Optimization of the Fermentation Conditions of Bacillus subtilis Z-5 Producing Pectinase and Its Application
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摘要: 为进一步提高果胶酶的产量，采用响应面法优化了Bacillus subtilis Z-5产果胶酶的发酵培养基和发酵条件，并将优化后得到的果胶酶应用于梨汁澄清实验。通过单因素实验探究9个因子对B. subtilis Z-5产果胶酶活力的影响，然后采用Plackett-Burman试验设计筛选出3个显著影响产酶的因素：酵母粉含量、pH、培养时间；再结合响应面设计法确定了最佳的发酵条件。结果表明最佳的发酵培养基成分是果胶10 g/L，酵母粉7.99 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L；最佳的发酵条件为初始pH5.66，发酵温度37 ℃，培养时间72 h，接种量为6%（v/v），装液量50/250 mL，底物浓度为10 g/L；在此基础上，B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力由879.00 U/mL提高到1549.62 U/mL，是优化前的1.76倍。在梨汁澄清实验中表明果胶酶的最适添加量为4 mL，最适酶解时间为2.5 h，最适酶解温度为65 ℃，最适酶解pH为6.0，此时透光率最大为79.77%，与商品酶相比，自制果胶酶是一种具有多种酶系复合酶，可作用于梨汁中含有的蛋白、淀粉等其他成分，使得梨汁更加澄清。本研究结果为果胶酶的工业化生产和应用提供了理论支撑。
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关键词:
- 果胶酶 /
- Bacillus subtilis Z-5 /
- 发酵条件优化 /
- 果汁澄清
Abstract: To further improve the yield of pectinase, the fermentation medium and fermentation conditions for pectinase production by Bacillus subtilis Z-5 were optimized using the response surface methodology, and the optimized pectinase was applied for the clarification of pear juice. Based on the single-factor experiments, the Plackett-Burman test design was applied to screen out three significant factors affecting enzyme production: Yeast powder content, pH and incubation time, and then combined with the response surface design method to determine the optimal fermentation conditions. The results showed that the optimal fermentation medium composition was 10 g/L pectin, 7.99 g/L yeast powder and 0.5 g/L MgSO4·7H2O, the optimal fermentation conditions were initial pH5.66, fermentation temperature 37 ℃, incubation time 72 h, inoculum 6% (v/v), liquid volume 50/250 mL and substrate concentration 10 g/L. On the basis of this, the enzymatic activity of pectinase produced by B. subtilis Z-5 was increased from 879.00 U/mL to 1549.62 U/mL, which was 1.76 times higher than the unoptimised one. In pear juice clarification experiments, it was shown that the optimum addition of pectinase was 4 mL, the optimum enzymatic time was 2.5 h, the optimum enzymatic temperature was 65 ℃ and the optimum enzymatic pH was 6.0, the maximum light transmission rate was 79.77%. Compared with the commercial enzyme, the homemade pectinase is a compound enzyme with multiple enzyme systems, which can act on other components such as protein and starch contained in the pear juice, making the pear juice more clarified. The results of this study have provided theoretical support for the industrial production and application of pectinase. -
果胶是一种复杂的、高分子量的酸性结构多糖，作为相邻细胞间的胶结物质，广泛存在于植物中层和初级细胞壁中[1]，能够保持植物组织的结构完整性和凝聚力[2]。果胶酶是一组参与果胶聚合物解聚的酶[3]，根据最适pH的不同，可被分为酸性果胶酶和碱性果胶酶[4]，已广泛应用于果汁澄清、纺织工业、葡萄酒生产工业、蔬菜废物处理、制浆和造纸工艺、植物纤维的脱胶、油提取过程以及茶和咖啡发酵等领域，据报道酸性果胶酶可显著地澄清果汁，其原理是利用果胶酶水解果汁中的果胶物质，提高果汁的出汁率，降低粘度，提高稳定性，减少化学试剂的用量，保留了果汁的营养成分，提高品质，因此果胶酶澄清果汁，具有快速、简便、效果好等特点，在生产过程中具有重要的应用价值[5]。然而果胶酶在澄清处理时，用量过高，酶蛋白自身会使果汁浑浊，澄清效果不好而且造成资源浪费；用量低时，酶不足以使果胶分解完全，澄清效果不明显，所以其用量是一个关键的影响因素[6]。
随着我国果汁果酒业的迅猛发展，国内对果胶酶的需求量也呈上升趋势[7]。开发活力高，稳定性好，专一性强的果胶酶制剂是对果胶酶研究的必然要求[8-9]。在大多数商业应用中，已经使用了真菌果胶酶，但与真菌来源的果胶酶相比，细菌产的果胶酶具有额外的优势，酶的产生可以在更短的时间内实现，芽孢杆菌菌株是果胶酶的有效来源[2]。为了更高效地提高果胶酶的产量，不仅要求有一株生长特性良好的菌株，培养条件的优化是微生物实现大批量工业化生产必不可少的环节之一，而不同的培养条件及培养基配比与微生物代谢产物的产量密切相关[10]。目前国内外学者通过优化培养基成分及培养条件来提高微生物生产果胶酶的产量，如白兰芳等[11]筛选出一株产果胶酶的细菌Bacillus stubtilis JLSP-13，通过响应面优化发酵条件后果胶酶活达到37.6 U/mL；Gupta等[12]通过响应面优化枯草芽孢杆菌产果胶酶的发酵培养基，其果胶酶产量提高了2倍；廖敏等[13]通过单因素实验和正交试验优化假单胞菌B41产果胶酶的培养基及发酵条件，其酶活达739 U/mL；刘均珠等[14]从高效酒饼粉中筛选出一株产果胶酶的菌株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，以百香果皮为发酵原材料进行单因素试验和正交试验优化培养条件，其酶活达到121.46 U/mL，提高了1.49倍。本实验前期以果胶为唯一碳源，通过透明圈法和DNS法从上海海洋大学橘子园的土壤中筛选出一株高产、有良好热稳定性和酸碱耐受性的产果胶酶的野生型菌株Z-5。通过鉴定确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在研究影响果胶酶酶活力的单因素的基础上，本研究通过Plackett-Burman 设计、Box-Behnken试验及响应面分析对显著影响的因素进行优化，简化工艺，降低生产成本，以期为工业上果胶酶的生产打下基础。然后将果胶酶应用于澄清梨汁的试验中，以透光率为指标，通过对澄清效果的单因素探究，以期为果汁产品开发提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验菌株 由实验室前期筛选到的Bacillus subtilis Z-5菌株，保藏于−80 ℃冰箱；安徽砀山酥梨、金盖酥 储存于阴凉地方，避免阳光直射；商品果胶酶粉 购自夏盛食品公司，称取0.1 g商品果胶酶粉，用pH6的柠檬酸一水-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100 mL；葡萄糖、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 均购自上海生工生物工程公司；氯化钠、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、pH6的柠檬酸一水-磷酸氢二钠缓冲溶液、DNS等其他试剂均为分析纯；种子培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉粉3，氯化钠5，pH7.5，121 ℃灭菌30 min；发酵培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨5，KH2PO4 3，K2HPO4.3H2O 9，pH6，121 ℃灭菌30 min。
UV-1800PC紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；TGL-16G台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂；DSX-280B自动手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；THZ300恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；pH730台式pH精密测试仪 德国 WTW。
1.2 实验方法
1.2.1 果胶酶酶活力的测定
果胶酶酶活力的测定方法采用DNS法，根据文献[15-21]并进行适当修改。
制备粗酶液：取培养物于4 ℃，10000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。
果胶酶活力的测定：采用DNS法，取5 mL 10 g/L的果胶溶液于比色管中，50 ℃水浴预热5 min，加入4 mL pH6.0的缓冲溶液，再加入1 mL稀释后的酶液，于50 ℃水浴反应30 min；取反应液的1/5即2 mL加入另一比色管中，加2 mL蒸馏水，再加入5 mL DNS，沸水浴加热5 min，立即冷却，最后定容到25 mL。于540 nm处测OD值。对照组将稀释后的酶液沸水浴灭活10 min，其余条件和实验组相同。
果胶酶酶活力的定义：在一定条件下，1 mL酶液1 min分解果胶产生1 μg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U/mL）。
酶活力计算公式：用测得的OD540 nm值带入标准曲线中计算出葡萄糖的量（G（mg）），再转换成半乳糖醛酸的量（W（mg））。
果胶酶酶活力(U/mL)=G×194/180×1000×N×5/T； 式中：G×194/180×1000表示半乳糖醛酸的量（W）[15, 17, 20-21]；N表示酶液的稀释倍数；5表示取了反应液的1/5；T表示反应时间（min）。
1.2.2 葡萄糖标准曲线
在前期实验研究的基础上，确定了葡萄糖标准曲线，其线性回归方程为y=0.6572x−0.1099（y：吸光值；x：葡萄糖含量），R2=0.9993，表明线性拟合程度良好，可用于计算果胶酶酶活力。
1.2.3 发酵培养基和发酵条件的单因素
1.2.3.1 碳源对B. subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响
在基础发酵培养基中分别添加10 g/L的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、果胶、蔗糖、果糖、麦芽糖作为碳源，37 ℃，160 r/min培养72 h后测不同碳源对果胶酶酶活力的影响。得到最佳碳源后，设置不同浓度的碳源（6、8、10、12、14、16 g/L），其他条件及添加量不变，测不同浓度的碳源条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.2 氮源对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
在确定了最佳碳源及添加量的基础上分别添加5 g/L的酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、蛋白胨加酵母粉、NH4Cl作为氮源，37 ℃，160 r/min培养72 h，测量不同氮源对果胶酶酶活力的影响。确定最佳氮源后，设置不同浓度的氮源（0.5、1、3、5、7、9、10 g/L），测不同浓度氮源条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.3 金属离子对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
确定了最佳碳源和最佳氮源的基础上，添加0.3 g/L的不同金属离子（Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+、Mn2+），37 ℃，160 r/min培养72 h，测定不同金属离子对果胶酶酶活力的影响。确定最佳金属离子之后，设置不同的浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L），测定不同浓度金属离子条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.4 发酵初始pH对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
在最佳碳源、氮源和金属离子的基础上，将发酵液的初始pH设置成4、5、6、7、8，37 ℃，160 r/min培养72 h，测定不同pH条件下的果胶酶酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.5 发酵温度对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
在碳源、氮源、金属离子和初始pH都确定好的基础上，设置不同的发酵温度（28、31、34、37、40、43 ℃），160 r/min培养72 h，测定不同发酵温度条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.6 培养时间对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
在上述确定好的碳源、氮源、金属离子、初始pH和发酵温度的基础上，设置不同的发酵时间（12、24、36、48、60、72、84、96 h），160 r/min，测定不同发酵时间条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.7 接种量对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
确定了碳源、氮源、金属离子、初始pH、培养温度、发酵时间之后，将种子液分别以2%、4%、6%、8%、10%、12%（v/v）的接种量接入发酵瓶中（50/250 mL），160 r/min，测定不同接种量对酶活力的影响，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.8 装液量对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
确定好上述7个因素的最佳结果后，设置不同的装液量（30、40、50、60、70、80/250 mL），测定不同装液量对果胶酶酶活力的影响，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.3.9 底物浓度对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响
确定好8个最佳因素及保持其他条件不变的情况下，设置不同的底物浓度（4、6、8、10、12、14 g/L），测定不同的底物浓度对果胶酶酶活力的影响，将酶活力最大值定义为100%，计算相对酶活力。
1.2.4 响应面试验设计
1.2.4.1 Plackett-Burman 试验设计
如表1所示，采用P-B试验对9个单因素进行探究，每个因素分别设置高、低两个水平，并设置虚拟因素J用来考察试验误差，以果胶酶酶活力为响应值，筛选出3个显著影响因素。
表 1 Plackett-Burman设计变量Table 1. Process variables used in Plackett-Burman design编号 因素 水平 低水平（−1） 高水平（+1） A 果胶（g/L） 8 10 B 酵母粉（g/L） 5 7 C MgSO4·7H2O（g/L） 0.4 0.5 D 初始pH 6 7 E 发酵温度（℃） 37 43 F 培养时间（h） 48 72 G 接种量（%） 4 6 H 装液量（mL） 40 50 I 底物浓度（g/L） 8 10 J 虚拟因素 −1 +1 1.2.4.2 Box-Behnken试验设计
P-B试验筛选出的3个显著因素分别是酵母粉、pH、培养时间。如表2所示，采用Box-Behnken设计法（BBD）设置3因素3水平试验，以酵母粉、pH、培养时间为自变量，以果胶酶活力为响应值。
表 2 响应面试验因素与水平Table 2. Factors and levels of response surface experiments编号 因素 水平 −1 0 +1 A 酵母粉（g/L） 5 7 9 B pH 5 6 7 C 培养时间（h） 60 72 84 1.2.5 果胶酶澄清梨汁的应用
1.2.5.1 澄清度的测定
以蒸馏水作对照，在660 nm处测梨汁的透光率，以透光率T（%）表示梨汁的澄清度[16]。
1.2.5.2 果胶物质的定性检测
参考GB/T 18963-2012《浓缩苹果汁》进行测定并进行适当修改。取经过澄清过后的梨汁2 mL，加入4 mL体积分数为95%酸性乙醇（含10 mL/L浓HCl）混匀，放置20 min，如有凝胶或者絮状物出现，则梨汁中含有果胶为阳性。反之，则为阴性[16]。
1.2.5.3 酶的添加量对梨汁澄清度的影响
向含4 mL梨汁的试管中分别加入0、0.5、1、2、3、4、5、6/4 mL粗酶液，混匀，于60 ℃反应2 h，然后沸水浴2 min终止反应，设置3组平行实验，660 nm处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。
1.2.5.4 酶解时间对梨汁澄清度的影响
向含4 mL梨汁的试管中加入4 mL粗酶液，混匀，于60 ℃分别反应0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，然后沸水浴2 min终止反应，并设置3组平行实验，在660 nm处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。
1.2.5.5 酶解温度对梨汁澄清度的影响
向含4 mL梨汁的试管中加入4 mL粗酶液，混匀，分别于45、50、55、60、65、70 ℃反应2.5 h，然后沸水浴2 min终止反应，并设置3组平行实验，在660 nm处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。
1.2.5.6 酶解pH对梨汁澄清度的影响
将7份梨汁分别调节pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，再分别取4 mL梨汁于试管中加入4 mL酶液，混匀于60 ℃反应2.5 h后沸水浴2 min终止反应，设置3组平行实验，660 nm处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。
1.3 数据处理
单因素实验数据用Origin处理，P-B试验用Minitab17处理，BBD试验用Design-Expert 8.0.6处理。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 最佳碳源的确定
如图1（a）所示，不同碳源对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响不同。果胶、淀粉、葡萄糖作为碳源时，B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力普遍较高，其中果胶尤为明显，淀粉次之，葡萄糖第三。而麦芽糖、果糖、蔗糖和乳糖对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力相对较低。所以选择果胶作为B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳碳源，可能是因为果胶可以被B. subtilis Z-5菌株分解利用，在生长前期促进菌株的生长繁殖，后期有利于产酶。图1（b）展示的是果胶浓度对B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响，其中当果胶浓度为10 g/L时，菌株产果胶酶酶活力最高，因此选择10 g/L的果胶作为发酵培养基的唯一碳源。
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2.1.2 最佳氮源的确定
图2（a）所示不同的氮源种类对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响。其中无机氮源NH4Cl和尿素产果胶酶的酶活力较低，有机氮源相对来说产果胶酶酶活力较高，其中酵母粉最为突出。说明酵母粉更适合B. subtilis Z-5菌株的生长，是菌株产果胶酶氮架结构的营养物来源。图2（b）展示的是不同酵母粉浓度对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响，从图中可以看出当酵母粉浓度为7 g/L时，菌株产果胶酶的相对酶活力最高，所以选择7 g/L的酵母粉作为最佳氮源。
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图 2 不同氮源（a）及最佳氮源浓度（b）对酶活力的影响Figure 2. Effects of different nitrogen sources (a) and optimal nitrogen source concentration (b) on enzyme activity2.1.3 最佳金属离子的确定
不同的金属离子对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的效果不同，如图3（a）所示，Mg2+、Fe2+实验组的相对酶活力（%）显著大于对照组，说明Mg2+、Fe2+对B. subtilis Z-5产果胶酶活力有显著促进作用，可能是Mg2+、Fe2+与酶结合后改变了酶的空间结构，稳定了酶蛋白活性的构象，进而提高酶活；Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+实验组的相对酶活力（%）显著小于对照组，说明Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+会抑制菌株产果胶酶的酶活力，可能是由于Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+破坏了该酶的三维构象，使其更易发生失活的现象。其中Mg2+促进作用最为明显，所以选择MgSO4·7H2O作为最佳金属离子。由图3（b）可知当MgSO4·7H2O浓度为0.5 g/L时，产果胶酶酶活力最大。
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图 3 不同金属离子（a）及最适金属离子浓度（b）对酶活力的影响Figure 3. Effects of different metal ions (a) and optimum metal ion concentration (b) on enzyme activity2.1.4 最佳初始pH的确定
如图4所示，不同的发酵初始pH对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力有一定的影响。过酸或过碱都会影响微生物的生长繁殖，进而影响产酶机制。当初始pH为6时，菌株产果胶酶酶活力最大，所以选择pH6为菌株B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳初始pH。
2.1.5 最佳发酵温度的确定
温度可以影响微生物的生长，进而影响菌株发酵产酶。图5所示为发酵温度对B. subtilis Z-5菌株产果胶酶酶活力的影响，随着温度的增加，酶活力也增加，当温度为37 ℃时，酶活力达到最大值，当温度再增加时，酶活力开始下降，所以选择37 ℃作为B. subtilis Z-5菌株产果胶酶最佳的发酵温度。
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图 5 不同发酵温度对酶活力的影响Figure 5. Effects of different fermentation temperatures on enzyme activity2.1.6 最佳培养时间的确定
时间也是影响微生物生长的重要因素之一，如图6所示，刚开始培养基中营养物质充足，随着时间的增长，微生物繁殖很快，因而菌株B. subtilis Z-5产果胶酶能力增加，直到72 h时，菌体数量达到最大值，此时菌株产酶能力也达到最大值。72 h后，营养物质逐渐被消耗，代谢产物增多，菌株的生长受到抑制，此时菌株产果胶酶的酶活力开始下降，所以选择72 h为B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳培养时间。
2.1.7 最佳接种量的确定
由图7可知，不同接种量对菌株产果胶酶能力不同，随着接种量的增加，菌株产果胶酶的能力先增加后下降，当接种量在2%~4%（v/v）时，接种量较低，菌体数量较少，所以产酶能力较弱；当接种量为6%（v/v）时，产酶能力达到最大值；当接种量继续增加，培养基中的营养物质被大量消耗，且氧气容量不足，导致菌株产酶能力下降。因此，将6%（v/v）确定为菌株B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳接种量。
2.1.8 最佳装液量的确定
由图8可知，当装液量为50/250 mL时，菌株B. subtilis Z-5产果胶酶能力最强；当装液量较高时，溶氧量不足，影响了菌株的生长，进而影响菌株的产酶能力；当装液量较低时，营养物质可能不足以维持菌株的生长繁殖，因此也影响了菌株的产酶能力。所以选择50/250 mL作为菌株B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳装液量。
2.1.9 最佳底物浓度的确定
底物浓度也是影响菌株B. subtilis Z-5产果胶酶能力的重要因素之一。如图9所示，随着底物果胶浓度的增加，菌株产果胶酶酶活力增大；当底物果胶浓度为10 g/L时，菌株产果胶酶酶活力值最大；当果胶浓度增加至大于10 g/L后，酶活力开始降低，所以选择果胶浓度为10 g/L作为菌株B. subtilis Z-5产果胶酶的最佳底物浓度。
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图 9 不同的底物浓度对酶活力的影响Figure 9. Effects of different substrate concentrations on enzyme activity2.2 Plackett-Burman 试验设计结果
P-B试验主要是用来评估9个单因素对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的显著性，表3为P-B试验的设计和结果。表4是对9个单因素进行了主效应分析，三个显著因素分别是酵母粉浓度、初始pH、培养时间，P值分别是0.017、0.047、0.037均小于0.05。选择显著的三个因素进行BBD试验。
表 3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3. Design and results of Plackett-Burman experiment试验号 A B C D E F G H I J 酶活力（U/mL） 1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 468.62 2 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 1 783.62 3 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 479.55 4 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 −1 1084.97 5 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 1 1348.04 6 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1011.85 7 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1002.97 8 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 −1 1069.25 9 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 456.32 10 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 694.79 11 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 1408.86 12 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1030.98 表 4 Plackett-Burman设计的因素水平及主效应分析Table 4. Factor levels and main effects analysis of Plackett-Burman design编号 因素 水平 T值 P值 显著性排序 低（−1） 高（+1） A 果胶（g/L） 8 10 7.03 0.090 7 B 酵母粉（g/L） 5 7 37.36 0.017 1 C MgSO4·7H2O（g/L） 0.4 0.5 4.31 0.145 9 D 初始pH 6 7 13.53 0.047 3 E 发酵温度（℃） 37 43 −0.59 0.659 10 F 培养时间（h） 48 72 −17.10 0.037 2 G 接种量（%） 4 6 7.12 0.089 6 H 装液量（mL） 40 50 9.42 0.067 4 I 底物浓度（g/L） 8 10 −5.44 0.116 8 J 虚拟因素 −1 +1 8.07 0.079 5 注：P<0.05为显著。 2.3 响应面设计和结果分析
2.3.1 Box-Behnken试验设计结果与回归模型方差分析
由P-B试验筛选出的酵母粉、初始pH和培养时间3个显著因素之后，利用BBD试验对3个显著因素做进一步分析。BBD试验设计表及结果如表5所示，且对试验结果进行多元回归分析，模型的二次回归方程如下：
表 5 Box-Behnken试验设计与结果Table 5. Design and results of Box-Behnken experiment试验号 A酵母粉（g/L） B初始pH C培养时间（h） 酶活力（U/mL） 1 9 6 60 719.3932 2 7 5 84 1214.56 3 7 6 72 1443.023 4 7 6 72 1449.856 5 9 7 72 698.7133 6 7 7 60 903.2047 7 7 6 72 1463.522 8 7 6 72 1458.056 9 5 6 60 880.4056 10 5 5 72 1067.2 11 7 5 60 1194.297 12 7 6 72 1448.489 13 9 5 72 917.5543 14 5 6 84 970.617 15 9 6 84 828.1911 16 7 7 84 1087.699 17 5 7 72 902.955 Y=1452.59−82.17A−100.06B+50.40C−13.65AB+4.65AC+41.20BC−403.07A2−152.92B2−199.87C2
式中：Y代表果胶酶酶活力（U/mL）；A、B、C分别代表酵母粉（g/L）、初始pH、培养时间（h）。
如表6所示，A、B、C、BC、A2、B2、C2对Y的影响极显著（P<0.01），AB对Y影响显著（P<0.05），AC对Y影响不显著（P>0.05），且模型的F=1271.53，P<0.0001，说明该模型极显著；模型失拟项F=2.36，P=0.2131>0.05，失拟项不显著，说明模型拟合较好。R2=0.9994，线性关系明显，校正确定系数R2Adj=0.9986，说明模型可以解释99.86%的试验结果，信噪比=95.745>4，说明试验精准度高。预测确定系数R2pred=0.9934与校正确定系数R2Adj=0.9986接近，说明试验预测值在可信区间内。因此，此模型可以用来预测和分析菌株B. subtilis Z-5产果胶酶发酵条件的优化。
表 6 回归模型的方差分析Table 6. Variance analysis of regression model项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.200E+006 9 1.333E+005 1271.53 <0.0001 ** A 54010.26 1 54010.26 515.21 <0.0001 ** B 80095.95 1 80095.95 764.05 <0.0001 ** C 20322.20 1 20322.20 193.86 <0.0001 ** AB 745.19 1 745.19 7.11 0.0322 * AC 86.34 1 86.34 0.82 0.3943 BC 6789.04 1 6789.04 64.76 <0.0001 ** A2 6.841E+005 1 6.841E+005 6525.30 <0.0001 ** B2 98459.10 1 98459.10 939.22 <0.0001 ** C2 1.682E+005 1 1.682E+005 1604.54 <0.0001 ** 残差 733.81 7 104.83 失拟项 468.58 3 156.19 2.36 0.2131 不显著 净误差 265.23 4 66.31 总和 1.200E+006 16 R2 0.9994 R2Adj 0.9986 注：“**”表示影响极其显著，P<0.01；“*”表示影响显著，P<0.05。 2.3.2 响应面曲线及等高线分析
如图10所示为酵母粉、初始pH、培养时间三种因素的交互作用对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的影响。响应面曲线的陡峭程度和等高线的形状可以反映两两因素交互作用的强度。曲线越陡，交互作用越强；曲线越平滑，交互作用越弱。等高线越接近椭圆，交互作用越显著；等高线越接近圆形，交互作用越不显著[22-23]。由图10可知酵母粉与培养时间对果胶酶酶活力的交互影响不显著，pH与培养时间、酵母粉与pH对果胶酶酶活力的交互影响显著，且交互作用强弱为BC>AB。
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图 10 发酵时间、pH、酵母粉交互作用对酶活力影响的响应面曲线Figure 10. Response surface plots of effects of interaction between fermentation time, pH and yeast on enzyme activity2.4 验证实验
利用Design-Expert软件分析得出菌株产果胶酶最优的发酵条件为酵母粉7.99 g/L，pH5.66，培养时间73.16 h，理论酶活力值为1350.69 U/mL。考虑实际操作情况，将培养时间调整为72 h，其他成分条件不变，进行3次平行实验，最后得出菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力为1549.62 U/mL，是优化前的1.76倍，且优化后的实际值与预测值相近，证明模型的准确性和有效性。
2.5 果胶酶澄清梨汁的应用
2.5.1 酶添加量对澄清梨汁的影响
当酶与底物作用时，底物浓度大大超过酶浓度，酶全部被底物饱和，则反应速度随酶浓度的增加而增加[6]。果胶酶用量少时，果胶物质分解不完全，澄清效果差；用量过多，酶蛋白又会使果汁产生混浊，而且澄清成本增加[6]。如图11所示，用果胶酶澄清梨汁时，随着酶浓度的增加，梨汁的透光率也显著地增加，呈正相关趋势。当酶添加量上升至4/4 mL时，透光率最大为71.30%，澄清效果最佳，此时酶与底物达到饱和；酶继续增加时，澄清度下降，酶蛋白使梨汁产生混浊。所以酶用量对果汁澄清效果有显著影响，选择合适的底物与酶添加量对果汁的生产工业非常重要。
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图 11 酶添加量对梨汁澄清度的影响Figure 11. The effect of enzyme addition on the pear juice clarification如表7所示，随着酶添加量的增大，梨汁中的果胶含量在不断减少，当果胶酶用量≥4/4 mL时，梨汁中的果胶已分解完全，所以综上最佳的酶添加量为4/4 mL。由图11可知商品果胶酶最适添加量也为4/4 mL，而此时透光率为68.24%不如自制果胶酶。
表 7 酶添加量对梨汁中果胶含量的影响Table 7. The effect of enzyme addition on pectin content of the pear juice2.5.2 酶解时间对梨汁澄清度的影响
如图12所示，当在0~0.5 h时，梨汁的透光率随着时间的增加而显著增大；当在0.5~2.5 h时，透光率随着时间的增加而缓慢增大；当酶解时间>2.5 h时，透光率增加不明显趋于平衡。如表8所示，当酶解时间>2.5 h时，梨汁中的果胶含量呈阴性，说明此时果胶酶将梨汁中的果胶分解完全，所以最佳的酶解时间是2.5 h，此时透光率为72.31%。从商品果胶酶曲线来看，当酶解时间>2.5 h时，透光率趋于稳定，而此时透光率低于自制果胶酶的透光率，自制果胶酶的澄清效果较好。
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图 12 酶解时间对梨汁澄清度的影响Figure 12. The effect of enzymolysis time on the pear juice clarification表 8 酶解时间对梨汁中果胶含量的影响Table 8. The effect of enzymolysis time on pectin content of the pear juice时间（h） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 果胶
含量+++ + + + + − − − − 2.5.3 酶解温度对梨汁澄清度的影响
酶只有在有效温度范围内才能进行催化作用，在最适温度下，酶催化反应速率达到最大。如图13所示，当温度在45~65 ℃时，随着温度的升高，透光率在缓慢增加；当温度在65 ℃时，梨汁的透光率最大为75.7%；当温度>65 ℃时，酶解温度的升高导致果胶酶开始变性，分解果胶能力开始下降，所以透光率下降。由表9可知，在45~55 ℃时，梨汁中的果胶含量呈阳性，此时因为温度较低导致果胶酶活力低，果胶不能完全分解；在60~65 ℃时，梨汁中的果胶已基本被分解；而当温度>65 ℃时，由于酶开始变性，酶活力降低，酶的作用能力下降，果胶含量增多。因为温度的升高，发生热凝作用，导致果胶的絮凝产生沉淀，使透光率降低[17]，所以最佳的酶解温度是65 ℃。而商品果胶酶的最佳酶解温度是60 ℃，此时透光率为69.53%，与商品酶相比，自制果胶酶更具热稳定性。
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图 13 酶解温度对梨汁澄清度的影响Figure 13. The effect of enzymolysis temperature on the pear juice clarification表 9 酶解温度对梨汁中果胶含量的影响Table 9. The effect of enzymolysis temperature on pectin content of the pear juice温度（℃） 45 50 55 60 65 70 75 果胶含量 + + + − − + ++ 2.5.4 酶解pH对梨汁澄清度的影响
pH过高或过低都会破坏酶的空间结构，使酶变性失活，当pH改变不是很剧烈时，酶虽然不变性，但活力受到影响，因为此时酶可能会与底物发生解离状态，从而导致酶活力下降[5]。如图14所示，随着pH的增大，梨汁的透光率呈先上升后下降的趋势，当pH为6时，梨汁透光率最大为79.77%，澄清效效果最好。如表10所示，当pH6时，梨汁中果胶含量呈阴性，果胶基本被分解。所以酶解的最佳pH是6。当用商品果胶酶时，梨汁透光率呈先上升后下降趋势，当pH为5.5时，透光率最大为70.21%，澄清效果最好，所以商品果胶酶的最佳酶解pH是5.5，而此时透光率比自制果胶酶催化时的透光率小，澄清效果较差。
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图 14 酶解pH对梨汁澄清度的影响Figure 14. The effect of enzymolysis pH on the pear juice clarification表 10 酶解pH对梨汁中果胶含量的影响Table 10. The effect of enzymolysis pH on pectin content of the pear juicepH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 果胶含量 + + − − − − + 3. 讨论
在9个单因素实验分析基础上，通过Plackett-Burman试验设计评估9个单因素对菌株B. subtilis Z-5产果胶酶酶活力的显著性，由实验结果可知，显著性大小依次是酵母粉浓度>培养时间>初始pH>装液量>接种量>果胶浓度>底物浓度>MgSO4·7H2O浓度>发酵温度。从中筛选出前3个显著影响因素进行BBD试验并进行响应面优化，得到最佳发酵培养基和发酵条件是果胶10 g/L，酵母粉7.99 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH5.66，发酵温度37 ℃，培养时间72 h，接种量6%（v/v），装液量50/250 mL，底物浓度是10 g/L。
果胶酶澄清果汁包括果胶的酶促水解和非酶的静电絮凝两部分：当果汁中的果胶在果胶酶作用下部分水解后，原来被包裹在内的部分带正电荷的蛋白质颗粒就暴露出来与其它带负电荷的粒子相撞，从而导致絮凝的发生，絮凝物在沉降过程中，吸附，缠绕果汁中的其它悬浮粒子，从而达到澄清目的[5, 24]。本研究通过优化发酵培养基成分和发酵条件，B. subtilis Z-5产果胶酶酶活提高至未优化的1.76倍，将此果胶酶应用于澄清梨汁，得到酶的最适添加量为4/4 mL，最适酶解时间是2.5 h，最适酶解温度为65 ℃，最适酶解pH为6.0，此时透光率为79.77%。相比商品酶（透光率为70.21%），自制果胶酶热稳定性较好，透光率较高，澄清效果较好，可能是由于B. subtilis Z-5产的果胶酶是一种复合酶，具有多种酶系，而梨汁中含有蛋白、淀粉等其他成分，使得梨汁更加澄清。
4. 结论
本研究采用单因素实验、Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken中心组合设计优化B. subtilis Z-5产果胶酶的发酵条件，得到优化后的发酵培养基组分是果胶10 g/L，酵母粉7.99 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；发酵条件初始pH为5.66，发酵温度37 ℃，培养时间72 h，接种量为6%（v/v），装液量50/250 mL，底物浓度为10 g/L；使果胶酶酶活力提高至未优化的1.76倍，说明响应面优化B. subtilis Z-5产果胶酶的发酵培养基和条件切实可行，为工业化及商业化生产果胶酶提供理论依据。
将发酵条件优化后得到的果胶酶粗酶液应用到梨汁的澄清中，研究表明酶的添加量、酶解时间、酶解温度、酶解pH都对梨汁的澄清都有重要影响。本次试验中酶的最适添加量为4/4 mL，最适酶解时间是2.5 h，最适酶解温度为65 ℃，最适酶解pH为6.0，此时透光率为79.77%。为工业上规模化澄清果汁奠定理论基础。
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图 2 不同氮源（a）及最佳氮源浓度（b）对酶活力的影响
Figure 2. Effects of different nitrogen sources (a) and optimal nitrogen source concentration (b) on enzyme activity
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图 3 不同金属离子（a）及最适金属离子浓度（b）对酶活力的影响
Figure 3. Effects of different metal ions (a) and optimum metal ion concentration (b) on enzyme activity
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图 5 不同发酵温度对酶活力的影响
Figure 5. Effects of different fermentation temperatures on enzyme activity
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图 9 不同的底物浓度对酶活力的影响
Figure 9. Effects of different substrate concentrations on enzyme activity
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图 10 发酵时间、pH、酵母粉交互作用对酶活力影响的响应面曲线
Figure 10. Response surface plots of effects of interaction between fermentation time, pH and yeast on enzyme activity
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图 11 酶添加量对梨汁澄清度的影响
Figure 11. The effect of enzyme addition on the pear juice clarification
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图 12 酶解时间对梨汁澄清度的影响
Figure 12. The effect of enzymolysis time on the pear juice clarification
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图 13 酶解温度对梨汁澄清度的影响
Figure 13. The effect of enzymolysis temperature on the pear juice clarification
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图 14 酶解pH对梨汁澄清度的影响
Figure 14. The effect of enzymolysis pH on the pear juice clarification
表 1 Plackett-Burman设计变量
Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design
编号 因素 水平 低水平（−1） 高水平（+1） A 果胶（g/L） 8 10 B 酵母粉（g/L） 5 7 C MgSO4·7H2O（g/L） 0.4 0.5 D 初始pH 6 7 E 发酵温度（℃） 37 43 F 培养时间（h） 48 72 G 接种量（%） 4 6 H 装液量（mL） 40 50 I 底物浓度（g/L） 8 10 J 虚拟因素 −1 +1 
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表 2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments
编号 因素 水平 −1 0 +1 A 酵母粉（g/L） 5 7 9 B pH 5 6 7 C 培养时间（h） 60 72 84
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表 3 Plackett-Burman试验设计与结果
Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiment
试验号 A B C D E F G H I J 酶活力（U/mL） 1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 468.62 2 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 1 783.62 3 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 479.55 4 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 −1 1084.97 5 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 1 1348.04 6 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1011.85 7 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1002.97 8 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 −1 1069.25 9 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 456.32 10 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 694.79 11 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 1408.86 12 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1030.98
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表 4 Plackett-Burman设计的因素水平及主效应分析
Table 4 Factor levels and main effects analysis of Plackett-Burman design
编号 因素 水平 T值 P值 显著性排序 低（−1） 高（+1） A 果胶（g/L） 8 10 7.03 0.090 7 B 酵母粉（g/L） 5 7 37.36 0.017 1 C MgSO4·7H2O（g/L） 0.4 0.5 4.31 0.145 9 D 初始pH 6 7 13.53 0.047 3 E 发酵温度（℃） 37 43 −0.59 0.659 10 F 培养时间（h） 48 72 −17.10 0.037 2 G 接种量（%） 4 6 7.12 0.089 6 H 装液量（mL） 40 50 9.42 0.067 4 I 底物浓度（g/L） 8 10 −5.44 0.116 8 J 虚拟因素 −1 +1 8.07 0.079 5 注：P<0.05为显著。
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表 5 Box-Behnken试验设计与结果
Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment
试验号 A酵母粉（g/L） B初始pH C培养时间（h） 酶活力（U/mL） 1 9 6 60 719.3932 2 7 5 84 1214.56 3 7 6 72 1443.023 4 7 6 72 1449.856 5 9 7 72 698.7133 6 7 7 60 903.2047 7 7 6 72 1463.522 8 7 6 72 1458.056 9 5 6 60 880.4056 10 5 5 72 1067.2 11 7 5 60 1194.297 12 7 6 72 1448.489 13 9 5 72 917.5543 14 5 6 84 970.617 15 9 6 84 828.1911 16 7 7 84 1087.699 17 5 7 72 902.955
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表 6 回归模型的方差分析
Table 6 Variance analysis of regression model
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.200E+006 9 1.333E+005 1271.53 <0.0001 ** A 54010.26 1 54010.26 515.21 <0.0001 ** B 80095.95 1 80095.95 764.05 <0.0001 ** C 20322.20 1 20322.20 193.86 <0.0001 ** AB 745.19 1 745.19 7.11 0.0322 * AC 86.34 1 86.34 0.82 0.3943 BC 6789.04 1 6789.04 64.76 <0.0001 ** A2 6.841E+005 1 6.841E+005 6525.30 <0.0001 ** B2 98459.10 1 98459.10 939.22 <0.0001 ** C2 1.682E+005 1 1.682E+005 1604.54 <0.0001 ** 残差 733.81 7 104.83 失拟项 468.58 3 156.19 2.36 0.2131 不显著 净误差 265.23 4 66.31 总和 1.200E+006 16 R2 0.9994 R2Adj 0.9986 注：“**”表示影响极其显著，P<0.01；“*”表示影响显著，P<0.05。
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表 7 酶添加量对梨汁中果胶含量的影响
Table 7 The effect of enzyme addition on pectin content of the pear juice
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表 8 酶解时间对梨汁中果胶含量的影响
Table 8 The effect of enzymolysis time on pectin content of the pear juice
时间（h） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 果胶
含量+++ + + + + − − − −
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表 9 酶解温度对梨汁中果胶含量的影响
Table 9 The effect of enzymolysis temperature on pectin content of the pear juice
温度（℃） 45 50 55 60 65 70 75 果胶含量 + + + − − + ++
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表 10 酶解pH对梨汁中果胶含量的影响
Table 10 The effect of enzymolysis pH on pectin content of the pear juice
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 果胶含量 + + − − − − +
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