Simultaneous Determination of Epi-Catechins and Their Oxidized Dimers, Gallic Acid and Caffeine in Tea by HPLC
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摘要: 目的：本研究旨在建立同时分析茶叶中4种表儿茶素（表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯）及其氧化二聚体（4种茶黄素（Theaflavins，TFs）：茶黄素、茶黄素双没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯和茶黄素-3’-没食子酸酯）、3种聚酯型儿茶素（Theasinensins，TSs）（TSA、TSB和TSC）、没食子酸和咖啡碱的高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）方法。方法：首先利用化学合成的方法制备TSA、TSB和TSC；然后参照文献对HPLC流动相做适当调整和对梯度洗脱条件进行优化，色谱柱为Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为纯水（A）、50 mmol/L磷酸（B）和乙腈（C），检测波长为280 nm，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 L；最后根据建立的HPLC方法对绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶中的上述13种物质含量进行测定。结果：在最优梯度洗脱条件下4种表儿茶素、4种TFs、3种TSs、没食子酸及咖啡碱可在66 min内得到较好地分离，同时各物质在0.01~1.00 mg/mL的质量浓度范围内与其峰面积的线性关系良好（R2均在0.9904~0.9966范围内），重复性相对标准偏差（The relative standard of deviation，RSD）为1.034%~4.008%，精密度RSD为1.882%~4.835%，稳定性RSD为0.349%~3.994%，三种浓度的加标回收率在90.106%~107.331%之间且RSD<3.268%。此外，上述13种物质含量在不同茶叶样本间存在显著差异，且所有检测值均在标准曲线有效测定范围内。结论：本方法操作简单高效、结果准确可靠，可用于茶叶中表儿茶素、茶黄素、聚酯型儿茶素、没食子酸和咖啡碱的同时分析。Abstract: Objective: The present study was aimed to develop the simultaneous determination of four kinds of epi-catechins ((-)-epicatechin, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin and (-)-epigallocatechin gallate) and their oxidized dimers (four kinds of theaflavin (TF): theaflavin, theaflavin-3-gallate, theaflavin-3'-gallate and theaflavin-3,3'-digallate, three kinds of theasinensin (TS): TSA, TSB and TSC), gallic acid and caffeine by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: Firstly, TSA, TSB and TSC were chemically synthesized. Then, the gradient elution conditions for HPLC analysis were obtained according to the reported methods with some modifications. Chromatographic separation was achieved on a Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). Ultrapure water (eluent A), 50 mmol/L H3PO4 (eluent B) and acetonitrile (eluent C) were used as the mobile phases. The DAD acquisition wavelength was set at 280 nm. The flow rate was 0.8 mL/min and oven temperature was set at 30 ℃. The volume of injection was 20 μL. Finally, the conents of these componds mentioned above in green, oolong, black and dark teas were determined by the developed HPLC method. Results: Under the optimized conditions, 4 kinds of epicatechins, 4 kinds of theaflavins, 3 kinds of theasinensins, gallic acid and caffeine could be separated within 66 min. At the same time, in the range of 0.01~1.00 mg/mL, the substances and their peak areas showed a good linear relationship (R2, 0.9904~0.9966). The relative standard of deviation (RSD) for repeatability was 1.034%~4.008%. The RSD of the precision and the stability were 1.882%~4.835% and 0.349%~3.994%, respectively. The recovery test of three concentrations was in the range of 90.106%~107.331% and the RSD was less than 3.268%. In adition, it was found that the contents of these 13 compounds were significantly different among different tea samples, and all the detected values were within the effective determination range of the standard curve. Conclusion: The developend method is simple, accurate, and reproducible, it can be used for the simultaneous determination of epi-catechins, theaflavins, theasinensins, gallic acid, and caffeine in tea samples.
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Keywords:
- tea /
- HPLC /
- epicatechins /
- theaflavins /
- theasinensins /
- caffeine
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茶作为当今世界受欢迎的饮品，按照加工方式的不同可分为绿茶、乌龙茶、红茶、黑茶等，并且这些不同种类的茶叶中各生物活性成分含量亦不尽相同，从而影响并决定不同种类茶叶的品质[1-4]。以儿茶素类、生物碱类、酚酸类等为代表的茶叶生物活性成分构筑了茶叶保健功能的物质基础，其中表儿茶素（（-）-epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（（-）-epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（（-）-epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）、茶黄素（Theaflavins，TFs）、聚酯型儿茶素（Theasinensins，TSs）、没食子酸（Gallic acid，GA）和咖啡碱（Caffeine）是茶叶品质的重要因子[5]。因此，构建一种可同时测定茶叶中4种表儿茶素、茶黄素、聚酯型儿茶素、没食子酸和咖啡碱的高效液相（HPLC）方法对于茶叶品质的分析与质量控制具有重要意义。
表儿茶素（EGCG、ECG、EGC、EC）是茶叶中最为主要的儿茶素单体，在茶叶中含量最高，也是茶叶中重要的氧化产物-TFs和TSs的主要儿茶素来源[5-7]。在茶叶发酵过程中，四种表儿茶素单体的含量及相对组成比例对茶叶二聚体的形成有着重要影响。TSs是可与TFs相媲美的一种仅通过联苯键形成[8]的儿茶素氧化二聚体，根据儿茶素底物的不同，TSs又可进一步分为TSA、TSB和TSC等[9]，它们仅存在于乌龙茶和红茶等发酵茶中，并且已被证明具有潜在的降血糖、抗肥胖等调节机体代谢紊乱的生物活性[10]，对茶的品质有着直接的影响。目前，国内外对茶叶中物质成分含量的测定方法主要有近红外光谱法[11]、薄层色谱法[12]、高效液相色谱（HPLC）法[13-15]和液相色谱-质谱联用法[16-19]等，其中HPLC方法对茶叶样品条件无严格要求，且受限制因素少，并能同时分离、识别和分析复杂的多元混合物，因此HPLC分析方法逐渐成为主流的检测方法。由于TSs制备的复杂性，缺乏TSs标样，目前同时检测茶叶中表儿茶素、TFs、TSs、GA和咖啡碱的HPLC方法报道较少。TSs的制备方法主要有直接提取法[20]、酶法合成法[8]和化学合成法[21]等。相较于直接提取法和酶法合成法，化学合成法对于产物的分离纯化难度较低，反应易于控制。因此，本研究首先利用化学合成的方法制备TSA、TSB和TSC，然后参照文献[22]的色谱条件对HPLC流动相做适当调整和对梯度洗脱条件进行优化，从而构建一种同时检测4种表儿茶素及其氧化二聚体（4种TFs、3种TSs）、没食子酸和咖啡碱的HPLC方法，最后利用该方法测定绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶中各成分的含量，为茶叶品质分析与控制提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
GA、咖啡碱、EGCG、EGC、ECG、EC、TF、TFDG、TF3G和TF3’G（HPLC≥98%） 成都普瑞法有限公司；TSA、TSB、TSC 实验室自制；抗坏血酸 南京辉亚生物科技有限公司；大孔树脂HP-20 北京市索莱宝生物科技有限公司；甲醇、乙腈 色谱纯，江苏汉邦公司；磷酸、氯化铜等 分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；绿茶（黄金芽）、红茶（正山小种红茶）、乌龙茶（凤凰单丛茶）、黑茶（益茯砖茶） 南京市玄武区苏果超市孝陵卫店。茶样信息见表1。
表 1 茶样信息Table 1. Information of tea samples茶样 产地 生产日期 黄金芽 浙江省丽水市松阳县 2022年4月16日 凤凰单从茶 广东省潮州市凤凰镇 2019年12月10日 正山小种红茶 福建省武夷山市星村镇 2021年11月23日 湘益茯砖茶 湖南省益阳市郝山区 2021年12月10日 Shimadzu AY120万分之一天平 日本岛津公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州普天仪器仪器制造有限公司；CJJ78-1磁力加热搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂；超纯水制备仪 南京易普易达科技发展有限公司；HL-2B型电脑数显恒流泵、DBS-100A型电脑全自动部分收集器、HD-A核酸蛋白检测仪 上海青浦沪西仪器厂；Telstar-LyoQuest 冷冻干燥机 西班牙Telstar公司；EYELA（N-1100）旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；AKTA制备型液相色谱仪 美国GE公司；Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ色谱柱（250 cm×4.6 mm，5 μm） 日本Cosmosil公司；YMC-Pack ODS-A色谱柱 日本YMC公司；Multifuge X1R高速冷冻台式离心机 美国Thermo Scientific公司；MALDI-TOF-MS 德国BRUKER公司。
1.2 实验方法
1.2.1 TSA、TSB和TSC的制备与纯度测定
TSA、TSB和TSC的制备参照文献[21]报道的方法。首先准确称取1.00 g EGCG，将其溶解到400 mL 30%甲醇水溶液（预先加有0.34 g CuCl2）中，于室温下搅拌反应24 h。随后加入10.00 g抗坏血酸，于85 ℃条件下加热15 min，得到TSA反应混合液。同样地，分别以EGCG和EGC为合成底物经过上述同样条件反应得到TSB反应混合液，以EGC为合成底物经过上述同样条件反应得到TSC反应混合液。将上述TSA、TSB和TSC反应混合液分别上样至已活化的HP-20大孔树脂层析柱中，利用甲醇溶液进行梯度洗脱，利用核酸蛋白检测仪于280 nm处进行在线监测洗脱，收集并合并同一组分洗脱液，得TSA、TSB和TSC粗品液。随后，利用AKTA进一步纯化TSA、TSB和TSC，色谱柱：YMC-Pack ODS-A （250 mm×20 mm），流动相条件为纯水:乙酸:乙腈=125:10:11（v:v:v），检测波长：280 nm，收集并合并同一组分洗脱液，旋蒸浓缩，冷冻干燥后得TSA、TSB和TSC纯品。
利用HPLC方法[21]并做适当修改对制得的TSA、TSB和TSC进行纯度检测，色谱柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测波长：280 nm；流动相：A相为纯水，B相为50 mmol/L磷酸；C相为乙腈；流速：0.8 mL/min；梯度洗脱条件：0~10 min，B 82%~76.54%，C 13%~16%；10~12 min，B 76.54%~82%，C 16%~13%；平衡5 min。利用MALDI-TOF-MS对TSA、TSB和TSC纯品进行分子量鉴定。样品检测条件为：以2,5-二羟基苯甲酸（DHB）为基质，1 μL的待测样品与1 μL的基质混匀后，在金属靶板上点样1 μL样品和基质的混合物，抽真空加速干燥，阳离子模式下对待测样进行检测，MALDI-TOF-MS的实验结果使用BRUKER Flexanalysis 3.3件进行分析。
1.2.2 高效液相色谱条件建立
1.2.2.1 标准品溶液及各茶叶样品溶液的制备
准确称取EC、ECG、EGC、EGCG、TF、TFDG、TF3G、TF3’G、TSA、TSB、TSC、GA、咖啡碱标准品10.0000 mg，10%乙腈溶液充分溶解并定容至5.0 mL作为浓度为2.0 mg/mL的混合标准品母液，采用梯度稀释法用10%乙腈溶液将混合标准品母液配制成1.0、0.75、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01 mg/mL的一系列质量浓度梯度的混合标准品工作液，过0.45 μm有机滤膜，4 ℃条件下贮存备用。
基于GB/T 8313-2018制备各茶叶样品溶液。首先称取0.2000 g均匀磨碎的茶样于10 mL离心管中，加入5.0 mL 70 ℃预热的70%甲醇，摇匀，于70 ℃水浴中浸提10 min，每5 min振荡1次。在3500 r/min转速下离心10 min，取上清液于10 mL离心管中。残渣再重复以上操作。最后合并2次提取液，定容至10.0 mL，摇匀，过0.45 μm有机滤膜，4 ℃条件下贮存备用。
1.2.2.2 梯度洗脱条件的优化
参照文献[22]同时测定TSs和TFs的HPLC方法，对流动相稍作修改并进行梯度洗脱条件的优化。设定色谱条件为：色谱柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测波长：280 nm；流动相：A相为纯水，B相为50 mmol/L磷酸；C相为乙腈；流速：0.8 mL/min；梯度洗脱条件优化如下（表2）：
表 2 梯度洗脱条件Table 2. Gradient elution时间（min） A相（%） B相（%） C相（%） 条件a 0 5 82 13 10 4 76 20 22 6 70 24 30 15.5 58 26.5 40 5 25 75 45 5 82 13 50 5 82 13 条件b 0 5 82 13 22 9 70 21 30 18.08 60 21.92 31 5 20 75 41 5 20 75 42 5 82 13 52 5 82 13 条件c 0 5 82 13 22 9 70 21 35 25 50 25 55 25 50 25 56 5 82 13 66 5 82 13 1.2.2.3 方法学考察及验证
标准曲线的绘制：将稀释至1.0、0.75、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0.01 mg/mL的混合标准品工作液，在1.2.2.2节最优梯度洗脱条件下进样20 μL测定，计算峰面积，重复测定3次。以标准品质量浓度（X，mg/L）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。
重复性实验：按照1.2.2.1节方法平行制备6份待测茶叶样品溶液，在1.2.2.2节最优梯度洗脱条件下进样20 μL测定，根据测得结果计算茶叶样品中各组分的含量，并计算相对标准偏差（RSD）。
精密度实验：按照1.2.2.1节方法制备待测茶叶样品溶液，在1.2.2.2节最优梯度洗脱条件下进样20 μL，重复进样6次，根据测得结果计算茶叶样品中各组分的含量，并计算RSD值。
稳定性实验：按照1.2.2.1节方法制备待测茶叶样品溶液，并将其放置于4 ℃冰箱中，分别取放置0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h样品溶液，在1.2.2.2节最优梯度洗脱条件下进样20 μL，根据测得结果计算茶叶样品中各组分的含量，并计算RSD值。
加标回收率实验：按照1.2.2.1节方法制备待测茶叶样品溶液，根据各标准物质在茶样中的含量，向样品中分别添加低、中、高三种浓度的混合标准溶液，再根据1.2.2.2节最优梯度洗脱条件进样20 μL，根据测得结果进行平均加标回收率检测，并计算RSD值。
1.3 数据处理
所有实验均设置3次重复，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析和数据统计。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。使用Origin 2018软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 TSA、TSB、TSC纯度测定和质谱鉴定
利用HPLC方法测定上述制备的TSA、TSB、TSC纯度，结果如图1A~C所示。由图可以看出，TSA、TSB和TSC的峰纯度指数（Peak purity index）均大于0.999，且均大于其单点阈值（Single point threshold），说明峰是纯峰。此外，峰面积占比（Peak area ratio）分别为97.52%、97.82%和96.91%，均大于95%，因此可用来进一步进行质谱鉴定。利用MALDI-TOF-MS进行分子量确认，MALDI-TOF-MS 质谱结果如图2A~C所示。一级质谱数据经Flexanalysis 3.3软件分析后，阳离子加钠条件下在图谱中发现TSA、TSB和TSC的特征荷质比分别为[M+Na]+=937.168、[M+Na]+=784.989和[M+Na]+=633.018，与其加钠阳离子条件下的理论荷质比一致。因此，本实验制备得到的TSA、TSB、TSC可用来进行后续相关实验。
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1 聚酯型儿茶素液相色谱图注：A：聚酯型儿茶素A；B：聚酯型儿茶素B：C：聚酯型儿茶素C。1. Liquid chromatographic diagram a of theasinensins![]()
图 2 聚酯型儿茶素的质谱图注：A：聚酯型儿茶素A；B：聚酯型儿茶素B；C：聚酯型儿茶素C。Figure 2. Mass spectra of theasinensins2.2 方法的建立与验证
2.2.1 HPLC色谱图出峰情况
图3A~C显示了三种梯度洗脱条件下13种标准品的高效液相色谱图。由图3可以看出，在A梯度洗脱条件下由于前期流动相组成变化较快，TSC和GA的分离度较差，两者不能良好分离，并且四种茶黄素未被洗脱下来。在B梯度洗脱条件下，TSA和GA能够实现较好分离，但TF、TFDG、TF3G和TF3’G四种茶黄素均未被洗脱出来，这可能是由于流动相极性较小所致。在HPLC中两种物质的分离程度可以用分离度（R）来衡量，在C梯度洗脱条件下，包括四种茶黄素在内的13种目标物质均能够被洗脱下来且R值均超过1.5，表明在该色谱条件下13种物质具有较好的分离效果。在C梯度洗脱条件下，乌龙茶和红茶样品中13种物质的出峰情况如图4A~B所示，图中13种目标物质在乌龙茶和红茶中均被检测到且能够较好分离。因此选择总运行时间为66 min的梯度洗脱条件C作为高效液相后续梯度洗脱条件。
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图 4 乌龙茶和红茶中13种物质液相色谱图注：A：乌龙茶；B：红茶。Figure 4. Liquid chromatographic diagram of oolong tea and black tea2.2.2 方法学验证结果
2.2.2.1 标准曲线建立
13种物质的标准曲线如表3所示。由表3可以看出13种物质的标准曲线方程回归系数在0.9904~0.9966之间，说明各单体峰面积在质量浓度范围0.01~1.00 mg/mL之间具有较强的线性关系。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别定义为当信噪比S/N为3和10时的样品浓度，13种标准品的LOD为0.0002~0.011 mg/mL，LOQ为0.0007~0.037 mg/mL。
表 3 各物质标准曲线Table 3. Standard curve of authentic standards物质 浓度范围（mg/mL） 回归方程 回归系数（R2） 检出限（mg/mL） 定量限（mg/mL） TSC 0.01~1.000 y=3676.9775x−209.2683 R2=0.9966 0.002 0.007 GA 0.01~1.000 y=22704.2817x+1854.5021 R2=0.9932 0.008 0.024 TSB 0.01~1.000 y=14950.5572x−1030.4098 R2=0.9950 0.003 0.010 EGC 0.01~1.000 y=3529.5253x−237.9732 R2=0.9916 0.011 0.037 咖啡碱 0.01~1.000 y=34920.3469x+700.6612 R2=0.9934 0.0002 0.0007 TSA 0.01~1.000 y=22508.2687x−1795.0829 R2=0.9926 0.002 0.007 EC 0.01~1.000 y=9390.1784x−238.4576 R2=0.9935 0.006 0.018 EGCG 0.01~1.000 y=23425.5722x−1771.3976 R2=0.9904 0.003 0.01 ECG 0.01~1.000 y=7211.3934x−283.3098 R2=0.9945 0.003 0.010 TF 0.01~1.000 y=3676.9775x−209.2683 R2=0.9966 0.005 0.016 TF3G 0.01~1.000 y=22704.2817x+1854.5021 R2=0.9932 0.003 0.009 TF3’G 0.01~1.000 y=14950.5572x−1030.4098 R2=0.9950 0.003 0.009 TFDG 0.01~1.000 y=3529.5253x−237.9732 R2=0.9916 0.003 0.010 2.2.2.2 重复性、精密度和稳定性
重复性实验结果如表4所示，各成分RSD值在1.034%~4.008%之间，说明此方法在最佳梯度洗脱条件下具有良好的重复性。精密度实验结果表明各成分RSD值在1.882%~4.835%之间，说明此方法精密度良好。稳定性实验结果表明各成分RSD值在0.349%~3.994%之间，说明此方法稳定性较好。
表 4 各物质重复性、精密度和稳定性试验结果Table 4. The results of the repetitive, precision and stability tests for substances物质 重复性相对标准
偏差（%）精密度相对标准
偏差（%）稳定性相对标准
偏差（%）TSC 2.890 3.030 2.071 GA 1.829 1.882 2.348 TSB 3.426 3.188 2.847 EGC 1.304 2.934 1.904 咖啡碱 1.901 2.541 2.062 TSA 3.592 4.835 0.349 EC 1.94 9 3.124 0.423 EGCG 1.034 4.155 3.844 ECG 2.665 3.378 3.444 TF 3.123 3.881 2.396 TF3G 3.020 4.020 0.724 TF3’G 4.008 4.278 3.994 TFDG 3.909 4.288 3.500 2.2.2.3 平均加标回收率
13种标准物质在高、中、低三种加标浓度下的回收率结果如表5所示，13种标准物质在不同加标浓度下的回收率在90.106%~107.331%之间，符合基质加标回收范围80%~120%，各物质RSD<3.268%，结果准确可靠。
表 5 各物质加标回收率试验结果Table 5. The results of the recovery test for substances物质 加标浓度（mg/mL） 加标回收率（%） RSD（%） 高 中 低 高 中 低 高 中 低 TSC 0.45 0.25 0.05 90.996 91.166 90.878 1.234 1.219 1.204 GA 0.45 0.20 0.10 94.150 95.682 96.822 1.210 0.991 0.712 TSB 0.45 0.25 0.05 91.876 92.727 93.398 1.219 1.226 1.320 EGC 0.80 0.50 0.20 95.989 95.880 95.771 0.503 0.489 0.475 咖啡碱 0.45 0.30 0.10 95.926 93.689 91.383 1.809 2.228 2.329 TSA 0.45 0.30 0.10 92.889 93.556 92.557 1.210 1.424 1.788 EC 0.45 0.30 0.10 99.080 98.662 99.800 3.120 3.268 3.110 EGCG 0.45 0.30 0.10 104.127 105.110 103.756 1.923 1.899 1.779 ECG 0.45 0.20 0.10 95.356 97.002 97.674 3.109 3.224 3.165 TF 0.18 0.10 0.02 95.826 94.939 96.869 1.210 1.118 0.534 TF3G 0.18 0.10 0.02 101.662 102.986 101.373 1.519 2.880 2.366 TF3’G 0.18 0.10 0.02 107.331 106.313 103.827 0.308 0.210 0.154 TFDG 0.18 0.10 0.02 90.256 90.961 90.106 2.239 2.528 1.512 2.3 不同茶叶样品中表儿茶素、没食子酸、茶黄素、聚酯型儿茶素和咖啡碱的含量测定
绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶的液相色谱图如图5所示。不同茶叶样品中13种物质的含量如表6所示。从表6可以看出，绿茶、红茶、乌龙茶和黑茶中4种表儿茶素、GA、TFs、TSs和咖啡碱含量存在显著差异。绿茶中4种表儿茶素类总量最高（171.65 mg/g），其次是乌龙茶（135.19 mg/g），红茶和黑茶含量较少（分别为29.72 mg/g和29.89 mg/g），与文献报道的一致[13,15]。此外，与绿茶相比，红茶和黑茶中的酯型儿茶素（EGCG、ECG）含量较低，这可能是由于在茶叶加工过程中部分酯型儿茶素被酶水解转化形成非酯型儿茶素和GA，而后部分非酯型儿茶素发生氧化缩合形成茶黄素、茶红素和茶褐素[23-24]；或者部分酯型儿茶素经酶促氧化形成醌类物质，而后以不同的方式转化形成TFs和TSs[25]。TSs方面，乌龙茶中聚酯型儿茶素含量最高（20.717 mg/g），其次是黑茶和红茶，分别为17.228 mg/g和15.106 mg/g，绿茶中聚酯型儿茶素类含量最少（3.942 mg/g），且四种茶样中均是TSA含量最高，TSB含量最少，与之前文献[22]报道的一致。TFs方面，未发酵绿茶中未检测到TFs。后发酵黑茶中未检测到TFs，这可能是由于黑茶后发酵过程中茶黄素、茶红素与多糖、蛋白质和脂类等其他物质进一步氧化聚合形成茶褐素[26-27]。半发酵茶乌龙茶和发酵茶红茶中TFs含量较高。红茶和乌龙茶中TFs总量分别为10.904 mg/g和9.046 mg/g，其中红茶中TFDG和TF含量均最高，分别为2.958±0.037 mg/g和2.845±0.011 mg/g，此结果与文献[28]报道的一致。红茶中GA含量最高（5.728±0.025 mg/g），其次是黑茶和乌龙茶（分别为5.008±0.016 mg/g和4.775±0.029 mg/g），绿茶中含量最低（3.909±0.023 mg/g），这与文献中报道的在茶叶发酵过程中酯型儿茶素降解生成非酯型儿茶素和GA[29]相一致。各茶叶样品中，咖啡碱含量最高为38.388±0.047 mg/g（红茶），最低为31.139±0.028 mg/g（黑茶），这与文献[30]报道的含量接近。
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图 5 绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶液相色谱图注：A：绿茶；B：乌龙茶；C：红茶；D：黑茶。Figure 5. Liquid chromatographic diagram of green tea, Oolong tea, black tea and dark tea表 6 茶样中化合物含量Table 6. Content of compounds in tea samples物质 绿茶（mg/g） 乌龙茶（mg/g） 红茶（mg/g） 黑茶（mg/g） TSC 1.008±0.046a 6.669±0.007c 4.260±0.029b 4.083±0.041b GA 3.909±0.023a 4.775±0.029b 5.728±0.025d 5.008±0.016c TSB 0.901±0.085a 4.854±0.062d 3.398±0.032b 3.992±0.067c EGC 38.195±0.003c 24.858±0.031b 10.803±0.030a 10.811±0.029a 咖啡碱 34.495±0.020b 35.714±0.024c 38.388±0.047d 31.139±0.028a TSA 2.033±0.017a 9.194±0.013c 9.570±0.021c 7.031±0.031b EC 20.894±0.045d 10.565±0.005c 5.498±0.038a 7.348±0.017b EGCG 81.813±0.025d 76.868±0.024c 5.979±0.025b 5.693±0.005a ECG 30.751±0.022d 22.903±0.041c 7.443±0.005b 6.047±0.025a TF ND 2.845±0.011a 2.853±0.025b ND TF3G ND 2.289±0.045a 2.724±0.043b ND TF3’G ND 1.800±0.010a 2.369±0.010b ND TFDG ND 2.112±0.040a 2.958±0.037b ND 注：同行不同小写字母表示存在显著差异（P<0.05）；ND表示未检测到。 3. 结论
本研究首先利用化学合成的方法制备TSA、TSB和TSC纯品，然后建立同时检测EGCG、EGC、ECG、EC、TF、TFDG、TF3G、TF3’G、TSA、TSB、TSC、GA和咖啡碱的HPLC方法。在此条件下茶叶中13种主要化学成分均可在66 min内得到较好地分离，同时各物质在0.01~1.00 mg/mL的质量浓度范围内与其峰面积的线性关系良好，并且该方法重复性好、精密度高、稳定性好、加标回收率符合要求。最后利用该方法对绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶中的 4 种表儿茶素及其氧化二聚体（4 种 TFs 和 3 种TSs）、GA和咖啡碱进行分析和比较，发现各活性物质在不同茶叶中存在显著差异。红茶中咖啡碱含量最高（38.388±0.047 mg/g），黑茶中含量最低（31.139±0.028 mg/g）。GA在红茶、黑茶、乌龙茶和绿茶中的含量由高到低依次为5.728±0.025、5.008±0.016、4.775±0.029和3.909±0.023 mg/g。绿茶中4种表儿茶素类总量为171.65 mg/g，其次是乌龙茶135.19 mg/g，红茶和黑茶含量分别为29.72 mg/g 和29.89 mg/g。与绿茶相比，红茶、乌龙茶和黑茶中EGCG和ECG含量较低，而红茶和乌龙茶中的茶黄素、EGC和EC含量较高，这可能与茶叶发酵过程中酯型儿茶素的降解以及氧化缩合有关[26,31]。本研究建立的方法操作简单、结果准确可靠，适用于不同茶叶中4种表儿茶素、茶黄素、聚酯型儿茶素、没食子酸和咖啡碱的同时分析。本研究为茶叶的加工、品质控制和营养功能评价提供了一种可靠的快速分析手段。
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1 聚酯型儿茶素液相色谱图
注：A：聚酯型儿茶素A；B：聚酯型儿茶素B：C：聚酯型儿茶素C。
1. Liquid chromatographic diagram a of theasinensins
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图 2 聚酯型儿茶素的质谱图
注：A：聚酯型儿茶素A；B：聚酯型儿茶素B；C：聚酯型儿茶素C。
Figure 2. Mass spectra of theasinensins
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图 4 乌龙茶和红茶中13种物质液相色谱图
注：A：乌龙茶；B：红茶。
Figure 4. Liquid chromatographic diagram of oolong tea and black tea
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图 5 绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶液相色谱图
注：A：绿茶；B：乌龙茶；C：红茶；D：黑茶。
Figure 5. Liquid chromatographic diagram of green tea, Oolong tea, black tea and dark tea
表 1 茶样信息
Table 1 Information of tea samples
茶样 产地 生产日期 黄金芽 浙江省丽水市松阳县 2022年4月16日 凤凰单从茶 广东省潮州市凤凰镇 2019年12月10日 正山小种红茶 福建省武夷山市星村镇 2021年11月23日 湘益茯砖茶 湖南省益阳市郝山区 2021年12月10日 
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表 2 梯度洗脱条件
Table 2 Gradient elution
时间（min） A相（%） B相（%） C相（%） 条件a 0 5 82 13 10 4 76 20 22 6 70 24 30 15.5 58 26.5 40 5 25 75 45 5 82 13 50 5 82 13 条件b 0 5 82 13 22 9 70 21 30 18.08 60 21.92 31 5 20 75 41 5 20 75 42 5 82 13 52 5 82 13 条件c 0 5 82 13 22 9 70 21 35 25 50 25 55 25 50 25 56 5 82 13 66 5 82 13
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表 3 各物质标准曲线
Table 3 Standard curve of authentic standards
物质 浓度范围（mg/mL） 回归方程 回归系数（R2） 检出限（mg/mL） 定量限（mg/mL） TSC 0.01~1.000 y=3676.9775x−209.2683 R2=0.9966 0.002 0.007 GA 0.01~1.000 y=22704.2817x+1854.5021 R2=0.9932 0.008 0.024 TSB 0.01~1.000 y=14950.5572x−1030.4098 R2=0.9950 0.003 0.010 EGC 0.01~1.000 y=3529.5253x−237.9732 R2=0.9916 0.011 0.037 咖啡碱 0.01~1.000 y=34920.3469x+700.6612 R2=0.9934 0.0002 0.0007 TSA 0.01~1.000 y=22508.2687x−1795.0829 R2=0.9926 0.002 0.007 EC 0.01~1.000 y=9390.1784x−238.4576 R2=0.9935 0.006 0.018 EGCG 0.01~1.000 y=23425.5722x−1771.3976 R2=0.9904 0.003 0.01 ECG 0.01~1.000 y=7211.3934x−283.3098 R2=0.9945 0.003 0.010 TF 0.01~1.000 y=3676.9775x−209.2683 R2=0.9966 0.005 0.016 TF3G 0.01~1.000 y=22704.2817x+1854.5021 R2=0.9932 0.003 0.009 TF3’G 0.01~1.000 y=14950.5572x−1030.4098 R2=0.9950 0.003 0.009 TFDG 0.01~1.000 y=3529.5253x−237.9732 R2=0.9916 0.003 0.010
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表 4 各物质重复性、精密度和稳定性试验结果
Table 4 The results of the repetitive, precision and stability tests for substances
物质 重复性相对标准
偏差（%）精密度相对标准
偏差（%）稳定性相对标准
偏差（%）TSC 2.890 3.030 2.071 GA 1.829 1.882 2.348 TSB 3.426 3.188 2.847 EGC 1.304 2.934 1.904 咖啡碱 1.901 2.541 2.062 TSA 3.592 4.835 0.349 EC 1.94 9 3.124 0.423 EGCG 1.034 4.155 3.844 ECG 2.665 3.378 3.444 TF 3.123 3.881 2.396 TF3G 3.020 4.020 0.724 TF3’G 4.008 4.278 3.994 TFDG 3.909 4.288 3.500
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表 5 各物质加标回收率试验结果
Table 5 The results of the recovery test for substances
物质 加标浓度（mg/mL） 加标回收率（%） RSD（%） 高 中 低 高 中 低 高 中 低 TSC 0.45 0.25 0.05 90.996 91.166 90.878 1.234 1.219 1.204 GA 0.45 0.20 0.10 94.150 95.682 96.822 1.210 0.991 0.712 TSB 0.45 0.25 0.05 91.876 92.727 93.398 1.219 1.226 1.320 EGC 0.80 0.50 0.20 95.989 95.880 95.771 0.503 0.489 0.475 咖啡碱 0.45 0.30 0.10 95.926 93.689 91.383 1.809 2.228 2.329 TSA 0.45 0.30 0.10 92.889 93.556 92.557 1.210 1.424 1.788 EC 0.45 0.30 0.10 99.080 98.662 99.800 3.120 3.268 3.110 EGCG 0.45 0.30 0.10 104.127 105.110 103.756 1.923 1.899 1.779 ECG 0.45 0.20 0.10 95.356 97.002 97.674 3.109 3.224 3.165 TF 0.18 0.10 0.02 95.826 94.939 96.869 1.210 1.118 0.534 TF3G 0.18 0.10 0.02 101.662 102.986 101.373 1.519 2.880 2.366 TF3’G 0.18 0.10 0.02 107.331 106.313 103.827 0.308 0.210 0.154 TFDG 0.18 0.10 0.02 90.256 90.961 90.106 2.239 2.528 1.512
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表 6 茶样中化合物含量
Table 6 Content of compounds in tea samples
物质 绿茶（mg/g） 乌龙茶（mg/g） 红茶（mg/g） 黑茶（mg/g） TSC 1.008±0.046a 6.669±0.007c 4.260±0.029b 4.083±0.041b GA 3.909±0.023a 4.775±0.029b 5.728±0.025d 5.008±0.016c TSB 0.901±0.085a 4.854±0.062d 3.398±0.032b 3.992±0.067c EGC 38.195±0.003c 24.858±0.031b 10.803±0.030a 10.811±0.029a 咖啡碱 34.495±0.020b 35.714±0.024c 38.388±0.047d 31.139±0.028a TSA 2.033±0.017a 9.194±0.013c 9.570±0.021c 7.031±0.031b EC 20.894±0.045d 10.565±0.005c 5.498±0.038a 7.348±0.017b EGCG 81.813±0.025d 76.868±0.024c 5.979±0.025b 5.693±0.005a ECG 30.751±0.022d 22.903±0.041c 7.443±0.005b 6.047±0.025a TF ND 2.845±0.011a 2.853±0.025b ND TF3G ND 2.289±0.045a 2.724±0.043b ND TF3’G ND 1.800±0.010a 2.369±0.010b ND TFDG ND 2.112±0.040a 2.958±0.037b ND 注：同行不同小写字母表示存在显著差异（P<0.05）；ND表示未检测到。
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