Ameliorative Effect of D-α-Tocopherol Acetate Complexes on D-Galactose-Induced Aging in Mice
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摘要: 为探究D-α-生育酚醋酸酯复配物对D-半乳糖致衰老小鼠的改善作用，通过测定天然油脂复配物+植物甾醇组（VEO组）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇复配组（VEZ组）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇+虾青素复配组（VEX组）的体外抗氧化能力，并采用小鼠颈背注射D-半乳糖建立衰老模型，同时用不同复配物进行干预。结果表明，三组复配物均有较强的抗氧化作用，其中VEZ组的体外抗氧化效果较佳；与衰老模型小鼠相比，经三组复配物干预后，小鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）升高，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）生成量下降（P<0.01），血清中炎症因子白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）和肝功能指标谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平均显著下降（P<0.01）；经过干预后，小鼠体内的核因子-E2-相关因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、醌氧化还原酶（Quinone oxidoreductase，NQO-1）、血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）的mRNA和蛋白表达显著增强（P<0.0001），说明不同复配物通过上调Nrf2、NQO-1、HO-1的表达，发挥其抗氧化作用，从而达到抗衰老的效果，其中VEZ组表达效果最佳。综上，D-α-生育酚醋酸酯复配物是通过增加抗氧化相关mRNA和蛋白表达量，从而增强下游抗氧化酶水平来实现抗衰老的效果，其中D-α-生育酚醋酸酯与植物甾醇复配的效果更佳。
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关键词:
- D-α-生育酚醋酸酯 /
- D-半乳糖 /
- 抗氧化作用 /
- 抗衰老作用 /
- 核因子-E2-相关因子（Nrf2）
Abstract: To investigate the ameliorative effect of the D-α-tocopheryl acetate compound on D-galactose-induced aging in mice, the in vitro antioxidant capacity of the compound of natural oils+phytosterols (VEO), the compound of D-α-tocopheryl acetate+phytosterol (VEZ), and the compound of D-α-tocopheryl acetat+phytosterol+astaxanthin (VEX) were measured. The aging model was established using mice injected with D-galactose on the back of the neck, while the intervention was carried out with different compounds. The results showed that all three groups of compounds had strong antioxidant effects, with the VEZ group showing better in vitro antioxidant effects. Compared with the aging model mice, the intervention of the three compounds increased glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidant capacity (T-AOC), decreased malondialdehyde (MDA) (P<0.01), and a decrease in the serum inflammatory factors interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor (TNF-α) and liver function indicators alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels were significantly reduced (P<0.01). After the intervention, the mRNA and protein expression of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), quinone oxidoreductase (NQO-1) and heme oxygenase-1 (HO-1) in mice were significantly enhanced (P<0.0001). This indicated that the different combinations exerted their antioxidant effects through up-regulating the expression of Nrf2, NQO-1 and HO-1, thus achieving anti-aging effects, with the VEZ group showing the best expression effect. In conclusion, D-α-Tocopheryl acetate complex achieved their anti-aging effects by increasing the expression of antioxidant-related mRNAs and proteins, thus enhancing the levels of downstream antioxidant enzymes, among which D-α-tocopheryl acetate was more effective when combined with phytosterols. -
衰老是机体内细胞、组织、器官渐渐衰退的生物学过程，这个过程往往伴随着一些并发症，如阿尔茨海默症、心血管疾病等[1]。迄今，关于衰老机制的理论有自由基学说、基因学说、细胞凋亡学说、端粒学说等，其中被人们认可和研究最多就是自由基学说[2]。当自由基的产生和抗氧化系统之间的平衡被破坏，会引起氧化应激和炎症反应的发生，从而导致衰老和疾病[3]。核因子-E2-相关因子（Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是氧化还原动态平衡和细胞解毒反应的主要调节者，通过激活几种抗氧化剂和解毒酶的基因转录，如醌氧化还原酶1（Quinone oxidoreductase 1，NQO-1），血红素氧合酶1（Hemeoxygenase1，HO-1）发挥抗氧化作用，从而起到抗衰老作用[4−5]。因此，寻找具有抗氧化及抗衰老作用的物质，并探究其作用机制是当前研究的热点之一。
脂溶性维生素E是一种天然抗氧化剂，可通过酯化反应，生成维生素E酯化衍化生物，使维生素E酯化衍生物既有维生素E原有的生理功能，又比维生素E更稳定[6]。天然形式的D-α-生育酚醋酸酯是目前常用的维生素E酯化衍生物之一。美藤果油是从美藤果的果仁中提取出来的，含有很高的不饱和脂肪酸含量，具有良好的体外抗氧化性[7]。植物甾醇可提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）浓度，改善氧化应激[8]。虾青素，一种类胡萝卜素的含氧衍生物，具有很好的体外抗氧化和提高抗氧化酶活性的能力[9]。大量研究表明，多种抗氧化剂的合用，能形成一个氧化-还原体系，其抗氧化能力明显高于单一的抗氧化剂[10]。王娜等[11]研究发现维生素E和白藜芦醇联合应用会有明显的抗氧化协同增效作用。Tang等[12]研究发现α-生育酚、γ-谷维素和植物甾醇的抗氧化能力随复配浓度的增加而增加。仅使用单一抗氧化剂不容易对机体的抗氧化系统产生全面的作用，因此采用多种抗氧化剂联合应用渐渐成为抗氧化研究新趋势。
鉴于此，本研究通过对比D-α-生育酚醋酸酯复配物的抗氧化和抗衰老效果，从而得出最佳的D-α-生育酚醋酸酯复配物，为抗衰老的相关研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
天然油脂复配物+植物甾醇（按小麦胚芽油：美藤果油：红花籽油：虾青素油：植物甾醇的比例为70:20:5:1:2制得）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇复配物（按D-α-生育酚醋酸酯：植物甾醇的比例为45:1混合而制）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇+虾青素复配物（按D-α-生育酚醋酸酯：植物甾醇：虾青素比例为90:2:1混合而制） 均由无限极（中国）有限公司提供；雄性SPF级C57BL/6小鼠 50只，（18±2）g，生产许可SCXK（粤）2021-0041南方医科大学实验动物中心；丙二醛试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶（Astaxanthin，AST）测试盒、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）测试盒、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）测试盒、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）测试盒 南京建成生物工程研究所
ANKE TDL-5-A型离心机 上海安亭分析仪器有限责任公司；Labserv K3酶标仪、Evolution 300紫外可见分光光度计、PIKOREAL96荧光定量RCP仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 体外抗氧化实验
1.2.1.1 DPPH·清除率
参照王肖行等[7]的方法，并略作修改。用乙醇将不同复配物、维生素C稀释成质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的溶液，取2 mL不同质量浓度的样品溶液于试管中，加入2 mL 0.2 mmol/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液，混匀，4000 r/min离心6 min，静置30 min，用乙醇为参比组调零，在517 nm处测定吸光度。按照以下公式计算清除能力：
式中：As为样品吸光度；Ac为用无水乙醇替代DPPH溶液的对照组吸光度；A0为用无水乙醇替代复配物样品溶液的空白组吸光度。
1.2.1.2 ·OH清除率
参照王钰等[13]的方法修改，用乙醇将不同的复配物、维生素C稀释成质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的溶液，在试管中加入2 mL配好的不同质量浓度的样品溶液、6 mmol/L的FeSO4溶液、6 mmol/L的H2O2溶液，摇匀后静置10 min，再加入6 mmol/L的水杨酸2 mL，混匀，室温避光静置30 min，在510 nm测其吸光度。羟基自由基（Hydroxyl radical，·OH）清除率按以下公式计算：
式中：As为样品组吸光度；Ac为用蒸馏水替代水杨酸的对照组吸光度；A0为用蒸馏水替代复配物溶液的空白组吸光度。
1.2.1.3 Fe2+螯合能力
参考王寒等[14]的方法。用乙醇将不同复配物、维生素C稀释成质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的溶液，在试管中加入1 mL不同质量浓度复配物溶液，3.7 mL蒸馏水、2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L 的菲啰嗪溶液 0.2 mL，振荡摇匀，避光静置10 min后，5000 r/min离心10 min，取上清液在562 nm处测定吸光度，Fe2+螯合率按以下公式计算：
式中：As为样品组吸光度，Ac为用蒸馏水替代反应体系中的FeCl2的空白组吸光度，A0为用蒸馏水替代复配物的空白组吸光度。
1.2.1.4 总还原能力
参考邢海亮等[15]的方法，用乙醇将不同复配物、维生素C稀释成质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的溶液，利用三氯乙酸法测定总还原能力，在700 nm测其吸光度。还原能力按以下公式计算：
式中：其中As为样品组吸光度，A0为用乙醇替代复配物稀释液作为空白组的吸光度。
1.2.2 衰老小鼠模型的抗氧化及抗衰老研究
1.2.2.1 衰老模型建立及干预
50只SPF级小鼠适应性喂养1周后，按体重随机分为5组，每组10只。其中，阴性对照组（NC）小鼠每日于颈背处皮下注射等体积的0.9%生理盐水；衰老模型组（SLM组）、天然油脂复配物+植物甾醇组（VEO组）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇复配组（VEZ组）、D-α-生育酚醋酸酯+植物甾醇+虾青素复配组（VEX组）小鼠每日于颈背处皮下注射300 mg/kg的D-半乳糖，同时VEO组、VEZ组、VEX组经口灌胃，给予剂量为1.7 mg/kg体重的相应受试样品，按照体重计算给药体积（0.1 mL/10 g），连续6周。
1.2.2.2 血清及肝脏组织的采集
实验结束后，小鼠禁食12 h，使用1%巴比妥钠（3.5 μL/g）麻醉各组小鼠，摘除小鼠眼球，用离心管收集小鼠血液，将收集好的血液，静置2 h，然后3500 r/min离心15 min，取上清液−20 ℃保存待测。采血后，即刻颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出肝脏，并将其在预冷的生理盐水中漂洗，去除血液，用滤纸吸干表面水分，冻存备用。
1.2.2.3 抗氧化指标测定
根据GSH-Px试剂盒、T-AOC试剂盒、MDA试剂盒的说明书，测定血清中相应的指标。
1.2.2.4 血清炎症因子测定
根据试剂盒说明书，测定IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子水平。
1.2.2.5 肝功能指标测定
根据试剂盒说明书，测定血清中AST、ALT含量。
1.2.2.6 RT-qPCR检测Nrf2通路中mRNA的表达
参照胡丽丽等[16]的方法，取肝脏组织0.02 g，用Trizol法提取组织总RNA，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，根据SYBR Premix EXTaqⅡ试剂盒使用说明配制反应体系，扩增条件为：预变性，95 ℃，10 min；扩增反应，95 ℃，15 s和95 ℃，30 s，共40个循环；溶解曲线分析在60~95 ℃。2−ΔΔCt法分析Nrf2相对内参基因β-肌动蛋白（β-actin）的表达水平。PCR引物由北京擎科有限公司设计合成，引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences引物 序列上游 序列下游 长度（bp） β-actin ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC TACTCCTGCTTGCTGATCCAC 223 Nrf2 GCTCCTATGCGTGAATCCCAA TTTGCCCTAAGCTCATCTCGT 143 NQO-1 TACGACAACGGTCCTTTCC AGAAACGCAGGATGCCACT 142 HO-1 TCCATGTTGACTGACCACGACT CCCACCCCTCAAAAGATAGCC 191 1.2.2.7 Western Blot检测Nrf2通路中蛋白的表达
剪取0.025 g肝脏组织，用冰预冷PBS洗组织，加入300 μL RIPA裂解液于生物样品均质仪中研磨，冰上裂解10 min；裂解结束后于4 ℃，12000 r/min离心15 min，取上清液进行蛋白定量。上样20 μL样品进行电泳分离后，转膜封闭；将膜与Nrf2、NQO-1、HO-1、β-actin抗体一起室温孵育60 min，4 ℃过夜；第2 d室温放置30 min，加入二抗孵育90 min后，在ECL化学发光液中显色，利用凝胶图像处理系统处理。
1.3 数据处理
所得实验数据利用GraphPad Prism 9软件进行汇总、显著性分析以及绘图，数据用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05则有显著差异。
2. 结果与分析
2.1 体外抗氧化能力
2.1.1 DPPH·清除率
DPPH·清除率常用来评估物质的抗氧化能力，该值越大，抗氧化能力越强[17]。由图1可知，质量浓度为1~5 mg/mL时，VEO组、VEZ组、VEX组的DPPH·清除率分别从20.83%、16.08%、14.25%升高到58.86%、67.81%、63.18%；在5 mg/mL时，VEZ组的清除率最高。
2.1.2 ·OH清除率
·OH是活性氧的一种，具有极强的氧化性[13]。由图1可知，除VEX组之外，其余复配物的·OH清除率随质量浓度的增加而升高，其中VEZ组的清除率显著优于VEO组（P<0.001）。VEX组的·OH清除能力在3 mg/mL达到最大；在5 mg/mL时，VEZ组的清除能力为67.48%，优于VEO组和VEX组。
2.1.3 Fe2+螯合能力
Fe2+离子具有强烈的助氧化能力，通过与过氧化氢（H2O2）之间的芬顿反应加速催化过氧自由基（·OOH）生成，诱导氧化反应的发生，而螯合剂可使Fe2+转化为稳定的氧化形式Fe3+，从而抑制芬顿反应中自由基的产生，发挥抗氧化作用[18]。从图1可知，在质量浓度为1~5 mg/mL范围内，不同复配物的Fe2+螯合能力随质量浓度的增加而升高，表现出比维生素C的Fe2+螯合能力强的效果；其中VEZ组表现最佳，在5 mg/mL时可达61.64%。
2.1.4 总还原能力
总还原能力指的是自由基接收到电子后转化为稳定物质的能力，抗氧化能力随总还原能力增强而增强[19]。由图1可知，在质量浓度为1~5 mg/mL范围内，不同复配物总还原能力随质量浓度的增加而升高，当质量浓度高于3 mg/mL后，VEZ组的总还原能力更好。刘晓飞等[20]研究表明植物甾醇具有良好的抗氧化能力，这与本实验结果相似。综上，不同复配物中，VEZ组的DPPH·清除能力、·OH清除能力、Fe2+螯合能力、总还原能力较强。
2.2 衰老小鼠模型抗氧化结果
2.2.1 不同复配物对衰老小鼠体内抗氧化指标的影响
在正常生理状态下，抗氧化系统负责清除组织中过多的活性氧（ROS），以保护机体免受氧化应激损伤，GSH-Px是抗氧化系统中主要的抗氧化酶，负责把组织中的ROS转化为乙醇和水，以中断过度氧化反应[21]。T-AOC各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平，是抗氧化系统功能状态的综合指标[22]。MDA是脂质过氧化的重要降解产物之一，其含量的表达间接反映了活性氧对细胞和组织的损害程度[23]。
从图2可知，与NC组相比，SLM组的GSH-Px酶活力和T-AOC活性分别显著（P<0.001）下降了63.54%、45.00%，MDA量显著增加了70.60%（P<0.0001），这表明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功。与SLM组相比，不同复配物的GSH-Px酶活力都提高了，VEO组、VEZ组、VEX组分别增加了34.28%、98.12%、170.49%；Min等[24]研究表明向饲料中添加维生素E能够通过上调GSH-Px基因的表达，发挥抗氧化能力，这与本研究结果一致。对于T-AOC活性，VEO组、VEZ组、VEX组分别比SLM组增加了65.01%、70.18%、70.67%（P<0.01）；对于MDA生成量，VEO组、VEZ组、VEX组分别比SLM组降低了56.04%、67.04%、64.04%（P<0.0001）。张露等[25]研究表明虾青素预处理，使高糖作用下晶状体上皮细胞的GSH-Px显著升高、MDA显著降低；李晓钰等[26]研究表明植物甾醇能降低高脂饮食建立的非酒精性脂肪肝小鼠模型的MDA上升。本研究发现，三组复配物显著降低了D-半乳糖诱导的脂质过氧化产物MDA的表达，并增加了GSH-Px和T-AOC的抗氧化酶活性，说明三组复配物具有良好的抗氧化能力，对小鼠体内氧化应激损伤具有一定的改善作用。
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2.2.2 不同复配物对衰老小鼠血清中炎症因子的影响
IL-6、IL-1β和TNF-α是参与炎症反应的细胞因子，参与到各种炎症反应与氧化应激中，当炎症增加，IL-6、IL-1β和TNF-α均升高[27]。由图3可知，与NC组相比，SLM组血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量表现出显著的升高（P<0.0001），通过不同复配物的干预后，均有所下降。与SLM组相比，VEO组、VEZ组、VEX组的IL-6含量分别下降了4.45%、3.34%、1.76%，IL-1β含量分别下降了4.79%、1.96%、2.30%，TNF-α含量分别下降了9.99%、8.07%、13.71%。这与丁婷婷等[28]研究结果一致，表明三组复配物在一定程度上具有缓解D-半乳糖致衰老小鼠炎症的能力。
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图 3 不同复配物对小鼠血清中炎症因子的影响Figure 3. Effects of different complexes on serum inflammatory factors in mice2.2.3 不同复配物对衰老小鼠ALT、AST含量的影响
氧化应激引发的肝功能破坏导致ALT、AST等酶的释放、脂质过氧化、抗氧化功能丧失以及活性氧的产生，因此ALT、AST酶活性的大小可以用于衡量肝功能的受损程度[29-30]。从图4可知，与NC组相比，SLM组的ALT和AST水平显著升高（P<0.0001），说明衰老导致了小鼠肝功能损伤。在不同复配物干预后，与SLM组相比，VEO组、VEZ组、VEX组的ALT水平分别下降22.21%、25.96%、24.11%，AST水平分别下降了8.85%、12.75%、16.01%（P<0.01）。这与Li等[31]研究结果相似，表明三组复配物有利于降低D-半乳糖致衰老小鼠的血清中AST、ALT含量，以缓解衰老导致的肝损伤。
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图 4 不同复配物对小鼠AST、ALT活力的影响Figure 4. Effects of different complexes on AST andALT activity in mice2.2.4 Nrf2通路的mRNA和蛋白的相对表达量
Nrf2是机体在氧化应激损伤时重要的转录调节因子，对位于其下游靶基因的表达起活化作用，当出现氧化应激时，Nrf2会激活下游NQO-1、HO-1等基因的表达[32]。Nrf2基因表达上调可能显著改善衰老相关疾病或延缓衰老过程，HO-1是体内负责把血红素分解的诱导酶，NQO-1能调节细胞的氧化还原电位水平，来发挥抗氧化作用[33−34]。由图5~图6可知，与NC组相比，SLM组的Nrf2、NQO-1、HO-1的mRNA和蛋白相对表达量显著下降（P<0.0001）。对于mRNA表达水平而言，与SLM组相比，VEO组、VEZ组、VEX组的Nrf2表达水平分别上升了336.31%、749.80%、393.06%，NQO-1的表达量分别上升了319.57%、668.94%、419.10%，HO-1表达量上升了404.83%、727.48%、460.43%（P<0.0001）；对于蛋白表达水平而言，与SLM组相比，VEO组、VEZ组、VEX组的Nrf2表达水平分别上升了42.6.67%、1093.33%、746.67%显著上升（P<0.0001），NQO-1的表达量分别上升了844.44%、1088.89%、1033.33%（P<0.0001），HO-1表达量上升了1150.00%、1912.50%、1412.50%（P<0.0001）。这与李晓钰等[28]、Sun等[35]研究结果一致，说明通过给予D-α-生育酚醋酸酯复配物可能通过激活Nrf2信号通路，减少氧化损伤，增加衰老小鼠下游靶基因NQO-1和HO-1的表达，能调节抗氧化酶活性，从而延缓衰老进程，并且在这不同D-α-生育酚醋酸酯复配物中，VEZ组的效果最好。
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图 6 Nrf2、NQO-1、HO-1mRNA和蛋白的相对表达量Figure 6. Relative expression of Nrf2, NQO-1, HO-1 genes and proteins3. 结论
本研究通过测定不同复配物的体外抗氧化能力，并采用D-半乳糖致小鼠衰老模型评价复配物的抗衰老作用。结果显示，三组复配物中VEZ组的体外抗氧化效果较佳；与衰老模型小鼠相比，经过三组复配物干预后，小鼠体内GSH-Px、T-AOC升高，MDA生成量下降，从而改善氧化应激损伤，血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和肝功能指标ALT、AST水平均下降；三组复配物干预后，Nrf2、NQO-1、HO-1的mRNA和蛋白相对表达量增强，其中VEZ组表达效果最佳。综上所述，D-α-生育酚醋酸酯复配物能激活Nrf2通路，增加NQO-1和HO-1的表达，提高抗氧化酶活性，降低脂质过氧化水平，来提升D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化应激能力增强抗氧化效果，从而延缓衰老进程，其中D-α-生育酚醋酸酯与植物甾醇复配的效果更佳。通过本研究结果将为D-α-生育酚醋酸酯复配物开发成为延缓衰老的食品提供实验依据。
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图 3 不同复配物对小鼠血清中炎症因子的影响
Figure 3. Effects of different complexes on serum inflammatory factors in mice
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图 4 不同复配物对小鼠AST、ALT活力的影响
Figure 4. Effects of different complexes on AST andALT activity in mice
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图 6 Nrf2、NQO-1、HO-1mRNA和蛋白的相对表达量
Figure 6. Relative expression of Nrf2, NQO-1, HO-1 genes and proteins
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物 序列上游 序列下游 长度（bp） β-actin ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC TACTCCTGCTTGCTGATCCAC 223 Nrf2 GCTCCTATGCGTGAATCCCAA TTTGCCCTAAGCTCATCTCGT 143 NQO-1 TACGACAACGGTCCTTTCC AGAAACGCAGGATGCCACT 142 HO-1 TCCATGTTGACTGACCACGACT CCCACCCCTCAAAAGATAGCC 191 
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