，淀粉体外消化率达到84.39%，游离酚含量为192.73 mg GAE/100 g DW，植酸降解率为35.58%。研究结果表明发酵显著优化了紫米粉的淀粉消化性和酚类物质构成，降低了抗营养因子含量，为高营养价值紫米婴幼儿辅食开发提供技术参考。Abstract: In order to optimize the nutritional quality of infant supplementary food, purple rice, the raw material used in this paper, was fermented by Rhizopus oryzae and Lactobacillus plantarum in the way of mixed fermentation, and subsequently extruded before it was produced as an instant infant purple rice flour. Based on reducing sugar content, anthocyanin content, sensory evaluation and titratable acidity, the conditions of the purple rice flour mixed fermentation process were optimized. Results showed that, the optimum technological parameters of mixed fermentation of purple rice noodles were 8:1 g/mL inoculation proportion (Rhizopus oryzae:Lactobacillus plantarum), 0.8% inoculation dose, 1:0.8 g/mL solid-liquid ratio, 12 h fermentation time, and 31 ℃ fermentation temperature. Compared with the unfermented purple rice flour as a control, the starch digestibility in vitro of the fermented flour increased from 50.27% to 62.37%, the free phenol content increased from 204.46 mg GAE/100 g DW to 231.44 mg GAE/100 g DW, and phytic acid degraded 25.64%. After fermentation and extruded, the starch digestibility in vitro of the infant purple rice flour reached 84.39%, the free phenol content was 192.73 mg GAE/100 g DW, and the phytic acid degradation rate was 35.58%. The results indicated that fermentation significantly optimized the starch digestibility and phenolic composition of the purple rice flour, and reduced the content of anti-nutrition factor. In summary, the present study provides technical reference for the development of purple rice infant supplementary food with high nutritional value.
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谷物类食品是世界卫生组织推荐的婴幼儿最理想的第一辅助食品，大米因其蛋白低敏性、低成本，目前在婴幼儿辅食中被广泛应用，据中国消费者报报导，米粉类辅食占中国市场主导地位[1]。市售畅销品牌婴儿米粉均以白米为主制备。
紫米营养丰富[2]，富含具备抗氧化活性的花色苷等酚类物质，且锌、铁、钙等微量元素含量高于白米[3]，营养保健价值较高，具有制作优质婴幼儿辅助食品的潜力。目前紫米多用作主食，深加工产品的研究与开发仍处于起步阶段，市面仅有少量的紫米粉丝、紫米饼、紫米酒等深加工产品。但以其作为原料开发婴幼儿辅助食品的研究甚少。
婴幼儿由于肠道内淀粉酶等酶系较少，对淀粉类食品消化比较困难[4]，目前以高温α-淀粉酶进行酶解提高淀粉消化性是婴幼儿辅食研究热点之一，但其不足之处是成本较高且作用单一。另外谷物中广泛存在着一种抗营养因子—植酸[5]，摄入植酸会降低人体对钙、锌、铁等金属离子的生理利用率[6-8]，还会抑制体内淀粉酶等多种酶的活性[9]。
微生物在发酵过程中可以产生大量的淀粉酶，将大分子淀粉转化为还原糖，并且提升可消化淀粉的含量，达到优化原料淀粉消化性的效果。米根霉拥有发达的淀粉酶体系，可以较好地优化淀粉消化性，是传统谷物发酵的优势菌种[10]。路锶等[11]采用米根霉对荞麦进行固态发酵，发酵后的荞麦还原糖含量显著提升。植物乳杆菌是植源性食物商业发酵最常用的菌属[12]，其产生的酸性环境能有效抑制杂菌的生长，但淀粉酶活力相对较低。本研究前期预实验发现，利用米根霉、植物乳杆菌单独发酵紫米粉，其淀粉消化性虽有所提高，但效果不及预期。
混菌发酵是近年来的研究热点之一，已有研究显示利用混菌发酵可以提高黑青稞的营养品质[13]、提高豆粕营养素含量及降低抗营养因子含量[14]、改善玉米的质构特性[15]、提升藜麦的抗氧化活性[16]等。因此本文拟研究米根霉与植物乳杆菌混菌发酵紫米粉发酵工艺，探讨混菌发酵对紫米粉淀粉消化性、酚类物质、植酸含量的影响，以期为高营养价值婴幼儿紫米粉的生产开发提供技术基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫米 广东省云浮市新兴县微丰农业科技有限公司提供的“天紫1号”；植物乳杆菌（GDM 1.191） 广东省微生物菌种保藏中心；米根霉发酵剂（配料：米粉、米根霉） 安琪酵母股份有限公司；无水葡萄糖 上海伯奥生物科技；3,5-二硝基水杨酸、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司；没食子酸 上海麦克林生化科技有限公司；猪胰α-淀粉酶（50 U/mg） 美国Sigma-Aldrich公司；糖化酶（105 U/mL） 酷尔化学；植酸钠（≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；试剂纯度均为分析纯。
SYSLG30-IV型实验双螺杆挤压膨化机 山东赛百诺机械有限公司；UV-6300紫外可见分光光度仪 上海美普达仪器有限公司；DLF-28立式分级连续投料粉碎机 温州市顶历医疗器械有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；LRH系列生化培养箱、ZTHZ-103B恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种的培养和接种
植物乳杆菌，首先取8 mLMRS液体培养基加入具塞试管中进行121 ℃灭菌20 min，冷却后取冻存管中的植物乳杆菌300 μL加入试管活化，在37 ℃下培养2 d，观察菌液浑浊情况，并测定菌落总数达到108 CFU/mL时，与商用固体粉末状米根霉发酵剂按照一定比例混合均匀，随后接种至经灭菌的紫米粉中。
1.2.2 婴幼儿紫米粉加工工艺步骤
紫米粉碎至60目→灭菌→冷却→接菌发酵→烘干→粉碎→调整水分含量→双螺杆挤压膨化→烘干→粉碎→婴幼儿紫米粉
原紫米粉、预发酵粉、挤压熟化粉、婴幼儿紫米粉（预发酵熟化）加工工艺步骤详见图1。双螺杆挤压膨化机具体参数如下：螺杆长径比为1:20.6，螺杆转速为26 Hz，进料速率为22 Hz，挤压温度由进料段到出口段为四段控制，分别为50、80、100、130 ℃，模头孔径为0.5 mm。
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图 1 婴幼儿紫米粉加工工艺步骤注：“□”内表示操作步骤；“○”内表示样品名称。Figure 1. Processing process of infant purple rice flour1.2.3 发酵工艺优化
1.2.3.1 混合菌种比例的确定
固定发酵条件为接种量0.6%、料水比为1:0.8 g/mL、发酵时间16 h、发酵温度31 ℃。设定混合菌种比例（米根霉:植物乳杆菌）分别为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL。采用无菌水将不同比例的混合菌种混匀后，与紫米粉充分搅拌均匀，发酵结束后测定还原糖含量、花色苷含量、感官评分、可滴定酸度，并计算综合评分，以综合评分为指标进行混菌比例优选。
1.2.3.2 混菌发酵单因素实验
固定菌种比例（米根霉:植物乳杆菌）为8:1 g/mL。在下述单因素实验过程中，除考察因素变动外，其余各因素水平分别固定值同1.2.3.1。分别考察接种量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）；料水比（1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1.0、1:1.2 g/mL）；发酵时间（8、12、16、20、24 h）；发酵温度（25、28、31、34、37 ℃）对发酵紫米粉还原糖含量、花色苷含量、感官评分、可滴定酸度的影响。
1.2.3.3 正交试验优化
在单因素实验的基础上，选择接种量、料水比、发酵时间、发酵温度这4个因素为影响因素，采用四因素三水平的正交试验设计，以综合评分为优化指标，进行参数优选。试验因素与水平设计见表1。
表 1 L9（34）正交试验因素水平Table 1. Factors and levels of L9 (34) orthogonal experiment水平 A接种量
（%）B料水比
（g/mL）C发酵时间
（h）D发酵温度
（℃）1 0.6 1:0.6 8 28 2 0.8 1:0.8 12 31 3 1.0 1:1.0 16 34 1.2.4 指标测定方法
1.2.4.1 还原糖含量的测定
取1 g样品于50 mL离心管中，加去离子水至30 mL，混匀。50 ℃下超声处理30 min，7000 r/min离心10 min后取上清液，参考高文军等[17]采用3,5-二硝基水杨酸法进行测定。样品中的还原糖含量根据葡萄糖标准曲线计算得出，标准曲线为：y=17.03x−0.0758，R2=0.9963。式中：y表示吸光值，x表示葡萄糖标准品浓度（mg/mL）。
1.2.4.2 花色苷含量的测定
采用分光光度法进行测定[18]。准确称取0.1 g样品粉末，加入95%乙醇与1.5 mol/L HCL的混合液（85/15，V/V）25 mL，随后在60 ℃下的水浴浸提5 h，抽滤后重新定容至25 mL，在535 nm紫外分光光度计下测定吸光度，花色苷含量的计算公式如式（1）。
花色苷含量(mg/100g)=OD×R×V98.2×m×100 (1) 式中：OD表示样品溶液的吸光值；R为提取液稀释至上机测试的稀释倍数；V表示定容体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.4.3 可滴定酸度的测定
参考王乃富[19]的方法稍作修改，取1 g样品于50 mL锥形瓶，加蒸馏水约30 mL，摇匀，30 ℃条件下超声提取30 min， 7000 r/min离心10 min，取上清液重新定容至50 mL，加3~4滴酚酞试剂，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微红色且30 s不褪色，记录NaOH消耗量，计算公式如式（2）。
可滴定酸度(%)=V×C×nm (2) 式中：V为NaOH消耗量，mL；C为NaOH浓度，mol/L；n为稀释倍数；m为样品质量，g。
1.2.4.4 感官评分的测定
感官评定小组由食品专业学生10人组成，从滋味、气味进行评价[20]，具体评分标准见表2。以所有分数平均值作为最终评分。
表 2 婴幼儿紫米粉感官评分标准Table 2. Sensory evaluation standard of infant purple rice flour评价项目 评价标准 感官评分
（总分20）滋味（15分） 风味柔和，酸甜适口，具有发酵的特殊风味 10~15 风味适中，无明显苦涩味、酸味 5~9 异味感强烈，有苦涩味、酸味 0~4 气味（5分） 有紫米的香味及发酵的香味 4~5 整体香味稍淡，无异味 2~3 酸味强烈，有异味 0~1 1.2.4.5 综合评分的计算方法
还原糖含量与可滴定酸度与淀粉的水解程度相关（有机酸由葡萄糖转化而成）[21]，花色苷是紫米代表性活性物质，感官评分可以直观地体现食用者对产品的食用感受。因此本实验分别以还原糖含量、花色苷含量、感官评分、可滴定酸度为评价指标，以各指标的最大值为参照值进行数据归一化处理，再赋予各指标不同的权重系数，进行多指标综合评分。侧重于优化淀粉的水解程度，同时尽可能地保留花色苷，并保证产品的滋味口感可以被食用者所接受，故设定权重系数为：还原糖含量0.4，花色苷含量0.2，感官评分0.3，可滴定酸度0.1，综合评分公式如式（3）。
综合评分=(F1F1max×0.4+F2F2max×0.2+F3F3max×0.3+F4F4max×0.1)×100 (3) 式中：F1表示还原糖含量，F2表示花色苷含量，F3表示感官评分，F4表示可滴定酸度；各自对应的Fmax则表示该指标所有实验组中测定的最大值。
1.2.4.6 淀粉体外消化性的测定
参考Englyst等[22]的方法稍作修改。准确称取0.2 g样品于锥形瓶中，加入15 mL 0.2 mol/L pH5.2醋酸钠缓冲溶液，混匀后，加入10 mL的猪胰α-淀粉酶（290 U/mL）和糖化酶（15 U/mL）的混合酶液，在37 ℃恒温条件下以150 r/min振荡水解，分别于0、10、20、30、60、90、120、180 min时取1 mL酶解液加入4 mL 80%乙醇灭酶，6000 r/min离心10 min，随后取0.5 mL上清液稀释至一定倍数，使用二硝基水杨酸法测定其还原糖含量。快速消化淀粉（RDS）、慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）含量计算公式如（4）~（6），体外淀粉消化率公式如（7）。
RDS(%)=(G20−FG)×0.9TS×100 (4) SDS(%)=(G120−G20)×0.9TS×100 (5) RS(%)=100%−RDS%−SDS% (6) 式中：G20和G120分别为水解至20 min和120 min时酶解液中还原糖的质量，mg；FG为水解前酶解液中还原糖的质量，mg；TS为样品总淀粉质量，mg。
体外淀粉消化率(%)=m180\;min×0.9m×100 (7) 式中：m为样品总淀粉质量，mg；m180 min为水解至180 min时酶解液中还原糖质量，mg。
1.2.4.7 游离酚及结合酚含量的测定
游离酚的提取：参考赵丹等[23]并稍作修改。精确称取样品2.000 g，放入50 mL离心管、加入20 mL 80%乙醇溶液，40 ℃下超声提取30 min，之后4000 r/min离心10 min，倒出上清液，沉淀再按上面的步骤重复提取一次，合并两次离心的上清液，在45 ℃条件下旋转蒸发至无水状态，残余物用80%甲醇定容至25 mL，于4 ℃冰箱中贮存待用。
结合酚的提取：参考杨凌霄等[24]的方法稍作修改。向游离物质提取后所得的残渣中加入20 mL NaOH（2 mol/L），搅拌均匀，在氮气保护下，置于超声仪中超声1 h，水解所得物以浓盐酸调节pH至中性，用正己烷按1:1（v/v）除去脂溶性成分，再用乙酸乙酯按1:1（v/v）萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发至干，用水定容至50 mL备用。
酚类含量的测定：采用Folin-Ciocalteu法[25]进行测定。样品中的酚类含量根据没食子酸标准曲线计算得出，标准曲线为：y=88.8x+0.075，R2=0.9984，式中：y表示吸光值，x表示没食子酸标准品浓度（mg/mL），结果以每百克干样品中没食子酸当量表示（mg GAE/100 g DW）。
1.2.4.8 植酸降解率的测定
称取样品0.1 g，加入40 mL 1.2% HCl-10% Na2SO4混合溶液于50 mL离心管中搅拌均匀，静置浸提2 h，7000 r/min下离心10 min。以1.2% HCl-10% Na2SO4混合溶液重新定容至50 mL，取上清液2.0 mL，加入15% TCA 2.0 mL于10 mL离心管中，于4 ℃冰箱中静置2 h，随后以7000 r/min离心10 min，取上清液，采用三氯化铁比色法[26]进行测定。样品中的植酸含量根据植酸钠标准曲线计算得出，标准曲线为：y=−0.9649x+0.7486，R2=0.9978，式中：y表示植酸钠标准品质量（g），x表示吸光值。植酸降解率计算公式如（8）。
植酸降解率(%)=(1−Mm)×100 (8) 式中：M为1 g样品中所含植酸质量，mg；m为1 g原紫米粉中所含植酸质量，mg。
1.3 数据处理
本文除感官评分外，所有指标均以干基计，所有实验进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。本文运用SPSS 24.0及Excel对数据进行处理分析，使用Origin 2017作图。
2. 结果与分析
2.1 混合菌种比例的确定
2.1.1 混合菌种比例对紫米粉还原糖及花色苷含量的影响
如图2所示，随着米根霉比例的降低，还原糖含量呈现显著下降的趋势。这是因为米根霉的淀粉酶体系发达，水解淀粉的能力较植物乳杆菌更强[15]，因此随着米根霉比例的降低，混合菌种水解淀粉的能力变弱，所产生的还原糖含量降低，这一现象与刘庆艾等[27]的研究一致。对于花色苷含量而言，在同一发酵条件下，菌种比例的改变对其影响不显著（P>0.05）。因此米根霉占比高有利于提高淀粉降解能力。
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2.1.2 混合菌种比例对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
由图3可知，随着米根霉比例的减少，感官评分总体上先增大后减小，混菌比例为8:1和6:1时显著高于其他比例（P<0.05）。感官评价结果显示，米根霉比例太高会使产品产生苦涩味，植物乳杆菌比例太高则会产生酸馊味，8:1和6:1之间差异不显著（P>0.05），为一个合适的混合菌种比例。
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图 3 菌种比例对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响Figure 3. Effects of the inoculation proportion on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour可滴定酸度随着米根霉的比例降低呈现为上下波动的情况。原因是：菌种发酵的过程中，代谢通量包括用于菌体生长的通量与代谢产物合成的通量。发酵时淀粉被水解为还原糖，还原糖进一步被微生物代谢为乳酸等有机酸[21]。当菌种生长旺盛时，菌体生长通量大于代谢产物合成通量，使代谢产物有机酸减少，反之亦然。田海勇[28]利用乳酸菌与米根霉混菌发酵香肠，在发酵过程中发现微生物的演替方向和速度不同步的现象。混菌发酵是一个复杂的反应体系，两个菌种的生长、代谢不同步，导致可滴定酸度变化规律性不强。牛萌萌等[10]在研究大麦仁混菌发酵时也出现相似的情况。
2.1.3 混合菌种比例对紫米粉综合评分的影响
根据图4可得，随着米根霉比例的降低，综合评分先升高后降低，在比例为8:1时达到最大值75.68，显著高于其他比例水平（P<0.05）。因此选择混合菌种比例（米根霉:植物乳杆菌）为8:1 g/mL，以此进行后续实验。
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图 4 菌种比例对紫米粉综合评分的影响Figure 4. Effect of the inoculation proportion on the comprehensive evaluation of the purple rice flour2.2 发酵参数单因素实验结果
2.2.1 接种量对紫米粉品质的影响
从图5可以看出，在所设定的范围内还原糖含量随着接种量的提高而持续增加。这是因为在接种量较低时，菌种分泌的淀粉酶较少，水解淀粉的能力较弱，产生的还原糖含量较低。而接种量的改变对花色苷含量影响不显著（P>0.05）。
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图 5 接种量对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响Figure 5. Effects of inoculation dose on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour由图6可知，在接种量小于1.0%时，感官评分变化不显著（P>0.05），在接种量大于1.0%后，紫米粉风味明显变差。随着接种量的增加，可滴定酸度先升后降，这可能是因为有机酸的含量，处于积累和消耗的动态过程，在接种量小于0.8%时，随接种量加大，还原糖不断提升并转化为有机酸，可滴定酸度提升，当接种量继续增大后，菌种繁殖对营养物质需求更大，消耗量大于积累量，导致可滴定酸度下降。感官评分与可滴定酸度二者同时在接种量为0.8%时达到最高值。综合考虑，选择接种量在0.6%、0.8%、1.0%水平下进行下一步研究。
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图 6 接种量对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响Figure 6. Effects of inoculation dose on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour2.2.2 料水比对紫米粉品质的影响
由图7可知，随着加水比例的增加，还原糖含量先增加后减少，在料水比为1:0.8时达到最大值54.03 mg/g，但在1:0.8和1:1.0之间差异不显著（P>0.05）。一般来说，微生物生长越活跃，菌株数量越富足，产酶能力也越强[29]。在水分含量过低时，不利于菌种生长繁殖，产生的淀粉酶较少，进而导致还原糖含量较少；而水分过高则会抑制菌种与空气的接触，本实验所用米根霉和植物乳杆菌均为兼性厌氧菌，在无氧条件下一般仅维持生存，代谢不完全，水解淀粉能力弱，产生还原糖含量少[30]。花色苷含量随着加水比例的增加显著下降（P<0.05），料水比为1:1.2时比1:0.4时下降了34.03%。这是因为花色苷是一种水溶性物质，加过多的水容易造成花色苷在沥干过程中随水流失。
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图 7 料水比对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响Figure 7. Effects of solid-liquid ratio on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour由图8可以看出，在水分含量占比低于物料时，感官评分变化不显著（P>0.05），在水分占比超过物料后显著下降（P<0.05），这是因为水分过高抑制发酵菌种生长，代谢产物带来不愉快的味道，厌氧条件下存在滋生如芽孢杆菌等的腐败菌的危险[31]。鹿保鑫等[32]使用米根霉发酵燕麦，在水分添加量过高时，燕麦风味变差，感官评分下降，与本研究结论一致。
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图 8 料水比对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响Figure 8. Effects of solid-liquid ratio on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour可滴定酸度随着加水量的增加先显著升高后下降（P<0.05），说明可滴定酸度与料水比有着密切关系。在料水比为1:0.8时达到最大值，可能由于此时混菌体系用于代谢产物合成的通量最强，生成有机酸最多，可滴定酸度为4.75%。综上，选择料水比在1:0.6、1:0.8、1:1.0 g/mL的水平下进行下一步研究。
2.2.3 发酵时间对紫米粉品质的影响
由图9可以看出，还原糖含量随着发酵时间的延长，先小幅提升，在16 h出现转折点，此时还原糖含量为54.03 mg/g，而后下降再增加，最高点24 h的还原糖含量为63.21 mg/g。微生物的生长均会经历四个时期（迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期），不同时期对不同碳源的利用优先级不同，通常葡萄糖优于淀粉[33]，由于两种菌生长发育不同步，使葡萄糖累积的高峰与消耗葡萄糖用于繁殖的步调不一致，以至于出现还原糖累积出现双峰。张杰等[13]利用米根霉固态发酵黑青稞，还原糖含量随发酵时间的变化与本文相近。
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图 9 发酵时间对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响Figure 9. Effects of fermentation time on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour花色苷含量随着发酵时间的增加而显著下降（P<0.05），在24 h时最低值为112.91 mg/100 g，相比8 h时下降了25.71%。这是因为花色苷极不稳定，容易受到温度、光照等的影响，随着时间的延长其损耗也增加。
由图10所得，感官评分随着发酵时间的延长先增加后急剧下降（P<0.05），在发酵时间为12 h达到峰值18.2。可滴定酸度随着发酵时间的增加而持续升高，这一现象与赵丹等[34]的研究一致。菌种通过淀粉酶水解淀粉生成还原糖，还原糖经过一系列复杂的反应转化为丙酮酸再转化为乳酸等有机酸[21]，从而随着发酵时间增加而不断累积。故综合考虑，选择发酵时间在8、12、16 h的水平下进行下一步研究。
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图 10 发酵时间对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响Figure 10. Effects of fermentation time on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour2.2.4 发酵温度对紫米粉品质的影响
根据图11可知，还原糖含量随温度的升高先增后减，在31 ℃时达到最大值54.03 mg/g，显著高于其他水平（P<0.05）。米根霉为真菌，其最适生长温度为30 ℃左右，植物乳杆菌为细菌，其最适生长温度为37 ℃左右。混菌发酵最适温度为31 ℃，与米根霉占比高相关。花色苷含量随着发酵温度的升高缓慢下降，因为花色苷是热敏性物质，结构极不稳定，温度越高损耗越大[35]。
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图 11 发酵温度对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响Figure 11. Effects of fermentation temperature on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour另依据图12所得，随着发酵温度的提升，感官评分在温度小于34 ℃时差异不显著（P>0.05），大于34 ℃后显著下降（P<0.05），这可能是因为温度超出了混菌的最适生长范围，代谢产物受到影响，使紫米粉风味变差。可滴定酸度则在温度小于31 ℃时逐渐提高，而后变化不明显。故综合考虑，选择发酵温度在28、31、34 ℃的水平下进行下一步研究。
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图 12 发酵温度对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响Figure 12. Effects of fermentation temperature on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour2.3 发酵参数正交试验结果
根据上述单因素实验结果，选取接种量（A）、料水比（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）4个因素，以综合评分为考查指标，采用L9（34）正交试验，进一步优化混菌发酵工艺参数。由表3正交试验结果和表4方差分析结果可知，4个因素均对综合评分影响极显著（P<0.01），各因素对综合评分的影响从大到小依次为料水比>发酵时间>发酵温度>接种量。根据综合评分计算得出k值的大小，可得到基本工艺优选组合为A2B2C2D2。该优选组合不在9组实验组当中，因此对其进行验证实验，得到紫米粉的还原糖含量为50.39 mg/g、花色苷含量150.08 mg/100 g、感官评分为18.2、可滴定酸度为3.8%，综合评分为81.41，高于正交表中9组实验的综合评分。故混菌发酵的优选发酵工艺参数选择A2B2C2D2，即接种量0.8%、料水比1:0.8 g/mL、发酵时间12 h、发酵温度31 ℃。
表 3 L9（34）正交试验结果Table 3. Results of L9 (34) orthogonal experiment实验号 A B C D 还原糖含量（mg/g） 花色苷含量（mg/100 g） 感官评分 可滴定酸度（%） 综合评分 1 1（0.6） 1（1:0.6） 1（8） 1（28） 30.35 161.91 15.40 2.45 64.28 2 1 2（1:0.8） 2（12） 2（31） 47.85 150.20 18.20 2.83 78.64 3 1 3（1:1.0） 3（16） 3（34） 44.49 125.00 3.30 3.25 50.74 4 2（0.8） 1 2 3 32.77 156.44 18.30 5.00 72.92 5 2 2 3 1 52.33 145.11 11.40 4.05 71.62 6 2 3 1 2 32.11 140.87 14.70 2.13 61.49 7 3（1） 1 3 2 42.61 146.13 13.90 5.13 71.04 8 3 2 1 3 43.17 154.02 15.10 3.33 71.91 9 3 3 2 1 35.92 137.35 12.60 2.45 60.53 k1 64.55 69.41 65.89 65.48 A2B2C2D2 k2 68.68 74.06 70.70 70.39 k3 67.83 57.59 64.46 65.19 R 4.13 16.47 6.23 5.20 表 4 正交试验方差分析结果Table 4. Variance analysis results of orthogonal experiment来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 修正模型 1716.744 8 214.593 165.319 .000 ** 截距 121200.320 1 121200.320 93370.672 .000 接种量 87.969 2 43.984 33.885 .000 ** 料水比 1290.635 2 645.318 497.142 .000 ** 发酵时间 188.007 2 94.003 72.419 .000 ** 发酵温度 150.134 2 75.067 57.830 .000 ** 误差 23.365 18 1.298 总计 122940.429 27 修正后总计 1740.109 26 注： *表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。 2.4 预发酵对紫米粉营养品质的影响
采用2.3混菌发酵优选参数，对紫米粉进行预发酵处理，其对体外淀粉消化性的影响如图13所示，经猪胰α-淀粉酶和糖化酶酶解180 min后，体外淀粉消化率由原紫米粉（对照）的50.27%提升至预发酵粉的62.37%，提升率为24.07%。RDS（快消化淀粉）由29.80%提高到34.67%，提高了16.34%（P<0.05），而RS（抗性淀粉）则由50.06%降低到44.76%，降低了10.59%（P<0.05）；表明混菌发酵显著提高了紫米粉的淀粉消化性。原因来自两个方面，微生物产生的淀粉酶将淀粉水解成还原糖；紫米淀粉经发酵后，淀粉颗粒结构变得更为疏松[36]，易于吸水膨胀，因而增加了淀粉与消化酶的接触几率。
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图 13 预发酵对紫米粉体外淀粉消化性的影响Figure 13. Effect of fermentation on the starch digestibility in vitro of the purple rice flour经过进一步挤压熟化后，预发酵熟化婴幼儿紫米粉体外淀粉消化率达到84.39%。RDS达到67.24%，RS降低至19.8%。表明挤压熟化也对改善淀粉消化性起到积极作用。
如图14所示，经预发酵处理后，游离酚含量显著增加，由原紫米粉204.46 mg GAE/100 g DW增加到231.44 mg GAE/100 g DW，提升了13.19%（P<0.05），而结合酚则显著降低（P<0.05），总酚含量则略微提升8.80 mg GAE/100 g DW，表明发酵提升了紫米粉中的游离酚含量。
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图 14 预发酵对紫米粉酚类含量的影响Figure 14. Effect of fermentation on the phenols content of the purple rice flour究其原因可能包含三方面，发酵过程中微生物分泌的酯酶可将结合酚转化为游离酚[37]；发酵改变了紫米细胞壁的通透性，使存在于细胞液泡中的多酚物质得到释放[38]；微生物通过次级代谢途径产生酚类物质[39]。大部分结合酚的生物利用率远低于游离酚[40]，因此结合酚转化为游离酚有利于提高婴幼儿紫米粉的生理效益。
由图15可知，预发酵粉植酸降解率为25.64%，预发酵熟化婴幼儿紫米粉为35.58%，表明发酵可以有效降解植酸，减少紫米中的植酸含量，熟化可以进一步加强该效果。这是因为在发酵过程中米根霉与植物乳杆菌可以产生植酸酶，进而达到分解植酸的效果，另外混菌发酵产生的酸性环境有利于植酸酶发挥作用[41]。目前已有研究证实了这个观点：Reddy等[42]用酵母菌、霉菌和细菌发酵谷类作物时，植酸含量降低了约50%；曹伟超等[43]用乳酸菌作为发酵剂制作黑豆酸面团，发酵后植酸降解率高达62.70%。植酸是谷物中常见的抗营养因子，减少植酸含量有助于营养物质的吸收[5]，对婴幼儿生长发育有利。
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图 15 预发酵对紫米粉植酸降解率的影响Figure 15. Effect of fermentation on the phytic acid degradation rate of the purple rice flour3. 结论
本研究通过单因素及正试实验，优选了米根霉与植物乳杆菌混菌发酵紫米粉的工艺参数，确定了最佳发酵条件为菌种混合比例（米根霉:植物乳杆菌）为8:1 g/mL、接种量0.8%、料水比1:0.8 g/mL、发酵时间12 h、发酵温度31 ℃。在此条件下得到的预发酵紫米粉还原糖含量为50.39 mg/g、花色苷含量150.08 mg/100 g、感官评分为18.2、可滴定酸度为3.8%，综合评分为81.41。另外通过对比原紫米粉与预发酵紫米粉营养品质，表明经过发酵处理可以显著提升紫米粉的体外淀粉消化性、增加游离酚含量以及减少植酸含量，大幅改善其营养品质。经过预发酵及挤压熟化处理后的婴幼儿紫米粉产品，其体外淀粉消化率为84.39%，游离酚含量为192.73 mg GAE/100 g DW，植酸降解率为35.58%。本工艺研究为开发以紫米为原料的高营养价值婴幼儿辅助食品提供了参考。
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图 1 婴幼儿紫米粉加工工艺步骤
注：“□”内表示操作步骤；“○”内表示样品名称。
Figure 1. Processing process of infant purple rice flour
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图 3 菌种比例对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
Figure 3. Effects of the inoculation proportion on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour
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图 4 菌种比例对紫米粉综合评分的影响
Figure 4. Effect of the inoculation proportion on the comprehensive evaluation of the purple rice flour
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图 5 接种量对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响
Figure 5. Effects of inoculation dose on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour
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图 6 接种量对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
Figure 6. Effects of inoculation dose on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour
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图 7 料水比对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响
Figure 7. Effects of solid-liquid ratio on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour
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图 8 料水比对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
Figure 8. Effects of solid-liquid ratio on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour
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图 9 发酵时间对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响
Figure 9. Effects of fermentation time on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour
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图 10 发酵时间对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
Figure 10. Effects of fermentation time on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour
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图 11 发酵温度对紫米粉还原糖含量、花色苷含量的影响
Figure 11. Effects of fermentation temperature on the content of reducing sugar and anthocyanin of the purple rice flour
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图 12 发酵温度对紫米粉感官评分、可滴定酸度的影响
Figure 12. Effects of fermentation temperature on the sensory evaluation and titrable acidity of the purple rice flour
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图 13 预发酵对紫米粉体外淀粉消化性的影响
Figure 13. Effect of fermentation on the starch digestibility in vitro of the purple rice flour
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图 14 预发酵对紫米粉酚类含量的影响
Figure 14. Effect of fermentation on the phenols content of the purple rice flour
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图 15 预发酵对紫米粉植酸降解率的影响
Figure 15. Effect of fermentation on the phytic acid degradation rate of the purple rice flour
表 1 L9（34）正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of L9 (34) orthogonal experiment
水平 A接种量
（%）B料水比
（g/mL）C发酵时间
（h）D发酵温度
（℃）1 0.6 1:0.6 8 28 2 0.8 1:0.8 12 31 3 1.0 1:1.0 16 34 
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表 2 婴幼儿紫米粉感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of infant purple rice flour
评价项目 评价标准 感官评分
（总分20）滋味（15分） 风味柔和，酸甜适口，具有发酵的特殊风味 10~15 风味适中，无明显苦涩味、酸味 5~9 异味感强烈，有苦涩味、酸味 0~4 气味（5分） 有紫米的香味及发酵的香味 4~5 整体香味稍淡，无异味 2~3 酸味强烈，有异味 0~1
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表 3 L9（34）正交试验结果
Table 3 Results of L9 (34) orthogonal experiment
实验号 A B C D 还原糖含量（mg/g） 花色苷含量（mg/100 g） 感官评分 可滴定酸度（%） 综合评分 1 1（0.6） 1（1:0.6） 1（8） 1（28） 30.35 161.91 15.40 2.45 64.28 2 1 2（1:0.8） 2（12） 2（31） 47.85 150.20 18.20 2.83 78.64 3 1 3（1:1.0） 3（16） 3（34） 44.49 125.00 3.30 3.25 50.74 4 2（0.8） 1 2 3 32.77 156.44 18.30 5.00 72.92 5 2 2 3 1 52.33 145.11 11.40 4.05 71.62 6 2 3 1 2 32.11 140.87 14.70 2.13 61.49 7 3（1） 1 3 2 42.61 146.13 13.90 5.13 71.04 8 3 2 1 3 43.17 154.02 15.10 3.33 71.91 9 3 3 2 1 35.92 137.35 12.60 2.45 60.53 k1 64.55 69.41 65.89 65.48 A2B2C2D2 k2 68.68 74.06 70.70 70.39 k3 67.83 57.59 64.46 65.19 R 4.13 16.47 6.23 5.20
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表 4 正交试验方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of orthogonal experiment
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 修正模型 1716.744 8 214.593 165.319 .000 ** 截距 121200.320 1 121200.320 93370.672 .000 接种量 87.969 2 43.984 33.885 .000 ** 料水比 1290.635 2 645.318 497.142 .000 ** 发酵时间 188.007 2 94.003 72.419 .000 ** 发酵温度 150.134 2 75.067 57.830 .000 ** 误差 23.365 18 1.298 总计 122940.429 27 修正后总计 1740.109 26 注： *表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
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